Guia Practicas BIOL CEL Y MOL Versión Final

GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO:
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Contenido
1 PRESENTACIÓN – PROPÓSITO ...................................................................... 10
2 RESULTADOS DE APRENDIZAJE .................................................................... 10
3 INSTRUCCIONES Y MEDIDAS DE SEGURIDAD .............................................. 10
4 PRÁCTICAS DE LABORATORIO....................................................................... 13
4.1 Práctica No. 001 – Introducción al manejo en el laboratorio y fundamentos

de bioseguridad – No. Sesiones 01 .................................................................... 14
4.1.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 14

4.1.2 Objetivos de la práctica .................................................................................. 14
4.1.3 Alcance ................................................................................................................ 14
4.1.4 Requisitos previos a la realización de la práctica ................................... 14
4.1.5 Aparatos, equipos e instrumentos............................................................... 14
4.1.6 Parámetros, magnitudes y rangos a ser determinados ......................... 14
4.1.7 Materiales y reactivos...................................................................................... 14
4.1.8 Recursos adicionales ...................................................................................... 15
4.1.9 Descripción del procedimiento ..................................................................... 15
4.1.10 Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación
de resultados. .................................................................................................................. 15
4.1.11 Referencias cruzadas.................................................................................. 15
4.1.12 Referencias normativas .............................................................................. 15
4.2 Práctica No. 002 – División celular – No. Sesiones 01............................. 16

4.2.3 Alcance ................................................................................................................ 16
de resultados. .................................................................................................................. 17
4.3 Práctica No. 003 – Funcionamiento celular: Transporte celular y ósmosis –
No. Sesiones 01 ................................................................................................. 18

4.3.3 Alcance ................................................................................................................ 18
de resultados. .................................................................................................................. 20
4.4 Práctica No. 004 – Extracción de ADN a partir de sangre periférica método
de salting out (kit Wizard) – No. Sesiones 01 .................................................... 20

4.4.3 Alcance ................................................................................................................ 20
de resultados. .................................................................................................................. 22
4.5 Práctica No. 005 – Extracción de ADN a partir de sangre periférica
(método columnas) – No. Sesiones 01 .............................................................. 23

4.5.3 Alcance ................................................................................................................ 23
de resultados. .................................................................................................................. 25

4.6 Práctica No. 006 – Métodos bioinformáticos aplicados: Diseño de primers
– No. Sesiones 01 .............................................................................................. 26

4.6.3 Alcance ................................................................................................................ 26
de resultados. .................................................................................................................. 27
4.7 Práctica No. 007 – Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) – No.
Sesiones 01 ........................................................................................................ 27

4.7.3 Alcance ................................................................................................................ 27
de resultados. .................................................................................................................. 29

4.8 Práctica No. 008 – Electroforesis de ADN – No. Sesiones 01.................. 30

4.8.3 Alcance ................................................................................................................ 30
de resultados. .................................................................................................................. 32
4.9 Práctica No. 009 – Métodos bioinformáticos aplicados: Árbol filogenético –
No. Sesiones 01 ................................................................................................. 32

4.9.3 Alcance ................................................................................................................ 32

de resultados. .................................................................................................................. 35
4.10 Práctica No. 010 – Extracción de Proteínas – No. Sesiones 01 ............... 35
4.10.1 Tema a desarrollar ....................................................................................... 35

4.10.2 Objetivos de la práctica .............................................................................. 35
4.10.3 Alcance ........................................................................................................... 35
4.10.4 Requisitos previos a la realización de la práctica ............................... 35
4.10.5 Aparatos, equipos e instrumentos .......................................................... 35
4.10.6 Parámetros, magnitudes y rangos a ser determinados ..................... 36
4.10.7 Materiales y reactivos ................................................................................. 36
4.10.8 Recursos adicionales.................................................................................. 36
4.10.9 Descripción del procedimiento ................................................................ 36
de resultados. .................................................................................................................. 37
4.11 Práctica No. 011 – Cuantificación de Proteínas – No. Sesiones 01 ......... 37

4.11.3 Alcance ........................................................................................................... 38

de resultados. .................................................................................................................. 39
4.12 Práctica No. 012 – Electroforesis vertical Proteínas – No. Sesiones 01 ... 39

4.12.3 Alcance ........................................................................................................... 40
de resultados. .................................................................................................................. 45
4.13 Práctica No. 0013 – PCR en Tiempo Real – No. Sesiones 01 ................. 45

4.13.3 Alcance ........................................................................................................... 45

de resultados. .................................................................................................................. 49
4.14 Práctica No. 014 – Ejercicio teórico de caracterización de un virus – No.
Sesiones 01 ........................................................................................................ 49

4.14.3 Alcance ........................................................................................................... 50
de resultados. .................................................................................................................. 54
5 BIBLIOGRAFÍA................................................................................................... 55
6 MECANISMOS DE EVALUACIÓN Y ANEXOS .................................................. 55
7 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................... 57

1 PRESENTACIÓN – PROPÓSITO
Esta Guía ha sido desarrollada para que los estudiantes de la asignatura de Biología Celular y
Molecular dispongan de la información necesaria para la realización de las prácticas
correspondientes de acuerdo a los temas, objetivos y resultados de aprendizaje definidos. En la
presente guía el estudiante encontrará los recursos, el procedimiento y los resultados
esperados de cada práctica; para posibilitar su adecuado proceder en el laboratorio y la
posterior elaboración de los informes u otras evidencias de aprendizaje de acuerdo a las
rúbricas establecidas.
Las prácticas de laboratorio de esta asignatura permiten el desarrollo de habilidades y destrezas

para el aprendizaje activo, profundo y colaborativo entorno a la biología celular y molecular que
permiten entender el funcionamiento de la célula como base fundamental de la vida y el papel
del DNA y RNA como portadores de información genética de un organismo. Los estudiantes
serán capaces de entender los avances científicos desde la perspectiva de análisis y diagnóstico
clínico usando técnicas del laboratorio de biología molecular.
Al realizar una lectura analítica del contenido de esta guía usted obtendrá el conocimiento
necesario para adquirir la destreza en el uso de elementos del laboratorio de Biología Celular y
Molecular.
2 RESULTADOS DE APRENDIZAJE
En esta guía se evidencia la consecución de los resultados de aprendizaje de la asignatura de

Biología Celular y Molecular:
RdA1. Describir la estructura y función de los componentes de la célula.
RdA2. Relacionar la estructura de los ácidos nucleicos y organelos celulares con los
pasos de la síntesis y procesamiento de proteínas.
RdA3. Identificar los pasos del ciclo celular.
RdA4. Reconocer las formas en las que la célula interacciona con el medio externo.
RdA5. Reconocer las principales técnicas moleculares aplicadas a la investigación y
diagnóstico de procesos salud-enfermedad.
3 INSTRUCCIONES Y MEDIDAS DE SEGURIDAD
Los Laboratorios multidisciplinarios de Ciencias Biológicas y Químicas (LACBYQ) de la UDLA, han

establecido las medidas de seguridad que se detallan a continuación.
Durante el desarrollo de las prácticas de laboratorio es necesario precautelar la integridad de

los usuarios (docentes, estudiantes, investigadores, asistentes, personal de apoyo y limpieza),
puesto que un accidente puede producirse por negligencia, descuido o por situaciones fuera de
Guía de Prácticas de Laboratorio – Coordinación de laboratorios LACBYQ

control. Cada persona es responsable de resguardar la seguridad de los laboratorios y el correcto
uso de los bienes de la universidad.
Precauciones Básicas
 Localice los dispositivos de seguridad más próximos como extintores, botiquín, lavaojos
y salidas de emergencia.
 No se pueden realizar prácticas no establecidas por el docente.
 Lea atentamente el manual de la práctica correspondiente. Siempre siga las indicaciones
dictadas por el docente y consulte cualquier inquietud que tenga.
 Los trabajos en el laboratorio deben siempre estar acompañados de alguien, no en
solitario.
 No juegue ni corra dentro del laboratorio.
 Comunique al docente si tiene alguna incompatibilidad con algún reactivo químico,
sufre de asma, alergia o de alguna patología.
Hábitos y Costumbres
 Está prohibido fumar, beber o ingerir alimentos dentro del laboratorio.
 Lávese las manos con frecuencia a la entrada y salida del laboratorio.
 Mantenga limpia y en orden su mesa de trabajo (mantener libre de libros, maletas, ropa,
etc.).
 No inhale o pruebe productos químicos.
 No inhale directamente ningún químico; en caso de ser necesario dirija un poco de vapor
con la mano hacia su nariz.
 Infórmese sobre el uso de materiales y equipos, cualquier duda diríjase al docente o
hacia una persona calificada.
 Se le informará sobre el tipo de desechos generados y el método de eliminación de los
mismos
Vestimenta y Equipos de protección individual

 Utilice mandil que cubra la mayor parte de su cuerpo y zapatos cerrados.
 En caso de trabajar con equipos, no lleve prendas sueltas o que cuelguen (bufandas,
corbatas, etc.), y/o bisutería que pueda enredarse.
 Recójase el cabello de ser el caso.
 Es de su entera responsabilidad la utilización de los equipos de protección individual.
 Use guantes, mascarilla y gafas siempre que se encuentre dentro de en
un laboratorio o que esté trabajando con reactivos y/o materiales que necesiten
manipulación especial. Infórmese o pregunte al docente
Precauciones en los Laboratorios Biológicos

 Procure mantener cerradas las válvulas de los mecheros hasta que se inicie la práctica y
al salir asegurarse de cerrarlas todas.
 Coloque los portaobjetos y cubreobjetos sucios en los recipientes con hipoclorito de
sodio.
 Use guantes de seguridad, mascarillas y gafas de seguridad en caso de trabajar con
muestras líquidas que puedan regarse.

 Manipule con cuidado los microscopios y déjelos limpios luego de usarlos con el lente
de 4x, condensador abajo, diafragma abierto, cabezal virable y tela protectora.
 Si se van a observar imágenes con el lente de 100x siempre utilizar aceite de inmersión,
luego utilizar papel limpiador de microscopio destinado para el aseo de este lente y dejar
el microscopio como se detalla en el punto anterior.
 Manipule con cuidado los estereomicroscopios y déjelos limpios luego de usarlos, con
el cabezal virable, y el macrométrico hacia abajo.
 No succionar con la boca los reactivos; usar las micropipetas, peras de seguridad o
pipeteador émbolo.
 Todo material cortopunzante debe ser colocado en los contenedores adecuados para
evitar accidentes.
 Mantenga la superficie de trabajo limpia y organizada, una vez culminada la práctica
proceda a limpiar su área siguiendo las normas de seguridad del producto limpiador a
utilizar.
Precauciones en Laboratorios de Química

 Lea atentamente las fichas de seguridad de los reactivos que utilizará durante la
práctica.
 Sea cuidadoso y utilice adecuadamente la Sorbona, especialmente cuando esté usando
reactivos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos.
 No se debe oler los recipientes con sustancias desconocidas de forma directa, se debe
acercar el olor con las manos, puesto que pueden ser peligrosas para la salud
 Calentar los recipientes dirigiendo la abertura hacia un lugar en que no se cause daño a
alguna persona.
 No succionar con la boca los reactivos; usar las micropipetas, peras de seguridad o
pipeteador émbolo
 Utilice material de vidrio en buen estado.
 No deje abierto los envases, siempre manténgalos alejados de focos de calor o ignición.
Tómelos siempre desde la base y no del tapón o tapa.
 Rotule debidamente todo el material con el que está trabajando para evitar
confusiones.
 No mezclar violentamente agua con ácidos o bases concentradas, realizar siempre
disoluciones.
 Una vez concluida la práctica seguir el procedimiento adecuado para el desecho de
reactivos y soluciones peligrosas. Desechar las soluciones en el respectivo contenedor
“ácido”, “base” o “solvente”
 Procure mantener cerradas las válvulas de los mecheros hasta que se inicie la práctica y
al salir asegúrese de cerrar todas.
 Use guantes de seguridad, mascarillas y gafas de seguridad en caso de trabajar con
muestras líquidas que puedan regarse.
 Todo material cortopunzante debe ser colocado en los contenedores adecuados para
evitar accidentes.
 Mantenga la superficie de trabajo limpia y organizada, una vez culminada la práctica
proceda a limpiar su área siguiendo las normas de seguridad del producto limpiador a
utilizar.

Emergencias
 En caso de incendio, utilice el extintor, de no funcionar, avise dicha emergencia y
abandone el laboratorio.
 Si ocurriera quemaduras con agentes químicos, comunique inmediatamente al docente
para efectuar mejor tratamiento.
 En caso de salpicaduras con agentes químicos o soluciones contaminadas, lave la zona
afectada con abundante agua durante 15 minutos con el lavaojos o duchas de
emergencia y diríjase al médico de manera inmediata.
4 PRÁCTICAS DE LABORATORIO
A continuación, se describen a detalle cada una de las prácticas a desarrollarse durante

el semestre.
4.1 Práctica 001. Introducción al manejo en el laboratorio y fundamentos de bioseguridad
– No Sesiones 01
4.2 Práctica 002. División celular – No Sesiones 01
4.3 Práctica 003. Funcionamiento celular: Transporte celular y ósmosis– No Sesiones 01
4.4 Práctica 004. Extracción de ADN a partir de sangre periférica método de salting out
(kit Wizard) – No Sesiones 01
4.5 Práctica 005. Extracción de ADN a partir de sangre periférica método columnas – No
Sesiones 01
4.6 Práctica 006. Métodos bioinformáticos aplicados: Diseño de primers– No Sesiones 01
4.7 Práctica 007. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) – No Sesiones 01
4.8 Práctica 008. Electroforesis de ADN– No Sesiones 01
4.9 Práctica 009. Métodos bioinformáticos aplicados: Árbol filogenético– No Sesiones 01
4.10 Práctica 010. Extracción de proteínas – No Sesiones 01
4.11 Práctica 011. Cuantificación de proteínas – No Sesiones 01
4.12 Práctica 012. Electroforesis vertical de proteínas – No Sesiones 01
4.13 Práctica 013. PCR en Tiempo Real – No Sesiones 01
4.14 Práctica 014. Ejercicio teórico de caracterización de un virus – No Sesiones 01

4.1 Práctica No. 001 – Introducción al manejo en el laboratorio y
fundamentos de bioseguridad – No. Sesiones 01
4.1.1 Tema a desarrollar

Introducción al manejo en el laboratorio de Biología molecular, sus instrumentos,
reactivos y normas de bioseguridad necesarias.
4.1.2 Objetivos de la práctica

Adquirir destreza en el uso de los diferentes elementos del laboratorio de Biología
Molecular bajo normas de bioseguridad.
4.1.3 Alcance
En esta práctica se pretende que los alumnos adquieran y apliquen el conocimiento de
las normas de bioseguridad y la identificación y uso adecuado de los materiales de
laboratorio que se utilizarán durante el actual periodo académico.
4.1.4 Requisitos previos a la realización de la práctica

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar la siguiente actividad:
 Leer Normas de Bioseguridad: Normas Generales de Laboratorio de Biología Molecular
 Lectura comprensiva de la guía de práctica.
Al inicio de la práctica se realizarán preguntas acerca de las lecturas
4.1.5 Aparatos, equipos e instrumentos
Aparatos, equipos e Cantidad Requisitos técnicos

instrumentos
Vórtex 1
Juegos de micropipetas (10, 5 calibradas
200, 1000 ul)
Centrífuga 1 Calibrada
Microcentrífuga 1 Calibrada
Balanza analítica 1 Calibrada
4.1.6 Parámetros, magnitudes y rangos a ser determinados

No aplica para esta práctica
4.1.7 Materiales y reactivos
Materiales Cantidad Especificaciones

Tubos eppendorf 20 unidades c/u 0,2-0,5-1 ml
Gradillas 3 unidades Para tubos eppendorf
Guantes de látex 20 pares Talla M y L
Guardianes 3 unidades
Puntas de micropipeta 1 rack c/u 0,2-0,5-1 ml
Reactivos Cantidad Especificaciones

Agua destilada 20 ml
Buffer de carga 5 ml Azul de bromofenol o Xilen
Xianol
4.1.8 Recursos adicionales
Conocimiento de técnicas de pipeteo
4.1.9 Descripción del procedimiento
El laboratorio de biología molecular requiere la manipulación de equipos muy precisos,

por lo tanto, conocer su correcta manipulación garantiza la exactitud del resultado final.
En la Práctica, cada estudiante: Manipulará microvolúmenes de líquidos (agua y buffer),
para adquirir la habilidad y experticia en el manejo de micropipetas y pequeños
recipientes contenedores (tubos eppendorf).
Recibirá instrucción precisa para la operación de diferentes equipos utilizados en la
rutina del laboratorio: Centrífuga, Microcentrífuga, Balanza analítica y vortex.
Protocolo:
Seleccione 50uL con la micropipeta de 200uL, tome una punta desechable y absorba
este volumen de agua y viértalo en un eppendorf de 0,2, 0,5 o 1 ml. Repita este proceso
al menos 10 veces. Identifique los topes primario y secundario de la micropipeta.
Repita el procedimiento anterior con xilene xianol o azul de bromofenol y mezcle ésta
sustancia con el agua vertida en el paso anterior, aspire y expela la mezcla hasta que
esta se presente homogénea.
Coloque al menos dos tubos en la microcentrífuga teniendo en cuenta las
recomendaciones para que esta esté perfectamente balanceada, seleccione 3000 rpm y
accione el aparato por 1 minuto.
Pese 1 gramo de arena en la balanza analítica de precisión, teniendo en cuenta las
recomendaciones impartidas para la correcta manipulación de éste instrumento.

de resultados.
Los datos obtenidos en la práctica serán registrados en la hoja de toma de datos de
laboratorio
4.1.11 Referencias cruzadas

4.1.12 Referencias normativas

Normas Generales de Laboratorios biológicos, Coordinación de Laboratorios UDLA

4.2 Práctica No. 002 – División celular – No. Sesiones 01

Observación al microscopio diferentes etapas de la división celular.

Teñir los cromosomas de células que se encuentren en división celular.
Identificar en el microscopio varias etapas de la división celular.
4.2.3 Alcance
En esta práctica comprende la preparación de raíces de cebolla para inducir su división
celular, su posterior preparación, tinción de cromosomas y análisis de las etapas de la
división celular al microscopio.

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá leer los fundamentos de la división
celular, identificar sus etapas y leer la guía de la práctica. Al inicio de la práctica se
realizarán preguntas acerca de las lecturas.

instrumentos
Plancha de calentamiento 1
Microscopio 5

No aplica a esta práctica. Se observarán las etapas del ciclo celular.

Portaobjetos 20
Cubreobjetos 20
Pipeta de plástico 20
Caja Petri 10
pares de tijeras 5
Vidrio de reloj 10
Pinza delgada 5
par de guantes desechables 10 Tallas M y L
Mascarilla 10
trozo de papel para limpieza de 10
lentes de 5 x 5 cm
trozo de papel filtro de 2 x 5 cm 10
aceite de inmersión 2ml

Orceína acética tipo A 5ml
Orceína acética tipo B 3ml

Conocimiento sobre estructura y división celular, ubicación de los cromosomas en cada
etapa.
A realizar 5 días antes de la práctica

Llenar un vaso de precipitados con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o
tres palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4
días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 o 4 cm de longitud.
A realizar durante la práctica:
Cortar con las tijeras unos 2-3 mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio
de reloj en el que se han vertido 5 gotas de orceína A.
Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero (pasar por la llama unas 5
o 6 veces), evitando la ebullición, hasta la emisión de vapores tenues. Mover
continuamente en círculo.
Una vez que se enfríe, con las pinzas tomar uno de los ápices o extremos de las raicillas
y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una gota de orceína B y dejar actuar durante
1 minuto.
Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja
enmangada (o lápiz con borrador) dar unos golpecitos sobre el cubre sin romperlo de
modo que la raíz quede extendida.
Sobre la preparación colocar unas tiras de papel de filtro. Poner el dedo pulgar sobre el
papel de filtro en la zona del cubreobjetos y hacer una suave presión, evitando que el
cubre resbale. Si la preparación está bien asentada no hay peligro de rotura por mucha
presión que se realice.
Observar al microscopio en el lente de 10x y 100x con aceite de inmersión.
Realizar un gráfico de las fases observadas en el lente de 100x.

de resultados.
laboratorio para elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la rúbrica detallada
en el punto 6 de la presente guía. El cuestionario correspondiente a esta práctica es el
siguiente:

No aplica para esta práctica.


4.3 Práctica No. 003 – Funcionamiento celular: Transporte celular y
ósmosis – No. Sesiones 01

Entendimiento sobre el comportamiento de diferentes células animales en un medio
hipotónico, hipertónico e isotónico.

Entender el funcionamiento y propiedades de la membrana celular.
4.3.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio incluirá evaluación de la forma y tamaño de una célula
animal (huevo) sometido a distintas soluciones. Adicionalmente se tomará una muestra
pequeña de sangre humana para observar en el microscopio el comportamiento de los
eritrocitos en soluciones isotónicas, hipotónicas e hipertónicas.

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre
transporte celular, estructura y funcionamiento de la membrana celular.

instrumentos
Microscopios 5


Pipetas de plástico con 20 unidades
medida
Pipetas Pasteur de vidrio 20 unidades
Caja tripetri 20 unidades
Picetas 3 unidades
Lancetas 10 unidades
torundas de algodón con 10 unidades
alcohol
Curitas 10 unidades
Chupones para pipetas 10 unidades
Pasteur
Portaobjetos 30 unidades
Cubreobjetos 30 unidades

trozo de papel para limpieza 10 unidades
de lentes de 5 x 5 cm
pares de guantes 10 pares Variados: Talla S, M y L
desechables
Marcador para vidrio 5 unidades
NaCl 0,9 % 12 ml
NaCl 10 % 12 ml
Aceite de inmersión 1 ml
Alcohol antiséptico 10 ml

Lectura sobre transporte celular, estructura y funcionamiento de la membrana celular.
Procedimiento A:
A realizar previo a la práctica:
Los integrantes de cada mesa de trabajo deben dividirse el trabajo de la siguiente
manera:
 Colocar seis huevos de codorniz en jugo de limón durante 4 horas aproximadamente,

hasta que toda la cáscara se desintegre. Los huevos deben estar completamente
sumergidos en el jugo de limón. Si luego de 4 o 5 horas máximo no se ha desintegrado
toda la cáscara raspar con mucho cuidado la cáscara sobrante para liberar al huevo
de la misma en su totalidad.
 Una vez que los huevos se han liberado de toda la cáscara, sacar del jugo de limón
 Anotar la forma y tamaño de los huevos
 Luego sumergir cada huevo, durante toda la noche, en los siguientes líquidos (un
huevo por cada líquido diferente): coca cola, vinagre, agua con sal, miel, gelatina con
sabor disuelta en un poco de agua y agua con azúcar.
A realizar durante la práctica:
 Observar y anotar el tamaño y la forma de cada uno de los huevos tratados la noche
anterior.
 Abrir el huevo y colocarlo en una caja petri. Anotar sus observaciones.
 Realizar un cuadro comparativo explicando que sucedió en cada uno de los seis
huevos.
Procedimiento B:
 Obtener sangre de la yema del dedo utilizando una lanceta estéril
 Colocar una gota de sangre en tres cajas petri: la primera con 1 ml de NaCl al 0,9%,
la segunda con 1 ml de NaCl al 10% y la tercera con 1 gota de agua destilada. Otra
opción es colocar en una caja tripetri una gota de sangre en cada división y seguir el

procedimiento descrito anteriormente.
 Luego de 2 minutos tome una gota de cada medio y coloque en tres portaobjetos
 Coloque un cubreobjetos en cada portaobjetos.
 Observe en el microscopio
 Anotar y graficar los resultados.

de resultados.
laboratorio para elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la rúbrica detallada
en el punto 6 de la presente guía. El cuestionario correspondiente a esta práctica es el
siguiente:
a) Explique en qué consiste el transporte activo, la difusión pasiva o simple y la difusión
facilitada en las células
b) ¿Qué es diálisis? Explique una aplicación médica de este proceso
c) Explique qué provoca la disminución de la turgencia cutánea en humanos



método de salting out (kit Wizard) – No. Sesiones 01

Extracción de DNA de sangre periférica usando el método de salting out.

Obtener DNA de buena calidad y cantidad a partir de sangre periférica humana.
4.4.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio incluye la extracción de sangre periférica y la obtención de
material genético para posterior análisis en el laboratorio de biología molecular.

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el inserto
específico de cada método usado y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se


instrumentos
Vórtex 1
200, 1000 ul)
Centrífuga 1 calibrada
Microcentrífuga 1 calibrada
Balanza analítica 1 calibrada
Baño maría 1
Calidad de DNA.
El DNA aislado idealmente usando el kit de extracción de invitrogen tendrá un valor
>1.80 al cuantificarla en un espectrofotómetro con una absorbancia A260/A280 cuando
las muestras están diluidas en el eluyente (Tris-HCl pH 7.5) lo cual indica que el DNA está
razonablemente limpio de proteínas que pudiesen intervenir con aplicaciones
siguientes. La ausencia de RNA contaminante se podría confirmar al realizar una
electroforesis en gel de agarosa

Jeringuilla/ vacuntainer 6 5 ml
Tubos EDTA 6 5 ml
Toallas de papel 30
Torundas de algodon 30
Torniquete 6
Agua miliQ 100 ml
Etanol frío 100 ml 99%
Isopropanol 100 ml 99%
Reactivo Salting Out Wizard 7 Reacciones

Conceptos básicos sobre estructura y función de los ácidos nucleicos. Replicación del
ADN y transmisión de información genética. Ciclo celular y niveles de condensación del
ADN.
EXTRACCIÓN CON EL KIT WIZARD GENOMIC (PROMEGA)

Lisis de Glóbulos Rojos
En un tubo eppendorf de 1,5 ml, combine 300 ul de sangre con 900 ul de Cell Lysis
Solution y mezcle por inversión.
Incube por 10 minutos a T ambiente.
Centrifugue a 13,000–16,000 × g* ; 20 seg
Descarte el sobrenadante, Vórtex breve al pellet.
Lisis de Núcleos y Precipitación de Proteínas

Adicione 300 ul de Nuclei Lysis Solution, Mezcle por inversión.
Adicione 100 ul de Protein Precipitation Solution; vórtex por 20 seg.
Centrifugue a 13,000–16,000 × g*; 3 minutos
Precipitación de DNA y Rehidratación del pellet

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo, al que se le haya adicionado previamente
300ul de isopropanol. Mezcle suavemente para observar la madeja de ADN en
formación.
Centrifugue a 13,000–16,000 × g*; 1 minuto
Discarte el sobrenadante, adicione 300 ul de etanol (same volume as isopropanol).
Centrifugue como en el paso 9.
Retire el etanol, y deje secar el pellet (10–15 minutes), a temperatura ambiente
Rehidrate el DNA en 100 ul de Agua MiliQ o buffer Tris EDTA pH7,3 por 1 hora a 65°C o
de un día para otro a 4°C.

de resultados.
Los datos que se registrarán serán los obtenidos en la medición de calidad de DNA en el
espectrofotómetro. Se deberá elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la
rúbrica detallada en el punto 6 de la presente guía. El cuestionario correspondiente a
esta práctica es el siguiente:
a) ¿Por qué el buffer de lisis celular deja intactos los núcleos de las células?
b) ¿Qué principio opera cuando usted agrega la solución de precipitación de proteínas?
¿Qué pasaría si se agregara una solución menos concentrada? (una décima parte de
la que utilizó)
c) ¿Qué sucede cuando se agrega el Isopropanol? ¿Qué pasaría si agrega el mismo
volumen de etanol? ¿Qué pasaría si agrega 2,5 volúmenes de etanol?



(método columnas) – No. Sesiones 01

Extracción de DNA de sangre periférica usando método de columnas

Obtener DNA de buena calidad y cantidad a partir de sangre periférica humana.
4.5.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio incluye la extracción de sangre periférica y la obtención de
material genético para posterior análisis en el laboratorio de biología molecular.

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el inserto
específico de cada método usado y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se

instrumentos
Vórtex 1
200, 1000 ul)
Baño maría 1
Calidad de DNA.
El DNA aislado idealmente usando el kit de extracción de invitrogen tendrá un valor
>1.80 al cuantificarla en un espectrofotómetro con una absorbancia A260/A280 cuando
las muestras están diluidas en el eluyente (Tris-HCl pH 7.5) lo cual indica que el DNA está
razonablemente limpio de proteínas que pudiesen intervenir con aplicaciones
siguientes. La ausencia de RNA contaminante se podría confirmar al realizar una
electroforesis en gel de agarosa


Tubos EDTA 6 5 ml
Toallas de papel 30
Torundas de algodon 30
Torniquete 6
Agua MiliQ 100 ml
Etanol frío 100 ml 99%
Isopropanol 100 ml 99%
Reactivo Purelink Genomic 7 Reacciones
DNA kit Invitrogen

Conceptos básicos sobre estructura y función de los ácidos nucleicos. Replicación del
ADN y transmisión de información genética. Ciclo celular y niveles de condensación del
ADN.
EXTRACCIÓN CON EL KIT PURE LINK GENOMIC MINI PREP (INVITROGEN)

El procedimiento de purificación de ADN está diseñado para purificar ADN genómico
utilizando un procedimiento asado en centrifugación de columnas las cuales poseen
carga específica para atraer el ADN.
Lisis
Calentar el baño maría a 55ºC
En un tubo eppendorf de 1,5ml colocar 200ul de sangre periférica con EDTA
Añada 20ul de proteinasa K y 20ul de RNAsa A
Añada 200ul del buffer de lisis
Mezcle usando vórtex
Incubar a 55ºC por 10minutos
Anadir 200ul de etanol 100%
Mezclar usando vórtex hasta obtener una solución homogénea
Unión del ADN a la columna

Añadir el lisado anterior (≈640ul) a la columna

Centrifugar la columna a 10000xg durante 1 minuto a temperatura ambiente
Desechar el tubo de colección y colocar la columna en un tubo colector limpio
Lavado
Añadir 500ul de buffer de lavado 1
Centrifugar la columna a 10000xg durante 1 minuto a temperatura ambiente
Desechar el tubo de colección y colocar la columna en un tubo colector limpio
Añadir 500ul del buffer de lavado 2
Centrifugar la columna a máxima velocidad durante 3 minuto a temperatura ambiente
Elución del ADN

Colocar la columna en un tubo eppendorf de 1,5ml estéril y rotulado
Añadir de 25 a 200ul del buffer de elución a la columna
Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto
Centrifugar a máxima velocidad por 1 minuto a temperatura ambiente
Conservación del ADN

Colocar el ADN purificado a -20ºC.

de resultados.
Los datos que se registrarán serán los obtenidos en la medición de calidad de DNA en el
espectrofotómetro. Se deberá elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la
rúbrica detallada en el punto 6 de la presente guía. El cuestionario correspondiente a
esta práctica es el siguiente:
a) ¿Qué función cumple la proteinasa K?
b) ¿Qué función cumple la RNasa A?
c) De acuerdo a la literatura, ¿Qué función cumple el Genomic Lysis / Binding Buffer?
d) ¿Qué función y componentes considera que constituyen el Wash Buffer?
e) ¿Para qué se utiliza el Genomic Elution Buffer, cual es el fundamento de su acción?



4.6 Práctica No. 006 – Métodos bioinformáticos aplicados: Diseño de
primers – No. Sesiones 01

Diseño de primers específicos para un gen y reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
mediante plataformas bioinformáticas.

Obtener un diseño de calidad de primers para amplificar un gen determinado mediante
PCR.
4.6.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio incluye el análisis de la secuencia del gen a amplificar, el
diseño bioinformático y selección del par de primers idóneo para la PCR a realizarse en
la siguiente práctica en el laboratorio de biología molecular.

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el diseño
de primers para PCR y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se realizarán preguntas
acerca de las lecturas.

instrumentos
Computadores con acceso a 30
internet
Se registrará el código del genbank del gen a amplificar. En el informe se registra el gen
y la traducción a proteína. Los primers se escribirán 5`a 3` con la temperatura de
anillamiento que estará comprendida entre los 68-62º.
Conceptos básicos sobre desnaturalización e hibridación del ADN.

Se descargará del genbank el gen a amplificar
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/. Se copiará en un documento Word. Se
localizará el inicio y el final del gen. Se traducirá el gen en la página
http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio/analysis/trans.htm. Se diseñará los primers
para amplificar los genes. Los dos primers tendrán una temperatura de
anillamiento comprendida entre los 68-62º. Se utilizará el programa
http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html

de resultados.
Los datos que se registrarán serán los obtenidos. Se deberá elaborar el informe sobre la
práctica de acuerdo a la rúbrica detallada en el punto 6 de la presente guía. El
cuestionario correspondiente a esta práctica es el siguiente:
a) ¿Por qué es importante que ambos primers tengan una temperatura de anillamiento
similar?
b) ¿Por qué la temperatura de anillamiento es menor que la temperatura de
polimerización?
c) ¿Por qué no puede haber primers de 5 nucleótidos?

4.7 Práctica No. 007 – Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) – No.

Sesiones 01

Reacción en cadena de la Polimerasa

Realizar el montaje experimental de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).
Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones de la reacción de PCR.
4.7.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio comprende el ensamblaje de la reacción de PCR y el
corrimiento de la misma en un termociclador, el DNA resultante, amplicones, se
almacenará para su visualización en gel de electroforesis en la siguiente práctica.

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el
fundamento teórico de la reacción en cadena de la Polimerasa y la guía de práctica. Al
inicio de la práctica se realizarán preguntas acerca de las lecturas.

instrumentos
Vórtex 1
200, 1000 ul)
Termociclador 1

Determinar las temperaturas de: denaturación, hibridación o annealing y extensión,
para calibrar la curva en el termociclador adecuada para obtener la amplificación del
DNA diana.

Toallas de papel 30
Agua MiliQ 100 ml estéril
dNTPs 20 ul 99%
Taq polimerasa 2 ul 5u/ul
Buffer o tampón de reacción 30 ul 10X
Primer 6 ul c/u 10 uM c/u
ADN diana 6 ul
MgCl2 10 ul 50mM
Aceite mineral 3ml

Conceptos básicos sobre replicación del ADN y transmisión de información genética.
Introducción al manejo del equipamiento básico del laboratorio de Biología Molecular
Preparación de la muestra para PCR

 Sobre una cubeta con hielo picado colocar un tubo eppendorf estéril para preparar
la master mix o mezcla maestra para PCR, usando la hoja especialmente diseñada

para el objeto.
 Todos los reactivos deben ser sacados del congelador poco tiempo antes de hacer la
mezcla y deberán ser mantenidos sobre hielo picado antes y después de ser usados.
Al descongelarlos se debe cuidar de que todo el reactivo se disuelva completamente.
 Para la adición de cada reactivo se deben utilizar puntas de pipeta nuevas y estériles.
La preparación de la mezcla se debe realizar con mascarilla y guantes.
 Evitar tocar el extremo de las puntas a usarse con cualquier material, el pelo, la piel,
etc.
 La cantidad de master mix a preparar debe ser calculada según el número de tubos
de reacción.
Master mix (volumen final por tubo de reacción = 50 ul)
Ingrediente/tubo Cantidad/tubo
Taq 0,2 ul
MgCl2 50mM 1 ul
dNTPs 10mM 2 ul
Primers 10µM 2 ul c/ primer
Tampón de reacción 10X 5 ul
Agua bidestilada o ultrapura 35,8 ul
 Colocar 48 ul de master mix en cada tubo de reacción (tubos eppendorf 0,2 ul).
Añadir a cada uno 2 ul del ADN extraído.
 Agregar de 2 a 3 gotas de aceite mineral a cada tubo de reacción dejándolo correr
por las paredes. Cerrar bien los tubos y llevarlos al termociclador, que debe haber
sido programado con anterioridad.
 Una vez terminados los ciclos respectivos, congelar los tubos de reacción en caso de
no usarlos inmediatamente.

de resultados.
Se deberá elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la rúbrica detallada en el
punto 6 de la presente guía. El cuestionario correspondiente a esta práctica es el
siguiente:
a) ¿Qué es PCR anidada o nested PCR y qué es PCR multiplex?
b) ¿De qué depende la temperatura de annealing o unión de los primers? Explique.
c) ¿Por qué es recomendable usar material nuevo y estéril para PCR?
d) ¿Qué son los RFLP y VNTR?
e) ¿Cuál es el fundamento de su acción?



4.8 Práctica No. 008 – Electroforesis de ADN – No. Sesiones 01

Electroforesis en gel de agarosa

Adquirir destreza en la producción y el montaje experimental de un gel de agarosa.
Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones de la electroforesis de ácidos
nucleicos.
4.8.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio comprende el de cálculo de las cantidades correctas para
elaborar un gel de agarosa en un porcentaje definido y montar una electroforesis para
separar moléculas de ácidos nucleicos amplificados por PCR.

fundamento teórico de la electroforesis en gel de agarosa y la guía de práctica. Al inicio
de la práctica se realizarán preguntas acerca de las lecturas.

instrumentos
Plancha de calentamiento con 1
agitación magnética
200, 1000 ul)
Microondas 1
Cámara de electroforesis 1 Con todos los accesorios
(agarosa)
Fuente de poder 1
Documentador de geles 1

El peso del gel de agarosa y los volúmenes de buffer para su preparación y corrida.

Tubos eppendorf 10 unidades c/u 0,5-1,5 ml
Gradillas 3 unidades Para tubos eppendorf 1,5ml
Cámara de electroforesis 3 unidades Con todos los accesorios
Vasos de precipitación 3 unidades
100ml
Puntas de micropipetas 1 rack c/u 0,2-0,5-1 ml
SYBR® Gold Nucleic Acid Gel 10 ul frio
Stain
Agarosa 2 gramos polvo
Buffer de Carga para Ácidos 50 ul Frio
Nucleicos
Buffer TBE 1X 1L
Conocimiento de fundamentos de electroforesis y del cálculo de porcentaje de gel de

agarosa en función de la longitud de las moléculas de ácido nucleico a separar.
Conocimiento de manejo del equipamiento necesario para la producción y montaje de
un gel de agarosa.
La técnica tradicionalmente y actualmente utilizada para la separación de moléculas de

ácidos nucleicos entre si según su longitud es la electroforesis en gel de agarosa.
En la Práctica, primero se expondrán los fundamentos y metodologías de la técnica de una
forma demostrativa, se planteará un caso clínico donde se necesita el uso de la técnica
expuesta para su diagnóstico con su correspondiente propuesta metodológica,
resultados, y discusión que oriente la adecuada toma de decisiones respecto a los
resultados obtenidos.
Después, los estudiantes: realizarán la producción de un gel de agarosa de un dado
porcentaje, la preparación y el montaje de las muestras de ácidos nucleicos, la corrida de
la electroforesis y la visualización de las bandas producidas de ácidos nucleicos con la
siguiente interpretación de los resultados obtenidos.
Recibirá instrucción precisa para la realización de las etapas que supone la práctica de
electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa.

Protocolo:
 Pesar 0,25 gr de agarosa.
 Calentar la solución hasta que se disuelva la agarosa cuidando de que al hervir no se
riegue la misma.
 Dejar enfriar la solución hasta aproximadamente 55 0C y agregar 2 microlitros de
SYBR Gold al gel y mezclar bien. Preparar el molde del gel y verter la solución en el
mismo moviendo las burbujas hacia la orilla.
 Colocar la peinilla en el gel y dejar que éste se solidifique, entonces retirar la peinilla
con cuidado.
 En un pedazo de parafilm limpio colocar 5 microlitros de tinta azul por cada tubo de
reacción y mezclar con 7 microlitros de muestra a correr.
 Colocar el gel en la cámara de electroforesis y cubrirlo con TBE 1X. Colocar la mezcla
obtenida en el paso 5, en cada uno de los pocillos del gel preparado anteriormente.
 Proceder a la electroforesis a voltaje constante (90 voltios).

de resultados.
punto 6 de la presente guía.


4.9 Práctica No. 009 – Métodos bioinformáticos aplicados: Árbol

filogenético – No. Sesiones 01

Elaboración de un árbol filogenético mediante plataformas bioinformáticas.

Elaborar un árbol filogenético mediante plataformas bioinformáticas.
4.9.3 Alcance
Esta práctica comprende la generación de tablas y un árbol filogenético
Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el diseño
de filogenia molecular https://actuaciencia.blogspot.com/2018/06/construccion-de-
un-arbol-filogenetico.html y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se realizarán
preguntas acerca de las lecturas.

instrumentos
internet
Conceptos básicos de filogenia
Piensa en como clasificarías diversos animales. Tradicionalmente, las diferencias físicas entre
organismos fueron utilizadas para deducir las relaciones evolutivas entre ellos, por ejemplo, si un
organismo tiene una columna vertebral, o si tiene alas. Sin embargo, esto puede causar problemas.
Por ejemplo, aves, murciélagos e insectos tienen todos ellos alas, pero ¿están estrechamente
relacionados? ¿Cómo calculas el tiempo que ha pasado desde que los organismos divergieron de
un ancestro común?
Sabemos por estudios de secuenciación de ADN que las mutaciones ocurren aleatoriamente a un
ritmo muy lento y son transmitidas de padres a hijos. De este modo, si asumes que todos los
organismos tienen un ancestro común, puedes utilizar las diferencias en secuencias homólogas
para medir el tiempo que ha pasado desde que los organismos divergieron. En otras palabras,
cuanto más tiempo haya pasado desde que dos especies divergieron de un ancestro común, más
diferentes serán sus secuencias de ADN.
Las secuencias homólogas se definen como aquellas secuencias en dos organismos que tienen
un origen común. En realidad no tenemos pruebas de que dos secuencias son homólogas (no
estuvimos allí para observar el cambio del ADN con el tiempo), pero si son suficientemente
similares, a menudo asumimos que son “homólogas”. Para conocer la similitud de dos secuencias,
necesitas alinearlas correctamente (pero esto no forma parte de esta actividad).
Hay que tener en cuenta que las diferentes regiones del ADN - regiones codificantes y no
codificantes - evolucionan a diferentes velocidades. En general, las regiones codificantes
evolucionan más lentamente, ya que una mutación que provoca un cambio en una proteína es
generalmente más costoso para el organismo - es menos probable sobrevivir y dejar
descendencia. Esto es analizado en la actividad “ADN móvil”.
Para ilustrar el concepto de homología, puedes utilizar el ejemplo de filología - el estudio de la
evolución de las lenguas. De hecho, hay muchos paralelismos entre los métodos usados para
estudiar la evolución de las lenguas y la de los organismos. Para leer más clica aquí. Como habrás
visto en la entrada del blog, las palabras derivadas de “factum” son todas muy parecidas. Cuanto
más cerca del origen más se parecen.

Cinco secuencias de ADN de primates
Neandertal (n)
TGGTCCTGCAGTCCTCTCCTGGCGCCCCGGGCGCGAGCGGTTGTCC
Humano (h)
TGGTCCTGCTGTCCTCTCCTGGCGCCCTGGGCGCGAGCGGATGTCC
Chimpancé (c)
TGATCCTGCAGTCCTCTTCTGGCGCCCTGGGCGCGTGCGGTTGTCC
Gorila (g)
TGGACCTGCAGTCATCTTCTGCCCGCCCGAGCGCTTGCCGATGTCC
Orangután (o)
ACAACCTGCACTCCTATTCTGCCGAGCCGGGCGCGTGGCAAAGTCC
Cuenta el número de diferencias entre cada par de secuencias y anótalo en la tabla 1
Distancia proporcional entre dos secuencias: el número de nucleótidos diferentes

entre dos secuencias dividido por el número total de nucleótidos en cada secuencia.
En la tabla, anota el número de nucleótidos diferentes y la diferencia proporcional.

Considera las dos especies que son más similares en secuencias: neandertal y humano.
Usando la tabla 2, puedes empezar a construir el árbol evolutivo:

Conecta neandertales y humanos con una línea. La longitud de las ramas debe corresponder
con el tiempo que pasó desde que los humanos y neandertales divergieron de su ancestro
común.
Vamos a suponer que se necesitarían 20 millones de años para que cada uno de los
nucleótidos de esta particular secuencia de ADN cambien. De este modo, para que la
secuencia de ADN cambie un 0.07, se necesitarían 0.07*20 millones = 1.4 millones de años. La
rama debe medir por lo tanto, 1.4 millones de años en la escala de tiempo.
Para calcular cuánto tiempo hace que el ancestro de los chimpancés divergió del ancestro de
los humanos (longitud de la rama), sumar las diferencias proporcionales en la Tabla 2
Usando la tabla 2, puedes empezar a construir el árbol evolutivo:

Conecta neandertales y humanos con una línea. La longitud de las ramas debe corresponder
con el tiempo que pasó desde que los humanos y neandertales divergieron de su ancestro
común.

Vamos a suponer que se necesitarían 20 millones de años para que cada uno de los
nucleótidos de esta particular secuencia de ADN cambien. De este modo, para que la
secuencia de ADN cambie un 0.07, se necesitarían 0.07*20 millones = 1.4 millones de años. La
rama debe medir por lo tanto, 1.4 millones de años en la escala de tiempo.
Para calcular cuánto tiempo hace que el ancestro de los chimpancés divergió del ancestro de
los humanos (longitud de la rama), sumar las diferencias proporcionales en la Tabla 2.

de resultados.
cuestionario correspondiente a esta práctica es el siguiente:
a) ¿Quién está más relacionado con los españoles que en 1492 invadieron América, los
actuales españoles o la población mestiza americana?
b) ¿Se corresponde el árbol filogenético con las diferencias morfológicas entre las
especies estudiadas?

4.10 Práctica No. 010 – Extracción de Proteínas – No. Sesiones 01

Extracción de proteínas a partir de muestras biológicas

Obtener un extracto de proteínas a partir de muestras biológicas mediante métodos de
lisis y precipitación en frío.
4.10.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio comprende el pasaje de las muestras biológicas, su lisis y
separación de un extracto de proteínas a ser cuantificado en la próxima práctica.

fundamento teórico de la extracción de proteínas y la guía de práctica. Al inicio de la
práctica se realizarán preguntas acerca de las lecturas.

instrumentos
Microcentrífuga refrigerada 1 Para tubos eppendorf 1,5ml
Centrífuga refrigerada 1 Para tubos falcon de 15ml
Micropipetas (1000 ul) 5 calibradas

Refrigeradora 1

El peso de la muestra biológica y los volúmenes de los reactivos a usarse (PBS y Sulfato
de amonio.

Mortero con vástago 5
Pipetas Pasteur de 1,5mL 10 unidades
Guantes de látex 20 pares Talla S, M y L
Puntas de micropipetas de 3 rack
1000uL
Tubos eppendorf de 1,5ml 12
Tubos falcón de 15ml 12
Cajas con hielo 5 5x5cm aproximadamente
PBS 20 ml Frío: NaCl 137 mM, Fosfato
10 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4
Sulfato de amonio saturado 5 ml Frío
Agua destilada 10 ml Fría

Conocimiento de fundamentos de electroforesis y del cálculo de porcentaje de gel de
agarosa en función de la longitud de las moléculas de ácido nucleico a separar.
Conocimiento de manejo del equipamiento necesario para la producción y montaje de
un gel de agarosa.
Extracción de proteínas:
 Pesar 10g de muestra biológica (hígado o carne).
 Colocar un trozo de tejido en el mortero sobre el hielo.
 Agregar 1500 μl PBS.
 Homogeneizar con el vástago hasta disgregar el tejido.
 De ser necesario agregar más PBS para seguir disgregando (anotar el volumen extra
agregado)
 Tomar el extracto líquido con micropipeta (utilizando p1000) evitando aspirar los
trozos menos disgregados de tejido.
 Centrifugar 15 minutos a 14.000 rpm a 4°C
 Colocar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y conservar en hielo.

*PBS (buffer fosfato salino): NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH of 7,4
Precipitación con Sulfato de amonio:

 Realizar las diluciones de la solución saturada de SO4(NH4)2 indicadas a continuación:
% Solución saturada de Sulfato de amonio 0 30 70 100

Volumen de agua (ul) 500 150 350 -
Volumen de Sulfato de amonio saturado (ul) - 350 150 500
 Rotular en la tapa 4 tubos con el % de sulfato de amonio agregado y el Número de

grupo de trabajo (ejemplo para el grupo 4: 30% G4) Agregar en cada uno 100 μl del
extracto crudo de proteínas.
 Agregar 100 μl de las diluciones de SO4(NH4)2 en le tubo correspondiente.
 Agitar vigorosamente durante unos segundos
 Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm.
 Tomar los sobrenadantes obtenidos y pasar a un nuevo tubo con el mismo rótulo, y
descartar el tubo con el pellet.
 Conservar en hielo.

de resultados.


4.11 Práctica No. 011 – Cuantificación de Proteínas – No. Sesiones 01

Cuantificación de proteínas extraídas a partir de muestras biológicas

Construir una curva estándar de proteínas para realizar la cuantificación de extractos.
Cuantificar los extractos de proteínas obtenidos a partir de muestras biológicas.

4.11.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio comprende la elaboración de diluciones seriadas, a partir
de una solución madre de BSA para construir una curva estándar de cuantificación de
proteínas; la medición de la cantidad de proteínas de los extractos por el método de
Bradford mediante espectrofotometría; y el cálculo de su concentración.


instrumentos
Espectrofotómetro 1 calibrado
Juego de Micropipetas (10, 5 calibradas
100 y 1000 ul)

de amonio.

Celdas de espectrofotómetro 25
Pipetas Pasteur de 1,5mL 10 unidades
Guantes de látex 20 pares Talla S, M y L
Puntas de micropipetas 2 rack por cada una
Tubos eppendorf de 1,5ml 12
Cajas con hielo 5 5x5cm aproximadamente
Papel aluminio Medio rollo
PBS 5ml
BSA 5mg
Reactivo de Braford 4 ml
Muestra de proteínas 10ul cada grupo
extraídas

Conocimiento de fundamentos de la reacción de Bradford para la cuantificación de
proteínas.
Curva estándar con BSA:

 Para realizar la curva del estándar preparar por duplicado 5 diluciones en PBS de la
proteína estandar (BSA) entre 0,05 mg/ml a 1 mg/ml. También incorporar a la curva
el valor "blanco" (PBS solo).
 Realizar 2 diluciones seriadas 1/10 de las muestras
Cuantificación de Proteínas:
 Colocar 200 μl del reactivo de Bradford en cada celda del espectrofotómetro que
se va a utilizar.
 Agregar 10 μl de cada dilución del estándar (y del blanco) en las celdas, cuidando
de cambiar la punta entre muestras. También colocar en otras celdas 10 μl de las
muestras (las dos diluciones). CAMBIAR LA PUNTA AL AGREGAR CADA MUESTRA.
 Incubar a temperatura ambiente por un mínimo de 5 minutos (y un máximo de 1
hora).
 Medir la absorbancia a 595 nm en un lector de microplacas.
 Con los valores obtenidos, construir la curva de calibración y calcular la
concentración de los extractos.

de resultados.


4.12 Práctica No. 012 – Electroforesis vertical de Proteínas – No. Sesiones

01

La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los métodos más utilizados para
la purificación, análisis y caracterización de proteínas. La técnica permite separar
moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción
de un campo eléctrico.

Conocer la técnica de electroforesis de proteínas en geles SDS-PAGE.
Separar proteínas de un extracto mediante electroforesis desnaturalizante en geles de
poliacrilamida.
Teñir las proteínas separadas en el gel con azul de Coomasie y determinar su peso
molecular.
4.12.3 Alcance
Esta práctica de laboratorio comprende la preparación de los geles de poliacrilamida
concentrador y desnaturalizante; la electroforesis y la visualización de las proteínas
mediante tinción con azul de Coomasie.


instrumentos
pH-metro 1 calibrado
Agitador magnético 1
Balanzas de precisión 1 calibrada
Microcentrífuga 1 Para tubos eppendorf de 1,5ml
Equipo de electroforesis 1 con accesorios (sistema de montaje y
preparación de geles, espaciadores para geles
de 0,75 mm de espesor, peines para formar 10
pocillos, placas de cristal).
Fuente de electroforesis. 1
Termobloque 1 a 100°C
Agitador orbital. 1
Transiluminador. 1
Sistema de documentación 1

de amonio.

Rotulador indeleble. 2 unidades
Etiquetas adhesivas de papel. 2 unidades
Espátulas. 3 unidades
Tijeras. 2 unidades
Botellas de vidrio 100mL 5 unidades
Botellas de vidrio 1000mL 3 unidades

Papel de filtro. 4 unidades
Matraz 10ml 5 unidades
Vasos de precipitado y probetas 2 de cada una
(10 y 100 ml).
Imán para agitación magnética. 2 unidades
Guantes 10 pares Tallas S, M y L
Juego de micropipetas (1-10 μl, 2 juegos
10-100 μl y 100-1000 μl).
Puntas para juego de 1 rack por cada una
micropipetas
Pipetas Pasteur de 1ml 5 unidades
Pipetas de vidrio 5ml 5 unidades
Peras de goma 2 unidades
Tubos eppendorf de 1,5 ml. 10 unidades
Gradillas para tubos eppendorf 1 unidad
Bandeja de plástico para el teñido 1 unidad
de geles
Extractos proteicos
Solución de acrilamida/bis- 7ml preparado comercial
acrilamida 30%.
Solución tampón para el gel 100ml 18.17g de Tris base en 80ml de
separador Tris-HCl 1.5M pH 8.8 agua destilada. Ajustar el pH
con HCl y completar el volumen
de 100ml con agua destilada.
Solución tampón para el gel 100ml 6.05g de Tris base en 80ml de
concentrador Tris-HCl 0.5M pH agua destilada. Ajustar el pH
6.8 con HCl y completar el volumen
de 100ml con agua destilada.
Persulfato amónico (APS) al 10% 10ml 10g de APS y completar con
agua destilada hasta 10ml
Solución tampón de 1L 30g de Tris base, 144g de
electroforesis Tris-Glicina pH8.3 glicina, 10g de SDS, 800ml de
10X agua destilada y ajustar el pH
con HCl.
Solución de tinción azul de 1L 1 g de azul de Coomasie, 100ml
Coomasie de ácido acético, 400ml de
metanol, completar con agua
destilada hasta 1L
Solución decolorante de geles 1L 100ml de ácido acético, 400ml
de metanol y 500ml de agua
destilada.
Solución de SDS al 10% 3ml 10% peso/volumen
Glicerol. 1ml

Azul de bromofenol al 1% 1ml
2-Mercaptoetanol. 1ml
Glicina (forma ácida) 200g
TEMED (preparado comercial) 1ml
Marcador de peso molecular de 20ul
proteínas
Agua destilada 2L

Conocimiento de fundamentos de la electroforesis de proteínas SDS-PAGE.
Preparación del gel de poliacrilamida

En la presente práctica se va a preparar un mini-gel de 0,75 mm de espesor. Este consta
de un gel concentrador de aproximadamente 2 cm de longitud que contiene los pocillos
para cargar las muestras, y un gel separador de aproximadamente 6 cm. En la figura 1,
se ilustra el montaje del sistema de electroforesis, la preparación de los geles y el
procedimiento a seguir.
Se prepara el sistema de electroforesis mini-gel tal como se indica en la Figura 1 (b).
Preparación del gel separador al 13%

Se mezcla en un matraz (capacidad aproximada de 10 mL) los componentes en el orden
siguiente: 2.5ml de Tampón Tris HCl 1.5M pH 8.8; 0,1ml de SDS 10%; 4.3ml de acrilamida
bisacrilamida 30%; 0.05ml de APS 10%; 0.005ml de TEMED, y agua destilada hasta
completar 10ml.
Con cuidado, utilizando una pipeta Pasteur, se añade la mezcla en el interior del molde
hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma
que quede suficiente espacio para el gel concentrador (se debe calcular 1 cm más de la
longitud de los pocillos del peine) (Fig 1, c).
A continuación, usando una pipeta limpia, se cubre la superficie del gel con agua
destilada. Esto previene el contacto del oxígeno con el gel que inhibe la reacción de
polimerización (Fig 1, d).
La polimerización del gel debe de ocurrir en unos 30 minutos.
Preparación del gel concentrador al 3%

Se elimina el alcohol que cubre el gel separador, y se lava la parte superior del gel 2-3
veces con agua destilada para eliminar cualquier residuo de acrilamida no polimerizada.
Se seca el líquido restante en la parte de superior del gel con papel de filtro con cuidado
de no dañar el gel
Se mezcla en un matraz de 10 ml, los componentes en el orden siguiente: 2.5ml de
Tampón Tris HCl 0.5M pH 6.8; 0.1ml de SDS 10%; 1ml de acrilamida bisacrilamida 30%;
0.1ml de APS 10%; 0.005ml de TEMED; y agua destilada hasta completar 10ml.
Utilizando una pipeta Pasteur, se introduce la solución directamente sobre la superficie

del gel separador (Fig 1, e). Inmediatamente se inserta el peine en la solución
concentradora con cuidado para evitar que se formen burbujas de aire (Fig 1, f).
Se espera hasta que el gel haya polimerizado (aproximadamente 30 minutos).
Se retira el peine cuidadosamente con un movimiento vertical (Fig 1., g). Usando una
botella de lavado, se enjuagan los pocillos 2-3 veces con agua destilada para eliminar
cualquier resto de acrilamida.
Preparación de las muestras

En el tiempo de espera durante la polimerización se preparan las muestras que se van a
cargar en el gel.
Para preparar el tampón de carga se añaden en un matraz de 10ml los siguientes
reactivos: 1ml de Tampón Tris HCl 0.5M pH 6.8; 0.8ml de glicerol; 1.6ml de SDS 10%;
0.4ml de azul de bromofenol al 1%; 0.4ml de 2-mercaptoetanol; y 3ml de agua destilada.
Con ayuda de una micropipeta se toman 20 μl del extracto proteico preparado en
tampón de carga en un tubo eppendorf. No se olvide preparar un tubo eppendorf con
las proteínas estándar de peso molecular conocido.
Se fijan las tapas de los tubos y se calientan en un termobloque a 100ºC durante 5
minutos.
Se centrifugan 15 segundos a máxima velocidad para concentrar el volumen en el fondo
del tubo.
Electroforesis
Se insertan las placas con los geles polimerizados en la unidad de electroforesis tal como
se indica en la Figura 1 (h,i).
Se prepara el tampón de electroforesis 1X a partir de la solución concentrada 10X (se
añaden 100ml de la solución concentrada 10X y 900ml de agua destilada en una botella
de vidrio) y se añade en los reservorios interior y exterior (Fig 1, j).
Se retiran, si las hubiera, las burbujas de aire y restos de acrilamida del interior de los
pocillos, introduciendo tampón de electroforesis en los mismos.
Se aplican las muestras con ayuda de una micropipeta (hasta 20 μl) en los pocillos, en
un orden predeterminado y previamente anotado (Fig 1, k). No se olvide añadir, en un
carril, la solución de proteínas estándar, de peso molecular conocido.
Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis y a la fuente de alimentación y
se aplica corriente eléctrica. La corriente eléctrica recomendada para geles de 0,75 mm
de grosor es un voltaje constante de 100-200V (Fig 1, l,m,n).
La duración aproximada del proceso es de 40-45 minutos. Una vez acabada la
electroforesis, cuando el frente de azul de bromofenol alcanza la parte inferior del gel,
se desconecta la fuente de alimentación, retirándose los electrodos y sacando los geles
de la cubeta de electroforesis. Estos se depositan en la mesa de trabajo (Fig 1, ñ).
Se sacan los geles de acrilamida del interior del molde, separando cuidadosamente con
ayuda de una espátula ambos cristales (Fig 1, p). Se elimina el gel concentrador (Fig 1,
q) y se hace una muesca al gel en una de las esquinas para orientar la posición de las
muestras (por ejemplo en la esquina inferior contraria al patrón de proteínas).
Tinción del gel con azul de coomassie

Las bandas de proteínas, una vez terminada la electroforesis, se visualizan tiñendo los
geles con una solución de azul de coomasie. La tinción se realiza con agitación suave
durante, al menos, 30 min.
Se trasfiere el gel de la placa de vidrio a un recipiente que contiene la solución de tinción
de coomassie (Fig 1, r). Se deja el gel en agitación suave con suficiente volumen de esta
solución a temperatura ambiente durante 1 hora. (Fig 1., s).
Se elimina la solución de tinción con una pipeta y se conserva para futuras tinciones.
Se añade solución decolorante y se incuba en agitación para eliminar el exceso de
coloración hasta que sólo queden teñidas de azul las proteínas, cambiando la solución
decolorante tantas veces como sea necesario. El gel puede estar en esta solución toda
la noche pero se pueden empezar a observar las proteínas en 20 minutos.
Se elimina la solución de desteñido y se añade agua destilada (o acético al 10%). Los
geles pueden conservarse de esta forma durante largos periodos de tiempo de forma
casi indefinida a 4ºC.
Figura 1. Esquema detallado de la práctica de electroforesis vertical de proteínas. Fuente: Maldonado &
Jorrín. Universidad de Córdoba.

de resultados.


4.13 Práctica No. 0013 – PCR en Tiempo Real – No. Sesiones 01

Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo real
Realizar el montaje experimental de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) tiempo real.

Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones de la reacción de qPCR.
4.13.3 Alcance
Es necesario entender los conceptos básicos de la qPCR para poder realizar investigación y/o
diagnóstico molecular. Ya que la PCR en tiempo real es una técnica muy usada en el laboratorio por
ser más sensible y exacta que una PCR convencional. Sin embargo, tiene limitaciones relacionadas
más que nada a la contaminación, por lo que es necesario mantener los materiales e instrumentos
estériles para evitar falsos positivos.
Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el fundamento
teórico de la reacción en cadena de la Polimerasa y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se

instrumentos
Vórtex 1
Juegos de micropipetas de 3 (10, 20, 200, 1000 ul) calibradas
alta precisión

Centrífuga de placas de 96 1 calibrada
pocillos qPCR
Caja con hielo 1
Termociclador en tiempo real. 1 calibrado
Ej: Light Cycler (ROCHE).
Regulador de voltaje 1
Computador con programa de Software de análisis instalado
análisis instalado

Determinar las temperaturas de: denaturación, hibridación o annealing y extensión,
para calibrar la curva en el termociclador adecuada para obtener la amplificación del
DNA diana.

Tubos o placas de PCR de de 1 placa/ 18 tubos 200 ul
calidad óptica
Guantes de nitrilo libres de 30 pares Talla M y L
polvo
nuevas estériles
Toallas de papel 30
Agua grado MiliQ 100 ml estéril
TaqMan Universal PCR kit
Master Mix (Applied
Biosystems)
Sonda Taqman 6000 pmol TAMRA (Quencher)
Control no relacionado 10 ul
Control positivo 10 ul
Blanco (mix sin DNA)
SybrGreen 500 x 20 µL reacción
dNTPs 20 ul 99%
Taq polimerasa 2 ul 5u/ul
Buffer o tampón de reacción 30 ul 10X
Primer 6 ul c/u 10 uM c/u
ADN diana 6 ul

MgCl2 10 ul 50mM
Conceptos básicos sobre replicación del ADN y transmisión de información genética.

Introducción al manejo del equipamiento básico del laboratorio de Biología Molecular
Antes de empezar se debe verificar que el fluoróforo para el ensayo sea el apropiado de acuerdo
con el equipo que se usará. El equipo debe estar calibrado; en caso necesario realizar las
calibraciones pertinentes. El equipo y el software deben estar conectados a un no break
(regulador de voltaje) para evitar que se interrumpa el ensayo o se pierdan datos por falla o por
cambios repentinos en el suministro eléctrico. Las superficies de trabajo deben estar limpias
para evitar la contaminación. Es muy importante trabajar con guantes sin polvo, limpiar las
superficies con papel sin pelusa y detergentes que degraden el ADN o bien con una solución de
hipoclorito de sodio al 10%.
Etapas de la técnica:
a) Extracción de DNA genómico
b) Cuantificación y dilución de DNA
c) Preparación de la mezcla de reacción
d) Preparación de la curva de calibración y controles
e) Colocación de la mezcla de reacción y DNA en la placa para qPCR
f) Amplificación por qPCR del fragmento de DNA endógeno y gen de interés
g) Ajuste de la curva de calibración y obtención de datos
1. Preparar una curva de calibración (ADN) con estándares certificados a diferentes

concentraciones.
a. Se emplean diluciones seriadas los puntos 10%, 1%, 0.1% y 0% de

concentración por cuadruplicado.

2. Reacciones de amplificación. Preparar por duplicado la mezcla de reacción, una para el
marcador endógeno (gen actina por ejemplo) y otra para el gen de interés, tomar en
cuenta controles (no relacionado, positivo y blanco), de acuerdo a las cantidades de la
Tabla.
Reactivo Ci Cf Vol para una reacción de 25 ul

Agua MiliQ __ __ 9,5 ul
TaqMan Universal PCR mix 2x 1x 12,5 ul
Forward 10 uM 150nM 0,375 ul
Reverse 10 uM 150nM 0,375 ul
Sonda 5 uM 50 nM 0,25 ul
ADN molde 50ng/ul 100 ng 2 ul
Volumen total __ __ 25 ul
Paso Temperatura Tiempo (h:min:s) Número de ciclos

1 50 0:02:00 1
1 95 0:10:00 1
1 95 0:00:15 45
2 60 0:01:00
3. Las muestras del ADN que van a ser analizadas deben mantenerse en hielo hasta que se
coloquen en la placa o en los tubos PCR. Procesar cada muestra por duplicado.
4. Todos los reactivos para la PCR deberán descongelarse y homogeneizarse,
cuidadosamente. Mantenerse sobre hielo y tapados para evitar que reciban la luz
directa.
5. Colocar 23 µL de la mezcla de reacción en cada tubo.
6. Agregar 2.0 µL del ADN problema a cada tubo.
7. Una vez preparadas las mezclas, centrifugar los tubos para eliminar burbujas que
pudieran interferir con la lectura de la fluorescencia y la solución quede en el fondo de
los tubos.
8. Preparar el equipo y programar las condiciones para la amplificación.
Descripción del programa de amplificación
9. Ejecutar el programa.
10. Obtención de datos.
a. Establecer el umbral. En el software del equipo desplegar las curvas de amplificación en

escala logarítmica. Primero, el gen endógeno, después el gen de interés. Localizar la
línea umbral en el área donde las curvas sean paralelas. Analizar los datos. Ver la curva
en modo lineal y verificar que el umbral seleccionado quede dentro de la fase
geométrica de ésta.
b. Establecer la línea base. Determinar el número de ciclo en el que la primera curva de
amplificación cruza el umbral y establecer la línea base tres ciclos antes de este punto.

c. Analizar los datos y exportarlos a una hoja de cálculo. De acuerdo al equipo y Software
empleado, lo anterior puede hacerse de manera automática o manual, algunos
programas permiten hacer todo el análisis sin necesidad de exportar a una hoja de
cálculo. Después de seleccionar el umbral y la línea base, el programa generará de
manera automática la curva de calibración y realizará una regresión lineal con los puntos
de la curva. A partir de la regresión calculará los valores de ciclo umbral o Ct para las
muestras problema y de estos últimos se calcula la concentración en porcentaje.
4.13.10 Datos a ser registrados y el método de análisis y de

presentación de resultados.
Se deberá elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la rúbrica detallada de la
presente guía. El cuestionario correspondiente a esta práctica es el siguiente:
a. Se hace una extracción de ADN utilizando columnas de unión a ADN (Qiagen)
para el estudio molecular de mutaciones K-RAS. Al medir en el biofotómetro se
obtiene una concentración de 700 ng/ul en 60 ul de volumen de elución. Para
la PCR se debe trabajar con un mix de primers (Forward y Reverse) que están a
una concentración de 100 uM y estos deben trabajarse a 500 nM como
concentración final.
a. Llevar el ADN a una concentración de 100 ng/ul

b. Indicar que volumen de ADN se debe tomar de la concentración final para
la PCR si se desea tener 150 ng de ADN en la reacción.
b. Se desea hacer la cuantificación absoluta usando PCR en tiempo real para EBV,
para lo cual se corrió la muestra por duplicado y se usó estándares. Se obtuvo
que, el estándar de 1 millón de copias amplificó en el ciclo 21, el estándar de
100 000 copias amplificó en el ciclo 24, el estándar de 10 000 copias amplificó
en el ciclo 27, el de 1000 copias amplificó en el ciclo 30 y el de 100 copias en el
ciclo 32. Si la muestra amplificó en el ciclo 27.5 y su repetición en el ciclo 28.
¿cuál es la cantidad de copias de virus en la muestra?

PCR

4.14 Práctica No. 014 – Ejercicio teórico de caracterización de un virus –

No. Sesiones 01

Elaboración de un árbol filogenético mediante plataformas bioinformáticas.

Elaborar un árbol filogenético mediante plataformas bioinformáticas.
4.14.3 Alcance
Esta práctica comprende la resolución de cuatro ejercicios teóricos.

experimento de Meselson-Stahl y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se realizarán
preguntas acerca de las lecturas.

instrumentos
internet



Conceptos básicos de biología celular y molecular vistos a lo largo del curso
Diario personal del médico militar del Rumiñahui V
Diario del Dr. Clever Moreira, médico militar en misión en la nave interestelar
Rumiñahui V. Día 30 de agosto de 2084.
Al regreso de una misión por la galaxia Galápagos, mi compañero de tripulación, Justo

Empate Saldarriaga, enferma gravemente. Exploro a Justo en búsqueda de señales de
infección y descubro que está incubando un virus alienígena.
Pregunta 1
a) Descubre que este virus porta ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. También averigua
que este virus puede infectar a las células HeLa las cuales dispone en su laboratorio.
i) Cultiva este virus en presencia de células HeLa con uno de los siguientes
radioisótopos:
32 35
P, S y 3H
¿Qué macromolécula viral será marcada con 32P?

¿Qué macromolécula viral será marcada con 3H?
¿Qué macromolécula viral será marcada con 35S?

ii) Analiza el ácido nucleico y encuentra lo siguiente:
Porcentaje
A 27.6%
G 23.2%
T 28,1%
C 24,0%
U 0,8%
¿Qué ácido nucleico tiene el virus? ¿Por qué?
b) Dado que se trata de un virus alienígena, usted quiere determinar qué macromolécula
(ácidos nucleicos, proteínas y lípidos) constituye el material hereditario. Explique cómo
procedería.
Pregunta 2
a) Jupiter Stalin Cedeño, el científico manabita, examina la replicación del ADN para
determinar si es semejante a la replicación del ADN en la tierra. Construye un sistema in
vitro para la replicación del ADN.
i) ¿Cuáles son los 4 componentes moleculares que debe incluir en su sistema?
ii) Antes de la replicación, todo el ADN molde está marcado con 15N ¿Dónde se
encuentra el nitrógeno en el ADN?
iii) Repite los experimentos de Meselson-Stahl. En el siguiente diagrama, dibuje los

resultados que se podrían esperar en cada prueba en los 2 tipos de replicación:
conservadora y semi-conservadora.
b) Jupiter Stalin ha inventado un generador de imágenes de tamaño nanoscópico que le

permite examinar un comienzo de replicación del ADN. El computador le facilita la
siguiente imágen de la horquilla de replicación. Vemos como la replicación está

teniendo lugar en ambas hebras y como las dos bifurcaciones se están separando cada
vez más
En la siguiente horquilla de replicación a) Situa en el dibujo los puntos de crecimiento.

b) Marque los extremos 3' y 5'. c) Indique qué hebras en particular son los fragmentos
de Okazaki. d) ¿A qué sitio (A, B o ambos) puede unirse el primr 5' CAAGG 3' para
iniciar la replicación? e) ¿A qué sitio (A, B o ambos) puede unirse el primer 5' CAAGG
3' para iniciar la replicación? f) Si un primer se une a la secuencia A ¿Cuál es la
dirección de elongación (izquierda o derecha)? g) En la hebra de la posición A la
síntesis de ADN se lleva a cabo de un modo continuo o discontinuo?. h) ¿Qué
fragmento se sintetiza primero C o D?
El cuadrado negro representa a la DNApolimerasaIII
c) Más miembros de la tripulación del Rumiñahui V comienzan a encontrarse mal a

causa de la infección vírica. Mientras le da vueltas al tema, observa que ningún
miembro manabí de la tripulación está enfermo. Habla con Jupiter Stalin, su colega
manabí que le proporciona una muestra de células de pacientes manabitas. Entonces,
decide mezclar el virus con las células de estos pacientes para hacer un seguimiento del
ciclo de la infección en las células sanguíneas manabitas. Cuando analiza estas células
observa que su ADN está altamente modificado con grupos metil en ciertas bases y que
hay una nucleasa peculiar en las células manabitas que desorganiza el ADN regular, no
modificado. ¿Puede proponer un modelo que explique la inmunidad de los manabitas?
Pregunta 3
Su caracterización preliminar del nuevo virus va por buen camino. Descubre que este
virus tiene
1 cromosoma y distingue un segmento del ADN que cree que otorga al virus su
capacidad para infectar. El equipo médico del Rumiñahui quiere que corte ese segmento
de ADN y que lo coloque en un vector para que sea enviado al Centro de Investigación
Médica de Yachay. Mostramos a continuación un esquema del fragmento deseado del
gen viral y una porción de ADN.
a) A continuación mostramos un set de enzimas de restricción que tiene en su

congelador.
SnaB1, EcoRI, RsaI, SalI, BamHI, XbaI
Al lado del nombre de la enzima en cuestión vemos su secuencia (de 5’ a 3’) y una
flecha que señala el lugar donde la enzima “corta”.

i) Señale la enzima o enzimas que NO PUEDEN cortar el fragmento de ADN mostrado
arriba.
ii) Señale cuál es la enzima (s) que deja extremos romos.
iii) Señale la enzima o enzimas que dejan extremos salientes después
de cortar.
iv) ¿Qué enzima única emplearía para quitar el gen del ADN viral?
RsaI
v) ¿Qué par de enzimas diferentes podría utilizar?
b) Desea insertar el fragmento en el vector que mostramos más abajo:
RsaI SalI
SnaBI
Vector
i) ¿Qué enzima o enzimas usaría para cortar los fragmentos deseados del ADN viral?
ii) ¿Qué enzima o enzimas usaría para cortar el vector de ADN?
c) Supongamos que emplea una única enzima para cortar tanto el vector como el
fragmento.
i) Tras ligar el fragmento con el vector, ¿cuántos sitios para esa enzima tendrá el ADN
resultante?
ii) ¿Cuántas moléculas de ADN posibles pueden resultar de este tipo de ligación?
d) Le pasa las maravillosas instrucciones detalladas arriba a un técnico del laboratorio

de Chone que echa a perder el experimento, utilizando sólo la enzima SnaB I para cortar
el vector de ADN, y la RsaI para cortar el fragmento del ADN viral. A continuación liga
el fragmento cortado al vector cortado.
i) ¿Puede arreglar este desbarajuste volviendo a extraer el fragmento con SnaBI?

Explique porque sí o porque no.
ii) ¿Puede arreglar este desbarajuste volviendo a extraer el fragmento con RsaI?
Explique porque sí o porque no.

Pregunta 4
Los científicos del Centro Médico del Rumiñahui V reciben finalmente su vector, pero
encuentran muchas dificultades a la hora de transcribir el vector de DNA con el
fragmento. En su tubo de reacción, tienen el buffer estándar de síntesis de ARN, el
vector de ADN con el fragmento, ADN polimerasa y los trifosfatos ATP, GTP, TTP, y
CTP.
a) Usted piensa, “¡Claro!”, e inmediatamente les envía un paquete con .........................

y .................. lo que les debería permitir sintetizar con éxito ARN del vector de ADN
que contiene el fragmento.
b) Usted piensa que es probable que los científicos del Centro Médico del Rumiñahui
requieran los componentes necesarios para sintetizar proteínas a partir del ARN que
ahora saben hacer. ¿Qué tres componentes esenciales necesita enviar a estos científicos
para que puedan sintetizar proteínas a partir del ARN viral?
c) Mientras tanto, en el Rumiñahui, se desarrolla un análogo de nucleótido denominado

Ajíceltron que puede utilizar como tratamiento contra este virus. El Ajíceltron se adapta
al centro catalítico del ARN Polimerasa del virus e impide que el ARN Polimerasa viral
se ligue al ADN. ¿Qué efecto tendrá el Ajíceltron en la transcripción vírica?
d) El técnico de laboratorio propone emplear Diablumitín. El Diablumitín es una

molécula que semeja un ARNt (transferente) cargado con aminoácidos. Se une al sitio A
de los ribosomas y causa la terminación prematura de la síntesis proteica. ¿Cuál cree
que es el mejor fármaco contra esta infección? Explique su razonamiento.
¿Cómo termina toda esta historia?
A Clever Moreira se le otorga el Premio Pedro Leiva de Biología y Medicina por haber
salvado las vidas humanas del Rumiñahui V y se substituye el festivo del 10 de Agosto
por el Día de Clever Moreira. La Academia Científica de Latam le concede una cátedra.
FIN
4.14.10 Datos a ser registrados y el método de análisis y de

presentación de resultados.
cuestionario correspondiente a esta práctica son las cuatro preguntas planteadas en el
apartado 4.19.9



5 BIBLIOGRAFÍA
 Watson, J. (2008) Molecular biology of the gene. San Francisco, EEUU: Pearson.
 Promega Co. (2010). TECHNICAL MANUAL Wizard® Genomic DNA Purification Kit
Instruccions for Use of Products A1120, A1123, A1125 and A1620 Extraído el día 5 del mes
agosto del año 2014 Desde:
http://worldwide.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Technical%20Manu
als/0/Wizard%20Genomic%20DNA%20Purification%20Kit%20Protocol.pdf
 Life Technologies. (2012). PureLink® Genomic DNA Kits For purification of genomic DNA
Extraído el día 5 del mes agosto del año 2014 Desde:
http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_genomic_man.pdf.
 León J., García J.M. 1992 Manual de Genética Molecular. SINTESIS Ed. Madrid.
 Newton C.R., Graham A. 1994 PCR BIOS. Scientific Publishers Limited Oxford, United
Kingdom.
 Nussbaum R.L., Roderick R.McI., Huntington F.W. 2001 Thompson & Thompson Genetics
in Medicine, W.B. Saunders Company, Philadelphia.
 Paz-y-Miño C., Creus A., Cabré O., Leone P.E. 2002 Genética Toxicológica y Carcinogénesis.
Ediciones ABYA-YALA – FUNDACYT-PUCE.
 Paz-y-Miño C., Arévalo M., Muñoz M.J., Leone P.E. 2005 CYP1A1 genetic polymorphisms
in Ecuador, South America. Disease Markers. 21(2):57-59.
 Strachan T., Read A. 1996 Human Molecular Genetics. Bios Scientific Publishers Limited,
UK.
 Thompson N.W., McInnes R.R., Willard H.F. 1996 Genetics in Medicine.W.B.Saunders
Company, Philadelphia, U.S.A.
 Verma R., Babu A. 1995 Human Chromosomes. Principles and Techniques. McGraw-Hill.
Philadelphia.
 León J., García J.M. 1992 Manual de Genética Molecular. SINTESIS Ed. Madrid.
 Newton C.R., Graham A. 1994 PCR BIOS. Scientific Publishers Limited Oxford, United
Kingdom.
 Nussbaum R.L., Roderick R. McI., Huntington F.W. 2001 Thompson & Thompson Genetics
in Medicine, W.B. Saunders Company, Philadelphia.
 Paz-y-Miño C., Creus A., Cabré O., Leone P.E. 2002 Genética Toxicológica y Carcinogénesis.
Ediciones ABYA-YALA – FUNDACYT-PUCE.
 Paz-y-Miño C., Arévalo M., Muñoz M.J., Leone P.E. 2005 CYP1A1 genetic polymorphisms
in Ecuador, South America. Disease Markers. 21(2):57-59.
 Strachan T., Read A. 1996 Human Molecular Genetics. Bios Scientific Publishers Limited,
UK.
 Thompson N.W., McInnes R.R., Willard H.F. 1996 Genetics in Medicine.W.B.Saunders
Company, Philadelphia, U.S.A.
 Verma R., Babu A. 1995 Human Chromosomes. Principles and Techniques. McGraw-Hill.
Philadelphia
6 MECANISMOS DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
El mecanismo de evaluación es el informe con criterios de evaluación similares para cada una

de las prácticas, por lo tanto, en las prácticas subsecuentes se tendrá en cuenta la rúbrica
consignada a continuación.
CATEGORIA 4 Excelente 3 Bueno 2 Regular 1 por mejorar NOTA

El reporte representa un El reporte El reporte ilustra El reporte
preciso y minucioso representa un un entendimiento representa un
entendimiento de los preciso limitado de los entendimiento
conceptos científicos entendimiento de la conceptos incorrecto de los
Introducción
esenciales en el mayoría de los científicos conceptos
laboratorio. conceptos esenciales en el científicos
científicos esenciales laboratorio. esenciales en el
en el laboratorio. laboratorio.
Especifica claramente los Especifica solamente Los objetivos no No especifica los

objetivos de la práctica en algunos de los son claros objetivos de la
verbo infinitivo, existe un objetivos práctica
objetivo por cada
Objetivos conclusión.
Los procedimientos están Los procedimientos Los Los procedimientos

enlistados con pasos claros. están enlistados en procedimientos no enlistan en
Cada paso está enumerado un orden lógico, están enlistados, forma precisa todos
Metodología
y es una oración completa. pero los pasos no pero no están en los pasos del
Se redacta en pasado y en están enumerados un orden lógico o experimento.
tercera persona y/o no son oraciones son difíciles de
completas. seguir.
Una representación Una representación Una Los datos no son

profesional y precisa de los precisa de los datos representación demostrados o no
datos en tablas y/o en tablas y/o precisa de los son precisos.
gráficas. Las gráficas y las gráficas. Las gráficas datos en forma
Resultados
tablas están etiquetadas y y tablas están escrita.
tituladas. etiquetadas y
tituladas.
La conclusión incluye los La conclusión La conclusión No hay conclusión

descubrimientos que incluye los incluye lo que fue incluida en el
apoyan la hipótesis, descubrimientos aprendido del informe.
posibles fuentes de error y que apoyan la experimento.
lo que se aprendió del hipótesis y lo que se
experimento. Debe existir aprendió del
Conclusión
al menos una conclusión experimento.
por cada objetivo. Las
conclusiones deben ser
personales; por lo tanto, no
incluyen referencias
bibliográficas.

El cuestionario está El cuestionario está El cuestionario está No hay
completo y correctamente incompleto, pero las incompleto, y las cuestionario.
contestado. preguntas respuestas
Cuestionario
contestadas están contestadas son
correctas. incorrectas.
El reporte de laboratorio El reporte de El reporte de El reporte de

está mecanografiado y usa laboratorio está laboratorio está laboratorio está
títulos y subtítulos para escrito a mano con escrito o escrito a mano y se
organizar visualmente el esmero y usa títulos mecanografiado ve descuidado y
Apariencia/Orga material. para organizar con esmero, pero con tachones,
nización visualmente el el formato no múltiples borrones
material. ayuda a organizar y/o desgarres y
visualmente el pliegues.
material.
Varias fuentes de Unas pocas fuentes Unas pocas fuentes El material es

antecedentes de renombre de antecedentes de de antecedentes directamente
son usados y citados renombre son son usadas y copiado en lugar de
correctamente. El material usadas y citadas citadas ponerlo en palabras
es traducido en las propias correctamente. El correctamente, propias y/o las
palabras de los estudiantes. material es pero algunas fuentes de
Referencias
traducido por los fuentes no son de antecedentes están
Bibliográficas
estudiantes en sus renombre. El citadas
propias palabras. material es incorrectamente.
traducido por los
estudiantes en sus
propias palabras.
7 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
En todos los casos, el estudiante deberá incluir las conclusiones y recomendaciones en los
métodos de presentación de los resultados establecidos para cada práctica. Estas deberán estar
relacionadas con los hallazgos o resultados de cada práctica con base en fundamentos técnico –
científicos.

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2 RESULTADOS DE APRENDIZAJE .................................................................... 10

3 INSTRUCCIONES Y MEDIDAS DE SEGURIDAD .............................................. 10

4.1 Práctica No. 001 – Introducción al manejo en el laboratorio y fundamentos

4.1.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 14

4.2.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 16

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4.3.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 18

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4.5.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 23

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4.6.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 26

4.7.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 27

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4.8.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 30

4.9.1 Tema a desarrollar............................................................................................ 32

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4.10.1 Tema a desarrollar ....................................................................................... 35

4.11.1 Tema a desarrollar ....................................................................................... 37

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4.12.1 Tema a desarrollar ....................................................................................... 39

4.13.1 Tema a desarrollar ....................................................................................... 45

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4.14.1 Tema a desarrollar ....................................................................................... 49

6 MECANISMOS DE EVALUACIÓN Y ANEXOS .................................................. 55

7 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................... 57

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