Workshop Anvisa 03-12-2013 PDF

Workshop de Validação de Metodologia
Analítica
Ministrante: Professora Antonia Maria Cavalcanti de Oliveira

Dezembro - 2012
Objetivos da Palestra
• Apresentar a teoria de validação de métodos à luz da Anvisa,
traçando paralelo com outras normas nacionais e
internacionais;
• Estimular análise crítica a respeito do tema;
• Mostrar a importância da leitura de artigos científicos, pois

nenhum tema é esgotado por si só em regulamentos
técnicos;
• Na legislação encontramos “o que deve ser feito” e “não o

como fazer”;
• Refletir a respeito da construção do conhecimento em nossa

prática diária e a contribuição desta para o regulatório.
Introdução à Validação
Validação
Definição:
Validação é um ato documentado que atesta que qualquer
procedimento, processo, equipamento, material, atividade
ou sistema realmente e consistentemente leva aos
resultados esperados. (RDC nº 17/2010)
Validação
“Os estudos de validação são parte essencial das BPF e

devem ser conduzidos de acordo com Protocolos pré-
definidos e aprovados. Relatório (...) contendo os
resultados e conclusões devem ser preparados e
arquivados.” (RDC nº 17/2010)
Plano Mestre de Validação
“Planejamento de todas as atividades de validação com os
objetivos, procedimentos, prazos e responsabilidades
definidos.”
Deve conter no mínimo: RDC nº 17/2010
I - uma política de validação;
II - estrutura organizacional das atividades de validação;
III - sumário (situação atual e programação);
IV - modelos de documentos ou referência a eles;
V - planejamento e cronograma;
VI - controle de mudanças; e
VII - referências a outros documentos existentes.
Protocolo de Validação
 É um plano escrito que descreve como a validação será conduzida,
definindo os critérios de aceitação.
 Inclui:
 Lista de equipamentos
 Parâmetros de teste
 Desenho experimental
 Dados que devem ser coletados e medidos
 Documentos inerentes
 Pontos de decisão e responsabilidades

Relatório de Validação
É um resumo ou sumário do processo de

validação, contendo todos os dados e resultados
obtidos. Deve concluir se os critérios de aceitação
foram atingidos e relatar as não conformidades.
Validação da Metodologia
Analítica
Validação de Metodologia Analítica
Definição:
É o processo pelo qual se estabelece, através de

estudos laboratoriais, que as características de
performance do método, também denominadas
parâmetros de validação, apresentam os requisitos
necessários para aplicação analítica pretendida.
(USP 36).
Objetivo:
“A validação dos procedimentos analíticos tem por
objetivo demonstrar que os métodos de ensaio
utilizados apresentam resultados que permitem avaliar
objetivamente a qualidade dos medicamentos, conforme
os parâmetros especificados.”
A Anvisa ressalta a importância da qualidade analítica

dos resultados como um dos instrumentos
fundamentais para a proteção e promoção da saúde
da população. (Guia para qualidade em química
analítica)
Uma das ferramenta que garante a qualidade analítica dos

resultados. Permite:
 Verificar adequação ao uso;

 Identificar fontes potenciais de erros;
 Conhecer as variáveis críticas;
 Apresentar prova de que o método pode ser usado
para tomada de decisão;
 Satisfazer especificações / requisitos legais;
EURACHEM, 1998
Definições
Método Normalizado:
É aquele desenvolvido por um organismo de

normalização ou outras organizações, cujos métodos
são aceitos pelo setor técnico em questão. (INMETRO -
DOQ-CGRE-008/2011)
Estão aqui incluídos os Métodos Farmacopéicos.

Definições
Método Não Normalizado:
É aquele desenvolvido pelo próprio laboratório ou outras

partes (por exemplo: pelo laboratório produtor do
medicamento), ou adaptados a partir de métodos
normalizados e validados. (INMETRO - DOQ-CGRE-
008/2011)
Quando Efetuar a Validação do Método?
Segundo INMETRO (DOQ-CGRE-008/2011).
 Método não normalizado

 Método criado/desenvolvido pelo próprio laboratório
 Método normalizado usado fora do escopo indicado
 Ampliações / Modificações dos métodos normalizados
Quando Efetuar a Validação do Método?
Segundo a Anvisa (RE 899/2003).
 No caso de metodologia analítica não descrita em

farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente
reconhecido pela Anvisa, deverá ser validada.
Quando Efetuar a Revalidação do Método?
Segundo a RE 899/2003.
 A metodologia analítica deverá ser revalidada:
Mudanças na síntese da substância ativa;
Mudanças na composição do produto acabado;
Mudanças no procedimento analítico.
Determinadas outras mudanças podem requerer validação.

Modificação x Ajuste
Revisão: Pharmacopeial Forum 31(3), pag. 834 – 835 .
 pH da fase móvel (CLAE) + 0,2 unidades,

 Concentração de sais no tampão (CLAE) + 10% (absoluto),
 Relação de componentes da fase móvel (CLAE) + 30% (relativo),
 Nenhum componente pode ser reduzido a zero (CLAE) ,
 Comprimento de onda (CLAE) + 3 nm,
 Comprimento da coluna (CLAE, CG) + 70%,
 Diâmetro interno da coluna (CLAE) + 50%, (CG) + 25%,
 Velocidade de fluxo + 50%,
Os Métodos Normalizados Devem Ser Validados?
No caso de metodologias analítica descrita em

farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente
reconhecidos pela ANVISA, a metodologia será
considerada validada. (RE 899/2003)
O laboratório deve confirmar que tem competência para

aplicar o método de modo apropriado e que atinge o
pretendido e que opera bem sob as condições normais de
uso.(DOQ-CGCRE-008-INMETRO/2011)
Para usar metodologia analítica descrita na USP-NF

é necessário verificar sua adequação nas
condições atuais de uso.
Estratégia para Validação de Métodos Normalizados
Definir escopo da aplicação
N
Validação
O método atende ? completa
Verificar competência do
laboratório
Documentar resultados
O que é Verificação?
 Definição:
Evidência documentada que um método previamente

validado desempenha como pretendido, no ambiente em
que está sendo aplicado.
Verificação da competência analítica.
 Segundo a RDC Nº. 31, DE 11 DE AGOSTO DE 2010

Validação parcial para método de teor.
 Especificidade, linearidade, exatidão, precisão
(repetibiliddae e intermediária) e intervalo.
 Segundo o FDA.
 Verificar a especificidade, a estabilidade da solução da

amostra e a precisão intermediária.
Estratégia para Validação de Métodos Não
Normalizados
Validação
Otimização Desenvolvimento
Desenvolvimento/Otimização
Resultado obtido com colunas cromatográficas diferentes.
Coluna T k’ N
cromatográfica
C18 1,63 8,93 1969
C8 1,27 9,76 5175
T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos teóricos.

Resultados referentes à variação proporção da fase móvel.
Proporção da fase móvel Rt T k’ N
75:25 2,93 1,51 4,87 3320
80:20 3,79 1,39 6,58 4055
85:15 5,32 1,27 9,65 5249
Rt = tempo de retenção; T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos
teóricos.
Resultados referentes à variação de pH da fase móvel (85:15).
pH Rt T k’ N
5,0 5,44 1,29 9,88 5208
6,0 5,45 1,28 9,89 5252
6,5 5,38 1,28 9,77 5165
Rt = tempo de retenção; T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos
teóricos.
Segundo a RE 899.
No caso de metodologia analítica não descrita em farmacopéias ou
formulários oficiais.
Especificidade e Seletividade
Linearidade
Intervalo
Exatidão Repetibilidade De acordo com
Precisão Precisão intermediária a classificação
do teste segundo
Reprodutibilidade
sua finalidade.
LQ e LD
Robustez
Classificação dos testes segundo sua finalidade
Categoria Finalidade do teste
I Testes quantitativos para determinação do
princípio ativo em produtos farmacêuticos ou
matérias-primas.
II Testes quantitativos ou ensaio limite para
determinação de impurezas e produtos de
degradação em produtos farmacêuticos ou
matérias-primas.
III Testes de performance (por exemplo: dissolução,
liberação do ativo)
IV Testes de identificação.
Planejamento (passos) da Validação.
 Definir o objetivo do método;
 Definir os parâmetros de desempenho e critérios de aceitação;
 Desenvolver o PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO;
 Definir os experimentos de validação – conhecer bem o método
antes de iniciar a validação;
 Executar os experimentos preliminares (definição dos testes de
conformidades do sistema);
 Ajustar os parâmetros do método se necessário;
 Realizar os experimentos completos de validação - Executar o
protocolo de validação;
 Desenvolva POP para a execução do método, na rotina;
 Prepare o RELATÓRIO DE VALIDAÇÃO.
Ensaios necessários para a validação do método.
Parâmetro Categoria I Categoria II Categoria III Categoria IV
Quantitativo Ensaio limite
Especificidade SIM SIM SIM * SIM
Linearidade SIM SIM NÃO * NÃO
Intervalo SIM SIM * * NÃO

Repe SIM SIM NÃO SIM NÃO
Precisão Inter
** ** NÃO ** NÃO
LD NÃO NÃO SIM * NÃO
NÃO SIM NÃO * NÃO

LQ
Exatidão SIM SIM * * NÃO
SIM SIM SIM NÃO NÃO

Robustez
* pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.

** se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária.
Teste de Adequação do Sistema
 Parâmetros e recomendações para o teste de verificação da

adequação do sistema (SHABIR, 2003)
Parâmetros Recomendações
Fator de capacidade (k') O pico deve estar bem resolvido de outros

picos e do volume morto k'  2,0.
Repetitividade É desejável um DPR  1% para N  5
Tempo de retenção relativo Não é essencial se a resolução é declarada
Resolução (R) R  2 entre o pico de interesse e o potencial

interferente que elui mais próximo
Fator de cauda (T) T2
Número de pratos teóricos (N) Em geral deve ser  2000

Definição dos Parâmetros de
Validação
Definição dos Parâmetros de Validação
 Especificidade
É a capacidade que o método possui de medir exatamente
um composto em presença de outros componentes tais como
impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.
 Para análise qualitativa (teste de identificação) é necessário

demonstrar a capacidade de discriminação do método.
 Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas

comparação dos resultados obtidos de amostras contaminadas
(impurezas ou excipientes) com amostras não contaminadas –
demonstrar que o resultado do teste não é afetado.
 Especificidade
Utilizar amostras
Impureza ou armazenadas sob
produto de condições de estresse
degradação não (Ex: luz, calor umidade,
disponíveis hidrólise ácida/básica,
oxidação).
 Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções

necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos.
 Detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas.

Plano Experimental
 Especificidade
Análise Qualitativa – Identificação
 Preparar um placebo (matriz),

 Contaminar o placebo com o material de referência,
Comprovar o resultado positivo para o placebo contaminado com

o material de referência e o resultado negativo para a matriz
em branco.
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Cromatograma do Padrão 100%.
3
50
3
00
O
5.28,Didanosina
2
50
N
NH
2
00
HO N N
1
50 O
Intensity(mV)
1
00
5
0
3.10
2.94
2.41
4.39
0
0 1 2 3 4 5 6 7
R
ete
nti
onT
ime(
min
)
Cromatograma do Placebo.
4
00
3
50
3
00
2
50
2
00
1
50
Intensity(mV)
1
00
5
0
3.29
0 1 2 3 4 5 6 7
R
ete
nti
onT
ime(
min
)
Cromatograma do Placebo contaminado.
3
50
3
00
O
5.29,Didanosina
2
50
N
NH
2
00
HO N N
1
50
O
Intensity(mV)
1
00
5
0
3.10
2.94
3.33
2.41
0 4.39
0 1 2 3 4 5 6 7
R
ete
nti
onT
ime(
min
)
Plano Experimental
 Especificidade
 Impurezas e produtos de degradação não disponíveis, submeter

amostras a condições de estresse: exposição a temperatura,
exposição a luz, hidrólise ácida (HCl 0,1N), hidrólise alcalina
(NaOH 0,1N) e Oxidação (H2O2 3%). Comparar os resultados obtidos
com as amostras degradadas e não degradadas.
Resolução entre picos adjacentes, do componente principal e outros

componentes (Rs) > 2.
Cromatograma obtido após exposição à temperatura de 1000 C
300
250
5.48,Didanosina
200
150
Intensity(mV)
100
50
2.48
3.18
3.03
4.83
0
0 1 2 3 4 5 6 7
RetentionTime(min)
Cromatograma obtido após exposição à solução de ácido clorídrico 0,1N.
2.49
4
00
3
00
2
00
Intensity(mV)
1
00
3.26
0 1 2 3 4 5 6 7
R
ete
nti
onT
ime(
min
)
Cromatograma obtido após exposição à solução de peróxido de
hidrogênio 3 %
400
1.62
350
2.51
300
250
200
150
Intensity(mV)
100
5.66,Didanosina
50
2.30
3.26
3.96
0.24
4.59
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Ret
enti
onT
ime(min
)
Cromatograma após injeção da solução de hipoxantina
8
0
7
0
6
0
2.54,Hipoxantina
5
0
4
0
Intensity(mV)
3
0
2
0
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
R
ete
nti
onT
ime(
min
)
Cromatograma obtido após injeção da solução de Didanosina
contaminada com hipoxantina, R= 13,51
350
300
250
5.79,Didanosina
200
150 2.51,Hipoxantina
Intensity(mV)
100
50
3.34
0 1 2 3 4 5 6 7
RetentionTime(min)
Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar
que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à
concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado.
 Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise

de, no mínimo, 5 concentrações diferentes.
 Estas concentrações devem seguir os intervalos da tabela a

seguir:
Limites percentuais do teor do analito que devem estar contidos no
intervalo de linearidade para alguns métodos analíticos.
Ensaio Alcance
Determinação quantitativa do analito em De 80% a 120% da concentração teórica
matérias-primas ou em formas farmacêuticas do teste.
Determinação de impurezas Do nível de impureza esperado até 120%

do limite máximo especificado. Quando
apresentarem importância toxicológica ou
efeitos farmacológicos inesperados, os
limites de quantificação e detecção devem
ser adequados às quantidades de
impurezas a serem controladas.
Uniformidade de conteúdo De 70% a 130% da concentração teórica

do teste.
Ensaio de dissolução De ± 20% sobre o valor especificado para
o intervalo. Caso a especificação para a
dissolução envolva mais de um tempo, o
alcance do método deve incluir –20%
sobre o menor valor e +20% sobre o maior
valor.
Plano Experimental
 Linearidade
 Preparar uma solução mãe da substância química de

referência e a partir desta, diluições a fim de obtermos
soluções em cinco níveis de concentração. Por exemplo:
50 %, 75 %, 100 %, 125 % e 150 %, do valor rotulado.
Cálculos Estatísticos
Linearidade
Calcular a Média, Variância o DP e o DPR . Prosseguir com

os seguintes cálculos.
 Elaborar Curva de Calibração

 Calcular coeficiente angular (b)
 Calcular coeficiente linear (a)
 Cálculo do coeficiente de correlação linear (r)
 Cálculo do erro padrão da estimativa (desvio padrão residual), (Se )
 Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE)
 Determinação de Valores Aberrantes.
 Um resultado analítico afetado por erro grosseiro difere, quase

sempre de modo visível, dos demais resultados do conjunto das
determinações executadas (replicatas) em paralelo na mesma amostra.
 Tais resultados são denominados aberrantes, comprometendo a

precisão e a exatidão do resultado final.
 Portanto o tratamento estatístico dos dados inicia-se pela detecção
de valores aberrantes, que pode ser realizado através do teste de
Grubbs.
 Este teste estatístico pode ser aplicado quando se deseja verificar se

o menor valor ou o maior valor é aberrante, denominado teste de
Grubbs para um valor aberrante, onde n  3.
 Teste de Grubbs.
Onde :
 xi  x  x i = valor suspeito de ser aberrante.

G 
s x = média dos valores obtidos.
s = desvio padrão dos valores obtidos.
Em função do número de replicatas (n) e um nível de significância .
Se G calculado > G tabelado ----- valor suspeito é considerado

aberrante, e então descartado.
Se G calculado < G tabelado ------- valor suspeito não é considerado
aberrante.
 Estudo de caso.
Determinação de valor aberrante. Teste de Grubbs
Padrão 50 % Padrão 75 % Padrão 100 % Padrão 125 % Padrão 150 %
Replicata 1 49,94 75,10 100,18 124,35 148,43
Replicata 2 49,88 75,00 100,07 124,31 148,44
Replicata 3 49,99 75,14 99,78 124,15 148,25
Replicata 4 49,96 73,23 99,95 124,04 148,26
Replicata 5 49,99 75,00 99,93 124,43 148,23
Replicata 6 49,99 75,09 100,10 124,30 148,19
 xi  x  73 , 23  74 , 76  Gcalc > Gtab

G  G   2 , 04
s 0 , 75
Aberrante, portanto, é descartado.
x = 74,76 s = 0,75 Gtab = 1,89
 Desvio padrão (s ou DP).
Desvio padrão é igual a raiz quadrada positiva da variância. Deve
ser expresso com dois algarismos significativos.
 x 
2
 x
s 
i
n 1
 Variância (s2 ou V).

A variância é calculada dividindo o somatório dos quadrados dos
desvios de cada valor em relação à média, pelo número de graus de
liberdade (n-1).
 x 
2
 x
s 
2 i
n 1
Homocedasticidade
Verificar a homocedasticidade, ou seja, a independência da variância

das respostas do método com as concentrações das amostras
analisadas (homogeneidade da variância dos resíduos) pelo teste de
Cochran, aplicando a fórmula que se segue.
2
s maior Onde:
C cal 

2
s
2
s maior = maior variância

2
s = somatório das variâncias
Homocedasticidade:
Se C calculado < C tabelado Homocedasticidade
Se C calculado > C tabelado Heterocedasticidade
Se o critério de homocedasticidade for aceito, a regressão linear é

executada pelo método dos mínimos quadrados, que estima qual a
melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente a
partir da curva de calibração.
Se não houver relação linear, realizar transformação matemática

Homocedasticidade
2
s maior
C cal 

2
s Como C calculado 0,344 é menor que
C tabelado 0,506.
2
s maior = 0,020 O critério de homocedasticidade foi
aceito.

2
s = 0,058
Aplicando a fórmula, C calculado = 0,344.

 Curva de calibração:
Realizada análise de regressão deve-se apresentar o coeficiente de

correlação linear (r), a inclinação (coeficiente angular), o intercepto
da reta (coeficiente linear), soma residual dos quadrados mínimos
da regressão linear e desvio padrão. A regressão linear é
representada por uma equação do tipo:
yˆ  a  bx
Onde, ŷ é o valor da resposta para uma dada concentração x do

analito.
 Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE).
SSE    y i  yˆ i 
2
Onde,
SSE = soma dos quadrados dos resíduos.
yi = valor observado experimentalmente (valor medido).
ŷ i = valor previsto pela reta (valor projetado).

 Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE).
 O critério da reta de regressão é encontrar os coeficientes a e b,

que minimizem a soma dos quadrados dos resíduos, procedimento
denominado método dos quadrados mínimos.
 Se os pares de valores estiverem contidos na reta ajustada a

soma dos quadrados dos resíduos será igual a zero e a explicação
da reta ajustada será completa (reta ideal), portanto o objetivo é que
a soma dos quadrados dos resíduos seja mais próxima de zero
possível.
 Cálculo do erro padrão da estimativa (Se).
  yi  yˆ i 
2
se 
n2
Onde,
s e = erro padrão da estimativa (desvio padrão residual)
y i = valor observado experimentalmente (valor medido)
ŷ i = valor previsto pela reta (valor projetado)
 = n -2 graus de liberdade
 Cálculo do erro padrão da estimativa (Se).
 O erro padrão da estimativa mede a dispersão dos desvios,

denominados resíduos, ao redor da reta de regressão.
 O conceito do erro padrão da estimativa ou desvio padrão

residual, é equivalente ao do desvio padrão que mede a
variabilidade dos valores da amostra ao redor da média aritmética
desses valores.
 Atendidas as premissas de regressão linear, se espera que

aproximadamente 95 % dos valores da amostra y se encontrem no
intervalo de + 2 x se de seus respectivos valores projetados pela reta
de regressão , ou seja, que os valores dos resíduos se encontrem
neste intervalo (+ 2 x se).
 Cálculo da Linearidade usando a Planilha Excel.
 Estudo de caso.
Resultado:
Erro Padrão da Estimativa ou Desvio Padrão Residual (Se )
Analista 1:
Estatística de regressão
R múltiplo 0,999972427
R-Quadrado 0,999944855
R-quadrado ajustado 0,999940613
Erro padrão 0,27788902
Observações 15
Critério de Aceitação:
Os valores dos resíduos devem-se encontrar no intervalo (+ 2 x Se ).
 Resultado dos resíduos.
Analista 1:
Identificação da am ostra: Padrão Lamivudina INCQS
Concentração Y previsto Resíduos
1 50,32 -0,23
2 50,32 -0,30
3 50,32 -0,23
4 74,95 0,18
5 74,95 0,10
6 74,95 0,16
7 99,59 0,44
8 99,59 0,35
9 99,59 0,44
10 124,22 -0,22
11 124,22 -0,23
12 124,22 -0,29
13 148,85 0,06
14 148,85 -0,18
15 148,85 -0,05
Como pode ser observado na tabela o resultado dos resíduos foi satisfatório.
Encontram-se dentro do intervalo de + 2 x 0,28 = + 0,56.
Estudo dos resíduos e dos valores medido e previsto para y.
Variável X 1 Plotagem de resíduos
0,50
Resíduos
0,00
0 200 400 600 800
-0,50
Variável X 1
PLOTAGEM DE AJUSTE DE
LINHA.
200
Y
Y
0
Y previsto
0 200 400 600 800
Variável X 1
 Exatidão.
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos

resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor
verdadeiro.
 Para o Fármaco:
 Aplica-se a metodologia analítica proposta, na análise de uma

substância de pureza conhecida (padrão de referência).
 Ou compara-se os resultados obtidos com aqueles resultantes

de uma segunda metodologia bem caracterizada, cuja
exatidão tenha sido estabelecida.
 Exatidão.
 Para o Produto (Forma Farmacêutica).
 Analisa-se uma amostra, na qual foi adicionada uma

quantidade conhecida do fármaco a uma mistura dos
componentes do medicamento (placebo contaminado).
 No caso de todos os componentes do medicamento não estarem

disponíveis, aceita-se a análise pelo método de adição de padrão,
no qual adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de
referência) ao medicamento.
 Exatidão.
 Para Impurezas.
 Utiliza-se o método de adição de padrão, no qual adiciona-se

quantidades conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradação
ao medicamento ou ao fármaco.
 No caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas

e/ou produtos de degradação, aceita-se a comparação dos
resultados obtidos com um segundo método bem caracterizado
(metodologia farmacopéica ou outro procedimento analítico
validado).
 Exatidão.
 A exatidão do método deve ser determinada após o

estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da
especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de:
no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o

intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três)
concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas
cada.
 A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média
determinada experimentalmente e a concentração teórica
correspondente, acrescida do intervalo de confiança.
Plano Experimental
 Exatidão.
 Preparar uma solução mãe concentrada e efetuar as diluições na

matriz a fim de obter três concentrações diferentes. Partir da solução
mãe também para a calibração, para evitar erros de pesagem.
 Efetuar nove determinações, em três concentrações diferentes,

com três réplicas cada, por exemplo: 75%, 100% e 125% do valor
rotulado, em triplicata de injeção.
 Realizar as análises no mesmo dia usando o mesmo analista.

 Exatidão.
É geralmente expressa como porcentagem de recuperação (R%) da
substância de interesse, calculada segundo a fórmula, acrescida
dos intervalos de confiança.
x  100
R %  
x Onde,
R %  = porcentagem de recuperação.
x = média dos resultados (valor determinado experimentalmente).
x = concentração teórica correspondente (valor esperado).
 Exatidão.
Quando não há possibilidade de preparar matriz limpa da amostra,
adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de
referência) ao medicamento, para determinar a Exatidão, que é
calculada segundo a fórmula.
100   x ca  x sa 
R %  
xa Onde,
R %  = porcentagem de recuperação
x ca = conc. medida na amostra com adição do analito ou padrão
x sa = conc. medida na amostra sem adição do analito ou padrão
x a = concentração adicionada
 Exatidão.
 Calcular a Média,
 Calcular o Desvio padrão (DP),
 Calcular o Desvio padrão relativo (DPR),
 Calcular o percentual de Recuperação,
 Calcular o Intervalo de confiança.
Critérios de Aceitação - Exatidão

Para ensaios de teor (maior componente) a recuperação média
deve ser de 100% + 2% para cada concentração na faixa de 80 a
120% da concentração alvo ou de estudo.
 Intervalo de confiança (IC).
É o intervalo dentro do qual o valor verdadeiro se encontra.
ts Portanto:
  x  = valor verdadeiro
n
x = média dos valores obtidos
Onde,
s = desvio padrão
ts
IC  n = tamanho da amostra (número de replicatas)
n
t = valor tabelado, em função de:
n0 de graus de liberdade,  = n –1
nível de significância ().
 Exatidão.
Analista 1:
Identificação das amostras: Placebo contaminado - Lamivudina comprimido revestido
Concentração da 75% 100% 125%

amostra
Replicata A1 98,02 99,34 99,26
Replicata A2 98,31 99,48 99,18
Replicata A3 98,35 99,51 99,14
Replicata B1 100,71 98,32 99,44
Replicata B2 100,51 98,40 99,36
Replicata B3 100,56 98,39 99,42
Replicata C1 98,63 99,12 99,36
Replicata C2 98,68 99,38 99,38
Replicata C3 99,18 99,21 99,46
Média 99,22 99,02 99,33
DP 1,08 0,50 0,11
DPR 1,09 0,51 0,12
% Recuperação 99,22 99,02 99,33
IC +0,83 +0,38 +0,08
 Exatidão.
Nível de 75%. % R = 99,22 + 0,83%
ts
IC  2 ,306  1, 08
n IC    0 ,83
9
ttab = 2,306. Nível de 100%. % R = 99,02 + 0,38 %

 = n –1 = 8
2 ,306  0 ,50
IC    0 ,38
9
Nível de 125%. % R = 99,33 + 0,08 %

2 ,306  0 ,11
IC    0 , 08
9
Critérios de Aceitação - Exatidão
Critério De Aceitação : AOAC, 2000
Concentração Concentração Recuperação média

Fracional %
100 % 1,0 98 – 102
10 % 0,1 98 – 102
1% 0,01 97 – 103
0,1 % 0,001 95 – 105
0,01 % 0,000 1 90 – 107
1 ppm 0,000 001 80 – 110
10 ppb 0,000 000 01 60 – 115
 Precisão.
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados
obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla
de uma mesma amostra. Esta é considerada em três níveis.
 Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os

resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo
analista e mesma instrumentação.
 Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância

entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias
diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.
 Precisão.
 Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): concordância

entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como em
estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de
metodologia analítica, por exemplo, para inclusão de metodologia
em farmacopéias.
Estes dados não precisam ser apresentados para a

concessão de registro.
 Precisão.
 A repetibilidade do método é verificada por, no mínimo, 9

(nove) determinações, contemplando o intervalo linear do
método, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta,
com 3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a
100% da concentração do teste.
 Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um

mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.
Plano Experimental
 Precisão.
 Verificar a precisão nos níveis repetibilidade e precisão

intermediária. Efetuar seis determinações, a 100% do valor
rotulado, através da analise de três amostras diferentes.
 No nível repetibilidade realizar as seis análises, de cada uma

das amostras, no mesmo dia e com o mesmo analista.
 Para o parâmetro precisão intermediária, com as mesmas

amostras descritas acima, executar três tipos de comparação:
 Repetir as análises, usando um analista diferente.
 Repetir as analises, utilizando um equipamento diferente.
 Precisão.
 Repetibilidade
Calcular a Média,
Calcular o DP,
Calcular o DPR.
 Precisão Intermediária – Teste de F

 Calcular as variâncias (s2),
 Calcular o valor de F para cada uma das comparações utilizadas
para avaliação da precisão intermediária.
 Precisão. Amostra Laboratório A Laboratório B Laboratório C
A1 101,84 100,16 96,97
 Repetibilidade A2 102,61 100,52 97,32
B1 101,54 98,05 96,55
Calcular a Média, B2 101,71 98,26 96,78
Calcular o DP, C1 100,58 99,27 98,27
Calcular o DPR. C2 100,57 99,31 98,46
D1 101,85 98,56 96,41
D2 101,74 98,72 95,80
E1 101,18 98,52 96,35
E2 101,19 98,78 96,15
F1 100,54 99,00 96,83
Média 101,33 99,02 96,89
DP 0,67 0,73 0,79
DPR 0,66 0,74 0,82

 Precisão.
Repetibilidade
Critério de Aceitação segundo a RE 899/2003:
O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a

metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, do
tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores
superiores a 5% (RE 899).
 Critérios de Aceitação - Precisão
Fórmula empírica de Horwitz RSD r  2(1 - 0,5 log c). 0,67
Analito % Horwitz Calculado DPR r %

100 2 1,3
10 2,8 1,9
1 4 2,7
0,1 5,6 3,7
0,01 8 5,3
0,001 11 7,3
0,0001 16 11
0,00001 23 15
0,000001 32 21
0,0000001 45 30
c – concentração fracional: representa a concentração percentual

dividida por cem.
 Precisão Intermediária – Teste de F

 Calcular as variâncias (s2),
 Calcular o valor de F para cada uma das comparações

utilizadas para avaliação da precisão intermediária.
 Comparação de variâncias (s2): Teste de F.
 Para comparação de variâncias pelo Teste-F, partimos da

hipótese nula de que não há diferença significativa entre as
variâncias comparadas, ou seja:
s  s
2 2
 s
2 2
H0 : s 1 2
H1 : 1 2
 O teste de hipótese aqui realizado, ou seja para comparação

de variâncias, é um teste em duas caudas, portanto a tabela de F
utilizada é a bicaudal.
2
s1
s  s
2 2
Fcalc  1 2
2
s 2
O Ftab é encontrado na tabela de F, para:
 o  (nível de significância) definido;
 para os graus liberdade (para o numerador)  1  n1  1
 e para os graus liberdade (para o denominador)  2  n 2  1

2
s1
s  s
2 2
Fcalc  1 2
2
s 2
 Para que a hipótese nula seja aceita, Fcalc < Ftab ou Fcrit .
 O valor de Fcalc é sempre maior que a unidade.

Identificação das amostras: Amostras do laboratório A
Precisão Intermediária analisadas por analistas diferentes.
Amostras Analista 1 Analista 2

Laboratório A Equip. 2 Equip. 2
s1  s 2
2 2
H 0 : s12  s 22 H1 : A1 101,84 100,36
A2 102,61 100,54
B1 101,54 99,46
B2 101,71 99,55
Fcalc. = 0,45/0,34
C1 100,58 101,53
Fcalc = 1,32 C2 100,57 99,89

D1 101,85 100,24
Ftab= 3,43 D2 101,74 100,39
E1 101,18 100,05
E2 101,19 100,02
Fcalc< Ftab F1 100,54 100,85

F2 100,58 100,84
H0 é aceita. Média 101,33 100,31
Analistas diferentes: DP 0,67 0,58
satisfatória DPR 0,66 0,58

s2 0,45 0,34
Identificação das amostras: Amostras do laboratório A analisadas
 Precisão Intermediária com equipamentos diferentes.
Amostras Analista 2 Analista 2

Laboratório A Equip.2 Equip.1
H 0 : s12  s 22 H1 : s1  s 2
2 2 A1 100,36 99,21
A2 100,54 98,80
B1 99,46 100,41
B2 99,55 100,83
Fcalc = 0,49/0,34 C1 101,53 99,50
Fcalc = 1,44 C2 99,89 99,64
D1 100,24 100,41
Ftab= 3,43 D2 100,39 100,07
E1 100,05 99,02
E2 100,02 99,03
Fcalc< Ftab F1 100,85 99,02
H0 é aceita. F2 100,84 98,80

Média 100,31 99,56
DP 0,58 0,70
Equip. diferentes: DPR 0,58 0,70
satisfatória S2 0,34 0,49
 Precisão Intermediária
A ANOVA (análise de variância) é utilizada para comparação de

duas ou mais análises, a partir da distribuição F, utilizada para
realizar o teste de hipótese, onde a hipótese nula é de que não
há diferenças estatisticamente significativas entre as análises,
se Fcalc < Ftab aceita-se a hipótese nula ( H 0 : ).
Ftab para o nível de significância adotado.

 Intervalo
Intervalo especificado é a faixa entre os limites de

quantificação superior e inferior de um método analítico.
 É estabelecido pela confirmação de que o método apresenta:

 Exatidão,
 Precisão,
 Linearidade
... adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades
de substâncias dentro do intervalo especificado.
O intervalo depende da aplicação pretendida.
 Limite de Detecção (LD).
O Limite de Detecção é a menor quantidade do analito

presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não
necessariamente quantificado, sob as condições experimentais
estabelecidas.
 O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de

soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito,
até o menor nível detectável.
 A avaliação do limite de detecção (LD) pode ser: Visual,

 Relação sinal/ruído - 3:1,
 Desvio Padrão da resposta e inclinação.
LD = 3 x DP DP = Desvio padrão
IC IC = Inclinação da curva de calibração
 A inclinação pode ser estimada da curva de calibração do analito.
 A estimativa do desvio padrão DP pode ser feita :
 Desvio padrão do Branco.

 Baseado na Curva de Calibração - Construir três curvas de
calibração na faixa do LQ, o DP da intersecção Y pode ser usado
como DP.
 Limite de Quantificação (LQ).
O Limite de Quantificação é a menor quantidade do

analito presente em uma amostra que pode ser determinada
com exatidão e precisão aceitáveis, sob as condições
experimentais estabelecidas.
 O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de

soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito,
até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis.
 Limite de Quantificação (LQ).
 Relação sinal/ruído - 10:1,

 Desvio Padrão da resposta e inclinação.
LD = 10 x DP DP = Desvio padrão
IC IC = Inclinação da curva de calibração
 A inclinação pode ser estimada da curva de calibração do analito.
 A estimativa do desvio padrão DP pode ser feita :

 Desvio padrão do Branco.
 Baseado na Curva de Calibração - Construir três curvas de
calibração na faixa do LQ, o DP da intersecção Y pode ser usado
como DP.
 Robustez.
A robustez de um método analítico é a medida de sua

capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos
parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal.
 Caso haja susceptibilidade do método à variações nas condições

analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser
incluídas no procedimento.
 Robustez.
 Fatores que devem ser considerados na determinação da robustez
do método analítico:
Preparo das Estabilidade das soluções analíticas
Amostras: Tempo de extração
Espectrofotometria: Variação do pH da solução

Diferentes fabricantes de solventes
Cromatografia Líquida: Variação do pH da fase móvel

Variação na composição da fase móvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Fluxo da fase móvel
 Robustez.
Cromatografia Gasosa. Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

Temperatura
Velocidade do gás de arraste
Avaliação da Robustez
 A verificação da robustez deve ser realizada após a

validação do método;
 Planejamento experimental para avaliar a robustez pelo

método de Youden – matriz de experimento;
 Avaliar qual o impacto das variações – teor (exatidão)

Bibliografia
ANVISA, Habilitação de Laboratórios Analíticos em saúde – segundo os

requisitos da ISO/IEC 17025 – Procedimento GGLAS 02/17025, 2. ed, Brasília,
2002.
ANVISA, Guia para Qualidade em Química Analítica – Uma Assistência a

Acreditação, v. 1, 1. ed, Brasília, 2004.
ANVISA, Informe Técnico nº 1 de 15 de julho de 2008 – Esclarecimento sobre o

item 2.9 do anexo da Resolução RE nº 1 de 29/07/2005, que trata do Guia para
Realização dos Estudos de Estabilidade.
BRASIL, Resolução (RE) nº 899, de 29 de maio de 2003. Determina a

publicação do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos". Diário
Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 de junho de 2003.
Bibliografia
BRASIL, Resolução (RDC) nº 210, de 04 de agosto de 2003. Atualiza as Boas

Práticas de Fabricação de medicamentos com o objetivo de acompanhar o
desenvolvimento de novas tecnologias. Diário Oficial [da] Republica Federativa do
Brasil, Brasília, DF, 14 de agosto de 2003.
BRITO, N.M. Avaliação da Exatidão e da Precisão de Métodos de Análise de

Resíduos de Pesticidas Mediante Ensaios de Recuperação. Pesticidas:
R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, p. 155-168, jan./dez. 2002
CDER (Center for Drug Evaluation and Research). Validation of Chromatografic

Methods, nov. 1994.
FURMAN,W. B. Pharm.Techn. 22, (6), 1998, 54 -65.
INMETRO DOQ-CGCRE-008 Orientações sobre Validações de Métodos de

Ensaios Químicos. RJ, Brasil, 20003.
LAPPONI, J.C. Estatística usando Excel. São Paulo: Lapponi treinamento e editora,
2000.
Bibliografia
NBR ISO/IEC 17025, Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de

Calibração e de Ensaios. ABNT, RJ, Brasil, 2001.
PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. Verification of Compendial

Procedures, 31(2), Mar-Abr, 2005, p. 555-558.
PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. 31(3), May-June, 2005, p. 834-835.
SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for

pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between
validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US
Pharmacopoeia and the International Conference on Harmonization. Journal of
Chromatography A, 987, p. 57-66, 2003. Disponível em http://www.sciencedirect.com,
Acesso em: 16 de abril de 2003.
USP (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA). Chromatography, 27 ed. Rockville:

United States Pharmacopeial Convention, 2004, p. 2272 – 2284.
Obrigada!
Contato: antonia.mcavalcanti@gmail.com
Tel: (21) 8596-6780

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Workshop de Validação de Metodologia

Ministrante: Professora Antonia Maria Cavalcanti de Oliveira

• Estimular análise crítica a respeito do tema;

• Mostrar a importância da leitura de artigos científicos, pois

• Na legislação encontramos “o que deve ser feito” e “não o

• Refletir a respeito da construção do conhecimento em nossa

“Os estudos de validação são parte essencial das BPF e

 Dados que devem ser coletados e medidos

 Pontos de decisão e responsabilidades

É um resumo ou sumário do processo de

É o processo pelo qual se estabelece, através de

A Anvisa ressalta a importância da qualidade analítica

Uma das ferramenta que garante a qualidade analítica dos

 Verificar adequação ao uso;

É aquele desenvolvido por um organismo de

Estão aqui incluídos os Métodos Farmacopéicos.

Método Não Normalizado:

É aquele desenvolvido pelo próprio laboratório ou outras

Segundo INMETRO (DOQ-CGRE-008/2011).

 Método não normalizado

Segundo a Anvisa (RE 899/2003).

 No caso de metodologia analítica não descrita em

Mudanças na síntese da substância ativa;

Mudanças na composição do produto acabado;

Mudanças no procedimento analítico.

Determinadas outras mudanças podem requerer validação.

 pH da fase móvel (CLAE) + 0,2 unidades,

No caso de metodologias analítica descrita em

O laboratório deve confirmar que tem competência para

Para usar metodologia analítica descrita na USP-NF

Evidência documentada que um método previamente

 Segundo a RDC Nº. 31, DE 11 DE AGOSTO DE 2010

 Verificar a especificidade, a estabilidade da solução da

Resultado obtido com colunas cromatográficas diferentes.

T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos teóricos.

Resultados referentes à variação proporção da fase móvel.

Proporção da fase móvel Rt T k’ N

75:25 2,93 1,51 4,87 3320

80:20 3,79 1,39 6,58 4055

85:15 5,32 1,27 9,65 5249

Resultados referentes à variação de pH da fase móvel (85:15).

5,0 5,44 1,29 9,88 5208

6,0 5,45 1,28 9,89 5252

6,5 5,38 1,28 9,77 5165

Quantitativo Ensaio limite

Especificidade SIM SIM SIM * SIM

Linearidade SIM SIM NÃO * NÃO

Intervalo SIM SIM * * NÃO

LD NÃO NÃO SIM * NÃO

NÃO SIM NÃO * NÃO

Exatidão SIM SIM * * NÃO

SIM SIM SIM NÃO NÃO

* pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.

 Parâmetros e recomendações para o teste de verificação da

Fator de capacidade (k') O pico deve estar bem resolvido de outros

Repetitividade É desejável um DPR  1% para N  5

Tempo de retenção relativo Não é essencial se a resolução é declarada

Resolução (R) R  2 entre o pico de interesse e o potencial

Fator de cauda (T) T2

Número de pratos teóricos (N) Em geral deve ser  2000

 Para análise qualitativa (teste de identificação) é necessário

 Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas

 Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções