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Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência

Prof. Dr. Marcelo Galindo Lahoud


Toledo - 2018
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O que é líquida?
Técnica para separação ou identificação de uma mistura de componentes por meio
de migração diferencial - devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis.

Fase fixa que contem grande área


superficial - fase estacionária (FE)
e um fluido que se move através da
fase estacionaria - fase móvel
(FM), sendo esta sempre líquida.

A cromatografia (do grego


χρώμα:chroma, cor e γραφειν:"grafein",
grafia)
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HPLC – É uma abreviação do nome em inglês:


High Performance (Pressure) Liquid Cromatography.
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Aplicações – CLAE
Toxicologia Cosméticos e fármacos

 Urina, sangue e cabelo: drogas de abuso


 Desenvolvimento e validação de
 Tecido de animais
metodologias analíticas
 Conteúdo estomacal
 Caracterização de compostos
 Larvas de insetos: química forense

Alimentos
Pesticidas

 Compostos tóxicos
Detecção/quantificação
 Corantes e conservantes
de resíduos pesticidas em
 Macro e micronutrientes
diferentes culturas
 Antibióticos e seus resíduos
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Como é composto um CLAE?
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Requisitos do analito para uso em CLAE
Ser solúvel em algum solvente líquido (na fase móvel utilizada)

Ter diferença de retenção entre os analitos a serem separados.

Força de eluição
FM forte: é um solvente ou uma solução pura que logo elui um analito retido
na coluna (o analito tem maior interação com a FM do que com a FE).

FM fraca: é um líquido que elui devagar o analito retido na coluna (o analito
tem maior solubilidade na FE do que na FM).
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Composição da FM
Isocrático: composição da fase móvel permanece constante ao longo da análise.
 Capaz de separar um número limitado de analitos.

Gradiente: composição da fase móvel


varia durante a análise.

Separação de amostras complexas:


FM fraca (Solvente A) 
para FM Forte (Solvente B).

Exemplo de eluição em modo gradiente


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Características da fase móvel
Ter ↑ grau de pureza
Dissolver a amostra sem
decompor seus componentes Não decompor ou dissolver a
fase estacionária

Ter baixa viscosidade


Degaseificação da FM
Compatível com o detector

Garantia de reprodutibilidade
de vazão Polaridade adequada à separação
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Reservatório do Solvente
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Bombas
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Função: proporcionar vazão constante e contínua de FM a todo o sistema.

REQUISITOS:
 Ser de material inerte

 Pressões de até 6000 psi (~400 atm)

 Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)

 Vazões de 0,1 a 10 ml/min (aplicações analíticas)

 Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1%


Instrumentação em CLAE: misturadores
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Misturador a
Alta Pressão

Misturador a
Baixa Pressão
Tipos de bombas
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Bomba recíproca:
Bomba de seringa (rosca):  Fluxo pulsado que deve ser atenuado
 Saída livre de pulsação  ↓ volume interno
 ↓ capacidade de volume (250 mL)  ↑ pressão de saída (10.000 psi)
 Difícil troca de solventes  Eluição por gradiente
 Vazões constantes

Bomba pneumática de pressão


(deslocamento):
 Barata
 Simples
 Livre de pulsação
 Não permite eluição por gradiente
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Sistema de injeção
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Injeção manual
 As amostras são introduzidas com seringas.
 Após virar a alça, a amostra é carregada pela
fase móvel até o início da coluna.

ALÇA TROCÁVEL
Volumes de 2 a 1000 µL
Sistema de injeção
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Injeção manual Amostrador automático


 As amostras são introduzidas com seringas. As amostras são postas em um frasco localizado dentro do
 Após virar a alça, a amostra é carregada pela amostrador.
fase móvel até o início da coluna.  Mede o volume correto para injeção.
 Injeta a amostra.
ALÇA TROCÁVEL  Prepara o injetor para uma próxima amostra
Volumes de 2 a 1000 µL
Sobrecarga de Volume da amostra
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 Para aproveitamento de todos os pratos que uma coluna possui, não se deve injetar um
volume maior que 1% do volume da coluna vazia.

𝑉𝑚𝑎𝑥(µL)= π(raio)2 (comprimento) (0,01)


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Pré-coluna
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 Instalada entre o injetor e a coluna

 Funções:

Remover partículas;

Remover substâncias que teriam forte interação com a coluna;

Remover substâncias que possam precipitar quando em contato com FM e FE.

Resumindo: aumentar o tempo de vida das colunas.

As pré-colunas devem ser substituídas regularmente


Colunas
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 Tubo: aço inoxidável que contém a FE.

 Colunas capilares e nano: tubos de sílica fundida


Colunas
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Colunas
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Colunas
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Colunas
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Colunas
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Colunas
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Fase estacionária
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Fase estacionária
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Fase estacionária
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Fase estacionária
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Fase estacionária
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Tipos de cromatografia líquida
Uma forma comum de agrupar as técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência é
pelo mecanismo de separação (que esta envolvido basicamente com a coluna [FE] ) :
Adsorção;
 Partição;
Troca iônica;
 Cromatografia por exclusão;
 Cromatografia por afinidade;
Cromatografia de Adsorção (ou líquido-sólido)
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Separa solutos com base em sua adsorção à superfície da FE (sílica ou alumina).


 Soluto e eluente são atraídos pelos sítios polares da FE.

Separação de ácidos graxos, álcoois, aminas, antioxidantes, corantes, fenóis, lipídios,


vitaminas lipossolúveis, etc.

 Pode reter solutos polares tão fortemente que são adsorvidos de modo irreversível. Ex.
água.
Fase estacionária
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Cromatografia de Partição (líquido-líquido)
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Os solutos são separados com base na partição entre a FM líquida e uma FE revestida
em um suporte sólido  FE é líquida e imiscível a FM

Antigamente usava-se coluna com a FE adsorvida ao suporte, no entanto, colunas mais


modernas a FE estão ligadas quimicamente ao suporte (geralmente sílica).

Grupo silanol organoclorossilano siloxano


Recheios de fase Normal e Reversa
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 Fase normal : A FE é polar e a FM é apolar

 Fase reversa : A FE é apolar e a FM é polar.


Fase estacionária quimicamente ligada
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Fase estacionária quimicamente ligada
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Fase estacionária quimicamente ligada
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Fase reversa
Fase estacionária quimicamente ligada
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Fase estacionária quimicamente ligada
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Fase estacionária quimicamente ligada
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Efeito do comprimento da cadeia na retenção
Fase estacionária quimicamente ligada
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Cromatografia de troca iônica
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 Solutos são separados por sua adsorção a um suporte contendo cargas fixas na superfície
Trocador de cátions - grupo com carga
negativa  separa íons positivos.
FE
Trocador de ânions - grupo com carga
positiva  separa íons negativos.

FM forte: solução com ↑ [ ] de íons concorrentes.


FM fraca: solução com ↓ [ ] de íons concorrentes.

Aplicação: separação de peptídeos, proteínas e biopolímeros.

Coluna supressora – 2ª coluna com carga oposta a 1ª


 ↓ a condutividade dos íons concorrentes sem afetar o
sinal da amostra.
Fase estacionária iônica
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Fase estacionária iônica
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Fase estacionária iônica
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Cromatografia de exclusão
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A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das moléculas.

Coluna: matéria inerte  poros com tamanho controlado  moléculas menores


penetram a maioria dos poros.

FE: sílica, gel ou polímero

Aquosa - filtração em gel


FM
Orgânica - permeação em gel

Aplicação: Estimar massa molecular de


proteínas, separação de biomoléculas,
remover solutos pequenos de grandes
agentes, como proteínas.
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Fase estacionária polimérica
Fase estacionária polimérica
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Cromatografia de afinidade
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Emprega interações específicas entre um tipo de molécula do soluto e uma segunda


molécula que está ligada covalentemente (imobilizada) na FE.

Interações biológicas seletivas e reversíveis.


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55 Fase estacionária reversa: otimização
Exercício
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Fase Móvel
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Detectores para CLAE
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 Características ideais de um detector:

Alta sensibilidade
Boa estabilidade e
reprodutividade
Resposta linear e rápida,
independente da vazão
Insensível a variações de
temperatura e pressão

Alta confiabilidade e fácil uso


Seletividade, precisão e
exatidão

Não destruir a amostra


Tipos de detectores para CLAE
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Detector por absorbância
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Aplicação: compostos que absorvem no UV-Vis Mais utilizado


70% das aplicações

Vantagens: Três tipos:


 Alta sensibilidade  Comprimento de onda fixo
 Não destrutivo  Comprimento de onda variável
 Permite trabalhar com gradiente  Comprimento de onda múltiplo
 Responde a uma larga faixa de [ ]  Detetor com Arranjo de Diodos - DAD
 Relativamente insensível a variação de T
e da vazão da FM

Desvantagens
 Detecta somente substâncias que
absorvem no UV-Vis
Exercício
Detector por Índice de refração
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 Mede a capacidade dos analitos em desviar e refletir um feixe de luz.


Desvantagens
Vantagens:
 Baixa sensibilidade;
 Universal (IR analito seja diferente da FM);
 Sensível a temperatura;
 Cobre ampla faixa de RI (1,000 – 1,750);
 Sensível a vibração
 Não destrutivo a amostra.
 Não permite trabalhar com gradiente
Escopo da cromatografia líquida
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Escopo da cromatografia
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líquida
Avanço da Cromatografia líquida
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 Diminui ainda mais o tamanho de partícula de coluna


 Melhorar a resolução
 Diminui o tempo de análise
 Demanda maior pressão ~1000 bar  bomba que suporta
Exercícios
Lista de exercícios

Fundamentos de química analítica Skoog

 HPLC: 32.1; 32.2; 32.3; 32.7; 32.9;32.16


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Referências bibliográficas
 HAGE, D. S.; CARR, J. D. Química analítica e análise quantitativa. Editora Pearson, 2012.

 COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentos de Cromatografia. Editora Unicamp,


2006.

 SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental. 5ª edição, Editora


Bookman, 2006.

 SNYDER, L.R; KIRKLAND, J.J.; DOLAW, J.W. Introduction to modern liquid chromatography. 3ª
edição, Wiley, 2009.