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QUIMICA BIOLÓGICA I
Alumno:
Carrera:
∼ Año 2013 ∼
029
QUIMICA BIOLOGICA I
Docentes
1/30
Química Biológica I - 2013
1. ASISTENCIA. Los TP de laboratorio se dictarán en siete (7) clases prácticas de cuatro (4)
horas de duración cada una (8.00 a 12.00 h) los días miércoles o jueves según distribución de
grupos. Se podrá tener como máximo dos (2) inasistencias o desaprobados durante el
cursado, SIN EXCEPCIÓN. Los TP no desarrollados por inasistencia o desaprobado se
recuperarán al final del cursado.
2. PUNTUALIDAD. El ingreso al Laboratorio es a las 8.00 h para rendir el coloquio. Una vez
que se haya entregado el primer coloquio resuelto, ya no se admitirá el ingreso de ningún
alumno SIN EXCEPCIÓN, deberá retirarse y recuperar el TP. Asimismo el horario de
salida es a las 12.00 h y deberá ser respetado del mismo modo que el horario de inicio.
5. INFORME. Esta guía cuenta con los respectivos informes para cada TP para que se
vuelquen los resultados, cálculos, gráficos, observaciones, discusión y conclusiones.
Respetar los espacios para cada sección. Tener en cuenta que en “Resultados” se colocan los
valores obtenidos de cada ensayo en las tablas o espacios correspondientes. Se deberá
indicar un solo ejemplo de cálculo si correspondiera. En “Observaciones” se indicará lo que
se apreció visualmente y detalles técnicos que se quieran consignar. Los “Gráficos” deberán
realizarse correctamente en papel milimetrado y no deberán entregarse sueltos, sino pegados
o abrochados. En “Discusión” se analizarán los resultados obtenidos (ej. La reacción de
Benedict fue positiva en la muestra…..). En “Conclusión” ya no se detallan ni se discuten los
resultados, sino que se consigna lo comprobado en el TP de laboratorio (ej. La reacción de
Benedict es un buen método cualitativo para determinar hidratos de carbono reductores en
una muestra”).
He leído y acepto los términos y condiciones para el desarrollo de los Trabajos Prácticos de
Laboratorio de Química Biológica I – Química Bioorgánica
---------------------------------------------------
Firma del alumno
-------------------------
Aclaración
-------------------------
L.U.
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Química Biológica I - 2013
TRABAJO PRÁCTICO Nº 1
OBJETIVOS:
REACTIVOS
Reactivo de Benedict: Disolver en 100 ml de agua caliente 17,3 g de CuSO4.5H2O. Disolver aparte
en 800 ml de agua 173 g de citrato de sodio y 100 g de Na2CO3. Esta última solución se agrega
sobre la primera. Completar a 1 litro con agua.
MUESTRAS
M1: Glucosa 1%
M2: Sacarosa 1%
M3: Almidón 0,5%
M4: Suero sanguíneo humano
M5: Sacarosa hidrolizada en medio ácido
TÉCNICA OPERATORIA
1. Hidrólisis ácida (M5): A 2,5 ml de la solución de sacarosa 1% agregar 0,5 ml de HCl 1N.
Llevar 10 minutos a baño maría, dejar enfriar y luego añadir 0,5 ml de NaOH 1 N.
2. Protocolo de Trabajo:
M1 M2 M3 M4 M5
Volumen de
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
muestra
Reactivo de
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Benedict
Baño maría 3 minutos. Retirar
OBSERVAR COLORACIÓN
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Química Biológica I - 2013
REACTIVOS
TÉCNICA OPERATORIA
Curva de Calibración
M1 B1 Test. 1 Test. 2 Test. 3 Test. 4 Test. 5
Testigo o
Muestra 1 - 1 0,7 0,5 0,3 0,2
(ml)
H2O (ml) - 1 - 0,3 0,5 0,7 0,8
Rvo.
0,75 ml
Somogyi
Calentar 10 minutos a 100º C. Enfriar
Rvo.
0,75 ml
Nelson
H2O dest. 2,50 ml
LEER ASBSORBANCIA A 530 nm
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Química Biológica I - 2013
APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:
Suero Sacarosa
MUESTRA Glucosa 1% Sacarosa 1% Almidón 1%
humano hidrolizada
COLOR
RESULTADO
(+, - o indet)
Observaciones y Discusión
CONCLUSIONES
Curva de Calibración
M1 B1 Test. 1 Test. 2 Test. 3 Test. 4 Test. 5
Abs Muestra
Abs Muestra ó
Test– Abs B
C (mM)
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Química Biológica I - 2013
Observaciones y Discusión
Conclusiones
Anexar gráfico
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Química Biológica I - 2013
TRABAJO PRACTICO Nº 1
OBJETIVO
FUNDAMENTO
MATERIALES
Glucosa 1%
Almidón 0,5%
Sephadex G25 fino
Columna: 9 cm de largo, 0,63 cm de diámetro
Volumen de siembra: 0,5 ml
Eluyente: buffer fosfato 50 mM pH 8
Número de fracciones: 10 de 0,5 ml cada una
TÉCNICA OPERATORIA
1. Armar la columna cromatográfica, lavar la misma con 5 ml de buffer fosfato antes de la siembra.
4. Pruebas cualitativas:
Almidón: Se colocará en cubetas pequeñas, en primer lugar una gota de Lugol seguido de
una gota del eluido. Reacción positiva: color azul pardo. Ver gráfico 1).
Glucosa: A lo que resta del eluido en el tubo de ensayos se le agrega 0,5 ml del Reactivo de
Benedict. Calentar el tubo a baño maría aproximadamente 10 minutos. Reacción positiva:
precipitado rojo-naranja. Ver gráfico 2)
Estas pruebas cualitativas se realizarán para cada una de las 10 fracciones recogidas.
1 gota
de eluido
Baño María
Fracción recogida/
Eluido Resto de eluido
NOTA: La columna no debe secarse en ningún momento, para ello debe agregarse el buffer
constantemente.
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Química Biológica I - 2013
APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:
RESULTADOS
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Glucosa
Almidón
*Los resultados cualitativos se indicarán con signos “+” ó “–“. La intensidad de una reacción
positiva se indicará colocando 1, 2 ó 3 signos “+”.
Observaciones y Discusión
Conclusiones
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Química Biológica I - 2013
TRABAJO PRÁCTICO Nº 2
LIPIDOS: ACCIÓN HEMOLÍTICA DE LISOFOSFOLÍPIDOS
OBJETIVO: - Comprobar la acción hemolítica de los lisofosfolípidos
FUNDAMENTO:
Los lípidos complejos que participan en la constitución de membranas celulares están en
permanente recambio. El proceso de degradación es cumplido por enzimas específicas que
catalizan la hidrólisis de las uniones entre los componentes de la molécula.
Los glicerofosfolípidos requieren un conjunto de enzimas para su total degradación. La
fosfolipasa A2 cataliza la hidrólisis de la unión éster del ácido graso en posición 2, con lo cual se
forman un lisofosfolípido y un ácido graso libre, generalmente insaturado. Otras fosfolipasas,
A1, C y D, son responsables del clivaje de otros enlaces éster de la molécula del
glicerofosfolípido.
Las fosfolipasas A2 (PLA2), están ampliamente distribuídas, habiéndose encontrado en casi
todos los tipos celulares. Las más estudiadas son las de origen pancreático y las presentes en
venenos de serpientes.
En este trabajo práctico se estudiará la acción de la PLA2 presente en veneno de yarará grande
(Bothrops alternatus) sobre fosfolípidos presentes en yema de huevo (rica especialmente en
lecitinas), se comprobará su acción hemolítica “indirecta”, cuando se enfrentan estas enzimas a
una suspensión de GR y yema de huevo, donde los lisofosfolípidos generados de su acción son
capaces de lisar los hematíes por su acción detergente.
MATERIALES:
PREPARACIÓN DE REACTIVOS:
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Química Biológica I - 2013
APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:
Esquema
(indique lo que
observa luego del
centrifugado,
sobrenadante y pellet)
¿Qué ocurrió en el
tubo?
¿Qué se comprueba
en este tubo?
CONCLUSION GENERAL:
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 3
CUANTIFICACION DE PROTEINAS
OBJETIVOS:
El trabajo práctico consistirá en realizar curvas de calibración de los distintos métodos a evaluar y
determinar la concentración de proteínas en suero y en una muestra incógnita.
Fundamento: La presencia de aminoácidos aromáticos en las proteínas da como resultado que éstas
tengan un máximo de absorción a 280 nm; la comparación de los valores de absorción a esta
longitud de onda de la muestra frente a la de un estándar proporciona un método sensible de
cuantificación.
MATERIALES:
TUBO B 1 2 3 4 5 6 S M
Testigo (ml) - 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 - -
S. fisiol. (ml) 5.0 4.5 4.0 3.0 2.0 1.0 - - -
Muestra (ml) - - - - - - - 1 1
Leer directamente Abs. a 280 nm
Abs 280
Abs - AbsB
C (mg/ml)
Fundamento: este método constituye una forma rápida y confiable para la determinación de
proteínas. Se basa en la cuantificación de la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie a una
proteína desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína
estándar. El complejo colorante-proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm.
Solución de Azul Brillante de Coomassie: 600 mg de Azul brillante de Coomassie G-250 se
disuelven en 1 l de ácido perclórico 2%. Filtrar con papel de filtro. Esta solución es estable
indefinidamente.
MATERIALES:
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Química Biológica I - 2013
B
TUBO 1 2 3 4 5 6 S M
Testigo (ml) - 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 - -
S. fisiol.
5.0 4.5 4.0 3.0 2.0 1.0 - - -
(ml)
transferir 1.5 ml de cada una de las soluciones a tubos limpios - -
Muestra
- - - - - - - 1.5 1.5
(ml)
Rvo.
Coomassie
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Blue (ml)
Agitar, esperar 2 minutos. Leer Abs a 595 nm antes de 1 hora
Abs 595
Abs - AbsB
C (mg/ml)
CALCULOS Y RESULTADOS:
GRAFICOS:
Para cada método de dosaje utilizar muestra incógnita sin diluir y muestra de suero diluida tal como
se indica en la siguiente tabla:
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Química Biológica I - 2013
APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:
Cálculos y resultados:
Observaciones y Discusión:
CONCLUSIONES:
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Química Biológica I - 2013
TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
Fundamentos:
La filtración en gel es un método de cromatografía líquida conocido también como
cromatografía de exclusión molecular. La estructura del gel contiene poros de diámetro variable
hasta un tamaño máximo. Las moléculas de la muestra pasan a través de la columna, de tal modo
que las que son más grandes que los poros se excluyen de las partículas del gel. Las moléculas más
pequeñas, sin embargo, penetran en el gel en una extensión variable según su tamaño, retardando así
su paso a través de la columna. La elución, por tanto va en orden decreciente de tamaños.
Existen en el mercado una gran variedad de medios utilizables para la filtración en gel, se
clasifican generalmente según su límite de exclusión, que es el peso molecular por encima del cual
todas las moléculas se excluyen de la estructura del gel. El Sephadex, es el medio utilizado
originalmente, se compone de dextrano (un polímero lineal de glucosa) que se modifica para
obtener distintos grados de entrecruzamiento, lo que determina el tamaño del poro del material. Es
un polímero fuertemente hidrofíIico que se hincha considerablemente en agua: por lo tanto, antes de
que se prepare la columna, el gel debe hidratarse completamente.
Materiales:
TÉCNICA OPERATORIA:
1. Armar la columna cromatográfica, lavar la misma con 5 ml de buffer fosfato antes de la
siembra.
2. De la solución de albúmina y glucosa se tomarán 0,5 ml para sembrar en la columna.
3. Desde el momento de la siembra se recogerán 10 fracciones de 0,5 ml c/u aproximadamente
en tubos de ensayo numerados.
4. Pruebas Cualitativas:
NOTA: La columna no debe secarse en ningún momento, para ello debe agregarse el buffer
constantemente.
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Química Biológica I - 2013
Fundamentos:
El intercambio iónico es un intercambio reversible y estequiométrico de iones entre una fase
sólida iónica y una fase líquida externa, sin cambio sustancial en la estructura del sólido.
Las fases sólidas usadas son por lo general resinas o redes tridimensionales de cadenas
poliméricas entrecruzadas con cortas cadenas que contienen grupos funcionales ionizados
(intercambiadores). Así existe una fase insoluble pero permeable, que contiene grupos iónicos
fijados a su estructura, mientras que especies de cargas opuestas están libres para moverse dentro
del líquido externo y ser reemplazadas por otros iones de igual carga, manteniendo la
electroneutralidad. Estas especies que se sustituyen son llamadas contraiones.
Los intercambiadores se denominan aniónicos o catiónicos según tengan afinidad por iones
negativos o positivos respectivamente. La DEAE celulosa pertenece al primer grupo, posee grupos
dietil-aminoetil.
Las separaciones en los intercambiadores iónicos se efectúan generalmente por variaciones de la
fuerza iónica o pH del eluyente o ambas cosas a la vez.
Materiales:
TÉCNICA OPERATORIA:
1. Armar la columna cromatográfica, lavar la misma con 5 ml de buffer fosfato antes de la
siembra.
2. Sembrar 0,2 ml de la solución de trabajo en la columna. Recolectar 1.5 ml de eluido en cada
tubo de ensayo. Agregar 10 ml de buffer fosfato 50 mM PH=7. Luego, agregar 10 ml de buffer
fosfato 50 mM pH=7, NaCl 500 mM. Anotar en que tubo se realizó el cambio de buffer.
Mantener continuamente en la jeringa un nivel de buffer de 0.5 cm por encima de la columna
de DEAE-celulosa.
3. Pruebas Cualitativas:
Albúmina: Se colocará en cubetas pequeñas, en primer lugar una gota de Azul
brillante de Coomassie seguido de una gota del eluido. Reacción positiva: color
azul.
Glucosa: Agregar al resto de eluído 1 ml de Reactivo de Benedict. Calentar el tubo
a baño maría aproximadamente 10’. Reacción positiva: precipitado rojo-naranja.
Reacción positiva: precipitado rojo-naranja.
NOTA: El trabajo práctico finaliza desarmando la columna con DEAE-celulosa. Regenerar la resina
usada agregando volúmenes iguales de NaOH 1 N y HCl 1 N, en ese orden. Luego lavar la misma
con agua (tres veces).
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Química Biológica I - 2013
INFORME-TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
SEPARACIÓN DE MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO
APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:
Anotar los resultados cualitativos en la tabla. Indicar el tubo en el que se realiza el cambio de
buffer.
-- precipitado: no visible / sin color, + poco, ++ intermedio, +++ gran cantidad
Observaciones y Discusión
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Química Biológica I - 2013
CONCLUSIONES:
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Química Biológica I - 2013
TRABAJO PRÁCTICO Nº 5
OBTENCIÓN DE ACIDO DESOXIRIBONUCLEICO (ADN) BACTERIANO
OBJETIVO:
Fundamentos:
La extracción del ADN celular es una etapa clave en muchos procedimientos de biología molecular
y aplicaciones de ingeniería genética. El método varía dependiendo de la célula o tejido desde donde
se necesita extraer el ADN, sin embargo, cualquier protocolo tiene las siguientes etapas básicas.
Primero las células deben ser lisadas (rotas) para liberar el núcleo (si
está presente). El núcleo también debe ser roto para liberar el ADN, en este punto debe ser
protegido de enzimas que podrían degradarlo (nucleasas). Una vez que el ADN es liberado, debe ser
precipitado con alcohol (etanol) para purificarlo y concentrarlo. Dependiendo de las
aplicaciones posteriores, puede ser necesario someter el ADN a etapas de purificación adicionales.
Usualmente el ADN extraído se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa y/o
espectrometría UV.
Materiales:
TÉCNICA OPERATORIA:
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Química Biológica I - 2013
INFORME-TRABAJO PRÁCTICO Nº 5
OBTENCIÓN DE ACIDO DESOXIRIBONUCLEICO (ADN) BACTERIANO
APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:
Observaciones en el gel
MPM Muestra
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Química Biológica I - 2013
TRABAJO PRÁCTICO Nº 6
ENZIMAS – Parte I
OBJETIVO GENERAL: Estudiar el comportamiento cinético de la enzima ureasa contenida en un
extracto crudo obtenido a partir de harina de soja.
Objetivos Parte I:
- Determinar KM y VM para la enzima ureasa en buffer fosfato de pH 7.
- Comprobar el uso de la ureasa en determinación de urea en muestras biológicas
(suero humano).
INTRODUCCIÓN:
La ureasa cataliza la hidrólisis específica de la urea:
La ureasa existe en muchas bacterias, varias especies de levaduras y en grandes plantas. Dos de las
mejores fuentes son: porotos (Canavlia ensiformis) del cual ha sido cristalizada y minuciosamente
estudiada, y Bacillus pasteurii. En este estudio se trabajará con ureasa presente en harina de la soja
(Glycine max).
OH-
NH3 + fenol + NaClO =======> azul de indofenol
• Suspender agitando enérgicamente, 500 mg de harina de soja en 5mI de buffer Pi (l0mM, PH=7).
• Centrifugar 3000 rpm 10’
• Trasvasar 0,25 ml del sobrenadante a un tubo de ensayo y agregar 9,75ml de buffer, (dilución 1/40
de ureasa, volumen total: 10ml).
2) CURVA DE CALIBRACIÓN
Realizar una curva de calibración para NH4 + según el protocolo presentado, con el objeto de
expresar los resultados de actividad enzimática en unidades internacionales.
Reactivos
1. NH4Cl 20 mM
2. Reactivo 1: fenol 10 ml
nitroprusiato de sodio 50 mg
H2O c.s.p. 200 ml
3. Reactivo 2: NaOH (10 N) 14 ml
Hipoclorito de sodio comercial 10 ml
H2O c.s.p. 200 ml
4. Buffer Pi (l0mM, PH=7)
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Química Biológica I - 2013
Blanco 1 2 3 4 5
VNH4 Cl (ml) - 0.5 1 1.5 2 2.5
V agua (ml) 10 9.5 9 8.5 8 7.5
Cf (mM) - 1 2 3 4 5
3) DETERMINACIÓN DE KM y VM
Para estudiar la variación de la velocidad en función de la concentración de sustrato, trabajar con 1
ml de ureasa 1/40, fijar el tiempo de incubación en 10 minutos, variar la concentración de sustrato
(6 puntos) utilizando Vf = 5ml y como sustrato una Solución de urea 6.10־² M.
Trabajar según el protocolo, respetando el orden de agregado de buffer, ureasa y urea.
Tubo
B1 1 2 3 4 5 6
buffer (ml)
1 3.8 3.6 3 2 1 -
ureasa (ml) - 1 1 1 1 1 1
La urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en la mayoría de los líquidos
biológicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico. En general una
elevación de la concentración sérica de urea se interpreta como una posible disfunción renal.
En este trabajo utilizamos la actividad catalítica de la ureasa para cuantificar la urea en la muestra
de suero.
Valores de referencia: (0,20 - 0,40) g/l
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Química Biológica I - 2013
Técnica operatoria:
B T suero
Agua destilada 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Suero - - 20 µl
Testigo urea (0.6 g/l) - 20 µl -
Ureasa (extracto 1 gota 1 gota 1 gota
crudo)
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Química Biológica I - 2013
1) CURVA DE CALIBRACIÓN
Tubo Blanco 1 2 3 4 5
C (mM) - 1 2 3 4 5
Absorbancia
Abs - Bco
2) DETERMINACIÓN DE KM y VM
• Con los datos de Abs., teniendo en cuenta la curva de calibración, calcular la velocidad de
transformación de sustrato en UI/L (µmol de sustrato transformados por minuto por litro de
extracto crudo diluido 1/40). Volcar los resultados en la siguiente tabla:
Tubo B1 1 2 3 4 5 6
C urea (mM)
Absorbancia
Abs - Bco
V (UI/L)
1/ Curea
1/ V
Observaciones y Discusión
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Química Biológica I - 2013
CONCLUSIONES
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Química Biológica I - 2013
TRABAJO PRÁCTICO Nº 7
ENZIMAS – Parte II
INTRODUCCIÓN:
La ureasa cataliza la hidrólisis específica de la urea:
La ureasa existe en muchas bacterias, en varias especies de levaduras y en grandes plantas, dos de
las mejores fuentes son: porotos (Canavlia ensiformis), del cual ha sido cristalizada y
minuciosamente estudiada, y Bacillus pasteurii. En este estudio se trabajará con ureasa presente en
la harina de soja (Glycine max).
OH-
NH3 + fenol + NaClO =======> azul de indofenol
Reactivos:
Urea ............................................................................ 1M
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Química Biológica I - 2013
Se determinará la actividad enzimática a distintos pH (buffers de pH 1.0 - 3.0 - 4.0 - 5.0 – 6.0 - 7.0
- 8.5 – 10.0 – 12.0) siguiendo el protocolo indicado y en el orden siguiente:
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Química Biológica I - 2013
APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:
pH
B 1 3 4 5 6 7 8.5 10 13
del medio
Abs
530 nm
Abs530 - B
Temperatura
B 0 10 25 37 50 70 100
(ºC)
Abs
530 nm
Abs530 - B
Gráfico de la absorbancia medida a 530 nm vs. temperatura (°C) (pegar en reverso de la hoja)
Observaciones y Discusión
CONCLUSIONES:
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