UNIVERSIDAD NACIONAL DE JULIACA

ESCUELA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

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ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA

EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

PRACTICA DE LABORATORIO Nº 02
DETERMINACION DE CARACTERISTICAS QUIMICAS DE
LAS FRUTAS Y HORTALIZAS

PRESENTADO POR:

YANETH YUCRA LIMAHUAYA

DOCENTE:
ING. ROGER
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PRACTICA N° 02

DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR EL

METODO DE RECUENTO POR DISOLUCION EN TUBO NMP

I. INTRODUCCION

Debido a que un gran numero de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando
como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con un microorganismo que funcionen
como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos
de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y
deben de ser capaces de desarrollarse extra intestinalmente.

Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual
comprende a todos los bacilos gram negativos aerobios o anaerobios facultativos,no esporulados,
que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 horas a 35°C 1°C. este
grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: enterobacter, echerichia, citobacter y
klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, esta constituidos por bacterias gram-negativas capaces de

fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 horas de incubación a 44.5°C 1°C. este grupo
no incluye la especie determinada, sin embargo la mas prominente es Echerichia Coli. La
demostración y el recuento de microorganismo coliformes, puede realizarse mediante el empleo
de medios de cultivo líquidos y solidos con características selectivas y diferenciales.

II. OBJETIVOS
 Familiarizarse con los métodos de recuento, especialmente con el de NMP
 Detectar bacterias coliformes totales y fecales en los alimentos
 Detectar si la muestra traída es apta para el consumo humano
III. MARCO TEORICO

Método mas probable (NMP)

Se basa en la determinación de presencia o ausencia de un determinado tipo de microrganismos
(en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio).

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método mas probable (NMP),

fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de
acido y gas tras incubarlos a 35 °C durante 48 horas, utilizando un medio de cultivo que contenga
sales biliares
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IV. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales de laboratorio

 Tubos de ensayo de 12 ml aprox.

 Gasa
 Algodón
 Pabilo
 Jeringas de tuberculina
 Asas de cohi
 Mecheros
 Alcohol
 Agua destilada
 Cajas Petri
 Pipetas de 10 ml
 Propipetas
 Campanitas de Durham

Equipos

 Estufa
 Autoclave
 Cuenta colonias
 Incubadora

Reactivos

 Caldo lauril sulfato

 Caldo verde brillante bilis
 Caldo EC
V. PROCEDIMIENTO

Preparación de prueba presuntiva

a) Preparamos el Caldo Lauril Sulfato de acuerdo a lo indicado en el frasco del caldo

35.6 gr ---------- 1000 ml

X ----------- 170 ml

X = 6.052 gr de Caldo Lauril Sulfato

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b) Pesamos la cantidad calculada del caldo, después lo disolvemos el caldo en un matraz con
170 ml de agua destilada.
c) Colocamos el caldo en nueve tubos 9 ml en cada tubo de ensayo
d) Utilizamos agua peptonada como diluyente de la muestra (queso), ya que el queso es una
muestra solida utilizamos el equipo para poder diluir bien, después realizamos la predilución
10-1, 10-2, 10-3 y agitar los tubos para homogenizar la muestra.
e) Luego transferir 1 ml de la muestra de queso prediluida a cada uno de los tubos con caldo
lauril sulfato de sodio (9 ml), después agitamos los tubos para homogenizar.
f) Incubamos los tubos a 37 °C por 48 horas, observar si hay formación de gas (flotación de la
campanita de Durham).

Preparación de la prueba confirmativa

Para coliformes totales

a) Para la preparación del CALDO VERDE BRILLANTE BILIS , primero pesamos la

cantidad de caldo según lo indicado en el frasco del caldo, luego disolvemos lo pesado en
170 ml de agua destilada.
b) luego colocamos 9 ml de la disolución en los tubos de ensayo.
c) Después transferimos 1 asada de cada tubo positivo obtenido de la prueba presuntiva, a los
tubos que contienen CALDO VERDE BRILLANTE BILIS (VBB) con campana de
Durham.
d) Incubamos a 35°C durante 48 horas.
e) Registrar como positivos los que presenten turbidez y producción de gas después de un
periodo de incubación de 48°C, y lecturamos con las tablas del (NMP) de tres tubos .
f) Consultar la tabla de NMP de tres tubos para conocer el numero mas probable de organismos
coliformes totales.
Para coliformes fecales
a) Para la preparación del CALDO E.C. se prepara de acuerdo a lo indicado en el frasco del
caldo, después el caldo pesado lo disolvemos en agua destilada 170 ml.
b) Luego transferimos 9 ml del caldo en los nueve tubos.
c) Transferimos 1 o 2 asadas de cada tubo positivo obtenido de la prueba presuntiva a los tubos
que contienen CALDO E.C. con las campanitas de Durham.
d) Incubamos en baño maría a 44.5°C
e) Registramos como positivos todos los tubos que se observe crecimiento y producción de
gas (flotación de la campanita de Durham) de un periodo 48 horas.
f) Lecturamos con la tabla (NMP) de tres tubos para poder conocer el numero mas probable
de microorganismos coliformes fecales.
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VI. RESULTADOS Y DICUSIONES

El grupo de bacterias coliformes incluye bacilos aeróbicos y anaeróbicos facultativos, Gram-

negativos, no esporíferos que fermentan lactosa y forman ácido y gas a 35°C dentro de 48
horas. Los miembros de Enterobacteriacae abarcan la mayoría de este grupo, pero
organismos tales como Aeromonas spp. también pueden ser incluidos. Los procedimientos
para detectar y confirmar coliformes se utilizan en las pruebas de agua, alimentos, productos
lácteos y otros materiales. El caldo de bilis verde brillante al 2% se utiliza para confirmar un
resultado de prueba presuntivo positivo

Estos términos ayudan mucho para la diferenciación, ya que otorga más veracidad y
un alto grado de certeza si la contaminación que presenta el agua es de origen fecal.
***http://es.wikipedia.org/wiki/Coliforme (05/10/08). Las investigaciones
ecológicas han demostrado que E. Coli proviene del tracto intestinal del hombre y de
los animales de sangre caliente, si puede sobre vivir e incluso multiplicarse en otros
nichos apropiados. Por lo tanto, la presencia de esta bacteria indica que puede haber
existido contaminación fecal y que el consumidor podría expuesto a patógenos
entéricos cuando ingiere el alimento. Para la evaluación higiénica de alimentos crudos
o de productos que no habían sido sometidos al tratamiento de inocuidad completo
mediante calor, E. Coli es el microorganismo índice mas valido. *** D. A. A. Mossel,
B. Moreno García, C. B. Struijak, 2ª edición, “Microbiología de los Alimentos”, Editorial
Acribia, Pág. 413-414. Se utiliza a veces también la denominación coliformes fecales
refiriéndose a los microorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa
en un medio que contiene sales biliares u otros agentes selectivos equivalentes y que
se incuba a 44-45°C *** D. A. A. Mossel, B. Moreno García, 1ª edición, “Microbiología
de los Alimentos”, Editorial Acribia, Pág. 142-144. Los coliformes son bacilos cortos
que se han definido como bacterias aerobias o anaerobias facultativas que fermentan
la lactosa con producción de gas. Las principales especies de bacterias coliformes son
el E. Coli y Enterobacter Aerogenes; no obstante, las especies que es posible que se
ajusten a estos criterios, son mas de veinte, encontrados entre las mismas especies
de otros géneros de la familia Enterobacteriaceae e incluso especies de Aeronomos.
El grupo de coliformes fecales incluye a los coliformes capaces de crecer a
temperatura elevada (44.5 o 45°C). ***1ª Edición,”Microbiología de los alimentos”.
Editorial Acribia, Pág. 570. Escherichia Coli La especie E. Coli es considerada
generalmente como integrante de la flora normal del tracto intestinal del hombre y
de los animales. La temperatura óptima de crecimiento del microorganismo es de
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37°C, con un intervalo de crecimiento de 10 a 40°C. Su pH optimo de crecimiento es

de7.0 a 7.5 con un pH mínimo de crecimiento de valor de 4.0 y un pH máximo de
crecimiento de valor de 8.5. Este microorganismo es relativamente termosensible y
puede ser destruido con facilidad a temperaturas de pasteurización y también
mediante la apropiada cocción de los alimentos. ***1ª Edición,”Microbiología de los
alimentos”. Editorial Acribia, Pág. 72. Es quizás el organismo procarionte más
estudiado por el ser humano, se trata de una bacteria que se encuentra generalmente
en los intestinos animales —incluido el humano— y por ende en las aguas negras.
Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo
alemán, quién la denominó Bacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó
el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor. Ésta y otras bacterias son
necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo. Además produce
vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram, es
anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma
esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++-
-. Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y
biotecnología molecular.
***http://es.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli(23/10/2008). Klebsiella Muchas
bacterias de este género son capsuladas. Se encuentran con frecuencia en las vías
respiratorias y en el tubo intestinal del hombre. K. Pneumoniae es el agente causal
de una neumonía de etiología bacteriana en las personas. ***1ª
Edición,”Microbiología de los alimentos”. Editorial Acribia, Pág. 58. Es un género de
bacterias no mótiles, Gram-negativas, con una prominente cápsula de polisacáridos.
Es un frecuente patógeno humano, los organismos bacteriales del género Klebsiella
pueden liderar un amplio rango de estados infecciosos, notablemente neumonía.
Entre ellos, cabe destacar los siguientes: -Klebsiella pneumoniae: infecciones del
tracto urinario, septicemia, e infecciones de tejidos blandos. -Klebsiella ozaenae:
rinitis atrófica. -Klebsiella rhinoscleromatis: infecciones en vias respiratorias,
causando rhinoescleroma o escleroma.
***http://es.wikipedia.org/wiki/Klebsiella(23/10/2008). Enterobacter Algunas
especies de este género se incluían antiguamente en el género de Aerobacter. Estas
bacterias son muy abundantes en la naturaleza. El género pertenece al grupo
Coliforme. ***1ª Edición,”Microbiología de los alimentos”. Editorial Acribia, Pág. 57.
Enterobacter es un género de bacterias Gram negativas facultativamente anaeróbicas
de la familia de las Enterobacteriaceae. Muchas de estas bacterias son patógenas y
causa de infección oportunista en huéspedes comprometidos, generalmente
hospitalizados. Causa preferentemente infección del tracto urinario y del tracto
respiratorio. ***http://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacter(23/10/2008) .