Marilu Flores

Facultad de Farmacia
INCIDENCIA Y NIVELES DE OCRATOXINA A Y

CINCO ANÁLOGOS EN VINO TINTO
Rebeca Remiro Íñigo
TESIS DOCTORAL
Facultad de Farmacia
El presente trabajo de investigación titulado:
INCIDENCIA Y NIVELES DE OCRATOXINA A Y CINCO

ANÁLOGOS EN VINO TINTO
que presenta Dª Rebeca Remiro Íñigo para aspirar al grado de

Doctor por la Universidad de Navarra, ha sido realizado en el
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica, bajo la
dirección de la Dra. Elena González-Peñas y la Dra. Elena
Lizarraga Pérez.
Pamplona, diciembre de 2011
Dra. Elena González-Peñas Dra. Elena Lizarraga Pérez

AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
Me gustaría expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a

todas las personas que han contribuido a la realización de esta tesis
doctoral.
En primer lugar, gracias a la Universidad de Navarra por su apoyo e

impulso a la investigación científica y el cuidado de sus alumnos.
A las entidades que han financiado el proyecto y las becas recibidas

para su elaboración: Plan de Investigación de la Universidad de Navarra
(PIUNA), Fundación Caja Navarra y Asociación de Amigos de la
Universidad de Navarra.
A las bodegas navarras que han cedido de manera desinteresada

muestras de vino para este estudio: Aristu, Azpea, Biurko Gorri, Lezaún,
Iturbide, Navarsotillo y Vega del Castillo. A la Dra. Eleni Pontiki por el
envío de las muestras griegas.
Al Dr. Antonio Monge, director de CIFA, y a todas las personas que

forman parte de este centro, por todos los momentos compartidos. A
Estefanía y, en especial, a Carlos por su amabilidad, disposición y el
interés mostrado. A Laura por su ayuda con el inglés de esa manera tan
graciosa y singular.
A las doctoras Elena González-Peñas y Elena Lizarraga Pérez,

directoras de esta investigación, muchas gracias por compartir conmigo
vuestra experiencia y por mostrarme siempre vuestra confianza y
comprensión.
A mis compañeros de laboratorio, los que estaban al empezar esta

etapa y los que están al acabarla. A Susana, fuiste mi maestra en el
manejo del HPLC y en el mundo de las ocratoxinas, es imposible olvidar
tu sonrisa y paciencia en tus lecciones. A Mayte y Teresa, que aún con
mi “desorden” habéis estado conmigo cada día, ayudándome y
apoyándome siempre. A Ángel, por socorrerme ante los problemas
AGRADECIMIENTOS
dejando de lado tus asuntos con tal de auxiliarme. Sin duda, lo mejor
que me llevo de estos años es vuestra amistad, surgida entre matraces
y debates cromatográficos y confirmada en la vida personal. Ha sido un
placer trabajar a vuestro lado.
A todas las personas que han pasado por el laboratorio durante

estos años, en especial a Olaia, por tus ganas de aprender, por
escucharme y reírte conmigo.
A los que forman parte del departamento vecino, Toxicología, en

especial a Ariane, Leire, Amaia, Cecilia, Celia y David por todos los
buenos momentos vividos, por preocuparos por mí y por esta tesis, por
animarme y compartir conmigo vuestro buen humor. A la Dra. Adela
López de Cerain, por su ayuda e interés, y dedicar siempre una sonrisa.
A mis químicas, Asun, Lau, Ele y Mary por escucharme y

aconsejarme siempre y por contagiarme vuestra alegría. Habéis vivido,
y sufrido esta tesis conmigo, en especial y más de cerca María, pero hoy
ya la acabamos (en plural). Ele, en este momento ¡doctoras a tu tercera
química! Lau, Asun, tengo que daros las gracias una vez más por todo lo
que habéis hecho por mí, habéis sido mis muletas, no me habéis dejado
caer y me habéis ayudado a levantar, nunca podré olvidarlo. Sin
vosotras este día nunca hubiera llegado.
Dicen que los verdaderos amigos son los que aún conociendo todo
sobre ti, te siguen queriendo. Gracias a Robe, David, Itzi, Pau, Patxi y
Monty por quererme y creer en mi. Me habéis acompañado en los malos
momentos y convertido en “brujeta” en los buenos ¡gracias! Hemos
demostrado que nuestra amistad es más fuerte que cualquier altibajo y
así será aunque un océano nos separe.
A todas las personas de Mirafuentes que en estos años me han

mostrado su apoyo y cariño, en especial a Maite, Lucía, Silvi y Silvia, y a
los incondicionales de las 8. Alda, siempre estarás en mi corazón.
AGRADECIMIENTOS
A toda mi familia por vuestro interés y cariño. Gracias, en especial,

a mi tía Ana y abuela Tutus por cuidarme siempre, preocuparos por mí y
ponerle velas a la Virgen para que todo me fuera bien.
A mis padres, Vicente y Emma, no hay palabras para describir el

agradecimiento enorme que siento. Sin vuestro esfuerzo, comprensión y
apoyo no hubiera conseguido esto.
¡¡GRACIAS A TODAS Y A TODOS!!

ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
AOAC: Asociación Oficial de la Comunidad Analítica

AEFI: Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria
ANOVA: Test de Análisis de la Varianza (Analysis of variance)
BPL: Buenas Prácticas de Laboratorio
CCAH: Comité Científico de la Alimentación Humana
CE: Comunidad Europea
CIA: Columnas de Inmunoafinidad
CIT: Citrinina
CPAEN: Consejo de la Producción Agraria de Navarra
CV: Coeficiente de Variación
DL50: Dosis Letal 50
D.O.: Denominación de Origen
EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food
Safety Authority)
ELISA: Ensayo Inmunoenzimático en Fase Sólida
ELL: Extracción Líquido-Líquido
ER: Error relativo
EURACHEM: Asociación Europea de Química Analítica
EtOTα: Etil éster de ocratoxina α
EtOTB: Etil éster de ocratoxina B
FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura (Food and Agricultural Organization of the United Nations)
FDA: Agencia Americana para alimentos y medicamentod (Food and
Drug Administration)
FLD: Detector de Fluorescencia (Fluorescence detector)
FR: Factor Respuesta
GC-MS: Cromatografía Gaseosa con Detector de Espectrometría de
Masas (Gas Chromatography – Mass Spectrometry)
HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución (High Permormance
Liquid Chromatography)
ABREVIATURAS
HPTLC: Cromatografía en Capa Fina de Alta Resolución (High

Permormance Thin Layer Chromatography)
IARC: Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer
(International Agency for Research on Cancer)
IC: Intervalo de Confianza
ICH: Conferencia Internacional de Armonización (International
Conference of Harmonization)
IGT: Indicación Geográfica Típica
IT: Trampa iónica (Ion Trap)
IUPAC: Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (International
Union of Pure and Applied Chemistry)
JECFA: Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios
(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)
LC: Limite de Cuantificación
LC-MS: Cromatografía Líquida con Detector de Espectrometría de Masas
(Liquid Chromatography – Mass Spectrometry)
LD: Límite de Detección
LOAEL: Nivel Más Bajo al que se Observan Efectos Adversos (Lowest
Observed Adverse Effect Level)
MeOTα: Metil éster de ocratoxina α
MeOTA: Metil éster de ocratoxina A
MeOTB: Metil éster de ocratoxina B
MIP: Polímeros Marcados Molecularmente (Moleculary Imprinted
Polymers)
MS: Detector de Espectrometría de Masas (Mass Spectrometry)
MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
NCF: Normas de Correcta Fabricación
NEB: Nefropatía Endémica de los Balcanes
NEL: Nivel Sin Efecto (No Effect Level)
ABREVIATURAS
NOAEL: Nivel al que No se Observan Efectos Adversos (No Observed

Adverse Effect Level)
OIV: Organización Internacional de la Vid y el Vino
OMS: Organización Mundial de la Salud
OTα: Ocratoxina α
OTA: Ocratoxina A
OTB: Ocratoxina B
OTC: Ocratoxina C
PAT: Patulina
PBS: Tampón Fosfato Salino (Phosphate Buffer Saline)
PM: Peso Molecular
PTDI: Ingesta Tolerable Diaria Provisional (Provisional Tolerable Daily
Intake)
PTWI: Ingesta Tolerable Semanal Provisional (Provisional Tolerable
Weekly Intake)
SCOOP: Programa de Cooperación Científica de la Unión Europea en
Cuestiones Relacionadas con la Seguridad Alimentaria (Scientific
Cooperation on Questions Relating to Food)
SPE: Extracción en Fase Sólida (Solid Phase Extraction)
SPME: Microextracción en Fase Sólida (Solid Phase Micro-Extraction)
TDI: Ingesta Tolerable Diaria (Tolerable Daily Intake)
TOF: Tiempo de vuelo (Time of Flight)
TWI: Ingesta Tolerable Semanal (Tolerable Weekly Intake)
TLC: Cromatografía en Capa Fina (Thin Layer Chromatography)
UE: Unión Europea
UV: Ultravioleta
WHO: Organización Mundial de la Salud (World Health Organization)
ÍNDICE
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ...........................................................................1
1. MICOTOXINAS ..................................................................... 3
ORIGEN E HISTORIA ........................................................ 5
TOXICIDAD DE LAS MICOTOXINAS .................................... 5
PRESENCIA DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS .................... 8
INGESTA Y EVALUACIÓN DEL RIESGO .............................. 10
2. OCRATOXINAS ................................................................... 13
ESTRUCTURAS QUÍMICAS............................................... 13
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS ..................................... 15
MÉTODOS DE ANÁLISIS DE OCRATOXINAS ....................... 16
Determinación simultánea de ocratoxinas .................... 18
TOXICIDAD................................................................... 19
Toxicidad de la ocratoxina A ....................................... 20
Toxicidad combinada ................................................. 22
PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN ALIMENTOS .................. 23
INGESTA DIARIA TOLERABLE DE OTA .............................. 25
LEGISLACIÓN................................................................ 27
3. OCRATOXINAS EN VINO ...................................................... 29
4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS ............................... 37
MUESTREO ................................................................... 40
APLICABILIDAD ............................................................. 41
ESTABILIDAD ................................................................ 41
ROBUSTEZ.................................................................... 42
SELECTIVIDAD .............................................................. 42
LINEALIDAD.................................................................. 43
PRECISIÓN ................................................................... 46
EXACTITUD................................................................... 47
LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .................... 47
JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y OBJETIVOS.............................51
I
ÍNDICE
MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................. 55

1. MATERIAL.......................................................................... 57
REACTIVOS .................................................................. 57
APARATOS Y EQUIPOS ................................................... 58
2. MUESTRAS ........................................................................ 63
VINOS TINTOS NAVARROS ............................................. 63
Vinos de agricultura tradicional................................... 64
Vinos ecológicos ....................................................... 65
Condiciones climatológicas ......................................... 66
VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ................................ 67
Vinos de España ....................................................... 68
Vinos de Francia ....................................................... 70
Vinos de Italia .......................................................... 71
Vinos de Croacia....................................................... 72
Vinos de Grecia. ....................................................... 73
Vinos de Turquía ...................................................... 74
Vinos de Israel ......................................................... 76
Vinos del norte de África............................................ 77
3. MÉTODOS......................................................................... .79
DISOLUCIONES MADRE DE OCRATOXINAS ....................... 79
DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO .......................... 81
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN ........................................ 81
DETERMINACIÓN POR HPLC-FLD ..................................... 83
CONFIRMACIÓN POR LC-MS............................................ 83
4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO.................................. 85
SELECTIVIDAD .............................................................. 85
LINEALIDAD E INTERVALO.............................................. 86
RECUPERACIÓN............................................................. 88
LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .................... 89
ROBUSTEZ.................................................................... 89
II
ÍNDICE
ESTABILIDAD ................................................................ 90
CONTROL DE CALIDAD DEL MÉTODO ............................... 90
5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...................................................... 91
RESULTADOS .............................................................................93
1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO ........................... 95
DISOLUCIONES MADRE DE OCRATOXINAS ....................... 95
DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO .......................... 96
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN ........................................ 97
PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO ........... 99
MÉTODO DEFINITIVO ................................................... 101
METIL Y ETIL ÉSTERES DE LA OTB Y DE LA OTα. ............. 102
CONFIRMACIÓN POR LC-MS .......................................... 105
2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO................................ 113
SELECTIVIDAD ............................................................ 113
LINEALIDAD................................................................ 114
RECUPERACIÓN........................................................... 123
LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .................. 127
ROBUSTEZ.................................................................. 128
ESTABILIDAD .............................................................. 131
CONTROL DE CALIDAD DEL MÉTODO ............................. 134
3. TRANSFORMACIÓN DE OTC EN OTA .................................... 137
4. PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN VINOS NAVARROS ........... 141
VINOS DE AGRICULTURA TRADICIONAL ......................... 141
VINOS DE AGRICULTURA ECOLÓGICA ............................ 143
PRESENCIA SIMULTÁNEA DE OCRATOXINAS
EN VINOS NAVARROS .................................................. 145
INFLUENCIA DEL TIPO DE AGRICULTURA
EN LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS ............................. 146
INGESTA DE OTA Y OCRATOXINAS A PARTIR
DE VINO TINTO NAVARRO ............................................ 148
III
ÍNDICE
RELACIÓN ENTRE LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS ........ 149

OCRATOXINAS Y CLIMA................................................ 151
5. OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ........ 153
VINOS DE ESPAÑA....................................................... 153
VINOS DE FRANCIA ..................................................... 153
VINOS DE ITALIA ........................................................ 154
VINOS DE CROACIA ..................................................... 155
VINOS DE GRECIA ....................................................... 155
VINOS DE TURQUÍA ..................................................... 156
VINOS DE ISRAEL........................................................ 157
VINOS DEL NORTE DE ÁFRICA ...................................... 157
EN VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ......................... 158
INFLUENCIA DEL PAÍS DE ORIGEN
DISCUSIÓN.............................................................................. 169
1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO ......................... 171
DISOLUCIONES MADRE DE OCRATOXINAS ..................... 171
DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO ........................ 173
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN ...................................... 174
PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO ......... 176
METIL Y ETIL ÉSTERES DE LA OTB Y DE LA OTα .............. 178
CONFIRMACIÓN POR LC-MS.......................................... 180
VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO........................... 183
SELECTIVIDAD ............................................................ 183
LINEALIDAD................................................................ 184
RECUPERACIÓN........................................................... 186
LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .................. 186
ROBUSTEZ.................................................................. 187
IV
ÍNDICE
ESTABILIDAD .............................................................. 187

CONTROL DE CALIDAD DEL MÉTODO ............................. 188
2. TRANSFORMACIÓN DE OTC EN OTA .................................... 189
3. PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN VINOS NAVARROS ........... 191
VINOS DE AGRICULTURA TRADICIONAL ......................... 191
VINOS DE AGRICULTURA ECOLÓGICA ............................ 192
EN VINOS NAVARROS .................................................. 192
INFLUENCIA DEL TIPO DE AGRICULTURA
INGESTA DE OTA Y OCRATOXINAS A PARTIR
DE VINO TINTO NAVARRO ............................................ 194
OCRATOXINAS Y CLIMA................................................ 196
4. OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ........ 197
VINOS DE ESPAÑA ....................................................... 197
VINOS DE FRANCIA ..................................................... 198
VINOS DE ITALIA ........................................................ 198
VINOS DE CROACIA ..................................................... 199
VINOS DE GRECIA ....................................................... 199
VINOS DE TURQUÍA ..................................................... 200
VINOS DE ISRAEL........................................................ 200
VINOS DEL NORTE DE ÁFRICA ...................................... 201
EN VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ......................... 201
INFLUENCIA DEL PAÍS DE ORIGEN
CONCLUSIONES .......................................................................205
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................209
V
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN: Micotoxinas
1. MICOTOXINAS
El término micotoxina (del griego, mikes y toxina, hongo y veneno
respectivamente) se refiere a una variedad de compuestos tóxicos, de
bajo peso molecular, producidos en el metabolismo secundario de
hongos filamentosos.
Dependiendo de la definición empleada, unos autores hablan de

menos de 100 sustancias identificadas como micotoxinas; otros, entre
300 y 400. En un sentido amplio, considerando aquellos metabolitos
secundarios de origen fúngico que al interaccionar con las células alteran
su desarrollo normal, el número de micotoxinas podría estimarse en un
número muy superior. Sin embargo, solo unas pocas tienen interés por
su presencia en productos agroalimentarios de forma natural y porque
se asocian habitualmente a problemas de micotoxicosis en el hombre y
en los animales (Soriano, 2007).
Las micotoxinas constituyen un grupo muy heterogéneo, tanto por

sus diferentes efectos tóxicos, como por su estructura y propiedades
químicas, por lo que también son difíciles de clasificar. Debido a sus
diversas estructuras químicas y orígenes biosintéticos, su multitud de
efectos biológicos y su producción por un amplio número de especies
fúngicas, los sistemas de clasificación tienden a basarse en alguna de
estas características. Desde la medicina, a menudo, se ordenan por el
órgano al que afectan, por lo que se catalogan como hepatotoxinas,
nefrotoxinas, neurotoxinas, inmunotoxinas, y así sucesivamente. Los
químicos orgánicos han tratado de clasificarlas por su estructura química
(por ejemplo, lactonas, cumarinas, etc.); los bioquímicos de acuerdo a
su origen biosintético (policetonas, derivados de aminoácidos, etc.), y
los micólogos por los hongos que las producen (por ejemplo, toxinas de
Aspergillus o Penicillium). Sin embargo, ninguna de estas clasificaciones
-3-
es del todo satisfactoria, ya que el mismo compuesto puede pertenecer

a diferentes categorías (Bennett y Klich, 2003).
Todas las micotoxinas son de origen fúngico; sin embargo, no todos

los compuestos tóxicos producidos por hongos se denominan
micotoxinas. El objeto de la toxicidad y la concentración del metabolito
son importantes. Por ejemplo, los compuestos fúngicos que son
principalmente tóxicos para las bacterias (como la penicilina) se
denominan antibióticos y los productos de hongos que son tóxicos para
las plantas se llaman fitotoxinas. Las micotoxinas son producidas por
hongos y son tóxicas para los vertebrados y otros grupos de animales
en bajas concentraciones. Otros metabolitos fúngicos de bajo peso
molecular, como el etanol, que son tóxicos solo en altas
concentraciones, no se consideran micotoxinas (Bennett y Klich, 2003).
La mayoría de las micotoxinas conocidas han sido identificadas

como metabolitos secundarios de hongos microscópicos, los Fungi
imperfecti, entre los que cabe destacar particularmente los de los
géneros Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Claviceps, Alternaria,
Byssochlamys, Stachybotrys, Trichoderma, Chaetomium, Paecilomyces,
y Rhizopus, entre otros (Soriano, 2007).
Las micotoxinas más importantes desde el punto de vista

agroalimentario y que participan en procesos de micotoxicosis naturales
son las aflatoxinas, la citrinina, las fumonisinas, la ocratoxina A, la
patulina, los tricotecenos, y la zearalenona. Fundamentalmente son
producidas por especies pertenecientes a los géneros Aspergillus,
Fusarium y Penicillium, que son los que agrupan un mayor número de
especies productoras (Soriano, 2007). Ya que los hongos toxicogénicos
son ubicuos, las micotoxinas son contaminantes ambientales presentes
en gran número de materias primas y de alimentos en todas las partes
del mundo.
-4-
ORIGEN E HISTORIA
El termino micotoxina fue acuñado en 1962 a raíz de una inusual

crisis veterinaria cerca de Londres, durante la cual murieron alrededor
de 100.000 pavos. Cuando esta enfermedad del pavo, inicialmente
desconocida, se vinculó a cacahuetes contaminados con metabolitos
secundarios de Aspergillus flavus (aflatoxinas), los científicos se
sensibilizaron sobre la posibilidad de que otros metabolitos fúngicos
desconocidos pudieran ser mortales.
Pronto, se incluyeron dentro del término micotoxinas sustancias

conocidas anteriormente (por ejemplo, los alcaloides del cornezuelo),
algunos compuestos que habían sido aislados como antibióticos (por
ejemplo, la patulina), y una serie de nuevos metabolitos secundarios
encontrados específicamente en investigaciones centradas en el
descubrimiento de micotoxinas, por ejemplo, la ocratoxina A (Bennett y
Klich, 2003).
El período entre 1960 y 1975 se denominó la fiebre del oro de las

micotoxinas (mycotoxin gold rush), ya que se llevó a cabo el
descubrimiento de un gran número de ellas y muchos científicos se
dedicaron a la búsqueda de estos agentes tóxicos (Maggon y col.,
1977).
Aunque el estudio de las micotoxinas no se inició hasta la década de

1960 con el descubrimiento de las aflatoxinas, el ergotismo (producido
por alcaloides del Claviceps) es una de las micotoxicosis más antigua
reconocida y que ha tenido una mayor importancia histórica.
TOXICIDAD DE LAS MICOTOXINAS
Las micotoxicosis, tanto en el hombre como en los animales, se

caracterizan por ser enfermedades relacionadas con alimentos
contaminados con especies fúngicas, no contagiosas, no infecciosas,
-5-
pero sí transferibles. Teniendo en cuenta la concentración y el tiempo de

exposición a una determinada micotoxina y, considerando también
factores individuales como edad, sexo, dieta o cualquier otra condición
general, las micotoxicosis pueden inducir una de las siguientes formas
de intoxicación (Cameán y Repetto, 2007):
- micotoxicosis agudas: se producen cuando se consumen

micotoxinas a concentraciones de moderadas a altas, causando
manifestaciones específicas, síndromes de enfermedad aguda o
incluso la muerte;
- micotoxicosis crónicas: se producen por la ingesta de niveles de

toxinas de bajos a moderados, causando enfermedades crónicas
específicas; y
- micotoxicosis indirectas: producidas por la ingesta de muy bajas

concentraciones de toxinas, causando un aumento de la
susceptibilidad a otras infecciones o enfermedades.
Los factores que afectan a la magnitud de la toxicidad de las

micotoxinas para el hombre y los animales se resumirían en: especies
fúngicas implicadas, mecanismos o modos de acción, metabolismo y
mecanismos de defensa del organismo vivo afectado.
El modo de acción tóxica de las micotoxinas está determinado por

su estructura química. Dado el amplio rango de estructuras químicas
existentes entre las micotoxinas, sus efectos bioquímicos a nivel celular,
entre otros, incluyen: interacciones con membranas celulares,
interferencia con el metabolismo energético, interacciones con el ADN o
moléculas proteicas, inhibición de la replicación del ADN, inhibición de la
transcripción, interferencia con el metabolismo de purinas e interacción
con receptores hormonales.
-6-
Dependiendo del modo de acción celular, las micotoxinas pueden

originar en los organismos diana una serie de efectos biológicos que
varían mucho según las micotoxinas. En general, los efectos biológicos
de la mayoría de ellas comprenden: hepatotoxicidad, nefrotoxicidad,
actividad inmunosupresora, teratogenicidad, mutagenicidad,
carcinogenicidad, estrogenicidad y acción diabetógena (Cameán y
Repetto, 2007).
En cuanto a su posible carcinogenicidad, la Organización Mundial de

la Salud (OMS, WHO) y la Agencia Internacional de Investigación sobre
el Cáncer (IARC) han evaluado, desde 1971, más de 900 agentes
(incluyendo algunas micotoxinas) de los cuales aproximadamente 400
han sido identificados como carcinógenos o potencialmente carcinógenos
para el hombre. La clasificación se realiza de acuerdo a los siguientes
grupos:
Grupo 1: el agente es carcinógeno en humanos.
Grupo 2A: agente probablemente carcinógeno en humanos; existe

limitada evidencia sobre humanos pero suficiente con animales.
Grupo 2B: agente posiblemente carcinógeno; la evidencia en

humanos es limitada y tampoco hay suficiente evidencia con animales
de experimentación.
Grupo 3: el agente no es clasificable como carcinógeno para

humanos y no puede incluirse en otro grupo.
Grupo 4: el agente probablemente no es carcinógeno en humanos;

la evidencia disponible, tanto de humanos como de experimentación
animal así lo sugiere.
En la tabla 1 se resume la evaluación realizada por la IARC en

relación al poder carcinógeno de las micotoxinas más relevantes:
-7-
MICOTOXINAS GRUPO Vol. AÑO

Aflatoxinas 1 56, 82 2002
Aflatoxina M1 2B 56 1993
Citrinina 3 40 (7) 1987
Esterigmatocistina 2B 10 (7) 1987
Fumonisina B1 2B 82 2002
Ocratoxina A 2B 56 1993
Patulina 3 40 (7) 1987
Toxinas derivadas de Fusarium graminearum,
F. culmorum y F. crookwellense (Zearalenona, 3 56 1993
Deoxinivalenol, Nivalenol y Fusarenona X)
Toxinas derivadas de Fusarium moniliforme
2B 56 1993
(Fumonisinas B1 y B2 y Fusarina C)
Toxinas derivadas de Fusarium
3 56 1993
sporotrichioides (toxina T-2)
Tabla 1: Clasificación de las micotoxinas según la IARC.
PRESENCIA DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS
Las micotoxinas suponen una amenaza para la salud humana y

animal debido a su presencia natural en productos agrícolas de todo el
mundo. Se estima que una cuarta parte de las cosechas mundiales
están contaminadas por micotoxinas. Un amplio estudio publicado en
2007, realizado con unas 2.800 muestras de cereales y piensos, reveló
que más de la mitad de las muestras de origen europeo y una tercera
parte de las de la región Asia-Pacífico estaban contaminadas con niveles
de micotoxinas por encima del límite de cuantificación de los métodos
aplicados (Binder y col., 2007).
Se han realizado un gran número de estudios sobre la presencia de

micotoxinas en alimentos, tanto en piensos animales como en productos
destinados al consumo humano. Su presencia es tan común que están
consideradas como el factor más importante de riesgo crónico en la
alimentación, mayor incluso que los contaminantes sintéticos, las
-8-
toxinas de plantas, los aditivos alimentarios o los pesticidas (Paterson y

Lima, 2010).
Conocidos sus efectos tóxicos y su presencia en alimentos,

gobiernos, agencias y organismos internacionales han establecido
diferentes límites máximos permitidos de estas sustancias en productos
alimenticios. Desafortunadamente, en ocasiones, los límites legislados
están basados más en las capacidades analíticas actuales que en
criterios de salud (Bennett y Klich, 2003).
La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la

Agricultura (FAO) resumió los reglamentos a nivel mundial para las
micotoxinas en alimentos (FAO, 2004). Para concretar y ejemplificar los
productos más susceptibles de contaminación por micotoxinas, se
enumeran los alimentos para los que se aplica el Reglamento Nº
1881/2006 de la Unión Europea*:
- Aflatoxinas: cacahuetes y otras semillas oleaginosas, almendras,

pistachos y huesos de albaricoque, avellanas y nueces del Brasil,
frutos de cáscara arbóreos, frutas pasas, cereales y productos a
base de cereales, maíz y arroz, leche y algunas especias.
- Ocratoxina A: cereales no elaborados y productos derivados, uvas

pasas, café, vino y zumo de uva, algunas especias y regaliz.
- Patulina: zumos de frutas, zumo de manzana, sidra y otras

bebidas fermentadas elaboradas con manzana o que contengan
zumo de manzana, productos sólidos elaborados con manzanas.
- Deoxinivalenol: Cereales, trigo duro, avena y maíz no elaborados,

cereales destinados al consumo humano directo, harina de cereales,
salvado y germen, pasta, pan (incluidos pequeños productos de
*
Reglamento modificado por los Reglamentos 1126/2007, 105/2010 y 165/2010.
-9-
panadería), pasteles, galletas, aperitivos de cereales y cereales para

desayuno.
- Zearalenona: Cereales y maíz no elaborados, cereales y maíz

destinados al consumo humano directo, harina de cereales, salvado
y germen, aceite de maíz refinado, pan (incluidos pequeños
productos de panadería), pasteles, galletas, aperitivos de cereales y
cereales de desayuno.
- Fumonisinas: Maíz no elaborado, maíz y alimentos a base de maíz

destinados al consumo humano directo, cereales para el desayuno a
base de maíz y aperitivos de maíz.
- Toxinas T-2 y HT-2: Cereales no elaborados y productos a base de

cereales.
INGESTA Y EVALUACIÓN DEL RIESGO
El conocimiento sobre la presencia de micotoxinas en alimentos, y

por tanto el desarrollo de métodos analíticos fiables que lo permitan,
cobran especial importancia al hablar de seguridad alimentaria y
evaluación del riesgo para la población.
El riesgo que representa la ingestión de productos alimenticios

contaminados con micotoxinas en el hombre puede ser evaluado
relacionando la exposición a esas micotoxinas (con los valores medios
de consumo diario de los alimentos, los niveles de micotoxinas en el
alimento que es consumido y el peso corporal), con la dosis tolerable de
micotoxina ingerida diariamente (TDI) y la dosis a la cual el 50% de los
individuos pueden desarrollar tumores malignos (TD50). Otros factores
como el estado fisiológico del individuo y la edad también pueden
aumentar o disminuir la toxicidad (Gimeno y Martins, 2005).
- 10 -
Con los datos obtenidos en estudios toxicológicos se hacen

interpolaciones y se establecen algunos parámetros (Gimeno y Martins,
2005):
- NOAEL (No Observed Adverse Effect Levels) es la estimación del

nivel de micotoxina con el que no se observan efectos adversos.
- TD50 es la dosis de micotoxina a la cual el 50% de los individuos

pueden desarrollar tumores malignos, estableciéndose así una
estimación del potencial cancerígeno.
- NEL (No Effect Level) es la estimación del nivel de micotoxina que

no causa efecto.
- LOAEL (Lowest Observed Adverse Effect Level) es el nivel de

micotoxina con el cual se observan los efectos adversos más bajos.
Finalmente, existe un parámetro comúnmente utilizado, la TDI

(Tolerable Daily Intake), o ingesta de micotoxina diaria que puede ser
tolerada. Todos los parámetros anteriores se expresan en cantidad de
micotoxina·kg de peso corporal (p.c.)-1·día-1 o en el caso de la TDI
puede expresarse en algunos casos en valor semanal, TWI (Tolerable
Weekly Intake).
Normalmente, el valor de TDI se suele obtener dividiendo el valor

de NOAEL, o el valor de NEL, por un factor de seguridad que corrige las
diferencias entre animales y personas, y entre diferentes personas, y
que puede oscilar entre 50 y 50.000. Se puede hacer lo mismo con el
valor de TD50, dependiendo del método de extrapolación utilizado,
siendo este último el más utilizado en las micotoxinas carcinogénicas. La
TDI se corrige con un factor de riesgo que normalmente es 1/100.000.
Cuando el valor de TDI está aún en estudio y por lo tanto es provisional,
se utiliza la denominación PTDI (Provisional Tolerable Daily Intake)
(Gimeno y Martins, 2005).
- 11 -
INTRODUCCIÓN: Ocratoxinas
2. OCRATOXINAS
En 1961, y después del interés despertado por el descubrimiento de
las aflatoxinas y la alta incidencia en África de ciertas enfermedades de
etiología desconocida, micólogos del Consejo Sudafricano para la
Investigación Científica e Industrial iniciaron una investigación sobre la
microflora de leguminosas locales y productos de cereales.
Se identificaron 46 cepas de 22 especies de hongos que eran

tóxicas en patos. Aspergillus ochraceus apareció con frecuencia en el
transcurso de esta investigación y pronto se vio que se encontraba
ampliamente en la naturaleza. Para la investigación química y
toxicológica de sus metabolitos se seleccionó una de las variedades más
tóxicas de este hongo, denominada K-804, aislada del sorgo (Steyn,
1971).
En 1965 Van der Merwe y col. detectaron y caracterizaron

químicamente por primera vez las ocratoxinas A, B y C (Van der Merwe
y col., 1965a y b). En 1967, Steyn y Holzapfel también aislaron los metil
y etil ésteres derivados de las ocratoxinas A y B como metabolitos de
Aspergillus ochraceus (Steyn y Holzapfel, 1967a). De entre estos
compuestos, la ocratoxina A se consideró el principal, debido a su
toxicidad e incidencia.
ESTRUCTURAS QUÍMICAS
Las ocratoxinas contienen una 3,4-dihidro-3-metilisocumarina unida

a una molécula de L-β-fenilalanina por el grupo carboxilo en posición 7
mediante un enlace amida. Las ocratoxinas objeto del presente estudio:
ocratoxina A (OTA), ocratoxina B (OTB), sus metil ésteres (MeOTA y
MeOTB) y sus etil ésteres (OTC y EtOTB) difieren básicamente en el
átomo de cloro en R1 y/o en la esterificación en el grupo ácido de la
fenilalanina (figura 1).
- 13 -
R2
O O
O OH O
NH O
CH 3
R1
Fórmula PM
Ocratoxina R1 R2
molecular (g·mol-1)
Ocratoxina A Cl H C20H18ClNO6 403,82
Metilocratoxina A Cl CH3 C21H20ClNO6 417,84
Etilocratoxina A (OTC) Cl CH3-CH2 C22H22ClNO6 431,87
Ocratoxina B H H C20H19NO6 369,37
Metilocratoxina B H CH3 C21H21NO6 383,40
Etilocratoxina B H CH3-CH2 C22H23NO6 397,42
Figura 1: Estructura de las ocratoxinas.
Tanto en cultivos de células (vegetales y animales) como en

animales se han identificado otros metabolitos derivados de la
ocratoxina A (Stormer y col., 1983; Xiao y col., 1996a y b; Ruhland y
col., 1996; Li y col., 2000). Por ejemplo, los compuestos hidroxilados en
posición 4 (4-hidroxi-OTA) o en posición 10 (10-hidroxi-OTA), los
productos resultantes de la hidrólisis de la OTA y OTB, la ocratoxina alfa
(OTα) y beta (OTβ) respectivamente, o la forma abierta de la lactona
(OP-OTA). Todos ellos se pueden ver en la figura 2:
O OH O O OH O
OH
R3 O R3
OH
CH2 R4 CH2 R4
R2 R1 R2 R1
Ocratoxina R1 R2 R3 R4
4-hidroxi-OTA OH Cl -NH-CH(COOH)-CH2-Fenil H
10-hidroxi-OTA H Cl -NH-CH(COOH)-CH2-Fenil OH
OTα H Cl OH H
OTβ H H OH H
OP-OTA H Cl -NH-CH(COOH)-CH2-Fenil H
Figura 2: Estructura de otros metabolitos de la ocratoxina A.
- 14 -
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS
Steyn y col. (1965) se basaron en los datos físicos y químicos para

elucidar la estructura química de los compuestos tóxicos aislados de
Aspergillus ochraceus. Estudiaron el punto de fusión, el espectro
infrarrojo, la reacción con cloruro férrico, la absorción ultravioleta, el
espectro de resonancia magnética nuclear, el espectro de masas, los
productos obtenidos de la hidrólisis y degradación y el espectro de
dispersión óptica rotatoria para identificar su estereoquímica (Steyn,
1971).
Estos autores describen la OTA como un compuesto cristalino

incoloro de fórmula molecular C20H18ClNO6. Su punto de fusión con una
molécula de benceno de cristalización es de 94-96ºC, mientras que a
partir de xileno cristaliza sin molécula de disolvente y funde a 169ºC.
Sus características ultravioletas en etanol son: λmax 213 y 332 nm
(ε = 36.800 y 6.400 M-1 cm-1, respectivamente).
La OTB (C20H19NO6) cristalizada desde metanol funde a 221ºC. Su

espectro UV muestra un desplazamiento hipsocrómico de 14 nm con
respecto a la longitud de onda alta de la OTA, λ max 218 y 318 nm
(ε = 34.300 y 6.750 M-1 cm-1, respectivamente) (Steyn y Holzapfel,
1967b).
Desde entonces, la ocratoxina A ha sido ampliamente estudiada; sin

embargo, la información disponible sobre las demás ocratoxinas es muy
limitada. Así, se sabe que la OTA es un compuesto fluorescente, muy
soluble en disolventes orgánicos polares, moderadamente soluble en
agua y soluble en bicarbonato sódico. El carácter de ácido débil de la
OTA es importante para los procedimientos analíticos. Su valor de pka
está entre 4,2-4,4 para el grupo carboxi del residuo de fenilalanina y
entre 7,0-7,3 para el grupo hidroxilo de la isocumarina (Valenta, 1998).
No se dispone de información similar de las demás ocratoxinas.
- 15 -
MÉTODOS DE ANÁLISIS DE OCRATOXINAS
Las referencias bibliográficas sobre la presencia de micotoxinas en

alimentos se cuentan por miles. La gran diferencia en las estructuras
químicas de las micotoxinas, la amplia variedad de alimentos y
productos agrícolas en los que se encuentran y, además, el hecho de
que sus concentraciones varíen sustancialmente en ellos, plantea un
reto en el desarrollo de métodos analíticos. Esto hace que muchos de los
métodos publicados se centren en una única toxina o en un sustrato
específico (Bennett y Klich, 2003). La mayoría de los métodos analíticos
desarrollados para ocratoxinas se refieren al análisis de OTA.
Los métodos cuantitativos se basan en la preparación de curvas de

calibrado con soluciones estándar de ocratoxina A. Tal y como menciona
Valenta (1998), la concentración de las soluciones estándar de OTA
utilizadas para el análisis cuantitativo debe ser determinada
espectrofotométricamente, ya que generalmente solo se adquieren unos
miligramos de ésta para fines analíticos. La cantidad exacta en el vial no
se especifica, el pesaje exacto de cantidades tan pequeñas es difícil y
además, se debe evitar la manipulación de micotoxinas en seco por el
riesgo de dispersión debido a cargas electrostáticas. Este paso resulta
crucial en las determinaciones analíticas, sin embargo se han descrito
distintos coeficientes de absortividad molar para la ocratoxina A, incluso
en el mismo disolvente (Valenta, 1998).
Existen multitud de métodos analíticos para el control de la

presencia de ocratoxina A en alimentos y materias primas (Scott, 2002;
Visconti y De Girolamo, 2005). La mayoría de los métodos de análisis de
OTA incluyen purificación por columnas de inmunoafinidad (CIA) en
combinación con la cromatografía líquida con detección de fluorescencia
(HPLC-FLD) (Castellari y col., 2000; Visconti y col., 2001; Monaci y
Palmisano, 2004) y también con espectrometría de masas (MS) (Zöllner
- 16 -
y col., 2000; Leitner y col., 2002; Bacaloni y col., 2005; Sforza y col.,
2006; Reinsch y col., 2007; Noba y col., 2008).
La OTA debe ser extraída de los productos alimenticios antes de su

análisis, una extracción alcalina muestra generalmente mejores
recuperaciones que el uso de medios ácidos (Senyuva y col., 2005).
Convencionalmente se han utilizado la extracción líquido-líquido y en
fase sólida (Saéz y col., 2004; Serra y col., 2004; Buttinger y col.,
2004; Hernandez y col., 2006; Fabiani y col. 2010,). Sin embargo, en
los últimos 15 años, la mayoría de los laboratorios han tendido a la
utilización de columnas de inmunoafinidad ya que el proceso es
relativamente fácil de llevar a cabo y proporciona, por lo general,
extractos libres de interferencias (EFSA, 2006).
Otros procedimientos de extracción desarrollados incluirían: la

microextracción en fase sólida o líquida (González-Peñas y col., 2004;
Yu y Lai, 2005; Aresta y col., 2006; Varelis y col., 2006; Yu y Lai, 2006;
Romero-González y col., 2010), la extracción líquido-líquido dispersiva
(Campone y col., 2011; Arroyo-Manzanares y col., 2011), los polímeros
marcados molecularmente (MIP) (Maier y col., 2004; Wei y col., 2007;
Yu y Lai, 2007), la extracción coacertiva (Garcia-Fonseca y col., 2008) o
incluso la inyección directa de muestras líquidas (Dall'Asta y col., 2004;
Tafuri y col., 2008; Altiokka y col., 2009; Pena y col., 2010; Tessini y
col., 2010).
También están disponibles métodos por cromatografía en capa fina

(TLC) (Santos y Vargas, 2002; Braicu y col., 2008), TLC de alta
resolución (HPTLC) (Kumagai y col., 2008; Welke y col., 2010), ELISA
(Alarcón y col., 2004; Flajs y col., 2009; Fabiani y col., 2010; Radoi y
col., 2009), cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
(GC-MS) (Tessini y col., 2010; Soleas y col., 2001) o electroforesis
- 17 -
capilar (González-Peñas y col., 2006; Koller y col., 2006; Almeda y col.,

2008).
Se han desarrollado métodos analíticos novedosos basados en

biosensores (Ngundi y col., 2005), inmunosensores (Adanyi y col.,
2007; Prieto-Simon y col., 2008), resonancia de plasma superficial
(Yuan y col., 2009), ICP-MS (Giesen y col., 2010) o inmunoensayos de
polarización de fluorescencia (Zezza y col., 2009), pero aún no son
utilizados regularmente.
Determinación simultánea de ocratoxinas
Debido a la presencia simultánea de diferentes toxinas en una

misma matriz, cada vez más se están desarrollando métodos analíticos
que permiten cuantificar conjuntamente diferentes toxinas en un mismo
análisis; tanto para el control de su presencia en alimentos, como para
la realización de estudios toxicológicos. La técnica de elección suele ser
la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS),
debido a que la detección es universal y no depende de las propiedades
fisicoquímicas del analito (p.e. absorción ultravioleta o emisión de
fluorescencia) pero su uso ha estado restringido por el difícil
acoplamiento de ambas técnicas (Krska y Molinelli, 2007).
Los métodos analíticos por LC-MS para la determinación de

micotoxinas en alimentos incluyen a la OTA junto a otras micotoxinas,
como aflatoxinas, fumonisinas o tricotecenos. Un resumen completo de
estos métodos se puede encontrar en las revisiones de Zöllner (2006) y
Krska (2007) (Zöllner y Mayer-Helm, 2006; Krska y Molinelli, 2007).
En el caso de las ocratoxinas, los métodos cromatográficos

disponibles para la determinación simultánea de ocratoxina A y varios
análogos han sido diseñados más para estudios de farmacocinética y
metabolismo que para su uso en el estudio de su presencia en alimentos
- 18 -
(Lerch y Muller, 1990; Xiao y col., 1996b; Li y col., 1998 y 2000; Harris
y Mantle, 2001; Jonsyn-Ellis, 2001; Stander y col., 2001; Boudra y
Morgavi, 2006)
TOXICIDAD
De entre todas las ocratoxinas, la ocratoxina A es el compuesto más

importante en cuanto a toxicidad debido, en parte, a que es producida
en mayor concentración que sus derivados. La OTC y MeOTA, que
también poseen el átomo de cloro y la fenilalanina, presentan similar
toxicidad aguda, sin embargo no han despertado ningún interés en
investigación a través de los años por su baja incidencia. Steyn y
Holzapfel (1967) demostraron que la dosis letal 50 (DL50) para las 3
ocratoxinas cloradas era similar (135-170 µg/pato), mientras que la OTB
y sus ésteres eran mucho menos tóxicas (Steyn y Holzapfel, 1967a).
Así, se puso de manifiesto que la toxicidad se debía a la presencia de
cloro en la molécula (Steyn y Holzapfel, 1967b).
Doster y col. (1972) no pudieron obtener la DL50 para la OTB en

truchas, sencillamente porque no hubo mortalidad de ningún animal.
Observaron cambios patológicos significativos en hígados y riñones
similares a los producidos por la OTA cuando a las truchas se les
administraba una concentración de OTB 10 veces superior a la de OTA
(Doster y col., 1972). Un estudio similar de este grupo realizado
posteriormente con los ésteres de la OTA y OTB, demostró que la OTC
es el doble de tóxica que la OTA (DL50 OTC = 3,0 mg·kg p.c.-1,
DL50 OTA = 5,5 mg·kg p.c.-1) mientras que la EtOTB lo era la mitad
(DL50 = 13,0 mg·kg p.c.-1). Estos datos hacen suponer que la toxicidad
es mayor cuanto mayor es el peso molecular del compuesto, de ahí que
la OTB no presente DL50 y sí su etil éster (Doster y col. 1974).
- 19 -
La OTB se ha descrito como diez veces menos tóxica que la OTA

(Marquardt y Frohlich, 1992; Li y col., 1997), pero algunos estudios
también mencionan su citotoxicidad (Dietrich y col., 2001),
nefrotoxicidad (Mally y col., 2005b) y efectos teratogénicos (O'Brien y
col., 2005). No obstante, la información sobre este aspecto es menor a
la disponible para la OTA.
Con respecto a la OTC, se ha comentado que posee una toxicidad

similar a la de la ocratoxina A (Marquardt y Frohlich, 1992; Xiao y col.,
1996a, Li y col., 1998) o incluso superior, según los experimentos en
truchas realizados por Doster y colaboradores (Doster y col., 1974).
Investigaciones más recientes en estudios in vitro también describen su
mayor potencial tóxico, al menos en lo que se refiere a efectos
inmunotóxicos en cultivos celulares (Müller y col., 2003 y 2004). La
esterificación facilita la penetración de la OTC en la célula y se convierte
rápidamente en OTA al entrar en el organismo; ambos hechos afectan a
la concentración máxima en tejidos y por tanto, a la toxicidad total,
mostrando un efecto tóxico sinérgico entre ambas ocratoxinas (Pfohl-
Leszkowicz y Manderville, 2007).
Toxicidad de la ocratoxina A
La toxicidad aguda de la ocratoxina A muestra muchas variaciones

entre especies. La DL50 por vía oral se encuentra en un intervalo entre
aproximadamente 20 y 50 mg·kg p.c.-1 en ratas y ratones, y hasta 0,2-
1 mg·kg p.c.-1 en perros, cerdos y pollos, que son las especies más
sensibles. Los síntomas de intoxicación aguda consisten en hemorragias
multifocales en los principales órganos y trombos de fibrina en bazo,
cerebro, hígado, riñón y corazón, así como nefrosis y necrosis hepática y
en el tejido linfoide (Soriano, 2007).
- 20 -
Los efectos crónicos de la ocratoxina A son los que generan mayor

preocupación. Está demostrado que el consumo crónico de OTA produce
una nefropatía intersticial en los animales de granja como pollos y
cerdos, que puede causar además, importantes pérdidas económicas. A
pesar de las diferencias en cuanto a la toxicocinética en diversas
especies, las lesiones renales en cerdos, aves y roedores son muy
similares (Soriano, 2007).
En el ser humano se ha relacionado con la etiología de una

nefropatía endémica en la zona de los Balcanes (denominada Nefropatía
Endémica de los Balcanes, NEB), que presenta una gran semejanza
histopatológica con la que se produce en los animales. Es una
enfermedad renal crónica y progresiva que representa actualmente el
11% de todas las enfermedades primarias diagnosticadas en la antigua
Yugoslavia, y que fue observada más frecuentemente en mujeres (de 30
a 50 años) que en hombres. Esta enfermedad se acompaña a veces de
tumores malignos del tracto urinario superior que resultan muy
agresivos (Marquardt y Frohlich, 1992; Pfohl-Leszkowicz y col., 2002;
Bamias y Boletis, 2008).
La OTA es también teratogénica, hepatotóxica, neurotóxica e

inmunotóxica (López de Cerain y col., 2000; Pfohl-Leszkowicz y
Manderville, 2007). Además, está clasificada por la IARC como posible
carcinógeno humano clase 2B ya que produce tumores renales en
animales de experimentación (IARC, 1993). Existen discrepancias en
cuanto a sus efectos genotóxicos (Arbillaga y col., 2004): algunos
autores afirman que no existen evidencias de que la OTA forme aductos
con el ADN (Mally y col. 2005a; Arbillaga y col. 2007), mientras que
otros, sin embargo, apoyan esta hipótesis (Pfohl-Leszkowicz y col.,
1993; Grosse y col., 1995).
- 21 -
Toxicidad combinada
La literatura científica ofrece una amplia información sobre los

efectos tóxicos individuales de micotoxinas en varias especies animales.
Sin embargo, la exposición simultánea a múltiples micotoxinas puede
ser más probable, debido a que un hongo puede producir distintas
micotoxinas y un mismo alimento puede estar contaminado, a su vez,
por varias especies fúngicas.
Algunos artículos científicos sobre los efectos sinérgicos de

micotoxinas en niveles agudos de toxicidad estudian combinaciones de
aflatoxinas con varios tricotecenos, así como ocratoxina A y
fumonisinas, y fumonisinas y deoxinivalenol. Sin embargo, hay que
señalar que son necesarios más trabajos en este campo de
investigación, así como sobre los niveles de contaminación de varias
toxinas en un mismo alimento (Binder y col., 2007).
Cabe esperar que, si las micotoxinas tienen una estructura química

similar o son producidas por la misma especie de hongos, su modo de
acción o perfil tóxico sea semejante. Es importante conocer los efectos
aditivos que estas micotoxinas relacionadas puedan ejercer (Speijers y
Speijers, 2004).
Teniendo en cuenta este hecho, y en relación a las ocratoxinas,

Knasmuller y col. (2004) estudiaron la actividad genotóxica de las
ocratoxinas A y B y la citrinina en células de hígado humano (HepG2).
Señalaron que el efecto combinado de estas micotoxinas en los
alimentos podría tener impacto en el riesgo total de cáncer para el
hombre (Knasmuller y col., 2004).
Heussner y col. (2006) revisaron la citotoxicidad, individual y

combinada, de las micotoxinas OTA, OTB, citrinina (CIT) y patulina
(PAT) en células renales de cerdo (LLC-PK1) con el ensayo de reducción
- 22 -
del MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) y

mostraron el efecto sinérgico de la citrinina con las ocratoxinas A y B
(Heussner y col., 2006).
En general, la administración simultánea de OTA y citrinina

aumenta la citotoxicidad, genotoxicidad y la incidencia de tumores
renales en ratones macho (Pfohl-Leszkowicz y Manderville, 2007).
PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN ALIMENTOS
Las micotoxinas en general, y las ocratoxinas en particular, cobran

gran importancia en la salud humana ya que pueden llegar al ser
humano a través de la cadena alimentaria, bien por el consumo de
alimentos vegetales contaminados o por el de sus productos
transformados, o bien por el de productos de animales que hayan
acumulado las toxinas después de una alimentación con piensos
contaminados.
La OTA ha sido estudiada y encontrada en un gran número de

alimentos, mientras que sus compuestos derivados minoritarios no han
despertado interés.
La presencia de ocratoxina A se ha descrito en: granos de cereales

(cebada, trigo, maíz, avena), semillas de café verde, cacao, cacahuetes,
carne de pollo y cerdo, frutos secos, vino, cerveza, zumo de uva y
especias, entre otros alimentos (Zimmerli y Dick, 1995; Jørgensen,
1998; Scudamore y MacDonald, 1998; López de Cerain y col., 2002;
MacDonald y col., 2003; Araguás y col., 2005; Amézqueta y col., 2005;
Murillo y col., 2007; Zaied y col., 2010; Ibáñez-Vea y col., 2011; Brera
y col., 2011). Esta relación es solo un ejemplo de la amplia literatura
científica existente sobre el tema.
En 1995 se publicó el primer informe relativo a la evaluación de la

ingesta diaria de ocratoxina A por la población de los Estados miembros
- 23 -
de la UE, en el marco del sistema de Cooperación Científica para asuntos

relacionados con la alimentación (SCOOP, 1995).
En este informe, que se completó y actualizó en 2002, participaron

13 países y se procesaron 18.599 muestras, clasificando los alimentos
en: cereales (trigo, centeno, cebada, maíz, avena, mijo y arroz), café
(verde y procesado), cerveza, vino, productos de cacao, frutos secos,
productos cárnicos y especias. Por ser el estudio con mayor número de
muestras analizadas, la tabla 2 resume los niveles de OTA encontrados y
da una idea de la presencia de ocratoxina A en los alimentos (SCOOP,
2002).
Nº de Muestras Media Máximo

Alimento País
muestras positivas (μg·kg-1) (μg·kg-1)
Cereales
Trigo 979 273 0,27 31,60 Dinamarca
Centeno 444 236 0,60 33,00 Dinamarca
Cebada 142 34 0,30 6,40 Reino Unido
Maíz 267 35 0,17 4,90 Italia
Avena 164 49 0,19 5,90 Reino Unido
Mijo 34 24 0,14 0,83 Grecia
Arroz 63 4 0,22 1,40 Francia
Café
Café verde 1.704 620 1,62 200,90 Grecia
Café procesado 1.184 549 0,72 11,50 Italia
Cerveza 496 192 0,03 0,29 Alemania
Vino 1.470 872 0,36 15,60 Italia
Cacao y derivados 547 445 0,24 3,60 Alemania
Frutos secos 800 582 2,30 53,60 Reino Unido
Carne y productos
1.828 328 0,20 9,33 Alemania
cárnicos
Especias 361 188 1,15 16,43 Alemania
Otros 4.927 2.472 0,20 16,43 Alemania
Tabla 2: Número de muestras analizadas y positivas de cada tipo de alimento,
concentraciones medias y máximas (μg·kg-1) de OTA (SCOOP, 2002).
De forma similar, la JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on

Food Additives) evaluó la presencia de ocratoxina A en 10.000 muestras
- 24 -
de cereales, vino, cerveza, zumo de uva, café procesado, cacao y

derivados y productos cárnicos (JECFA, 2001). En general, no hay
diferencias en los niveles de ocratoxina A entre estos datos y los
publicados en el informe SCOOP 2002, salvo en el caso del cacao, donde
las concentraciones medias de los datos del SCOOP y de la JECFA son
0,24 y 0,55 μg·kg-1, respectivamente (EFSA, 2006).
El primer dato sobre la presencia de OTB en alimentos se dio en

1983 analizando pan enmohecido responsable de micotoxicosis en unos
animales de granja (Visconti y Bottalico, 1983). Aunque se conoce que
aparece frecuentemente junto con la OTA (EFSA, 2006), hay muy pocos
métodos disponibles que las analicen conjuntamente (Boudra y Morgavi,
2006; Gareis 1999). Algunos investigadores asiáticos han puesto su
atención en la determinación simultánea de OTA, OTB y citrinina en
algunos alimentos (Han y col., 2010; Kawamura, 2010; Tabata y col.,
2008a; Nakazato M y col., 1996; Ibe y col., 1984).
Valero y col. (2008) sugieren que un pico no identificado, presente

en los cromatogramas de todas las muestras contaminadas con
ocratoxina A de vinos especiales europeos, pudiera deberse a la
presencia de OTB (Valero y col., 2008).
Zimmerli y Dick (1996), a la par que desarrollaban por primera vez

un método analítico para la determinación de OTA en vino, también
pusieron de manifiesto la presencia de OTC en esta matriz (Zimmerli y
Dick, 1996). Sin embargo, no hay más estudios acerca de la presencia
de OTC en alimentos.
INGESTA DIARIA TOLERABLE DE OTA
La ingesta diaria tolerable (TDI) para la OTA no está aún

suficientemente bien establecida. Si se establece basándose en estudios
carcinogénicos, el intervalo de TDI oscila entre 1,2 y 5,7 ng·kg p.c.-1 con
- 25 -
unos factores de seguridad de 50.000 y 5.000, respectivamente, y un

factor de riesgo de 1/100000 (Kuiper-Goodman, 1996). De forma
similar, un grupo de expertos en seguridad alimentaria de los países
nórdicos propusieron un valor de TDI de 5 ng·kg p.c.-1·día-1, que
también fue adoptado por el Comité Científico de la Alimentación
Humana (CCAH) (Kuiper-Goodman y col., 2010).
La JECFA en 1991, basándose en estudios efectuados en cerdos con

respecto a las alteraciones de la función renal, y dividiendo el valor de
LOAEL con un factor de seguridad de 500, estableció una ingesta
tolerabla diaria provisional (PTDI) de 16 ng·kg p.c.-1·día-1 (PTWI =
112 ng·kg p.c.-1·semana-1) (JECFA, 1991). Redondeó este valor semanal
a 100 ng·kg p.c.-1 en 1995 (JECFA, 1995), reevaluándolo y
manteniéndolo constante en 2001 y 2007, considerando los nuevos
estudios de toxicidad y valores de contaminación de OTA encontrados en
alimentos (JECFA, 2001 y 2007). El valor más alto de ingesta semanal
tolerable provisional (PTWI) es de 120 ng·kg p.c.-1 establecido por la
EFSA en 2006 (EFSA, 2006) y que es el que se menciona en el
Reglamento de la Unión Europea que fija el contenido máximo de OTA
en diferentes alimentos (Reglamento Nº 1881/2006).
Es evidente que este intervalo de PTDI tan amplio y que va de 1,2 a

17,1 ng·kg p.c.-1·día-1, es consecuencia del efecto tóxico en el que se
basan los estudios, de los diferentes métodos de extrapolación y de los
diferentes factores de seguridad que se aplican. Sería necesario un
mayor número de estudios al respecto. Probablemente la tendencia sea
la de establecer un valor de TDI igual o inferior a 5 ng·kg p.c. -1·día-1
basándose en los estudios carcinogénicos. Sin embargo, no hay todavía
suficientes evidencias de que la OTA sea carcinogénica para los
humanos, aunque sí las hay de que lo sea para los animales (Walker,
2002).
- 26 -
LEGISLACIÓN
Con el objetivo de garantizar la seguridad del consumidor y

conseguir que no se superen los valores de TDI fijados, el reglamento de
la Comisión Europea Nº 1881/2006 relativo al contenido máximo de
determinados contaminantes en los productos alimenticios (Reglamento
Nº 1881/2006) y el reglamento Nº 105/2010 que modifica el anterior
(Reglamento Nº 105/2006), establecen los siguientes límites máximos
(μg·kg-1) para la ocratoxina A en algunos alimentos (tabla 3).
Alimentos (μg·kg-1)
Cereales no elaborados 5
Todos los productos derivados de cereales no elaborados, incluidos los
productos transformados a base de cereales y los cereales destinados al 3
consumo humano directo.
Uvas pasas (pasas de Corinto, sultanas y otras variedades de pasas) 10
Café tostado en grano y café tostado molido, excluido el café soluble 5
Café soluble (café instantáneo) 10
Vino (incluidos los vinos espumosos y excluidos los vinos de licor y los vinos
2
con un grado alcohólico mínimo de 15 % vol.) y vino de frutas
Vino aromatizado, bebidas aromatizadas a base de vino y cócteles
2
aromatizados de productos vitivinícolas
Zumo de uva, zumo de uva concentrado reconstituido, néctar de uva, mosto
de uva y mosto de uva concentrado reconstituido, destinados al consumo 2
humano directo
Alimentos elaborados a base de cereales y alimentos infantiles para lactantes
0.5
y niños de corta edad
Alimentos dietéticos destinados a usos médicos especiales dirigidos
0.5
específicamente a los lactantes
Especias 30
Capsicum spp. (frutos de dicho género secos, enteros o pulverizados, con (desde el
inclusión de los chiles, el chile en polvo, la cayena y el pimentón) 1.7.2010
Piper spp. (frutos, con inclusión de la pimienta blanca y negra) hasta el
Myristica fragrans (nuez moscada) 30.6.2012)
Zingiber officinale (jengibre)
Curcuma longa (cúrcuma) 15
Mezclas de especias que contengan una o más de las especias antes (a partir del
mencionadas 1.7.2012)
Regaliz (Glycyrrhiza glabra, Glycyrrhiza inflata y otras especies)

Raíz de regaliz, ingrediente para infusiones 20
Extracto de regaliz, para uso alimentario, especialmente en bebidas y 80
confitería
-1
Tabla 3: Límites máximos permitidos (µg·kg ) de ocratoxina A en diferentes productos
alimenticios.
- 27 -
INTRODUCCIÓN: Ocratoxinas en vino
3. OCRATOXINAS EN VINO
La presencia de ocratoxina A en el vino ha sido investigada
considerablemente en todo el mundo, ya que se supone la segunda
fuente más importante de ingesta de OTA en humanos (SCOOP, 2002).
Se conocen ampliamente los métodos analíticos a utilizar, niveles en el
vino, hongos productores en la uva, factores que afectan a su
concentración, etc.
Actualmente, una búsqueda en ISI Web of Knowledge, por ejemplo,

con “ochratoxin” y “wine” como palabras clave en el título aporta más de
250 resultados. De éstos, el artículo más citado es el de Zimmerli y
Dick, Ochratoxin A in table wine and grape-juice: Occurrence and risk-
assesment (Zimmerli y Dick, 1996). Este hecho refleja su relevancia y
que la mayoría de métodos publicados para la determinación de OTA en
vino utilicen sus condiciones o alguna modificación de este proceso, que,
en esencia, se basa en el uso de columnas de inmunoafinidad para la
extracción y purificación y HPLC en fase reversa con detección de
fluorescencia, para su análisis y cuantificación. Sin embargo, es de
extrañar que, después de 15 años, no se haya profundizado sobre la
información que aporta este conocido documento referente a la
presencia de ocratoxina C.
En la tabla 4 se muestran las características de los métodos

analíticos utilizados para la cuantificación de OTA en vino.
- 29 -
Columna Tª Flujo λexc-λem tR OTA/ LD-LC
Referencia Extracción Fase móvil VI
(mm; µm) (ºC) (mL·min-1) (nm) tanálisis (µg·L-1)
Zimmerli y Dick, ELL* CHCl3 +
(72:28) MeOH:HAc (9%) 20 (250x4,6; 5) 50 1 390-440 5/10 0,003-0,005
1995 y 1996 CIA Ochraprep
Burdaspal y ELL CHCl3 +
Gradiente MeOH:HAc (9%) --- --- --- --- --- 8,5/30 0,003-0,009
Legarda, 1999 CIA Ochratest
Visconti y col., PEG + NaHCO3,
(99:99:2) ACN:H2O:HAc 100 (150x4,6; 5) NE 1 333-460 6/12 0,01-0,04
1999 y 2001 CIA Ochratest
Jornet y col., (48:52) ACN:H2O (4 mM
SPE C18 20 (250x4,6; 5) 30 1 247-480 11/15 ---
2000 NaAc-HAc (19:1))
CIA Ochaprep 0,015-0,020
Castellari y col., CIA Ochratest (49:49:2) ACN:H 2O:HAc 100 (250x4; 5) 35 0,75 333-460 11,8/14 0,015-0,045
2000
ELL CHCl3 +
0,015-0,040
CIA Ochraprep
Otteneder y
CIA Ochratest (45:54:1) ACN:H 2O:HAc 20 (125x2; 5) NE 0,3 330-460 --- 0,01-0,01
Majerus, 2000
ELL tolueno + (48:52) ACN:H2O (4 mM
Filali y col., 2001 50 (250x4,6; 10) Amb 1 330-470 7/NE NE/0,01
SPE C18 NaAc-HAc (19:1))
- 30 -
Pietri y col., ELL CHCl3 + 0,0006-
(43:57) ACN/HAc (2%) 30 C8 (150x4; 4) Amb 1,2 333-470 5,6/8
2001 CIA Ochratest 0,001
López de Cerain ELL CHCl3 + (26:26:48) MeOH:ACN:5 mM
25 (250x3; 10) 40 1,5 225-461 5/15 0,05-0,07
y col., 2002 CIA Ochratest NaAc (H3PO4)
Aboul-Enein y
ELL CHCl3 ACN:H2O:HAc (99:99:2) 20 (150x4,6; 3) NE 0,4 330-450 11,7/14 0,1-3,3
col., 2002
Brera y col.,
CIA Ochraprep ACN:H2O:HAc (50:49:1) 150 (150x4,6; 5) 40 1 333-460 7/10 0,01-0,1
2003
Stefanaki y col., PEG + NaHCO3,
ACN:H2O:HAc (49:49:2) 100 (250x4,6; 5) Amb 1 333-477 14/NE 0,05-0,1
2003 CIA Ochraprep
Soufleros y col., PEG + NaHCO3, Gradiente ACN:H2O:HAc
100 (150x4,6; 5) NE 1 333-450 ---/30 0,02/---
2003 CIA Ochraprep (49:49:2)
Shepard y col., PEG + NaHCO3,
(99:99:2) ACN:H 2O:HAc 100 (100x4,6; 3) NE 1 333-460 6,4/--- 0,01/---
2003 CIA Ochratest
Miceli y col.,
CIA RIDA OTA Gradiente ACN:H2O (2% HAc) 5 (150x2,1; 3) 45 0,4 247-460 NE NE
2003
Tabla 4: Métodos analíticos para la cuantificación de ocratoxina A en vino.*ELL: extracción líquido-líquido. SPE: Extracción en fase sólida.
CIA: columnas de inmunoafinidad. MeOH: metanol. ACN: Acetonitrilo. HAc: Ácido acético. NaAc: Acetato de sodio. PEG: Polietilenglicol. V I:
Volumen de inyección. Amb: Temperatura ambiente NE: No especificado.
Hocking ycol., ELL* Dietileter
(100:98:2) ACN:H2O:HAc 35 (250x4,6; 5) 40 1,5 385-437 11,8/20 0,02-0,05
2003 + SPE C18
Lo Curto y col., PEG + NaHCO3,
(99:99:2) ACN:H 2O:HAc 20 (150x4,6; 5) Amb 1 333-460 10,5/15 0,01/---
2003 CIA Ochratest
(48:52) ACN:H2O (4 mM
Bellí y col., 2004 CIA Ochraprep 25 (250x4,6; 5) NE 1 230-458 12/--- 0,05/---
NaAc-HAc (19:1))
Dall’Asta y col., Inyección (15:85) ACN/(NH4Cl/NH3 20
5 (250x4,6; 5) NE 1 380-440 18/30 0,05-0,2
2004 directa vino mM, pH 9,8)
González-Peñas Microextracción (29:29:42) MeOH:ACN:5 mM
100 (250x4; 5) 40 1,5 225-461 4,9/9 0,20/0,25
y col., 2004 en fase líquida NaAc (pH= 2,2 H3PO4)
Rosa y col., ELL CHCl3 +
(72:28) MeOH:HAc (9%) 20 (250x4,6; 5) NE 1 335-470 NE 0,021/---
2004 CIA Ochratest
Blesa y col. 2004 CIA Ochraprep (50:49:1) ACN:H 2O:HAc 150 (150x4,6; 5) NE 1 333-470 7,5/10 0,01-0,05
Maier y col.,
SPE C18 + MIP (40:60:2) ACN:H 2O:HAc 50 (125x4; 5) 25 0,8 333-460 10,2/30 0,01/NE
2004
(433:283:283)
Ng y col., 2004 CIA Ochratest 50 (250x4,6; 5) NE 1 330-470 NE 0,008/0,040
H3PO4 0,083 M :MeOH:ACN
- 31 -
Berente y col., Gradiente ACN:MeOH/H2O
SPE C18 100 (250x4,6; 5) 50 1 333-460 16/25 0,024-0,125
2005 (85% H3PO4)
CIA Ochraprep (85:114:1) ACN:H2O:HAc 100 (125x4; 5) 40 1 333-460 5,8/10 0,008-0,015
Pacin y col.,
2005 ELL CHCl3 +
(99:99:2) ACN:H 2O:HAc 100 (150x3,9; 5) NE 1 333-460 6,2/10 0,012-0,04
CIA Ochratest
Czerwiecki y col. (55:19:28) H3PO4 0,75 M 0,0005-
CIA Ochratest 100 (250x4,6; 5) Amb 0,7 330-460 NE
2005 :ACN:Isopropanol 0,002
ELL CHCl3 +
Lin y col., 2005 (99:99:2) ACN:H 2O:HAc 100 (250x4,6; 5) NE 1 333-460 10,5/13 0,2/NE
CIA Ochratest
Domijan y
CIA Ochratest (700:300:2) MeOH:H2O:HAc 50 (125x4; 5) Amb 0,5 336-464 8/NE 0,01/NE
Peraica, 2005
ELL Tolueno +
Anli y col., 2005 Gradiente ACN:H2O:HAc 25 (250x4,6; 5) 25 1 330-470 25/30 NE/0,01
SPE Sep Pack
Varga y col.,
SPE C15 (99:99:2) ACN:H 2O:HAc 20 (250x4; 5) NE 1 334-460 NE 0,01/NE
2005
Tabla 4 cont.: Métodos analíticos para la cuantificación de ocratoxina A en vino.*ELL: extracción líquido-líquido. SPE: Extracción en fase
sólida. CIA: columnas de inmunoafinidad. MeOH: metanol. ACN: Acetonitrilo. HAc: Ácido acético. NaAc: Acetato de sodio. PEG:
Polietilenglicol. VI: Volumen de inyección. Amb: Temperatura ambiente NE: No especificado.

Aresta y col.,
SPME* (87:111:2) ACN:H2O:HAc 50 (150x4,6) Amb 1 332-460 13/20 0,07-0,22
2006
Cigic y col., SPE automated
(50:49:1) ACN:H 2O:HAc (250x4; 5) NE 1 333-460 6,9/11 NE/0,01
2006 on line
Chiodini y col., Gradiente ACN:H2O
SPE C18 25 (150x4,6; 5) Amb. 0,8 333-460 12/20 0,05/0,16
2006 (0,5% Ac. Propiónico)
Shundo y col., PEG + NaHCO3, (30:35:35)
20 (250x4; 10) NE 0,8 332-476 6,5/15 0,01/0,03
2006 CIA Ochraprep 3,33% HAc:ACN:MeOH
El Khoury y col., PEG + NaHCO3,
(99:99:2) ACN:H 2O:HAc 100 (250x4; 5) Amb. 1 333-460 8/NE 0,01/NE
2006 CIA Ochraprep
Varelis y col., SPE polimérica y
(50:50) ACN:1% Ac. Fórmico NE (250x4,6; 5) 40 0,65 385-430 8,5/10 0,004/0,016
2006 aminopropilo
Belajová y PEG + NaHCO3,
(50:50) ACN:2% HAc 100 (250x4,6; 5) Amb. 1 333-460 10,9/14 0,011/0,033

Rauova, 2007 CIA Ochraprep
Var y Kabak,
CIA Ochraprep (47:51:2) ACN:H 2O:HAc 20 (250x4,6; 5) NE 1 337-470 13/15 0,010/0,030
2007
Perrone y col., PEG + NaHCO3,
(99:99:2) ACN:H 2O:HAc 100 (150x4,6; 5) NE 1 333-460 NE 0,01/0,02
- 32 -
2007 CIA Ochratest
García-Fonseca y Gradiente H2O:ACN (10%
Coacervatos 20 (150x4,6; 5) NE 1 334-460 NE 0,015-0,025
col., 2008 HAc)
Flajs y col., 2009 CIA Ochratest (70:30:2) MeOH:H2O:HAc 50 (125x4; 5) Amb. 0,5 336-464 NE 0,005/NE
Rusanova y col., PEG + NaHCO3,
(50:49:1) ACN:H 2O:HAc 25 (150x4,6; 5) Amb. 1 NE NE NE/0,5
2009 CIA
Altiokka y col., Inyección
(50:48:2) ACN:H 2O:HAc 10 (150x4,6; 3) NE 0,4 333-450 13/NE 0,052-0,159
2009 directa
Pena y col., Inyección (15:85) ACN:NH4Cl, NH4OH
NE (250x4,6; 5) 25 1 383-440 NE 1,0/NE
2010 directa 20 mM
Spadaro y col., PEG + NaHCO3, 0,0072-
(99:99:2) ACN:H 2O:HAc 100 (150x4,6; 5) NE 1 333-460 6,2/18
2010 CIA Ochratest 0,0093
Quintela y col., PEG + NaHCO3,
(99:99:2) ACN:H 2O:HAc 100 (150x4,6; 4) NE 1 333-460 NE 0,002-0,004
2011 CIA Ochratest
Tabla 4 cont.: Métodos analíticos para la cuantificación de ocratoxina A en vino.*SPME: microextracción en fase sólida. SPE: Extracción en
fase sólida. CIA: columnas de inmunoafinidad. MeOH: metanol. ACN: Acetonitrilo. HAc: Ácido acético. NaAc: Acetato de sodio. PEG:
Polietilenglicol. VI: Volumen de inyección. Amb: Temperatura ambiente NE: No especificado.
En la tabla 5 se muestran valores de ocratoxina A descritos en la

bibliografía en muestras de vino tinto de diferentes países.
Nº >LD/ Media Mediana Intervalo

Referencia País*
Nº total (µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1)
I, F, S, NA, E,
Zimmerli y Dick, 1996 77/79 0,039 0,013 <0,003-0,388
otros
Burdaspal y Legarda,
84 / 91 0,054 NE <0,003–0,603 Total
1999
66/72 0,038 NE <0,003-0,155 España
8/8 0,225 NE 0,004-0,452 Francia
6/8 0,052 NE <0,003-0,191 Italia
2/2 0,016 NE 0,011-0,020 Portugal
1/1 0,005 0,005 0,005 Hungría
Visconti y col., 1999 37/38 1,24 0,76 <0,01-7,63 Italia
Castellari y col., 2000 7/7 2,60 3,05 0,06-5,00 Italia
1/1 0,74 0,74 0,74 España
1/1 2,14 2,14 2,14 EEUU
Otteneder y Majerus,
165/305 0,201 0,02 <0,01-3,31 Mundial
2000
Filali y col., 2001 20/20 0,912 0,785 0,04-3,24 Marruecos
Pietri y col., 2001 82/96 0,419 0,090 <0,0006-3,177 Italia
Markaki y col., 2001 31 / 31 NE NE 0,010-3,4 Mediterráneo
+
Soleas y col., 2001 96/580 0,18 <0,05 0,15-0,20 Mundial
López de Cerain y col.,
13/28 0,147 NE 0,05-0,316+ E (Navarra)
2002
Aboul-Enein y col.,
2/2 7,47 NE 3,80-11,14 NE
2002
Stefanaki y col., 2003 71/104 0,34 0,09 <0,05–2,69 Grecia
Soufleros y col., 2003 9/14 0,68 0,09 <0,02–2,51 Grecia
Shepard y col.,2003 9/9 0,24 NE 0,07–0,39 Sudáfrica
5/5 0,58 NE 0,23-0,91 Italia
Miceli y col., 2003 14/14 0,32 0,16 0,05-1,28 Italia
Hocking y col., 2003 49/344 NE <0,02 <0,02-0,62 Australia
Lo Curto y col., 2003 7/7 0,49 0,22 0,10-2 Italia
Bellí y col., 2004 24/130 0,46 <0,05 <0,05–4,24 España
Dall’Asta y col., 2004 30/60 NE >0,2 <0,05–>0,5 Italia
Tabla 5: Presencia de ocratoxina A en muestras de vino tinto de diferentes países.
+
Intervalo en muestras >LC. *I (Italia), F (Francia), S (Suiza), NA (Norte de África), E
(España). NE: No especificado.
- 33 -

Referencia País*
Rosa y col., 2004 3/10 0,035 0,028-0,042 Brasil
2/7 0,035 0,028-0,042 Argentina
2/5 0,050 0,028-0,071 Chile
1/4 0,042 0,042 España
2/5 0,028 0,028 Francia
3/5 0,033 0,028-0,042 Italia
3/7 0,040 0,028-0,057 Portugal
+
Blesa y col., 2004 21/61 0,28 <0,01 O,06-0,53 E (Valencia)
1AU, 1AS,
Maier y col., 2004 5/11 0,21 <0,01 0,12-0,30+ 1CH, 1SA, 5I,
1CA, 1CR
Ng y col., 2004 5/36 0,024 <0,008 <0,008-0,333 Canada
9FR, 10GR,
26/48 0,211 <0,050 <0,008-2,320 9IT, 7E, 1TUR,
1AL, 11 EEUU
Brera y col., 2005 134/159 0,5 <0,10 <0,01–4,00 Italia
0/27 <0,01 <0,01 <0,01 Hungría
+
Berente y col., 2005 7/57 NE <0,024 <0,125 Hungría
0/54 <0,008 <0,008 <0,008 Argentina
Pacin y col., 2005
0/14 <0,012 <0,012 <0,012 Chile
+ Holanda
Czerwiecki y col., 2005 49/53 0,478 0,039 0,0022-6,71
(importados)
Taiwan
Lin y col., 2005 5/10 0,3 NE 0,2-0,5+
(importados)
Domijan y Peraica, 2005 7/7 0,022 0,022 0,012-0,047 Croacia
Bacaloni y col., 2005 36/43 0,031 NE 0,04-1,44 Italia
Anli y col., 2005 36/36 0,728 NE 0,04-1,92 Turquía
Varga y col., 2005 33/33 0,117 NE 0,03-0,533 Hungría
+ +
Aresta y col., 2006 16/29 NE 0,72 0,31-2,92 Italia
Cigic y col., 2006 3/3 NE <0,01 <0,01-0,04 Eslovenia
9F, 4I, 1SA
Chiodini y col., 2006 NE/14 0,18 0,073 <0,05-0,75
Tradicionales
7F, 3I, 1SA,
NE/12 0,16 0,066 <0,05-0,72
1AL Orgánicos
Shundo y col., 2006 9/29 NE NE 0,10-1,33+ Brasil
18/34 NE NE <0,03-0,32 Importados
Tabla 5 cont.: Presencia de ocratoxina A en muestras de vino tinto de diferentes países.
+
Intervalo en muestras >LC. * E (España), AU (Australia), AS (Austria), CH (Chile), SA
(África del Sur), I (Italia), CA (California), CR (Croacia), F (Francia), AL (Alemania). NE: No
especificado.
- 34 -

Referencia País*
El Khoury y col., 2006 42/70 NE NE 0,012-0,126+ Líbano
Belajová y Rauova, +
12/18 NE NE 0,011-0,463 Eslovaquia
2007
7/7 NE NE 0,011-0,122 Importados
Var y col., 2007 44/51 0,110 NE <0,010-0,815 Turquía
Perrone y col., 2007 88/112 0,64 NE <0,01-4,93 Italia

García-Fonseca y col.,
1/5 NE <0,015 <0,015-<0,025 España
2008
Brera y col., 2008 535/773 0,34 0,10 <0,01-7,50 Italia
Flajs y col., 2009 8/10 0,015 0,015 <0,005-0,021 Croacia

+
Rusanova y col., 2009 3/7 2,9 <0,5 1,8-4,4 Rusia
Altiokka y col., 2009 20/20 2,85 NE 0,39-7,96 Turquía
Tessini y col., 2010 27/154 NE <0,01 NE CH, AR, FR
Welke y col., 2010 1/34 4,5 <0,016 4,5 Brasil
Pena y col., 2010 9/35 NE <1,0 1,23 Portugal
Spadaro y col., 2010 696/1002 0,121 NE <0,072-2,63 Italia

+
Campone y col., 2011 13/16 0,287 0,040 0,017-1,53 Italia
Quintela y col., 2011 54/94 0,037 NE 0,004-0,179+ E (La Rioja)

Tabla 5 cont.: Presencia de ocratoxina A en muestras de vino tinto de diferentes países.
+
Intervalo en muestras >LC. *CH (Chile), AR (Argentina), F (Francia), E (España). NE: No
especificado.
Algunos autores apuntan que la presencia de ocratoxina A en vinos

del sur de Europa es mayor debido a las condiciones climatológicas más
cálidas (Otteneder y Majerus, 2000; Blesa y col., 2006; Brera y col.,
2008). Sin embargo, la EFSA menciona que no se encuentran
diferencias sistemáticas entre países (EFSA, 2006).
Según los diferentes tipos de vino, los vinos tintos contienen

mayores concentraciones de OTA que los rosados o los blancos (Mateo y
col., 2007).
- 35 -
INTRODUCCIÓN: Validación de métodos analíticos
4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

La validación de un método analítico se define como el
establecimiento documental de que un procedimiento analítico
conducirá, con un alto grado de seguridad a la obtención de resultados
precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de
calidad previamente establecidos (AEFI, 2001).
Previamente a la validación, se desarrolla la puesta a punto del

método analítico, que incluye desde los primeros estudios de tanteo con
patrones, hasta la utilización del método en muestras reales que
garanticen el buen comportamiento del método en el momento del
análisis. En ocasiones, se puede adaptar un método existente para una
nueva aplicación. En otras, es preciso el desarrollo de uno nuevo en su
totalidad. Siempre, el método debe ser optimizado, de manera que se
decidan bien las características del método final antes de la validación.
El proceso de validación demuestra y verifica documentalmente que

el método es adecuado para el análisis propuesto en las condiciones
descritas, permite el conocimiento del método analítico y ofrece
confianza y seguridad en los resultados. La alta calidad de los datos
obtenidos con un método validado ha hecho que este proceso reciba una
considerable atención desde la industria y organismos reguladores. Los
laboratorios analíticos que requieran cumplir legislación o normas de
calidad (BPL, NCF, ISO 17025…) deben validar sus métodos analíticos.
Por ello, diferentes organizaciones proporcionan guías cuya amplitud
depende de los requerimientos exigidos, aunque el objetivo de la
validación es siempre el mismo. Algunos ejemplos son:
La Food and Drug Administration de EEUU (FDA) desarrolló dos

guías para la industria sobre validación de métodos analíticos: Guidance
for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry,
- 37 -
Manufacturing, and Controls Documentation (2000) y Guidance for

Industry. Process Validation. General Principles and Practices (2011).
La International Conference on Harmonisation of Technical

Requeriments for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)
tiene una guía para validación de métodos analíticos: Validation of
Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1) (2005).
La International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)

publicó Harmonized guidelines for Single-Laboratory Validation of
Methods of Analysis (2002).
La red de organizaciones EURACHEM, A Focus for Analytical

Chemistry in Europe, desarrolló una guía oficial para los laboratorios
acreditados bajo normas ISO: The fitness for Purpose of Analytical
Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics
(1998).
La Scientific Association Dedicated to Analytical Excellence (AOAC

International) ofrece métodos oficiales de análisis y guías sobre
validación en un solo laboratorio (AOAC Guidelines for Single Laboratory
Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals,
2002) o en estudios colaborativos (Guidelines for Collaborative Study
Procedures to Validate Characteristics of a Method of Analysis, 2002).
La Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI)

publicó un libro sobre validación de métodos analíticos aplicados en el
análisis de productos farmacéuticos (2001).
La Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) escribió

un informe técnico sobre Recomendaciones Armonizadas para la
Validación de Métodos de Análisis en un solo Laboratorio (Resolución
OENO 8/2005) y otro centrado en análisis enológicos, Guía práctica para
- 38 -
la validación, el control de calidad y la estimación de la incertidumbre de

un método de análisis enológico alternativo (Resolución OENO 10/2005).
La Comisión Europea (CE) estableció la Decisión de la Comisión de

12 de agosto de 2002 por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del
Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la
interpretación de los resultados, y el Reglamento (CE) Nº 401/2006 de
la Comisión de 23 de febrero de 2006 por el que se establecen los
métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido
de micotoxinas en los productos alimenticios.
Los parámetros a evaluar en una validación dependen del tipo de

análisis y su aplicación. Las definiciones y algunos términos varían entre
organismos, esto se muestra en la tabla 6.
Este contraste de conceptos hace que a veces las guías resulten

confusas o que no todos los parámetros puedan/tengan que ser
estudiados para una determinada aplicación, ya que la secuencia óptima
de experimentos analíticos necesarios para el desarrollo de un método
depende del objetivo del método. Sin embargo, el objetivo de la puesta
a punto y validación del método siempre es demostrar que el método
ofrece resultados exactos y precisos, por lo que el papel del
investigador, su conocimiento del método y su criterio ante los
resultados obtenidos cobran un papel significativo. Los términos
utilizados dejan de ser importantes siempre que se cumpla el objetivo
buscado y conocer las definiciones más comunes de cada parámetro
ayuda a ello.
- 39 -
Parámetro Término Organismo

Aplicabilidad Aplicability (scope) AOAC, CE, IUPAC, OIV
Selectividad Specificity USP, ICH, CE, EURACHEM
Selectivity ISO 17025, AOAC, OIV, IUPAC,
EURACHEM
Precisión Fidelidad OIV
Precision USP, ICH, IUPAC, OIV
Reliability AOAC
Repetibilidad Repeatability ICH, ISO 17025, CE, AOAC,
EURACHEM
Precisión intermedia Intermediate precision ICH, AOAC
Reproducibilidad Reproducibility ICH, ISO 17025, CE, AOAC,
EURACHEM
Exactitud Veracidad OIV, CE
Accuracy USP, ICH, AOAC, ISO 17025,
EURACHEM,
Trueness or bias CE, IUPAC, OIV, EURACHEM
Recovery AOAC, CE, IUPAC, EURACHEM,
OIV
Incertidumbre Uncertainty AOAC, CE, IUPAC, EURACHEM,
OIV
Linealidad Linearity USP, ICH, ISO 17025, IUPAC
Calibration AOAC, CE, IUPAC, OIV
Intervalo, rango Range USP, ICH, IUPAC, EURACHEM,
OIV
Límite de detección Limit of detection USP, ICH, ISO 17025, IUPAC,
EURACHEM, OIV
Limit of determination AOAC
Detection capability CE
Límite de cuantificación Limit of quantitation USP, ICH, ISO 17025, IUPAC,
EURACHEM, OIV
Limit of determination IUPAC, OIV
Decision limit CE
Sensibilidad Sensitivity OIV, IUPAC
Robustez Robustness ICH, ISO 17025, EURACHEM
Ruggedness USP, AOAC, CE, OIV, IUPAC,
EURACHEM
Tabla 6: Parámetros de validación y organismo que los mencionan.
MUESTREO
La toma de muestras es un paso que suele obviarse en las guías

porque a menudo la muestra es suministrada y este aspecto no está
bajo el control del laboratorio (AOAC, 2002). Sin embargo, para el
análisis de micotoxinas en alimentos, el muestreo tiene un papel
- 40 -
fundamental ya que las micotoxinas están muy heterogéneamente

distribuidas en los lotes. El Reglamento 401/2006 establece el
procedimiento de muestreo para el control oficial del contenido de
micotoxinas en los productos alimenticios (Reglamento Nº 401/2006).
APLICABILIDAD
También se denomina especificación, ámbito de validación o

practicabilidad (scope of validation, fitness-for-purpose). El método
analítico se aplica para determinar un analito específico, en un intervalo
de concentraciones determinado, en un tipo de material particular
utilizado para un propósito específico. En general, la validación debe
comprobar que el método se comporta de forma adecuada para la
finalidad perseguida en todo el conjunto de concentraciones del analito y
de materiales de ensayo a los que se aplica. En ocasiones, este es un
factor que, erróneamente, no se tiene en cuenta y se utiliza un mismo
método para diferentes matrices, sin tener en cuenta el efecto de éstas
en los resultados obtenidos (diferente recuperación, límite de
cuantificación…). En la Decisión 2002/657/CE se utiliza el término
aplicabilidad como sinónimo de robustez de los cambios menores
(Decisión 2002/657/CE).
ESTABILIDAD
La demostración de la estabilidad de los analitos en la muestra y de

los patrones durante el tiempo comprendido entre su tratamiento y la
finalización de los análisis es un requerimiento básico, especialmente
cuando se utilizan equipos de análisis automáticos en donde las
muestras pueden permanecer horas antes de ser analizadas (AEFI,
2001). De la misma forma debe demostrarse la estabilidad de los
analitos en las condiciones de almacenamiento de las muestras.
- 41 -
ROBUSTEZ
La robustez es la medida de la capacidad de un método analítico

para permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones
en ciertos parámetros, proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad
durante su empleo en rutina (AEFI, 2001).
El estudio de robustez se utiliza para optimizar y ver la criticidad del

valor de los parámetros del método antes de validar. Deben identificarse
y evaluarse los aspectos del método susceptibles de afectar a los
resultados. La Farmacopea USP utiliza el término ruggedness pero
asimilado al término reproducibilidad (USP, 2009). La guía EURACHEM
menciona los dos términos en inglés (robustness, ruggedness)
indistintamente aunque prefiere ruggedness (ERACHEM, 1998). La CE,
además, emplea la diferenciación cambios importantes-cambios
menores (Decisión 2002/657/CE).
SELECTIVIDAD
La selectividad es la capacidad de un método analítico para medir

y/o identificar simultánea o separadamente los analitos de interés, de
forma inequívoca, en presencia de otras sustancias químicas que puedan
estar presentes en la muestra (AEFI, 2001).
Frecuentemente el término especificidad se utiliza como sinónimo,

aunque debería reservarse para aquellas situaciones donde la respuesta
obtenida solo se puede producir con una única entidad química. Como
existen muy pocos métodos que den respuesta específica solo a un
único analito, el término selectividad es, normalmente, más apropiado.
La selectividad de un método analítico es uno de los parámetros

más importantes y debería determinarse antes de iniciar el estudio de
cualquier otro parámetro de validación, dado que debe conocerse en qué
grado la respuesta del método es únicamente proporcionada por el
- 42 -
analito, sin interferencias de otras sustancias relacionadas con él de una

u otra forma. La presencia de interferencias imposibilita la identificación
inequívoca del analito (aparición de falsos positivos) y puede
distorsionar su respuesta (AEFI, 2001).
LINEALIDAD
La linealidad se define como la capacidad del método para

proporcionar resultados que son directamente (o por medio de
transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del
analito en la muestra dentro de un intervalo establecido (AEFI, 2001). El
término linealidad es el más extendido ya que generalmente se buscan
relaciones lineales entre respuesta y concentración del analito; sin
embargo, no siempre ocurre así, como por ejemplo en métodos
inmunológicos y, en este caso, el término calibración resulta más
apropiado.
El intervalo de concentración dentro del cual el método puede

considerarse validado es la diferencia en magnitud entre la
concentración superior e inferior de analito para la cual se ha
demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad (AEFI, 2001).
Para evaluar la linealidad se recomienda estudiar al menos 5 niveles

de concentración dentro del intervalo establecido y analizarlos por
triplicado (k = 5, nº de réplicas = 3, n = 15) (AEFI, 2001). Aunque lo
deseable sería analizar las muestras de manera aleatoria, no obstante,
se establece como criterio práctico analizarlas en sentido creciente de
concentración para minimizar posibles efectos memoria en el equipo.
El estudio de linealidad no solo implica una representación gráfica

área/concentración, sino que es necesario realizar una comprobación
estadística (AEFI, 2001).
- 43 -
Ecuación de la recta. Pendiente y ordenada en el origen.
En la recta de regresión y=b·x+a, x es la concentración, y la

respuesta, b el valor de la pendiente y a la ordenada en el origen.
La pendiente b está relacionada con la sensibilidad del método de

forma que a mayor pendiente, mayor sensibilidad (respuesta del método
frente a los cambios de la concentración de analito). La ordenada en el
origen a es la intersección de la recta con el eje de ordenadas y es
indicativa del error sistemático, no difiriendo estadísticamente de cero
en caso de no existir sesgo.
Coeficiente de correlación (r) y coeficiente de determinación (r 2).
El coeficiente de correlación indica el grado de relación entre la

concentración y la respuesta. Si r es cercano a la unidad significa que
existe correlación con una probabilidad elevada.
La información obtenida mediante el cálculo de r es limitada y no

justifica por sí sola la linealidad, siendo el coeficiente de determinación
r2 el que aporta una mayor significación estadística ya que expresa la
proporción de la variación total de y explicada por el modelo.
Varianza residual constante (homoscedasticidad).
La representación de los residuales (diferencia entre el valor “y”

estimado y el valor obtenido) frente a los valores estimados debe seguir
una distribución aleatoria y no reflejar ninguna tendencia.
Análisis de la varianza: ANOVA
Para poder realizar un ANOVA se deben cumplir los siguientes

supuestos:
-Homogeneidad de varianzas. Se puede comprobar aplicando un

test de Cochran que indica si el factor de concentración tiene alguna
influencia en la variabilidad de los resultados. Deben normalizarse
- 44 -
previamente las respuestas, ya que, de lo contrario, se comparan

coeficientes de variación que corresponden a medias de
concentración diferentes entre sí. Las varianzas no deben ser
estadísticamente diferentes entre sí para el grado de significación
escogido (α = 0,05), Gexp < Gtablas.
-Normalidad de los residuales. Puede comprobarse mediante

representación gráfica o aplicando un test de normalidad.
Una vez comprobados estos supuestos, se calcularán los

estadísticos F1 y F2. F1exp > F1tablas demuestra la existencia de una
pendiente distinta de cero. F2exp < F2tablas demuestra la linealidad entre
los resultados obtenidos.
Test de linealidad.
Existen varios procedimientos para verificar la linealidad:
Coeficiente de variación de los factores respuesta (f)
El factor respuesta (f) expresa la relación entre el área y la

concentración y puede tomarse como una expresión aproximada de la
sensibilidad del calibrado. Los factores respuesta deben ser semejantes
entre sí y cercanos al valor de la pendiente. En general, valores del
coeficiente de variación superiores al 5% serían indicativos de una
posible falta de linealidad (AEFI, 2001).
Significación estadística de la desviación estándar de la pendiente
Se trata de comprobar que la pendiente es significativamente

distinta de cero mediante una prueba t de Student. El intervalo de
confianza de la pendiente no debe incluir al cero.
- 45 -
Test de proporcionalidad
Permite evaluar si la recta pasa por el origen de coordenadas

determinando si la variable independiente es significativamente distinta
de cero. En el intervalo de confianza debe estar incluido el cero.
PRECISIÓN
Es la capacidad de un método para proporcionar resultados

próximos entre si. La guía ICH indica que se puede estudiar a tres
niveles (ICH, 2005):
- Repetibilidad: Se refiere al grado de concordancia de los

resultados cuando las condiciones de los análisis se mantienen lo más
constantes posible: mismo analista, reactivos, equipos e instrumentos, y
se realizan en un corto período de tiempo (precisión intraensayo, within-
day precision).
- Precisión intermedia: Evalúa la precisión frente a variaciones de

analista, equipo y día (precisión intralaboratorio o precisión interensayo,
within-laboratory precision, between-day precision).
- Reproducibilidad: Evalúa la precisión entre laboratorios (precisión

interlaboratorios, between-laboratory precision).
Uno de los factores que más puede afectar en la repetibilidad del

método de análisis es la concentración de analito, ya que la desviación
estándar de las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la
concentración de analito. Así, cuando se trabaja a concentraciones bajas
se aceptan coeficientes de variación mayores que cuando se trabaja a
concentraciones altas.
La AEFI propone valores límite del coeficiente de variación del

método en función de la concentración de analito según la tabla 7:
- 46 -
Concentración
CV (%)
(µg·L-1)
1 30
10 21
100 15
Tabla 7: Valores límite de CV de un método analítico (AEFI, 2001).
EXACTITUD
La exactitud expresa la proximidad entre el valor que es aceptado

convencionalmente como valor verdadero o valor de referencia y el valor
experimentalmente encontrado (AEFI, 2001). La recuperación se puede
englobar dentro de este término ya que expresa la proximidad al valor
verdadero cuando sobre la muestra se aplica el método completo.
La recuperación se expresa como porcentaje y se calcula conforme

a la expresión:
El Reglamento (CE) Nº 401/2006 fija los siguientes valores de

recuperación para los métodos de análisis de OTA en alimentos
(tabla 8). Además, establece los criterios en condiciones de repetibilidad
(CVr) y reproducibilidad (CVR) que deben cumplir los métodos de análisis
para el control oficial del contenido de micotoxinas en productos
alimenticios.
Contenido de Recuperación
CVr (%) CVR (%)
OTA (µg·kg-1) (%)
<1 50 - 120 40 60
1-10 70 - 110 20 30
Tabla 8: Criterios de recuperación fijados para métodos de análisis de OTA.
LÍMITES DE CUANTIFICACIÓN Y DETECCIÓN
El límite de cuantificación (LC) es la mínima cantidad de analito que

puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y
- 47 -
precisión (AEFI, 2001). Experimentalmente, puede calcularse

analizando, por triplicado, muestras fortificadas con concentraciones
decrecientes de analito, comprobando cuál es la concentración a la que
los valores de recuperación y coeficiente de variación son adecuados.
El límite de detección (LD) es la mínima cantidad de analito en una

muestra que puede ser detectado, aunque no necesariamente
cuantificado, con precisión y exactitud (AEFI, 2001).
Entre el límite de detección y cuantificación hay un intervalo de

concentración en el que, si bien no puede cuantificarse el analito con
razonable certeza, sí puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos
positivos.
El LD no debe confundirse con la sensibilidad, ya que ésta es la

capacidad de un método de análisis para discriminar pequeñas
diferencias en la concentración. Una alta sensibilidad del método
analítico no siempre permite suponer inferiores LC y LD, ya que lo que
definirá estos límites es la relación entre el ruido y la señal debida al
analito. A este respecto, siempre es preferible un sistema con un bajo
ruido de fondo a costa de una menor sensibilidad.
De acuerdo con la IUPAC, puede calcularse el LD de un método

analítico a partir del conocimiento de la desviación estándar atribuible a
la respuesta de una muestra placebo y la pendiente de la recta de
calibrado del analito (AEFI, 2001). Este procedimiento, al igual que el de
la relación señal/ruido plantea el problema de cómo calcular la señal
media de un blanco, así cómo su desviación estándar. Por ello, se
recomienda utilizar el método basado en la extrapolación de la recta de
calibrado a concentración cero (AEFI, 2001).
Para calcular el límite de detección se utiliza la pendiente de una

recta de calibrado (b) realizada a niveles de concentración cercanos a
los límites esperados y el valor de la señal del blanco se sustituye por el
- 48 -
resultante de la extrapolación de dicha recta. La intersección con el eje y

corresponderá teóricamente al valor de la respuesta a concentración
cero de analito (ybl). La desviación estándar del blanco se estima como
la ordenada en el origen de la recta calculada representando la
desviación estándar de las concentraciones frente a la concentración
(sbl). El límite de detección se calcula a través de la fórmula:
- 49 -
JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y
OBJETIVOS
JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y OBJETIVOS
El presente proyecto se enmarca dentro de la línea de investigación

sobre “Presencia de micotoxinas en alimentos y su implicación en la
salud humana”, que se desarrolla conjuntamente en los departamentos
de Química Orgánica y Farmacéutica (sección Técnicas Instrumentales)
y Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología, de la Universidad
de Navarra.
La presencia de ocratoxina A (OTA) se ha estudiado ampliamente

en multitud de matrices alimentarias, incluido el vino. Este producto ha
sido identificado como la segunda fuente de ingesta de esta micotoxina
para el hombre después de los cereales. La concentración e incidencia
de esta toxina parece depender de las condiciones climatológicas y se ha
postulado que los vinos del sur de Europa presentan niveles más altos
de OTA debido a las condiciones de temperatura y humedad de la zona.
Otros compuestos relacionados, como la ocratoxina B y los metil y

etil ésteres de ambas ocratoxinas, son producidos por las mismas
especies de hongos y, por ello, pueden ser también contaminantes
naturales de diversos alimentos. La presencia de ocratoxina C en el vino
se describió por primera, y única, vez en 1996 y se indicó que su
concentración podía ser 10 veces inferior a la correspondiente de OTA
(Zimmerli y Dick, 1996). Desde entonces, no se han llevado a cabo más
estudios al respecto.
Valero y col. (2006) mencionaron que en los cromatogramas de

muestras de vino contaminadas por ocratoxina A aparecía otro pico a
menor tiempo de retención, sugiriendo que podía deberse a la presencia
de ocratoxina B.
Los efectos tóxicos de estas ocratoxinas relacionadas son en gran

parte desconocidos, pero los de la OTA podrían verse aumentados, o al
menos modificados, cuando ésta va acompañada de estos compuestos.
Por ello, conocer si aparecen o no en el vino junto a la OTA y en qué
- 53 -
JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y OBJETIVOS
niveles es de gran interés para evaluar el riesgo de ingestión de

ocratoxinas a través de esta matriz.
Cabe esperar que los niveles de contaminación de los compuestos

análogos de la OTA sean menores que los de esta micotoxina. Para su
cuantificación, se hace necesario un método analítico con menores
límites de detección que los descritos hasta ahora en la bibliografía para
la ocratoxina A.
El objetivo general de este trabajo es el estudio de la presencia

conjunta de OTA y otras ocratoxinas (OTB, MeOTA, OTC, MeOTB y
EtOTB) en vino tinto, a fin de aportar datos sobre la exposición humana
a estas micotoxinas.
Este objetivo general se concreta en los siguientes objetivos

específicos:
1. Puesta a punto y validación de un método analítico por HPLC-FLD

que permita la cuantificación simultánea de OTA, OTB, MeOTA,
OTC, MeOTB y EtOTB en vino tinto.
2. Estudio de los niveles de ocratoxinas (OTA, OTB, MeOTA, OTC,

MeOTB y EtOTB) en muestras de vino tinto de la Comunidad Foral
de Navarra. Estudio de la influencia del tipo de cultivo (tradicional o
ecológico) y las condiciones meteorológicas en los niveles
encontrados.
3. Estudio de los niveles de ocratoxinas en muestras de vino tinto

de países que circundan el mediterráneo.
4. Evaluación de la posible transformación de ocratoxina C en

ocratoxina A en vino tinto.
5. Estudio de la posible relación en la presencia de las diferentes

ocratoxinas.
- 54 -
MATERIAL Y MÉTODOS
MATERIAL Y MÉTODOS: Material
1. MATERIAL
REACTIVOS
Ocratoxinas
- Ocratoxina A de Aspergillus Ochraceus, 1 mg. Sigma-Aldrich (ref:

O1877).
- Ocratoxina B de Aspergillus Ochraceus, 1 mg. Sigma-Aldrich (ref:

O1382).
- Disolución de ocratoxina alpha en acetonitrilo, 1 mL, 10 µg·mL-1.

Biopure (ref: S02053)
- Metanol CHROMASOLV® para HPLC. Sigma-Aldrich (ref: 34860).
- Etanol absoluto PAI*. Panreac (ref: 361086).
- Ácido clorhídrico fumante 37% PA. Merck (ref: 1003171000).
- Diclorometano PA. Merck (ref: 1060501000).
- Hidrogenocarbonato de sodio. Riedel-de Häen (ref: 31437).
Extracción y purificación
- Hidróxido de sodio, lentejas. Panreac (ref: 131687).
- PBS, buffer de fosfato. Biochrom AG (ref: L-182-05).
- Columnas de inmunoafinidad Ochraprep®. R-Biopharm Rhône

(ref: P14B).
- Metanol CHROMASOLV® para HPLC. Sigma-Aldrich (ref: 34860).
*PAI: para análisis instrumental (UV, IR, HPLC…). PA: reactivos especialmente indicados
para aplicaciones analíticas generales. PA-ACS: ACS indica que el producto cumple,
además, con las normas de American Chemical Society específicas para él.
- 57 -
Cuantificación y confirmación
- Acetonitrilo CHROMASOLV® para HPLC. Sigma-Aldrich (ref:

34851).
- Acetonitrilo UpS Ultragradiente ROMIL. Teknokroma (ref: RM-

H050L).
- Agua desionizada de calidad Milli-Q®, recogida diariamente

(resistividad 18,2 MΩ·cm).
- Ácido fórmico 98% PA-ACS. Panreac (ref: 131030).
- Filtros Millex®-HV, 0,45 µm, PVDF, 13 mm, no estériles. Millipore

(ref: SLHVX13NK).
- Kit Viales: viales ámbar de rosca 2 mL, tapones y septum. Agilent

Technologies (ref: 5182-0554).
- Inserto para vial 400 µL vidrio desactivado. Agilent Technologies

(ref: 5183-2086).
APARATOS Y EQUIPOS
Preparación y almacenamiento de disoluciones patrón
- Espectrofotómetro de doble haz UVIKON 922 de Kontron

Instruments.
- Campana de seguridad Cruma 990.
- Agitador rotatorio SBS.
- Congelador vertical Zanussi ZD 2050 VPR.
Extracción
- pH-metro Basic 20 Crison.
- Balanza Mettler Toledo XP 205 DeltaRange®.
- 58 -
- Colector múltiple de vacío vacuum manifold VisiprepTM 24 de

Supelco.
- Baño de agua termostatizado Selecta acoplado a un sistema de

evaporación con gas nitrógeno.
- Agitador Vórtex Techno Kartell TK3S.
Cuantificación
- Pipetas automáticas Brand Transferpette® entre 5 y 1.000 µL.
- Vórtex-evaporador 230V 4322 100 de Labconco.
- Equipo de purificación de agua Milli Q Gradient de Millipore.
- Baño ultrasonidos Selecta.
- Cromatógrafo de líquidos HPLC 1100 de Agilent Technologies

(figura 3), dotado de desgasificador de vacío G1322A, sistema de
bombeo cuaternario G1311A, inyector automático G1313A,
compartimento termostatizado para columnas G1316A, detector de
fluorescencia G1321A y programa informático Chemstation 3D. Columna
Zorbax Eclipse XDB-C18, 5 µm, 150 x 4,6 mm de Agilent Technologies y
precolumna Tracer Extrasil ODS, 5 µm, 1 0,4 cm de Teknokroma.
Figura 3: Equipo HPLC-FLD.
- 59 -
Confirmación
- Cromatógrafo de líquidos HPLC 1200 de Agilent Technologies,

dotado de desgasificador de vacío G1379B, sistema de bombeo binario
SL G1312B, inyector automático SL G1367C, termostato para inyector
G1330B, compartimento termostatizado para columnas G1316B,
detector de fluorescencia G1321A y programa informático Chemstation
3D. Columna Zorbax Eclipse Extend-C18, 3,5 µm, 50 x 2,1 mm de
Agilent Technologies.

acoplado a un espectrómetro de masas tipo TOF (Time of Flight) 6220
Accurate-Mass TOF LC/MS (figura 4). El equipo consta además de:
desgasificador de vacío G1379B, sistema de bombeo binario SL G1312B,
inyector automático G1367C, termostato del inyector G1330B,
compartimento termostatizado de columna G1316B, detector
ultravioleta G1315B y programa informático Mass Hunter.
Figura 4: Accurate-Mass TOF LC/MS de Agilent Technologies.

acoplado a un espectrómetro de masas tipo trampa iónica LC/MSD
Trap XCT Plus (figura 5). El equipo consta además de:
- 60 -
desgasificador de vacío G1379B, sistema de bombeo binario

G1312B, inyector automático G1367C, termostato del inyector
G1330B, compartimento termostatizado para columnas G1316B,
detector ultravioleta G1315B y los programas informáticos Agilent
Chemstation 3D y LC/MSD Trap software.
Figura 5: HPLC 1200/MSD Trap XCT Plus de Agilent Technologies.
- 61 -
MATERIAL Y MÉTODOS: Muestras
2. MUESTRAS
VINOS TINTOS NAVARROS
Se han analizado 51 vinos tintos de la Comunidad Foral de Navarra.

De estos, 35 son vinos tintos de agricultura tradicional y 16 cuentan con
la certificación de vino ecológico del Consejo de la Producción Agraria
Ecológica de Navarra (CPAEN).
En Navarra, la Denominación de Origen data del año 1933. Una de

las principales características que la definen es la gran diversidad de
paisajes y climas que se dan en los más de 100 km que separan el norte
de la zona, situada en las cercanías de Pamplona, del sur, enclavada en
la ribera del Ebro.
La confluencia en Navarra de los climas atlántico, continental y

mediterráneo define las 5 zonas de producción vitivinícolas diferenciadas
por su localización geográfica, su orografía, las variedades cultivadas, el
suelo y el clima. Las cinco áreas son: Baja Montaña, Valdizarbe, Tierra
Estella, Ribera Baja y Ribera Alta (ver mapa). Entre ellas se alcanza una
superficie superior a las 15.000 hectáreas de viñedo.
Figura 6: Mapa de las 5 zonas de la D.O. Navarra y municipios de donde se ha analizado vino.
- 63 -
La elaboración de vino tinto supone un 70% de la producción total

de vino de Navarra, mientras que la producción de rosado y blanco
constituye un 25 y 5%, respectivamente. En cuanto a la
comercialización, el 70% se vende en territorio nacional y un 30% se
exporta a Alemania, Holanda, Reino Unido y EEUU, principalmente
(Consejo Regulador de la D.O. Navarra, www.navarrawine.com).
Figura 7: Comercialización de vino navarro y principales países de exportación.
Vinos de agricultura tradicional
Los 35 vinos de agricultura tradicional analizados se han adquirido

en diferentes comercios de Navarra, y se han clasificado en base al año
de cosecha. Así, 23 muestras son vinos jóvenes de los años 2006 y
2007 y las 10 restantes son vinos crianza de la cosecha de 2004. En la
tabla 9 se muestran el municipio de la bodega, la zona viticultora a la
que pertenece, el porcentaje de alcohol (% alc.) indicado en la etiqueta,
la variedad de uva y el año de cosecha.
Código Municipio Zona Año % alc. Tipo Uva
1J Corella Ribera Baja NE 12 NE
2J Cascante Ribera Baja NE 13,5 Tempranillo
3J Muruarte de Reta Valdizarbe NE 13 NE
2Jb Corella Ribera Baja 2006 12,5 Tempranillo, CS
Tempranillo, Merlot, CS,
4J Olite Ribera Alta 2006 13,5
Garnacha
5J Azcona Estella 2006 13 Tempranillo
11J Los Arcos Estella 2006 13,5 Tempranillo
12J Obanos Valdizarbe 2006 13,5 Garnacha
13J Carcastillo Ribera Alta 2006 13,5 NE
14J Falces Ribera Alta 2006 14,5 Cabernet Sauvignon, Merlot
Tabla 9: Características de los 35 vinos tintos de agricultura tradicional analizados. NE:
No especificado en la etiqueta. J: joven, C: crianza. CS: Cabernet Sauvignon.
- 64 -

6J Carcastillo Ribera Alta 2007 13,5 NE
7J Corella Ribera Baja 2007 13 Tempranillo
8J Corella Ribera Baja 2007 12,5 NE
Tempranillo, Cabernet
9J Obanos Valdizarbe 2007 13
Sauvignon
10J Corella Ribera Baja 2007 13,5 NE
Baja 70% Tempranillo, 20%
15J San Martin de Unx 2007 13,5
Montaña Garnacha, 10% CS+Merlot
16J Murchante Ribera Baja 2007 13,5 Tempranillo
17J Añorbe Valdizarbe 2007 13,5 Tempranillo, Merlot
18J Olite Ribera Alta 2007 13 Garnacha, Tempranillo
19J Lerín Ribera Alta 2007 13 Tempranillo
Tempranillo, Merlot, CS,
20J Olite Ribera Alta 2007 13,5
Garnacha
21J Corella Ribera Baja 2007 13 Tempranillo, CS
60% Tempranillo, 40%
22J Corella Ribera Baja 2007 13
Garnacha
23J Murchante Ribera Baja 2007 13,5 Tempranillo
24J Murchante Ribera Baja 2007 13 Tempranillo
Tempranillo, Garnacha,
1C Cintruénigo Ribera Baja 2004 12,5
Cabernet Sauvignon
2C Olite Ribera Alta 2004 13 Tempranillo
3C Muruarte de Reta Valdizarbe 2004 13 NE
4C Olite Ribera Alta 2004 14,5
Sauvignon, Merlot
Merlot, Cabernet Sauvignon,
5C Azcona Estella 2004 13
Tempranillo
Merlot, Cabernet Sauvignon,
6C Carcastillo Ribera Alta 2004 13,5
Tempranillo
7C Corella Ribera Baja 2004 13,5 NE
8C Corella Ribera Baja 2004 13,5 NE
9C Puente la Reina Estella 2004 13 NE
10C Corella Ribera Baja 2004 13,5
Sauvignon, Merlot
Tabla 9 cont.: Características de los 35 vinos tintos de agricultura tradicional analizados.
NE: No especificado en la etiqueta. J: joven, C: crianza. CS: Cabernet Sauvignon.
Vinos ecológicos
Los 16 vinos de agricultura ecológica analizados han sido

suministrados por siete bodegas navarras y provienen de las cosechas
de 2007 y 2008. Todas las bodegas están inscritas como elaboradores
de productos ecológicos en el Consejo de la Producción Agraria Ecológica
de Navarra (CPAEN).
- 65 -
El municipio y zona de viticultura de cada vino, con el año de

vendimia, el porcentaje de alcohol (% alc.) mostrado en la etiqueta y el
tipo de uva empleada de los vinos de agricultura ecológica se muestran
en la tabla 10.

1-EC-2007 Olite Ribera Alta 2007 13,5 NE
2-EC-2007 Peralta Ribera Alta 2007 14
Garnacha, 10% CS
2-EC-2007b Peralta Ribera Alta 2007 15,5 Tempranillo, Garnacha
3-EC-2007 Lakar Estella 2007 14
Merlot, 30% CS
4-EC-2007 Andosilla Rioja Baja 2007 NE NE
5-EC-2007 Bargota Rioja Baja 2007 13,5 Tempranillo
Garnacha, Cabernet
6-EC-2007 Lumbier Baja Montaña 2007 14
Sauvignon, Tempranillo
7-EC-2007 Lumbier Baja Montaña 2007 13,5 Garnacha
1-EC-2008 Olite Ribera Alta 2008 13,5 NE
2-EC-2008 Peralta Ribera Alta 2008 14
Garnacha, 10% CS
3-EC-2008 Lakar Estella 2008 13,5 Tempranillo
4-EC-2008 Andosilla Rioja Baja 2008 NE NE
5-EC-2008 Bargota Rioja Baja 2008 13,5 Tempranillo
7-EC-2008 Lumbier Baja Montaña 2008 13,5 Garnacha
8-EC-2008 Igúzquiza Estella 2008 13
Cabernet Sauvignon
9-EC-2008 Igúzquiza Estella 2008 13 Tempranillo 100%
Tabla 10: Características de los 16 vinos tintos de agricultura ecológica analizados.
NE: No especificado en la etiqueta. EC: ecológico. NE: No especificado. CS: Cabernet
Sauvignon.
Condiciones climatológicas
Los datos referentes a la temperatura media, humedad relativa

media y precipitación de los dos meses anteriores a la vendimia (julio y
agosto) del año correspondiente de cada vino, en cada municipio, se han
tomado de la página web de la Agencia Nacional de Meteorología y el
Gobierno de Navarra y se muestran en la tabla 11.
(http://meteo.navarra.es/estaciones/mapadeestaciones.cfm).
- 66 -
Humedad Precipitación
Año Municipio Tª media (ºC)
relativa (%) acumulada (L·m-2)
Cintruénigo 21,9 56,9 49,6
Olite 22,4 58,1 90,1
Muruarte de Reta 20,2 70,0 69,9
2004 Azcona Yerri 20,8 61,7 136,8
Carcastillo 21,9 61,3 55,8
Puente la Reina 21,0 60,0 56,8
Corella 21,8 56,0 50,2
Corella 22,5 52,9 32,2
Olite 22,9 56,5 36,8
Azcona, Yerri 21,4 63,0 57,7
2006 Los Arcos 22,0 58,6 36,8
Obanos 21,3 61,2 78,8
Falces 22,9 57,1 37,4
Obanos 19,8 61,5 49,0
Corella 21,4 49,4 8,2
San Martin 21,1 53,4 20,2
Murchante 22,1 50,5 20,6
Añorbe 19,8 61,5 49,0
2007 Olite 21,5 54,7 24,3
Lerín 20,3 55,4 9,5
Peralta 21,4 56,1 5,2
Lakar 19,6 63,1 36,6
Andosilla 21,3 61,0 13,2
Bargota 20,8 54,9 21,8
Lumbier 19,7 59,3 44,4
Olite 22,1 57,5 26,5
Peralta 20,8 57,9 25,5
Lakar 19,7 66,2 49,8
2008 Andosilla 21,6 62,1 23,0
Bargota 21,0 59,1 69,8
Lumbier 19,9 64,1 38,0
Igúzquiza 20,2 61,2 46,3
Tabla 11: Temperatura media (ºC), humedad relativa media (%) y precipitación
acumulada (L) de julio y agosto de cada año de vendimia en cada municipio.
VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS
Diversos trabajos (Blesa y col., 2006; Otteneder y Majerus, 2000;

Mateo y col., 2007) han concluido que los vinos de los países del Sur de
Europa son más susceptibles de contaminación por ocratoxina A debido
al clima cálido (tipo mediterráneo). Con el objetivo de conocer los
niveles de ocratoxina A y sus análogos en los países que bordean el
Mediterráneo se han analizado 96 vinos tintos procedentes de 9 países
- 67 -
de este entorno geográfico: España, Francia, Italia, Croacia, Grecia,

Turquía, Israel, Túnez y Argelia. Su situación geográfica se muestra en
el siguiente mapa:
Figura 8: Localización de los países mediterráneos de los que se han analizado vinos.
Vinos de España
Dentro de todas las denominaciones de origen de vino tinto de

España se ha elegido Cataluña por ser una zona con clima típicamente
mediterráneo.
En la Comunidad Autónoma de Cataluña el viñedo ocupa una

extensión aproximada de 71.000 hectáreas y cuenta en la actualidad
con diez denominaciones de origen (D.O. Alella, Conca de Barberà,
Costers del Segre, Empordà, Montsant, Penedès, Pla del Bages, Priorat,
Tarragona, Terra Alta) más una denominación de carácter genérico
creada en el año 2001 con el nombre de Denominación de Origen
Catalunya a la que pueden adscribirse las ya existentes (Ver figura 9).
De los 12 vinos analizados, 6 se adquirieron en diferentes comercios

de Pamplona y otros 6 por Internet (www.lavinia.es). Sus características
se muestran en la tabla 12.
- 68 -
Figura 9: Mapa de las denominaciones de origen en Cataluña.
Código D.O. Año % alc. Tipo Uva

1-CA-XXXX Penedés NE 12,5 Tempranillo, Merlot
2-CA-XXXX Catalunya NE 12,5 NE
3-CA-2007 Catalunya 2007 13 Tempranillo, Garnacha, Monastrell
4-CA-2007 Catalunya 2007 13 Cabernet Sauvignon, Merlot, Tempranillo
5-CA-2007 Catalunya 2007 13,5 Garnacha tinta, Mazuelo
6-CA-2008 Penedés 2008 13,5 Tempranillo, Garnacha, Monastrell
7-CA-2006 Penedés 2006 13,5 Cabernet Sauvignon, Merlot
8-CA-2008 Penedés 2008 14 Tempranillo
53% Cariñena, 28% Garnacha, 12%
9-CA-2008 Montsant 2008 14
Cabernet Sauvignon, 7% Tempranillo
10-CA-2008 Montsant 2008 14 85% Garnacha, 15% Syrah
11-CA-2009 Priorato 2009 14,5 Garnacha, Cariñena, Cabernet Sauvignon
12-CA-2008 Priorato 2008 15 80% Garnacha, 20% Cariñena
Tabla 12: Características de los 12 vinos tintos catalanes analizados. NE: No especificado
en la etiqueta.CA: Cataluña. XXXX: Año vendimia desconocido. D.O.: Denominación de
origen. % alc.: porcentaje de alcohol.
- 69 -
Vinos de Francia
Las muestras de vino francés analizadas han sido adquiridas en

comercios de Pamplona (10 vinos) o a través de Internet (2)
(www.lavinia.es). Sus características se muestran en la tabla 13.
Código Región Dpto D.O. Año % alc Uva
1-FR-2006 L’Atlantique Gironda Bordeaux 2006 12 Cabernet Merlot
2-FR-2007 L’Atlantique Gironda Bordeaux 2007 12,5 NE
Coteaux du
3-FR-2007 Vin de Pays d'Oc NE 2007 13 NE
languedoc
Coteaux du
4-FR-2007 Vin de Pays d'Oc NE 2007 13 NE
languedoc
5-FR-2007 Vin de Pays d'Oc NE Pays d’Oc 2008 13 Merlot
6-FR-2008 Vin de Pays d'Oc NE Pays d’Oc 2007 13 Merlot
Comtés
7-FR-2009 NE Beaujolais 2009 12,5 NE
Rhodaniens
Comtés Côtes du Garnacha,
8-FR-2009 Ródano 2009 13
Rhodaniens Rhône Syrah
9-FR-2006 L’Atlantique Gironda Bordeaux 2006 13 NE
Comtés
10-FR-2008 NE Beaujolais 2008 12 Gamay
Rhodaniens
Comtés Côtes du Garnacha
11-FR-2006 Ródano 2006 14,5
Rhodaniens Rhône Cariñena, Syrah
Comtés Saumur
12-FR-2007 Loira 2007 13 NE
Rhodaniens Champigny
Tabla 13: Características de los 12 vinos tintos franceses analizados. Dpto:
Departamento. D.O.: Denominación de origen. % alc.: porcentaje de alcohol. NE: No
especificado en la etiqueta. FR: Francia.
Figura 10: Mapa de las regiones y departamentos de Francia.
- 70 -
Vinos de Italia
Italia es el mayor productor de vino del mundo y el país con mayor

índice de consumo por
habitante.
Se ha analizado vino de
las regiones señaladas en la
figura 11. Las muestras
analizadas han sido adquiridas
en comercios de Pamplona (9
vinos) o a través de Internet (3
vinos) (www.lavinia.es). En la
tabla 14 se muestran el código,
la denominación de origen
(D.O.), la región, el año, el
porcentaje de alcohol (% alc.)
y el tipo de uva empleada.
Figura 11: Mapa de Italia.
Código D.O. Región Año % alc. Uva
1-IT-XXXX IGT Emilia-Romaña NE 11,5 NE

2-IT-2005 DOC Calabria 2005 13,5 Gaglioppo
3-IT-2006 DOC Cerdeña 2006 13 NE
4-IT-2007 DOC Emilia-Romaña 2007 11,5 NE
5-IT-2007 DOCG Toscana (Chianti) 2007 12,5 NE
7-IT-2007 IGT Apulia (Salento) 2007 13,5 NE
8-IT-2007 IGT Apulia (Salento) 2007 13,5 NE
95% Sangiovese, 5%
10-IT-2005 IGT Toscana 2005 13,5
Colorino
11-IT-2005 IGT Toscana 2005 14 NE
CS 40%, Merlot 20%, Syrah
12-IT-2006 IGT Toscana 2006 14
20%, Sangiovese 20%
Tabla 14: Características de los 12 vinos tintos italianos analizados. NE: No especificado
en la etiqueta. IT: Italia. CS: Cabernet Sauvigon. XXXX: Año vendimia desconocido.
- 71 -
Vinos de Croacia
Se indican en la figura 12 las regiones croatas de donde se han

analizado vinos.
Figura 12: Mapa de Croacia, señalados los condados de origen de las muestras.
Las muestras de vino croata se adquirieron a través de la página

web alemana www.jadrovino.de.
Código Origen Condado Año % alc. Uva
1-CR-2004 Stari Grad Split-Dalmacia 2004 13,5 Plavac mali
2-CR-2004 Konavle Dubrovnik-Neretva 2004 12,4 Cabernet Sauvignon
3-CR-2005 Peljesac Dubrovnik-Neretva 2005 12 Cuvée
4-CR-2005 Hvar Split-Dalmacia 2005 12 Plavac mali
5-CR-2006 Imotski Split-Dalmacia 2006 13,3 Merlot, Vranac, Trnjak
6-CR-2006 Konavle Dubrovnik-Neretva 2006 12,9 CS, Merlot
7-CR-2006 Dubrovnik Dubrovnik-Neretva 2006 12,3 Plavac mali
8-CR-2006 Peljesac Dubrovnik-Neretva 2006 11,5 Plavac mali
9-CR-2007 Ston Dubrovnik-Neretva 2007 12,5 Plavac mali
10-CR-2007 Kutjevo Eslavonia 2007 12,4 Pinot noir
11-CR-2008 Šibenik Šibenik-Knin 2008 13 Babic
12-CR-2008 Brtonigla Istria 2008 13,5 Merlot
Tabla 15: Características de los 12 vinos tintos croatas analizados. % alc.: porcentaje de
alcohol. CR: Croacia. CS: Cabernet Sauvignon
- 72 -
Vinos de Grecia
Grecia puede considerarse la cuna de las viñas y el vino en Europa

con más de 4.000 años de cultura vinícola. Este país exporta más de 28
millones de litros anuales, siendo Alemania su principal mercado, con la
mitad de las ventas totales, seguida de Francia e Italia.
Las zonas de donde se ha recogido vino pueden verse en la figura:
Figura 13: Mapa de Grecia, señaladas las regiones de procedencia de las muestras.
De las 12 muestras analizadas, 6 fueron adquiridas por la Dra. Eleni

Pontiki en comercios de Tesalónica (Grecia). Las restantes se
adquirieron por Internet (www.iamatrade.com). Las características de
estos vinos, código, origen, zona, año, porcentaje de alcohol (% alc.) y
variedad de uva empleada se muestran en la tabla 16.
- 73 -
Código Origen Zona Año % alc. Tipo Uva

1-GR-XXX Nemea Peloponeso 2007 13 Agiorgitiko
2-GR-2007 Nemea Peloponeso 2007 12,5 Agiorgitiko
3-GR-2007 Rodas Islas del mar Egeo 2007 11,5 Mandilaria
4-GR-2007 Halkidiki Macedonia 2007 13,5 Limnio
5-GR-2007 Nemea Peloponeso 2007 12,5 Agiorgitiko
6-GR-2007 Creta Islas del mar Egeo 2007 12,5 NE
7-GR-XXXX Santorini Islas del mar Egeo NE 12,5 Mandilaria
8-GR-2003 Tripoli Peloponeso 2003 13,5 CS merlot
9-GR-2004 Santorini Islas del mar Egeo 2004 12,5 Mandilaria Agiorgitiko
10-GR-2004 Grevena Macedonia 2004 12 Moschomavro
60% Mavrodaphne,
11-GR-2004 Acaya Peloponeso 2004 13,5
40% merlot
12-GR-2005 Drama Macedonia 2005 13 CS Merlot Limnio
Tabla 16: Características de los 12 vinos tintos griegos analizados. NE: No especificado en
la etiqueta. GR: grecia. CS: Cabernet Sauvigon. XXXX: Año vendimia desconocido.
Vinos de Turquía
El consumo de bebidas alcohólicas en general, y de vino en

particular, está cada vez más extendido en Turquía, pese a ser un país
de mayoría musulmana, aunque el consumo per cápita es de tan solo un
litro por persona al año (www.icex.es).
Turquía es el sexto país productor de uvas del mundo y el cuarto en

superficie dedicada a viñedos, sin embargo solo el 12% de las uvas
producidas se dedica a la elaboración de vino.
Las regiones de las cuales se han analizado vinos se muestran en la

figura 14.
- 74 -
Figura 14: Mapa de Turquía, señaladas las regiones de procedencia de las muestras.
Las muestras de vino turco se adquirieron a través de la página web

alemana www.tuerkischer-weinversand.de. Sus características se
muestran en la tabla 17.
Código Región Año % alc. Tipo Uva

1-TUR-2003 Egeo 2003 11,5 Öküzgözü, Bogazkere
2-TUR-2003 Mármara 2003 12,5 Gamay, Bogazkere
3-TUR-2005 Anatolia oriental 2005 11,5 Öküzgözü
4-TUR-2005 Sureste de Anatolia 2005 12,5 Bogazkere
5-TUR-2005 Egeo 2005 13 Syrah
6-TUR-2005 Mármara 2005 13 CS, Merlot
7-TUR-2005 Anatolia Central 2005 13 Kalecik Karasi
8-TUR-2005 Egeo 2005 12,5 Syrah, Kalecik Karasi, CS
9-TUR-2006 Egeo 2006 13 Kalecik Karasi
10-TUR-2006 Anatolia oriental 2006 13 Öküzgözü, Bogazkere
11-TUR-2007 Egeo 2007 14,5 CS, Syrah
Syrah, Merlot, Kalecik
12-TUR-2007 Egeo 2007 13,5
Karasi, Bogazkere
Tabla 17: Características de los 12 vinos tintos turcos analizados. TUR: Turquía. CS:
Cabernet Sauvigon. % alc.: porcentaje de alcohol.
- 75 -
Vinos de Israel
La principal característica de los vinos de Israel es su certificación
de vino kosher (“puro”). Esto significa que el vino cumple con los
estrictos criterios de producción que imponen los rabinos.
Israel está dividido en seis regiones productoras de vino: Galilea,

los montes de Judea, Sansón, la llanura de Sharon, Haifa y los Altos del
Golán.
Figura 15: Mapa de Israel, señaladas las regiones de las muestras.
Las muestras de vino israelí se adquirieron a través de Internet

(www.judaicawebstore.com), sus características se muestran en la
tabla 18:
1-IS-2006 Altos del Golán, Alta Galilea 2006 13,9 CS, Merlot, Cabernet Franc
2-IS-2006 Altos del Golán 2006 14,5 Merlot
3-IS-2006 Altos del Golán 2006 14,5 Sangiovese
4-IS-2007 Baja Galilea, Sansón 2007 14 Shiraz
Cabernet Sauvignon,
5-IS-2008 Galilea, montes de Judea 2008 13
Merlot, Shiraz
6-IS-2008 Alta Galilea 2008 14,5 Cabernet Sauvignon
Tabla 18: Características de los 12 vinos tintos israelíes analizados. NE: No especificado
en la etiqueta. IS: Israel. CS: Cabernet Sauvigon. % alc.: porcentaje de alcohol.
- 76 -
Código Región Año % alc Tipo Uva

7-IS-2008 Altos del Golán 2008 14,5 Cabernet Sauvignon
8-IS-2008 Altos del Golán 2008 14,5 Merlot
Sangiovese, Syrah, Gamay
9-IS-2009 Altos del Golán 2009 14 Noir, Pinot Noit (Nebbiolo,
Napa Gamay)
10-IS-2009 Galilea 2009 NE Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon,
11-IS-2009 Altos del Golán 2009 14 Merlot, Cabernet Franc,
Malbec, Petit Verdot.
12-IS-2008 Alta Galilea 2008 14,5 Merlot
Tabla 18 cont.: Características de los 12 vinos tintos israelíes analizados. NE: No
especificado en la etiqueta. IS: Israel. CS: Cabernet Sauvigon. . % alc: porcentaje de
alcohol.
Vinos del norte de África
Los principales países productores de la región mediterránea son

Argelia, Marruecos y Túnez. Siendo la población de estos países
mayoritariamente practicantes del Islam, la producción de vinos se
destina sobre todo a la exportación.
En la imagen se muestran las zonas de Argelia y Túnez de donde se

han seleccionado las muestras de vino.
Figura 16: Mapa de Argelia (izquierda) y Túnez (derecha).
- 77 -
Se han analizado 7 muestras de vino argelino y 5 originarias de

Túnez (ver tabla 19), adquiridas a través de Internet
(www.bahadourian.com y www.weine-aus-marokko.de).
Provincia/
Gobernación
1-AR-XXXX Muaskar Muaskar NE 12,5 NE
2-AR-1998 Zaccar Djelfa 1998 12,5 NE
3-AR-2004 Muaskar Muaskar 2004 12,5 NE
4-AR-2006 Dahra Chlef 2006 13 NE
5-AR-2006 Médéa Médéa 2006 13 NE
6-AR-2008 Tlemecén Tlemecén 2008 13 NE
7-AR-XXXX Muaskar Muaskar NE 13 NE
1-TU-XXXX Mornag Túnez NE 12 Cariñena, Syrah
2-TU-XXXX Tebourba Manouba NE NE NE
3-TU-XXXX Mornag Túnez NE 13,5 NE
4-TU-2005 Mornag Túnez 2005 13,5 Cariñena, Garnacha, Syrah
5-TU-2006 Mornag Túnez 2006 12,5 Syrah, Merlot
Tabla 19: Características de los 12 vinos tintos africanos analizados. % alc.: porcentaje
de alcohol. NE: No especificado en la etiqueta. AR: Argelia. TU: Túnez. XXXX: Año
vendimia desconocido.
- 78 -
MATERIAL Y MÉTODOS: Métodos
3. MÉTODOS
DISOLUCIONES MADRE DE OCRATOXINAS
OCRATOXINA A
Se disuelve 1 mg de ocratoxina A en 1 mL de metanol. El metanol

se inyecta con una jeringa de 2 mL directamente en el vial de la OTA en
polvo sin abrir para evitar la dispersión del polvo. De esta solución se
toman alícuotas de 0,1 mL en tubos con tapa (eppendorfs) a los que se
añaden 0,9 mL de metanol.
Cada alícuota posee una concentración teórica de 100 mg·L-1. La

concentración real se determina por espectrofotometría UV a 333 nm
aplicando la ley de Lambert-Beer:
Donde, A es la media de los 10 valores de absorbancia medidos con

el espectrofotómetro,
ε es el coeficiente de extinción molar (ε = 5.500 M-1·cm-1)

(Jiménez y col., 2001),
c es la longitud de la cubeta de medida (c = 1 cm),
PM es el peso molecular de la OTA (PM = 403,82 g·mol-1).
OCRATOXINA B
Se procede de la misma manera que con la ocratoxina A, utilizando

etanol en lugar de metanol y midiendo la absorbancia a 318 nm,
PMOTB = 369,37 g·mol-1, ε318 (EtOH) = 6.900 M-1·cm-1 (Cole y col.,
2003).
- 79 -
SÍNTESIS DE METILOCRATOXINA A Y OCRATOXINA C
Los metil y etil ésteres de la OTA (MeOTA y OTC, respectivamente)

se sintetizan según el procedimiento de Li y col. (1998), basado en la
esterificación alcohólica de la molécula de OTA (Li y col., 1998).
Se evaporan 500 µL de una disolución patrón de OTA de 100 mg·L -1

en un tubo de vidrio. El residuo se redisuelve en 2 mL de metanol, para
la síntesis de MeOTA, y en 2 mL de etanol, para la síntesis de OTC, y se
les añade a cada tubo 100 µL de HCl 12 M. La mezcla se deja en
agitación durante 48 h a temperatura ambiente. Después, el disolvente
se evapora bajo corriente de nitrógeno a 60ºC.
Como no se alcanza una conversión cuantitativa de la ocratoxina A,

los ésteres obtenidos se purifican con una extracción líquido-líquido con
NaHCO3 (0,25%) y diclorometano (DCM). El residuo seco de los
productos obtenidos de la síntesis se disuelve en 5 mL de bicarbonato, a
los que se añaden 2,5 mL de DCM. Se agita durante media hora en un
agitador rotatorio y se separa la fase orgánica, que contiene cada uno
de los ésteres. Este proceso se repite con otros 2,5 mL de DCM. Para
cada uno de los ésteres, se juntan las fases orgánicas y se evapora el
disolvente. Los ésteres así purificados se disuelven en 700 µL de etanol,
comprobándose la pureza mediante HPLC-FLD y la confirmación de los
productos obtenidos mediante LC-MS. La concentración de estos
patrones se calcula por espectrometría de la misma manera que para la
OTA y OTB (PMMeOTA = 417,84 g·mol-1, PMOTC = 431,87 g·mol-1,
ε333 (OTC, EtOH) = 7.000 M-1·cm-1 (Cole y col., 2003)).
SÍNTESIS DE METIL Y ETILOCRATOXINA B
Los ésteres derivados de la OTB se sintetizan de la misma manera

que en el caso de los ésteres derivados para la OTA. Debido a que se
desconocen sus coeficientes de absortividad molar no se pueden
determinar sus concentraciones.
- 80 -
DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO
A partir de las disoluciones madre de concentración conocida se

preparan tres disoluciones de 400, 40 y 4 µg·L-1 en metanol, cada una
de ellas conteniendo las 4 ocratoxinas (OTA, OTB, MeOTA y OTC) en las
concentraciones indicadas. Estos estándares se almacenan a -20ºC en
frascos de polipropileno con cierre hermético.
Los patrones de calibración se preparan evaporando a 40ºC bajo

corriente de nitrógeno los volúmenes adecuados de estas disoluciones
de trabajo, para que al evaporar el disolvente y resuspender en 250 μL
de fase móvil (42:58 acetonitrilo:ácido fórmico 0,4%), se obtenga la
concentración deseada de patrón.
Los extractos en metanol obtenidos de las muestras de vino se

preparan de la misma manera (evaporando y resuspendiendo en 250 μL
de fase móvil) para su inyección en el HPLC.
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
La extracción y purificación de las ocratoxinas desde el vino se lleva

a cabo con una modificación del procedimiento descrito en las
instrucciones de uso de las columnas de inmunoafinidad.
Aproximadamente, 60 mL de vino tinto se ajustan a pH 7,2 con una

disolución acuosa de NaOH 2 M. La mezcla se filtra por gravedad con
papel de filtro, se cogen 50 mL con una pipeta aforada de vidrio y se
conservan en un tubo de plástico para su paso por las columnas.
Las columnas de inmunoafinidad se colocan en el colector múltiple

de vacío con jeringas de 20 mL en su extremo superior, que sirven de
depósito para la muestra. Es importante que no queden burbujas de aire
en la parte inferior de la columna para evitar su atasco. Las columnas
quedan ubicadas como se muestran en la figura siguiente.
- 81 -
Figura 17: Montaje del sistema de purificación.
Cada columna se acondiciona con 10 mL de PBS antes de añadir la

muestra. Posteriormente, se lava la columna con 10 mL de PBS y 20 mL
de agua Milli-Q. Para secarla se pasan varias emboladas de aire con
ayuda de una jeringa.
Las ocratoxinas se eluyen con 4 mL de metanol sobre un tubo de

vidrio de fondo cónico. Primero, se añaden 2 mL de metanol y cuando
cae la primera gota se cambia la dirección del flujo con una jeringa para
asegurar la completa desnaturalización de los anticuerpos y la elución
total de las ocratoxinas. Se cierra la conexión y se dejan en contacto
columna y metanol durante 3 minutos, se abre la conexión y se añaden
los 2 mL de metanol restantes. Una vez que todo el disolvente ha
atravesado la columna, ésta se seca con varias emboladas de aire.
- 82 -
DETERMINACIÓN POR HPLC-FLD
Los extractos en metanol obtenidos de las muestras de vino tinto se

evaporan a sequedad en un baño de agua a 40ºC bajo corriente suave
de nitrógeno. El residuo se resuspende en 250 L de fase móvil (42:58
acetonitrilo:ácido fórmico 0,4%) agitando en vórtex durante 3 minutos.
Este volumen se filtra con un filtro de jeringa de 0,45 µm, antes de
colocarlo en un vial de vidrio para su análisis por HPLC.
Las condiciones cromatográficas se describen en la tabla 20:

Factores Condiciones
Aparato HPLC 1100 Agilent Technologies
Columna Zorbax Eclipse XDB-C18, 150 x 4,6 mm (5 µm)
Temperatura de horno 40 ºC
Volumen de inyección 100 μL
Acetonitrilo:Ácido fórmico 0,4%
Fase móvil 42:58 de 0 a 10 min
60:40 de 15 a 25 min
Flujo 1 mL·min-1
Detector Fluorescencia
λexc: 318 nm (0-7,5 min)
333 nm (7,5-25 min)
λem: 461 nm
Ganancia = 13
Tabla 20: Condiciones empleadas para la cuantificación de ocratoxinas por HPLC-FLD.
CONFIRMACIÓN POR LC-MS
La detección por espectrometría de masas requiere un flujo de fase

móvil menor que el utilizado en el método de cuantificación por
fluorescencia. La transferencia de métodos HPLC se realizó teniendo en
cuenta las fórmulas teóricas que relacionan el flujo (F) con el diámetro
de columna (dc) y el volumen de inyección (V), y la longitud (L) con el
diámetro de partícula (dp) y el tiempo (t) (Agilent, 2009).
La disminución del diámetro interior de la columna permite la

reducción del flujo y el volumen de inyección a través de las relaciones:
- 83 -
d c2, nuevo d c2, nuevo

Fnuevo Fanterior Vnuevo Vanterior
d c2, anterior d c2, anterior
Reducir de manera simultánea la longitud de columna y el diámetro
de partícula permite tiempos de análisis más cortos manteniendo la
eficacia del sistema. Las relaciones a tener en cuenta son:
d p ,nuevo Lc , nuevo
Lc ,nuevo Lc ,anterior t nuevo t anterior
d p ,anterior Lc , anterior
El efecto de estas nuevas condiciones en la separación

cromatográfica se probó primero en un HPLC 1200 con detector de
fluorescencia, antes de aplicarlas en el LC-MS, ya que este modelo de
HPLC es similar al disponible en los acoplamientos instrumentales LC-MS
(ion trap) y LC-MS (TOF). Las condiciones utilizadas se muestran en la
tabla 21:
Columna Zorbax Extend-C18, 50 x 2,1 mm (3,5 µm)
Fase móvil
35:65 de 0 a 2 min, 53:47 de 2,1 a 15 min
Flujo 0,2 mL·min-1
Tabla 21: Nuevas condiciones cromatográficas a emplear en la confirmación de
ocratoxinas por LC-MS.
Esta optimización previa permite transferir de manera muy sencilla

el método analítico a cualquiera de los dos equipos de espectrometría de
masas, cambiando únicamente las condiciones de detección:
Detector MS Trampa iónica MS TOF
Interfase electrospray electrospray
Polaridad positiva positiva
Presión del nebulizador 40 psi 40 psi
Flujo del gas de secado 8 L·min-1 8 L·min-1
Tª del gas de secado 350 ºC 350 ºC
Target mass [M+H]+ [M+H]+
Tabla 22: Condiciones de detección empleadas en la confirmación de ocratoxinas por LC-
MS.
- 84 -
MATERIAL Y MÉTODOS: Validación del método analítico
4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

La validación del método analítico para la cuantificación simultánea
de OTA, OTB, MeOTA y OTC en muestras de vino tinto se ha basado en
el estudio de los siguientes parámetros: selectividad, linealidad,
precisión, exactitud, recuperación, límite de detección, límite de
cuantificación, robustez y estabilidad.
SELECTIVIDAD
La selectividad del método se ha asegurado con la especificidad de

las columnas de inmunoafinidad usadas en el proceso de extracción, la
separación cromatográfica y el uso de un detector de fluorescencia, con
una longitud de onda de excitación y emisión características para estos
compuestos.
Además, se ha verificado la capacidad del método para medir

inequívocamente las ocratoxinas, comprobando que sus tiempos de
retención coinciden en una disolución patrón, en muestras naturalmente
contaminadas y en muestras contaminadas y fortificadas y que, en estas
últimas, los picos no presentan desdoblamientos ni deformaciones.
El alto factor de concentración aplicado a las muestras de vino

puede aumentar el riesgo de interferencias debidas a la matriz, por lo
que también se han estudiado, en vinos con baja concentración de los
analitos, los siguientes parámetros cromatográficos: factor de retención,
simetría del pico, anchura de pico a media altura, número de platos
teóricos y, especialmente, la resolución cromatográfica de cada
compuesto con el pico anterior.
El factor de retención o factor de capacidad (k’) representa la

relación del tiempo que el soluto pasa en la fase estacionaria con
respecto al que pasa en la fase móvil y se calcula a través de la
expresión:
- 85 -
Donde, tR es el tiempo de retención del compuesto, t’R es el tiempo

de retención relativo y tM es el tiempo muerto.
La simetría y la anchura de pico a media altura (wh) son

suministradas por el equipo para cada pico integrado.
El número de platos teóricos (N) es la longitud de la columna

requerida para que se establezca un equilibrio del soluto entre las fases
estacionaria y móvil. Mide la calidad de una columna y se calcula con la
fórmula:
2
tR
N 5,54
wh
La resolución (Rs) determina las separaciones entre picos. La calcula
el equipo para cada compuesto en relación con el pico anterior, por lo
que se debe analizar en un cromatograma de una muestra y no de
patrón.
LINEALIDAD E INTERVALO
El estudio de linealidad se ha realizado en un amplio intervalo de

concentraciones con el fin de incluir los niveles de ocratoxinas que
pueden encontrarse en muestras contaminadas naturalmente. La
linealidad se ha estudiado desde la concentración de patrón más baja
que puede observarse con el detector de fluorescencia (con adecuada
precisión y exactitud) hasta 400 µg·L-1 en patrón, que corresponden a
2 µg·L-1 en vino, la concentración máxima permitida por la Unión
Europea para la OTA en vinos.
Se han preparado tres rectas con disoluciones patrón en los

intervalos 0,1-1, 1-20, 20-400 µg·L-1. Dentro de cada intervalo se han
- 86 -
estudiado 5 niveles de concentración por triplicado. En la siguiente tabla

se muestran los niveles de concentración considerados.
Intervalo Concentración (µg·L-1)

0,1 - 1 0,1 0,2 0,4 0,6 1
1 - 20 1 4 8 12 20
20 - 400 20 60 120 200 400
Tabla 23: Niveles de concentración estudiados para cada intervalo.
Las rectas de calibrado se han obtenido representando las áreas de

los picos obtenidos para cada ocratoxina a cada concentración frente a
dicha concentración. El estudio de linealidad no solo ha consistido en
una representación gráfica, sino que se ha realizado la correspondiente
comprobación estadística.
El método se ha considerado lineal si ha cumplido los objetivos

establecidos en la guía AEFI: coeficientes de correlación y determinación
> 0,990, coeficiente de variación de los factores respuesta < 5%
(< 10% para las rectas de concentración inferior, 0,1-1 µg·L-1),
pendiente significativamente distinta de cero, intervalo de confianza al
95% de la ordenada en el origen incluye al cero, la representación de los
residuales debe generar una distribución de puntos al azar y test ANOVA
significativo, comprobando los supestos de homogeneidad de varianzas
y normalidad de los residuales (AEFI, 2001).
La repetibilidad se ha estudiado analizando por triplicado

disoluciones patrón de ocratoxinas con concentraciones
correspondientes a los niveles bajo, medio y alto de cada recta de
calibrado: 0,1, 0,4, 1, 8, 20, 120 y 400 µg·L-1. La precisión intermedia
se ha realizado llevando a cabo estos análisis en tres días diferentes. Los
resultados se han expresado como coeficiente de variación (CV, %).
Las mismas muestras se han empleado para evaluar la exactitud

instrumental, expresada como error relativo, a través de la fórmula:
- 87 -
Creal Cobtenida
ER(%) 100
Creal
Se ha considerado que el análisis de patrones era preciso y exacto
si los valores del coeficiente de variación y del error relativo son
inferiores al 10%. Se han aceptado valores inferiores al 15% para el
nivel de concentración más bajo estudiado.
RECUPERACIÓN
El estudio de recuperación se ha efectuado sobre una serie de

alícuotas de muestras de vino tinto fortificado, que se analizan
independientemente desde el principio (preparación de la muestra)
hasta el final (lectura de resultados). Debido al amplio intervalo de
concentraciones estudiado se han analizado 5 niveles por triplicado en
un día (n = 15) para establecer la repetibilidad del método, y en tres
días diferentes (n = 45) para la precisión intermedia.
Las alícuotas de vino se fortificaron con volúmenes adecuados de

las disoluciones patrón (400, 40 y 4 µg·L-1) para alcanzar los niveles de
0,0005, 0,003, 0,04, 0,6 y 2 µg·L-1.
La recuperación se ha expresado como porcentaje y se ha calculado

corrigiendo la concentración medida con la concentración del blanco
conforme a la expresión:
Se han aceptado valores de recuperación entre el 50-120% y un

coeficiente de variación inferior al 20% (Reglamento Nº 401/2006). Los
valores de recuperación obtenidos en condiciones de precisión
intermedia para cada ocratoxina se han empleado como factor de
corrección de los resultados en el análisis de las muestras.
- 88 -
LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
Los límites de detección y cuantificación se han calculado

-1
fortificando muestras de vino tinto a 0,3, 0,4 y 0,5 ng·L por triplicado.
Se ha considerado como límite de cuantificación el nivel de
concentración cuya recuperación esté comprendida entre el 50 – 120%
y cuyo coeficiente de variación en el estudio de repetibilidad sea inferior
al 20% (Reglamento Nº 401/2006).
El límite de detección se ha calculado matemáticamente por el

método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a
concentración cero (AEFI, 2001), tal y como se explica en el capítulo
Introducción.
ROBUSTEZ
Se ha empleado únicamente una columna cromatográfica durante

todo el desarrollo de este trabajo, por lo que no se ha considerado el
factor de cambio de columna en el estudio de la robustez. Los factores
considerados han sido el pH al que se ajusta el vino antes de su paso
por las CIA y el volumen de inyección.
Para estudiar el efecto de cambios de pH en la cuantificación, se ha

evaluado la influencia en la recuperación del ajuste del pH a 6,8, 7,2 y
7,6 en muestras de vino fortificadas a 0,05 µg·L-1. El análisis se ha
realizado por duplicado y las áreas obtenidas, restando las áreas del
blanco, se han comparado con las áreas de una disolución de calibración
de 10 µg·L-1. El método se ha considerado robusto si el coeficiente de
variación de las recuperaciones obtenidas es inferior al 5%.
Para analizar la influencia del volumen de inyección en el HPLC en la

exactitud de los resultados se han realizado 9 análisis para cada
concentración de 4, 40 y 400 µg·L-1, con un volumen de inyección de
20 µL. Las concentraciones ensayadas se han comparado con las
- 89 -
obtenidas al multiplicar por cinco las concentraciones calculadas a partir

de las áreas con 20 µL. Se ha considerado robusto si el error relativo es
inferior al 5%.
ESTABILIDAD
Se ha estudiado la estabilidad de las disoluciones estándar de

trabajo almacenadas en congelación a -20ºC. Las disoluciones de 4, 40
y 400 µg·L-1 de OTA, OTB, MeOTA y OTC en metanol se analizaron por
triplicado el día de su preparación, y 1, 3, 6 y 12 meses después. Se ha
calculado la exactitud (ER %) de la concentración media de los 3 análisis
con respecto a la concentración inicial, aceptándose un valor máximo del
5%.
Además, se ha comprobado la estabilidad de los analitos disueltos

en fase móvil una vez colocados en el vial y en el inyector del HPLC
durante 48 horas. Se analizaron cada 3 horas patrones de
-1
concentraciones 8 y 100 µg·L , y muestras de vino fortificadas a 0,04 y
0,3 µg·L-1 (equivalente a 8 y 60 µg·L-1 en vial). Se ha estudiado la
exactitud de cada concentración con respecto al valor a tiempo 0,
considerándose estables si el error relativo es menor del 5%.
CONTROL DE CALIDAD DEL MÉTODO
Durante el análisis de las muestras y con el objetivo de garantizar el

perfecto funcionamiento del equipo, se ha procedido de la siguiente
forma: se colocan dos patrones de concentración conocida al principio
de la secuencia de análisis, uno más cada diez muestras a analizar y dos
al final de la secuencia, siguiendo un orden de concentración creciente y
abarcando todo el intervalo de concentraciones de trabajo esperado. El
criterio fijado de aceptación de resultados es un error relativo igual o
inferior al 10% de la concentración ensayada en, al menos, el 75% de
los patrones.
- 90 -
MATERIAL Y MÉTODOS: Análisis estadístico
5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La evaluación estadística de los datos obtenidos se ha realizado de
acuerdo con la guía AEFI y con un manual de bioestadística aplicada
(AEFI, 2001; García-Granero, 2010). Se ha utilizado el programa UnStat
versión 1.0 para el análisis de los resultados.
Los parámetros del estudio de linealidad se han calculado con el

test de regresión. Además, se ha realizado el análisis de la varianza
(ANOVA) para cada recta. La normalidad de los residuales se ha
comprobado con el test D’Agostino Pearson y se ha utilizado el test de
Cochran para examinar la homogeneidad de varianzas de los factores
respuesta, calculando el estadístico G a través de las desviaciones
estándar (s) con la fórmula:
2
smáxima
Gexp
si2
El cálculo de las concentraciones medianas de ocratoxinas en los

vinos se ha realizado teniendo en cuenta todos los valores obtenidos,
incluidos los valores entre el LD y LC y las concentraciones inferiores al
LD, para las que se ha empleado el valor LD/2. En el cálculo de las
medias se han considerado solo las concentraciones superiores al LC.
La normalidad de los datos a los que se han aplicado test

estadísticos se ha estudiado con el test D’Agostino Pearson. Se han
empleado test no paramétricos debido a la significación (p<0,05)
obtenida con este test en todos los casos.
El estudio acerca de la transformación de ocratoxina C en OTA se ha

analizado con el test de Friedman para k muestras relacionadas.
El test de Kruskal-Wallis para k muestras independientes se ha

empleado en el caso del análisis de las concentraciones entre diferentes
- 91 -
MATERIAL Y MÉTODOS: Análisis estadístico
años de los vinos navarros de agricultura tradicional y con las muestras

de los vinos de países mediterráneos.
Cuando el resultado de estos test ha sido significativo se han

realizado test a posteriori de comparaciones múltiples para detectar las
diferencias: test DMS recomendado para 3 muestras y test de
Bonferroni.
El test U de Mann-Whitney para dos muestras independientes se ha

utilizado para comparar los resultados de las cosechas de vinos
ecológicos de Navarra y para estudiar la influencia del tipo de cultivo en
las concentraciones de ocratoxinas.
La correlación de las concentraciones de ocratoxinas entre sí y de

éstas con las condiciones climatológicas (temperatura media, humedad
relativa media y precipitación acumulada) se ha observado con el
coeficiente de correlación no paramétrico de Spearman. Valores de este
coeficiente entre 0,3 y 0,5 muestran una relación mediana, moderada
entre ambas variables, entre 0,5 y 0,7 existe una relación grande, entre
0,7 y 0,9 la asociación es muy elevada y con valores mayores de 0,9 la
asociación es prácticamente perfecta (García-Granero, 2010).
- 92 -
RESULTADOS
RESULTADOS: Puesta a punto del método analítico
1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO

La síntesis propuesta por Li y col. (Li y col., 1998) no produjo una

conversión completa de la OTA en sus respectivos ésteres, como se
puede apreciar en los cromatogramas obtenidos al analizar las
disoluciones tras la reacción de esterificación (figura 18).
Figura 18: Cromatogramas obtenidos después de la síntesis de a) MeOTA y b) OTC, antes

de su purificación.
La purificación de los ésteres obtenidos se intentó con extracciones

líquido-líquido utilizando diferentes mezclas de disolventes.
- K2CO3 (2%) – hexano
- K2CO3 (2%) – acetato de etilo
- Agua – diclorometano (DCM)
- NaHCO3 (1 %) – DCM
- NaHCO3 (0,5 %) – DCM
- NaHCO3 (0,25 %) – DCM
- 95 -
Se utilizaron disoluciones de diferentes carbonatos debido a que

habían sido empleadas en el laboratorio con anterioridad para la
eliminación de OTA en la cáscara de cacao (Amézqueta y col., 2008).
La mezcla de disolventes NaHCO3 (0,25 %) – DCM fue la que dio

lugar a una separación completa de la OTC y MeOTA de la OTA no
reaccionante. La figura 19 muestra los cromatogramas obtenidos a
partir de los productos purificados. En ellos se observa la desaparición
del pico de OTA a 11,1 min.
Figura 19: Cromatogramas obtenidos después de la síntesis y purificación de a) MeOTA y

b) OTC.
Las disoluciones estándar de trabajo de 400, 40 y 4 µg·L-1 de OTA,

OTB, MeOTA y OTC conjuntamente se prepararon en metanol, ya que al
prepararlas en acetonitrilo se observó una disminución de la
concentración de OTA y OTB detectable en concentraciones bajas.
Se puede observar esta disminución de áreas en los cromatogramas

obtenidos al analizar un patrón de calibrado de 4 µg·L-1 preparado a
partir de la disolución en metanol y otro obtenido a partir de la
disolución en acetonitrilo (figura 20).
- 96 -
Figura 20: Cromatogramas de disoluciones estándar de trabajo de 4 µg·L -1 preparadas en

metanol (___) y en acetonitrilo (___).
La extracción y purificación de la ocratoxina A del vino se realiza

comúnmente con columnas de inmunoafinidad, pero la aplicación de las
mismas para la cuantificación de las demás ocratoxinas no se menciona
ni en las instrucciones de la casa comercial de las columnas ni en la
bibliografía.
La retención de los compuestos análogos resultó ser diferente según

la marca comercial de las columnas. Inicialmente, se utilizaron las CIA
Ochratest® de la marca Vicam, ya que son las habitualmente empleadas
en el laboratorio para la purificación de la OTA. Sin embargo, se observó
que retienen la OTA y sus ésteres pero no la OTB, impidiendo su
análisis. Cuando se utilizaron las columnas Ochraprep® de R-Biopharm,
las 4 ocratoxinas fueron retenidas en las columnas. Por esta razón, se
eligieron estas columnas para la extracción de las ocratoxinas desde el
vino. En la figura 21 se observan dos cromatogramas correspondientes a
vino fortificado con los 4 compuestos. El primero de ellos se ha obtenido
tras extraer las ocratoxinas con columnas Ochratest®; mientras que en
el segundo caso se han empleado columnas Ochraprep®
- 97 -
Figura 21: a) Retención de OTA, MeOTA y OTC por las CIA Ochratest ®, b) Retención de
OTB, OTA, MeOTA y OTC por las CIA Ochraprep ®.
Se realizaron algunos cambios en la metodología para la extracción

de las ocratoxinas respecto a las instrucciones de uso propuestas por la
casa comercial Ochraprep®.
Con la intención de disminuir los límites de detección y

cuantificación, a la columna se aplicaron 50 mL de vino en vez de utilizar
20 mL. La elución de las ocratoxinas se realizó con 4 mL de metanol en
lugar de emplear 1,5 mL de disolución metanol:ácido acético (98:2 v/v),
debido a que la estabilidad de las ocratoxinas podría verse alterada con
esta disolución ácida de metanol.
En las instrucciones se propone analizar este eluido directamente en

el HPLC, no obstante se evaporaron los 4 mL del metanol de elución y el
residuo se resuspendió en 250 μL de fase móvil.
Estas modificaciones han permitido concentrar los niveles de

ocratoxinas 200 veces en lugar de las 13,3 veces que se hubiesen
conseguido con el procedimiento recomendado por el fabricante.
- 98 -
PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO
El método cromatográfico desarrollado es una variación del

procedimiento descrito por la Organización de la Vid y el Vino (OIV) y
del utilizado anteriormente en el laboratorio para la determinación de
OTA en vino (OIV, 2001; López de Cerain y col., 2002), ya que estos
métodos fueron desarrollados para la cuantificación de ocratoxina A,
pero no para la de sus análogos.
Al aplicar las condiciones isocráticas descritas en el método de la

OIV se observó muy poca retención para la OTB y unos tiempos de
retención altos para la MeOTA y la OTC. Con el objetivo de acortar el
tiempo de análisis, se optimizó la separación con un gradiente de fase
móvil acetonitrilo: agua (ácido fórmico 0,4%).
Aumentar la temperatura del horno de columna hasta 60ºC no

redujo de manera importante la duración del cromatograma (figura 22).
Figura 22: Patrón de calibrado de 1 µg·L-1 analizado a 40, 50 y 60 ºC.
- 99 -
En cuanto a la detección y con objeto de reducir el ruido en el

cromatograma, se cambió la longitud de onda de excitación de
fluorescencia de la OTA comúnmente empleada en el laboratorio,
225 nm, a 333 nm. En el caso de las muestras analizadas en este
estudio, reducir el ruido ha sido de gran interés para bajar el límite de
detección. A 333 nm, aunque las áreas de pico obtenidas son menores,
la estabilidad de la línea base es mayor, alcanzándose límites de
detección más bajos. En la figura 23 se muestran los cromatogramas
obtenidos al analizar el mismo patrón de calibración con una u otra
longitud de onda.
Figura 23: Patrón de calibrado de 0,6 µg·L-1 con λexc a 225 y 333 nm.
La mezcla de acetonitrilo:solución acuosa de ácido fórmico 0,4%

(42:58), que se eligió como disolvente para la reconstitución del residuo
y posterior inyección de las muestras, produjo en el cromatograma una
interferencia inesperada cuando se utilizaban viales de HPLC de plástico.
Esta interferencia se evidenció a tiempos de retención altos, una vez que
el gradiente alcanza el 60% de acetonitrilo, afectando a la cuantificación
- 100 -
de MeOTA. En la figura 24 se muestran ejemplos de los cromatogramas

obtenidos tras un análisis de vino y de patrón.
Figura 24: Interferencia causada por el uso de viales de HPLC de plástico. a) muestra de
vino tinto, b) patrón de calibrado.
Esta interferencia desapareció cuando se empleaban viales para

HPLC de vidrio para recoger el extracto resuspendido de las muestras.
Por esta razón se eligieron este tipo de viales para la realización del
presente estudio.
MÉTODO DEFINITIVO
Todo lo anterior ha definido el procedimiento de extracción y

purificación y el método cromatográfico para la cuantificación de la OTB,
OTA y sus metil y etil ésteres descrito en el apartado material y métodos
y que se resume a continuación:
a) Extracción desde el vino
- 101 -
- Se ajusta el pH de 60 mL de vino tinto a 7,2 con NaOH 2 M y se

filtra por gravedad.
- 50 mL de la mezcla anterior se pasan por las CIA Ochraprep®
previamente acondicionadas con 10 mL de PBS.
- Se lavan las columnas con 10 mL de PBS y 20 mL de agua.
- Las ocratoxinas se eluyen con 4 mL de metanol
- Los extractos en metanol se evaporan a sequedad y el residuo se
resuspende en 250 µL de fase móvil 42:58, ACN:H2O (0,4%
ácido fórmico).
b) Separación cromatográfica y detección
Columna Zorbax Eclipse XDB-C18, 150 x 4,6 mm (5 µm)
Fase móvil 42:58 de 0 a 10 min
60:40 de 15 a 25 min
Flujo 1 mL·min-1
Detector Fluorescencia
λexc: 318 nm (0-7,5 min)
333 nm (7,5-25 min)
λem: 461 nm
Ganancia = 13
Viales Vidrio desactivado
Tabla 24: Condiciones definitivas del método HPLC optimizado.
METIL Y ETIL ÉSTERES DE LA OTB Y DE LA OTα
Los análisis de algunas muestras de vino con el método ya

optimizado y validado mostraron cómo, además de los cuatros picos
correspondientes a OTB, OTA, MeOTA y OTC, aparecían otros picos
(figura 25).
El hecho de utilizar columnas de inmunoafinidad y condiciones de

fluorescencia propias de los compuestos estudiados, hizo pensar que
- 102 -
estos picos podrían corresponder a otras ocratoxinas presentes en el

vino.
Figura 25: Cromatograma de una muestra de vino tinto.
Para confirmar esta hipótesis, se sintetizaron los metil y etil ésteres

de la OTB y de la OTα, utilizando para ello el mismo procedimiento
empleado en la síntesis de los ésteres de la ocratoxina A. Ejemplos de
los cromatogramas obtenidos tras el análisis por HPLC de disoluciones
conteniendo estos ésteres se muestran en las figuras 26 y 27, y los
tiempos de retención se indican en la tabla 25.
Figura 26: Análisis simultáneo de MeOTB y EtOTB después de su síntesis a partir de OTB.
- 103 -
Figura 27: Análisis simultáneo de MeOTα y EtOTα después de su síntesis a partir de OTα.
OTα OTB MeOTα OTA EtOTα MeOTB EtOTB MeOTA OTC

tR 2,7 5,6 8,9 11,1 14,2 14,3 17 18,5 21,3
Tabla 25: Tiempos de retención (min) de las 9 ocratoxinas.
La ocratoxina alpha y sus ésteres resultaron no ser retenidos por las

CIA, por lo que no aparecerán en el análisis de las muestras de vino. Los
tiempos de retención de MeOTB y EtOTB corresponden con los de dos
picos minoritarios que se observan en algunos análisis. En la figura 28
se muestra un cromatograma de un vino fortificado con las 6
ocratoxinas.
Figura 28: Análisis de un vino fortificado con OTB, OTA, MeOTB, EtOTB, MeOTA y EtOTB.
El estudio posterior de los espectros de masas correspondientes a

estos picos (ver apartado Confirmación por LC-MS) confirmó su
identidad.
- 104 -
El coeficiente de absortividad molar de los ésteres de la OTB no se

ha encontrado tras una consulta detallada de la bibliografía. Por lo tanto,
no se pudieron preparar disoluciones de concentración conocida y el
método analítico no se pudo validar para ellos. Por esta razón, se
decidió calcular las concentraciones aproximadas de MeOTB y EtOTB
utilizando las rectas, recuperación, LC y LD de MeOTA (para MeOTB) y
de OTC (para EtOTB). De esta forma se han conseguido los datos de
concentración que aparecen en el apartado de análisis de muestras.
La confirmación de la presencia de las ocratoxinas en las muestras

se ha llevado a cabo reanalizando un 10% de las mismas por LC-MS.
El método cromatográfico utilizado para la determinación de

ocratoxinas con detección de fluorescencia tuvo que ser modificado para
hacer compatible el flujo de la fase móvil empleado con el detector de
fluorescencia con la detección por espectrometría de masas, como ya se
ha indicado en el apartado material y métodos.
Las fórmulas teóricas facilitaron la conversión del método y

aportaron las nuevas condiciones de análisis. En la tabla 26 se pueden
ver las condiciones calculadas y las aplicadas finalmente:
Método de Transferencia Transferencia

cuantificación teórica aplicada
Columna (mm) 150 x 4,6 50 x 2,1 50 x 2,1
dp (µm) 5 1,8 3,5
Flujo (mL·min-1) 1 0,21 0,20
V inyección (µL) 100 21 20
t (min) % ACN t (min) % ACN t (min) % ACN
0 42 0 42 0 35
Gradiente 10 42 3,3 42 2 35
15 60 5 60 2,1 53
25 60 8,3 60 15 53
Tabla 26: Condiciones calculadas y aplicadas al transferir el método de cuantificación.
El cromatograma obtenido al optimizar el método en el HPLC 1200

con detector de fluorescencia se puede ver en la figura 29.
- 105 -
Figura 29: Cromatograma de una solución patrón de las 6 ocratoxinas a 0,2 mL·min -1.
Se han empleado dos detectores de espectrometría de masas: un

detector de tiempo de vuelo (TOF, time-of-flight) y uno de trampa iónica
(ion trap).
El detector MS-TOF es un detector de “masa exacta” y ofrece los

m/z de cada compuesto con 4 decimales. El cromatograma se obtiene
extrayendo el ion M+1 de cada compuesto. Al no haber fragmentación
de la molécula, el espectro obtenido corresponde al ión molecular
detallado con 4 decimales. Se puede extraer no solo el m/z máximo del
pico del espectro, sino también su anchura en masa, obteniendo un
intervalo que tiene en cuenta las contribuciones isotópicas. El m/z
máximo [M+H]+ y los intervalos extraídos para cada ocratoxina se
muestran en la tabla 27. Los cromatogramas obtenidos extrayendo los
intervalos de la tabla se muestran en las figuras 30 y 31.
OT m/z máximo Intervalo m/z
OTB 370,1158 370,0855 – 370, 1530
OTA 404,0766 404,0437 – 404,1115
MeOTB 384,1307 384,1017 – 384,1626
EtOTB 398,1463 398,1183 – 398,1747
MeOTA 418,0900 418,0669 – 418,1133
OTC 432,1080 432,0703 – 432,1656
Tabla 27: Máximo e intervalo de m/z para cada ocratoxina obtenidos con el LC-MS (TOF).
- 106 -
Figura 30: Cromatograma de un patrón de 6 ocratoxinas en el LC-MS (TOF).
Figura 31: Cromatograma de LC-MS (TOF) de un vino contaminado naturalmente.
- 107 -
La trampa de iones aísla un m/z característico, el [M+H] + en este

caso, en un intervalo de tiempo concreto y ofrece los espectros de
masas de los compuestos encontrados. Los iones de fragmentación
característicos de cada compuesto pueden utilizarse para obtener el
cromatograma de ion extraído (EIC) del cromatograma de iones totales
(TIC). Los tiempos obtenidos (min), sus m/z correspondientes y los
iones de fragmentación característicos se muestran en la tabla 28.
Ocratoxinas tR Intervalo m/z [M+H]+ Iones fragmentación
OTB 3,6 0-5 370,1 324,1; 352,1; 307,1
OTA 6,7 5 – 7,2 404,0 358,1; 386,1; 341,1
MeOTB 7,4 7,2 – 8,3 384,0 324,1; 352,1; 307,1
EtOTB 8,7 8,3 – 9,4 398,0 324,1; 352,1; 307,1
MeOTA 9,8 9,4 – 11 418,1 358,1; 386,1; 341,1
OTC 12,1 11 - 14 432,1 358,1; 386,1; 341,1
Tabla 28: Tiempos de retención y masas características obtenidas con LC-MS (IT).
Los cromatogramas obtenidos para una disolución patrón y una

muestra naturalmente contaminada se muestran en la figura 32.
a)
b)
Figura 32: a) TIC de una disolución patrón y b) EIC de una muestra contaminada.
- 108 -
Los espectros de masas (MS-IT) obtenidos de cada compuesto se

muestran en las figuras siguientes. Se indican las posibles pérdidas de
grupo para explicar los iones característicos.
Figura 33: Espectro de masas de la ocratoxina B.
Figura 34: Espectro de masas de la ocratoxina A.
- 109 -
Figura 35: Espectro de masas de la metilocratoxina B.
Figura 36: Espectro de masas de la etilocratoxina B.
- 110 -
Figura 37: Espectro de masas de la metilocratoxina A.
Figura 38: Espectro de masas de la ocratoxina C.
- 111 -
RESULTADOS: Validación del método analítico
2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO*

SELECTIVIDAD
La selectividad del método se ha favorecido con el uso de técnicas

de inmunoafinidad en el proceso de extracción y la utilización de
fluorescencia en la detección.
En la figura 39, se muestra un cromatograma de los obtenidos para

una disolución patrón de ocratoxinas, una muestra naturalmente
contaminada y una muestra fortificada. En este último se observa cómo
ningún pico presenta hombros ni deformaciones.
Figura 39: Cromatogramas obtenidos de a) una disolución patrón, b) una muestra de vino
tinto naturalmente contaminada y c) una muestra fortificada.
Los tiempos de retención de OTB, OTA, MeOTA y OTC con las

condiciones descritas son 5,6, 11,1, 18,5 y 21,3 minutos
respectivamente, y coinciden en las disoluciones patrón y en las
muestras contaminadas.
*
Resultados publicados en Journal of Chromatography A, 1217 (2010) 8249-8256.
Validation of a liquid chromatography method for the simultaneous quantification of
ochratoxin A and its analogues in red wines. Rebeca Remiro, María Ibáñez-Vea, Elena
González-Peñas, Elena Lizarraga.
- 113 -
Los parámetros cromatográficos obtenidos estudiando un

cromatograma de vino tinto fortificado a 0,5 ng·L-1 con las 4 micotoxinas
FACTOR OTB OTA MeOTA OTC

Tiempo retención (tR) (min) 5,7 11,2 18,5 21,4
Tiempo muerto (tm) (min) 1 1 1 1
Factor de retención (k') 4,7 10,2 17,5 20,4
Simetría 0,78 0,89 0,91 0,88
Anchura de pico (wh) 0,32 0,52 0,27 0,36
Platos teóricos (N) 5.125 7.496 77.829 88.456
Resolución (Rs) 1,4 2,3 1,4 9,2
Tabla 29: Parámetros cromatográficos obtenidos.
LINEALIDAD
En las tablas 30 y 31 se muestran, para las 3 rectas de cada una de

las 4 ocratoxinas, el área media (Amedia) obtenida de las tres réplicas
analizadas para cada nivel de concentración, el factor respuesta (f)
medio (n = 3), junto con el valor medio calculado para cada recta fM
(n = 15) y su coeficiente de variación (CVf).
La representación gráfica de las rectas de calibrado obtenidas para

cada ocratoxina se muestra en la figura 40 y los parámetros obtenidos
del estudio estadístico de la linealidad se muestran en la tabla 32.
- 114 -
OTB OTA
-1
c (µg·L ) Amedia f fM CVf (%) Amedia f fM CVf (%)
0,1 2,05 20,5 1,98 19,8
0,2 4,63 23,2 4,86 24,3
0,4 9,43 23,6 23,0 7,3 9,82 24,5 23,8 9,8
0,6 14,5 24,1 15,2 25,3
1 23,8 23,8 24,9 24,9
1 23,8 23,8 24,9 24,9
4 91,7 22,9 94,8 23,7
8 185 23,1 23,3 2,6 191 23,9 24,1 2,7
12 284 23,7 294 24,5
20 458 22,9 473 23,6
20 458 22,9 473 23,6
60 1266 21,1 1320 21,9
120 2600 21,7 21,6 3,8 2700 22,5 22,5 3,5
200 4360 21,8 4540 22,7
400 8260 20,6 8620 21,5
Tabla 30: Áreas y factores respuesta obtenidas para OTB y OTA en el estudio de
linealidad.
MeOTA OTC
-1
c (µg·L ) Amedia f fM CVf (%) Amedia f fM CVf (%)
0,1 2,27 22,7 2,19 21,9
0,2 5,13 25,6 5,10 25,5
0,4 10,4 26,0 25,3 5,9 10,1 25,2 24,6 6,4
0,6 15,8 26,3 15,4 25,7
1 25,8 25,8 24,9 24,9
1 25,8 25,8 24,9 24,9
4 98,6 24,7 96,2 24,0
8 199 24,8 25,1 2,6 194 24,2 24,4 2,6
12 306 25,5 298 24,8
20 493 24,6 480 24,0
20 493 24,6 480 24,0
60 1370 22,8 1340 22,3
120 2810 23,4 23,3 3,8 2740 22,9 22,8 3,6
200 4700 23,5 4600 23,0
400 8900 22,3 8730 21,8
Tabla 31: Áreas obtenidas y factores respuesta para MeOTA y OTC en el estudio de
linealidad.
- 115 -
30 500 9000
Recta 0,1 - 1 µg/L OTB Recta 1 - 20 µg/L OTB Recta 20 - 400 µg/L OTB
450 8000
25
400 7000
350
20 6000
300
5000
15 250
Área
Área
Área
4000
200
10 3000
A = 24,162C- 0,233 150 A = 22,979C + 1,664 A = 20,586C + 92,827
R² = 0,9997 R² = 0,9995 2000
100 R² = 0,9991
5
50 1000
Ocratoxina B
0 0 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Concentración ocratoxina B (µg/L) Concentración ocratoxina B (µg/L) Concentración ocratoxina B (µg/L)
30 600 10000
Recta 0,1 - 1 µg/L OTA Recta 1 - 20 µg/L OTA Recta 20 - 400 µg/L OTA
9000
25 500
8000
7000
20 400
6000
15 300 5000
Área
Área
Área
4000
10 200
3000
A = 21,507C + 89,117
A= 25,432C - 0,348 2000
5 R² = 0,9996 100 A = 23,718C + 1,994 R² = 0,9992
R² = 0,9994 1000
Ocratoxina A
0 0 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Concentración ocratoxina A (µg/L) Concentración ocratoxina A (µg/L) Concentración ocratoxina A (µg/L)
30 600 10000
Recta 0,1 - 1 µg/L MeOTA Recta 1 - 20 µg/L MeOTA Recta 1 - 20 µg/L MeOTA
9000
- 116 -
25 500
8000
20 7000
400
6000
15 300 5000
Área
Área
Área
4000
10 200
3000
A = 26,135C- 0,140 A = 22,195C + 102,431
R² = 0,9996 A = 24,723C + 1,742 2000 R² = 0,9991
5 100
R² = 0,9995
1000
0 0 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Metil-ocratoxina A
Concentración metil-ocratoxina A (µg/L) Concentración metil-ocratoxina A (µg/L) Concentración metil-ocratoxina A (µg/L)

30 600 10000
Recta 0,1 - 1 µg/L OTC Recta 1 - 20 µg/L OTC Recta 20 - 400 µg/L OTC
9000
25 500
8000
20 7000
400
Figura 40: Rectas de calibrado para cada una de las ocratoxinas

6000
15 300 5000
Área
Área
Área
4000
10 200
3000
A = 21,776C + 93,158
A = 25,128C - 0,029
5 A = 24,090C + 1,710 2000 R² = 0,9992
R² = 0,9991 100
R² = 0,9995 1000
Ocratoxina C
0 0 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Concentración ocratoxina C (µg/L) Concentración ocratoxina C (µg/L) Concentración ocratoxina C (µg/L)
OTB OTA
Intervalo
0,1-1 1-20 20-400 0,1-1 1-20 20-400
(µg·L-1)
r 0,9998 0,9997 0,9996 0,9998 0,9997 0,9996
2
r 0,9997 0,9995 0,9991 0,9996 0,9994 0,9992
Pendiente 24,2 23,0 20,6 25,4 23,7 21,5
IC* 95%
(23,4; 24,9) (22,0; 23,9) (19,5; 21,7) (24,5; 26,4) (22,7; 24,8) (20,4; 22,6)
pendiente
Ordenada -0,233 1,66 92,8 -0,348 1,99 89,1
IC 95% (-0,649; (-0,885;
(-9,13; 12,4) (-140; 326) (-9,74; 13,7) (-147; 325)
ordenada 0,184) 0,189)
MeOTA OTC
Intervalo
0,1-1 1-20 20-400 0,1-1 1-20 20-400
(µg·L-1)
r 0,9998 0,9997 0,9995 0,9996 0,9998 0,9996
r2 0,9996 0,9995 0,9991 0,9991 0,9995 0,9992
Pendiente 26,1 24,7 22,2 25,1 24,1 21,8
IC* 95%
(25,1; 27,1) (23,7; 25,7) (21,0; 23,4) (23,8; 26,5) (23,1; 25,1) (20,6; 22,9)
pendiente
Ordenada -0,140 1,74 102 -0,029 1,71 93,2
IC 95% (-0,696; (-0,785;
(-9,65; 13,1) (-156; 361) (-9,27; 12,7) (-149; 336)
ordenada 0,416) 0,726)
Tabla 32: Parámetros de linealidad para cada ocratoxina en cada intervalo estudiado.
*IC: intervalo de confianza.
Además de estos parámetros, se ha realizado el análisis de la

varianza (ANOVA) para cada recta, comprobando que se cumplen los
supuestos de homogeneidad de varianzas (a través del Test de Cochran)
y la normalidad de los residuales. En las siguientes tablas se muestran
los valores de los factores respuesta obtenidos para cada concentración,
la varianza (s2) de éstos y el estadístico G calculado. También, se dan el
estadístico K2 de la prueba de normalidad de D’Agostino Pearson de los
residuales, con su correspondiente significación, y la F del ANOVA con su
probabilidad. La representación gráfica de los residuales frente a la
concentración de cada ocratoxina se muestra en la figura 41.
- 117 -
OTB
C (µg·L-1) Factores respuesta s2 G exp K2 F
0,1 19,5 19,7 22,4 2,69
0,2 24,0 21,5 24,0 2,08
4,831 5.367,28
0,4 21,9 24,4 24,4 2,03 0,37
(p=0,089) (p<0,001)
0,6 24,2 24,0 24,3 0,02
1 24,0 24,4 23,0 0,52
1 24,0 24,4 23,0 0,52
4 23,1 23,1 22,7 0,06
1,717 11.716,87
8 22,2 23,4 23,7 0,66 0,44
(p=0,424) (p<0,001)
12 23,8 23,2 24,1 0,21
20 23,1 22,6 23,0 0,07
20 23,1 22,6 23,0 0,07
60 20,8 20,9 21,6 0,18
0,325 10.801,13
120 21,8 22,0 21,2 0,14 0,36
(p=0,850) (p<0,001)
200 21,9 21,6 21,8 0,02
400 20,3 20,8 20,9 0,10
Tabla 33: Estudio estadístico de normalidad y homoscedasticidad de los residuales para la
OTB. Valor del estadístico F y significación del ANOVA.
OTA
-1
C (µg·L ) Factores respuesta s2 G exp K2 F
0,1 21,1 16,9 21,6 6,74
0,2 24,6 23,7 24,6 0,28
1,127 9.374,13
0,4 24,0 24,8 24,8 0,19 0,86
(p=0,569) (p<0,001)
0,6 24,5 25,7 25,6 0,41
1 25,0 25,4 24,4 0,22
1 25,0 25,4 24,4 0,22
4 24,0 23,6 23,5 0,09
1,713 12.109,52
8 23,0 24,3 24,4 0,60 0,53
(p=0,425) (p<0,001)
12 24,5 24,1 24,9 0,16
20 23,9 23,3 23,7 0,07
20 23,9 23,3 23,7 0,07
60 21,7 21,7 22,4 0,17
0,355 11.204,76
120 22,7 22,8 22,0 0,18 0,33
(p=0,838) (p<0,001)
200 22,9 22,6 22,7 0,02
400 21,2 21,7 21,8 0,11
OTA. Valor del estadístico F y significación del ANOVA.
- 118 -
MeOTA
C (µg·L-1) Factores respuesta s2 G exp K2 F
0,1 23,5 22,6 21,9 0,57
0,2 25,6 26,6 24,7 0,90
11,054 9.288,27
0,4 25,3 26,4 26,3 0,33 0,40
(p=0,004) (p<0,001)
0,6 26,1 26,5 26,4 0,06
1 26,2 26,2 25,1 0,39
1 26,2 26,2 25,1 0,39
4 24,8 24,8 24,4 0,05
1,128 13.657,65
8 23,9 25,2 25,4 0,68 0,51
(p=0,569) (p<0,001)
12 25,6 25,0 25,8 0,14
20 24,8 24,4 24,7 0,06
20 24,8 24,4 24,7 0,06
60 22,5 22,6 23,3 0,18
0,176 10.335,34
120 23,6 23,7 22,9 0,21 0,35
(p=0,916) (p<0,001)
200 23,7 23,4 23,4 0,03
400 21,9 22,4 22,5 0,11
MeOTA. Valor del estadístico F y significación del ANOVA.
OTC
-1
C (µg·L ) Factores respuesta s2 G exp K2 F
0,1 21,4 22,9 21,4 0,70
0,2 26,1 25,8 24,7 0,52
7,712 4.692,87
0,4 24,4 26,1 25,2 0,70 0,28
(p=0,021) (p<0,001)
0,6 25,4 25,9 25,7 0,07
1 25,0 25,7 23,9 0,76
1 25,0 25,7 23,9 0,76
4 24,4 24,2 23,7 0,13
1,632 13.319,80
8 23,3 24,5 24,9 0,67 0,42
(p=0,442) (p<0,001)
12 24,9 24,3 25,2 0,19
20 24,1 23,8 24,1 0,05
20 24,1 23,8 24,1 0,05
60 22,0 22,0 22,8 0,19
0,258 11.486,26
120 23,0 23,2 22,4 0,19 0,34
(p=0,879) (p<0,001)
200 23,2 22,9 22,9 0,03
400 21,5 21,9 22,1 0,09
OTC. Valor del estadístico F y significación del ANOVA.
- 119 -
0,3 10 200
0,2
5 100
0,1
Residuos
Residuos
0
Residuos
0 0
-0,1 0 0,5 1 1,5
0 5 10 15 20 25 0 100 200 300 400 500
Ocratoxina B
-0,2 Concentración OTB (µg/L) -5 Concentración OTB (µg/L) -100 Concentración OTB (µg/L)
0,3 10 200
0,2
0,1 5 100
0
Residuos
Residuos
Residuos
-0,1 0 0,5 1 1,5 0 0
-0,2 0 5 10 15 20 25
Ocratoxina A
0 100 200 300 400 500

-0,3 Concentración OTA (µg/L) -5 Concentración OTA (µg/L) -100 Concentración OTA (µg/L)
0,4 10 200
- 120 -
0,2
5 100
0
Residuos
Residuos
Residuos
0 0,5 1 1,5 0 0
-0,2
0 5 10 15 20 25 0 100 200 300 400 500
Metil-ocratoxina A
-0,4 Concentración MeOTA (µg/L) -5 Concentración MeOTA (µg/L) -100 Concentración MeOTA (µg/L)
0,4 10 200
0,2 5 100
0
Residuos
Residuos
Residuos
0 0,5 1 1,5 0 0
-0,2 0 5 10 15 20 25 0 100 200 300 400 500
Ocratoxina C
Figura 41: Residuales correspondientes a las rectas de calibrado de cada ocratoxina.

-0,4 Concentración OTC (µg/L) -5 Concentración OTC (µg/L) -100 Concentración OTC (µg/L)
Los resultados de repetibilidad y precisión intermedia de la

linealidad se detallan en la tabla 37. Se muestran las concentraciones
medias para cada concentración ensayada y el coeficiente de variación
(CV, %).
Repetibilidad (n=3) Precisión intermedia (n=9)

-1 C media C media
C (µg·L ) CV (%) CV (%)
(µg·L-1) (µg·L-1)
0,1 0,095 7,18 0,091 8,61
0,4 0,400 5,92 0,393 4,14
1 0,995 2,99 1,01 3,25
OTB 8 7,97 3,55 7,82 2,93
20 19,8 1,17 19,8 1,63
120 122 1,81 122 2,21
400 396 1,54 398 2,04
0,1 0,092 11,1 0,092 9,83
0,4 0,400 1,74 0,392 3,92
1 0,994 1,87 1,01 2,99
OTA 8 7,96 3,28 7,81 2,76
20 19,8 1,14 19,8 1,54
120 122 1,97 121 2,14
400 397 1,54 397 1,99
0,1 0,092 3,06 0,091 3,26
0,4 0,403 2,23 0,395 2,42
1 0,993 2,42 1,01 2,39
MeOTA 8 7,96 3,34 7,80 2,75
20 19,9 1,02 19,8 1,65
120 122 2,02 121 2,29
400 396 1,52 396 2,12
0,1 0,088 3,84 0,087 4,84
0,4 0,403 3,34 0,395 3,57
1 0,991 3,51 1,02 3,00
OTC 8 7,98 3,41 7,82 2,78
20 19,8 0,94 19,8 1,64
120 122 1,96 121 1,76
400 396 1,37 397 2,11
Tabla 37: Resultados de repetibilidad y precisión intermedia de la linealidad para cada
ocratoxina.
- 121 -
Los resultados de exactitud de la linealidad se detallan en la

tabla 38. Se muestran las concentraciones medias para cada
concentración ensayada y el error relativo (ER, %).
Exactitud 1 día (n=3) Exactitud 3 días (n=9)
-1 C media C media
C (µg·L ) ER (%) ER (%)
(µg·L-1) (µg·L-1)
0,1 0,095 5,36 0,091 8,48
0,4 0,400 0,10 0,393 1,86
1 0,995 0,57 1,01 1,32
OTB 8 7,97 0,37 7,82 2,28
20 19,8 0,73 19,8 1,08
120 122 1,42 122 1,73
400 396 0,86 398 0,44
0,1 0,092 8,31 0,092 6,55
0,4 0,400 0,35 0,392 2,11
1 0,994 0,33 1,01 0,96
OTA 8 7,96 0,49 7,81 2,34
20 19,8 0,75 19,8 1,02
120 122 1,31 121 0,99
400 397 0,84 397 0,82
0,1 0,092 7,87 0,091 9,15
0,4 0,403 0,75 0,395 1,37
1 0,993 0,67 1,01 1,07
MeOTA 8 7,96 0,51 7,80 2,49
20 19,9 0,69 19,8 1,22
120 122 1,53 121 1,00
400 396 0,89 396 0,87
0,1 0,088 11,8 0,087 12,5
0,4 0,403 0,66 0,395 1,25
1 0,991 0,91 1,02 1,64
OTC 8 7,98 0,30 7,82 2,25
20 19,8 0,71 19,8 1,07
120 122 1,41 121 1,72
400 396 0,85 397 0,74
Tabla 38: Resultados de exactitud de la linealidad para cada ocratoxina.
Tras obtener estos resultados se ha considerado que el método es

lineal para cada ocratoxina en los intervalos de concentración
ensayados.
- 122 -
RECUPERACIÓN
Los estudios de exactitud (expresada como recuperación) y de

precisión (repetibilidad y precisión intermedia) del método analítico se
han calculado a partir de la fortificación, extracción y análisis de
muestras de vino como se indica en el capítulo de material y métodos y
se muestran en las siguientes tablas.
- Ocratoxina B
Repetibilidad OTB
C (µg·L-1) Rec (%) Media (n=3) CV (n=3) Global (n=15) CV (n=15)
67,8
0,0005 69,3 71,7 7,7%
78,1
104
0,003 112 101 14%
85,2
82,7
0,04 89,0 83,4 6,4% 87,0 13%
78,4
91,4
0,6 94,2 93,5 2,0%
94,9
80,0
2 88,1 85,7 5,8%
89,1
Tabla 39: Estudio de recuperación y repetibilidad del método analítico para la OTB.
Precisión intermedia OTB

-1 Recuperación (%) Media CV Global CV
C (µg·L )
día 1 día 2 día 3 (n=9) (n=9) (n=45) (n=45)
67,8 61,8 70,4
0,0005 69,3 53,3 54,5 63,8 13%
78,1 66,4 52,8
104 51,3 75,5
0,003 112 71,5 87,0 83,9 20%
85,2 83,8 84,4
82,7 85,0 82,1
0,04 89,0 88,0 82,0 84,9 4,2% 81,7 16%
78,4 86,8 89,6
91,4 84,8 95,5
0,6 94,2 94,5 91,4 92,7 3,3%
94,9 93,5 94,0
80,0 66,4 85,6
2 88,1 87,5 83,2 83,1 8,4%
89,1 78,5 89,9
Tabla 40: Estudio de recuperación y precisión intermedia del método analítico para la OTB.
- 123 -
- Ocratoxina A
Repetibilidad OTA
Media CV
C (µg·L-1) Rec (%) CV (n=3) Global (n=15)
(n=3) (n=15)
97,6
0,0005 93,7 93,3 4,7%
88,8
93,4
0,003 94,8 92,9 2,3%
90,6
88,6
0,04 94,8 89,6 5,3% 91,1 4,8%
85,4
90,9
0,6 95,2 93,8 2,7%
95,2
80,3
2 88,7 85,7 5,5%
88,2
Tabla 41: Estudio de recuperación y repetibilidad del método analítico para la OTA.
Precisión intermedia OTA

Rec (%) Media CV Global CV
C (µg·L-1)
día 1 día 2 día 3 (n=9) (n=9) (n=45) (n=45)
97,6 120 93,5
0,0005 93,7 111 112 104 11%
88,8 95,8 120
93,4 97,1 98,3
0,003 94,8 113 98,8 95,7 8,3%
90,6 95,6 80,4
88,6 91,1 87,9
0,04 94,8 94,0 89,0 90,8 3,7% 93,5 10%
85,4 90,7 96,1
90,9 87,2 94,3
0,6 95,2 94,5 96,5 93,8 3,1%
95,2 93,2 97,1
80,3 67,0 84,1
2 88,7 86,5 88,4 83,7 8,3%
88,2 78,9 90,7
Tabla 42: Estudio de recuperación y precisión intermedia del método analítico para la OTA
- 124 -
- Metilocratoxina A
Repetibilidad MeOTA
Media CV
(n=3) (n=15)
83,2
0,0005 71,4 80,0 9,5%
85,5
78,2
0,003 76,6 76,6 2,1%
74,9
77,0
0,04 81,4 77,2 5,2% 76,7 8,6%
73,4
78,9
0,6 85,7 82,7 4,2%
83,6
63,2
2 70,0 66,7 5,1%
66,7
Tabla 43: Estudio de recuperación y repetibilidad del método analítico para la MeOTA.
Precisión intermedia MeOTA

Rec (%) Media (s) CV Global CV
C (µg·L-1)
día 1 día 2 día 3 (n=9) (n=9) (n=45) (n=45)
83,2 89,7 81,1
0,0005 71,4 89,5 109 80,7 19%
85,5 56,2 60,2
78,2 74,1 74,2
0,003 76,6 83,3 77,4 75,6 5,6%
74,9 75,6 66,4
77,0 77,8 71,9
0,04 81,4 78,9 72,6 76,3 4,5% 76,0 13%
73,4 73,0 80,9
78,9 76,4 82,7
0,6 85,7 83,7 86,4 82,4 3,9%
83,6 79,4 84,7
63,2 54,4 57,8
2 70,0 62,3 73,4 64,8 8,7%
66,7 68,4 66,9
Tabla 44: Estudio de recuperación y precisión intermedia del método analítico para la
MeOTA.
- 125 -
- Ocratoxina C
Repetibilidad OTC
Media (s) CV
(n=3) (n=15)
63,3
0,0005 79,0 65,7 19%
54,7
81,0
0,003 77,0 77,3 4,7%
73,7
78,3
0,04 80,4 78,0 3,5% 74,2 11%
75,1
79,1
0,6 86,3 83,2 4,5%
84,0
63,8
2 70,2 67,0 4,8%
67,1
Tabla 45: Estudio de recuperación y repetibilidad del método analítico para la OTC.
Precisión intermedia OTC

Rec (%) Media (s) CV Global CV
C (µg·L-1)
día 1 día 2 día 3 (n=9) (n=9) (n=45) (n=45)
63,3 52,5 83,6
0,0005 79,0 51,4 63,7 65,0 19%
54,7 55,6 81,0
81,0 80,3 76,8
0,003 77,0 85,0 76,6 77,1 6,4%
73,7 77,8 66,1
78,3 78,5 73,5
0,04 80,4 79,8 74,5 77,3 4,0% 73,4 13%
75,1 73,4 82,1
79,1 77,7 82,4
0,6 86,3 83,9 86,4 82,7 3,8%
84,0 79,1 85,5
63,8 54,8 57,1
2 70,2 62,3 73,8 64,9 8,9%
67,1 68,8 66,6
Tabla 46: Estudio de recuperación y precisión intermedia del método analítico para la OTC
- 126 -
En el posterior análisis de las muestras se ha empleado la

recuperación obtenida en condiciones de precisión intermedia como
factor de corrección de los resultados analíticos. Los valores empleados
OTB OTA MeOTA OTC

Recuperación (%) 81,7 93,5 76,0 73,4
Tabla 47: Recuperación en condiciones de precisión intermedia para cada ocratoxina.
Como se indica en el apartado de material y métodos, para la

obtención de los límites de detección y cuantificación, se han fortificado
alícuotas de vino a tres concentraciones cercanas a los límites
presumibles.
Las concentraciones obtenidas para cada ocratoxina, para cada

nivel de concentración ensayado, así como su valor medio, CV y
recuperación se muestran en la tabla 48.
C media Recuperación
C (ng·L-1) C medida (ng·L-1) CV (%)
(ng·L-1) (%)
0,3 0,092 0,121 0,227 0,147 48,5 48,9
OTB 0,4 0,433 0,166 0,262 0,287 47,2 71,8
0,5 0,379 0,388 0,437 0,401 7,73 80,3
0,3 0,108 0,078 0,116 0,100 19,7 33,5
OTA 0,4 0,336 0,268 0,347 0,317 13,6 79,3
0,5 0,538 0,513 0,481 0,511 5,53 102,1
0,3 0,297 0,284 0,162 0,248 30,0 82,5
MeOTA 0,4 0,291 0,242 0,273 0,269 9,32 67,2
0,5 0,416 0,357 0,428 0,400 9,47 80,0
0,3 0,100 0,089 0,008 0,066 76,7 21,9
OTC 0,4 0,258 0,325 0,251 0,278 14,7 69,4
0,5 0,317 0,395 0,273 0,328 18,8 65,7
Tabla 48: Concentraciones, CV (%) y recuperación obtenidas en el estudio del LD y LC.
- 127 -
La concentración más baja para la que se obtiene, para todas las

micotoxinas, adecuados valores de recuperación (entre 50-120%) y
coeficiente variación (< del 20%) es 0,5 ng·L-1; por esta razón, se ha
fijado este nivel como límite de cuantificación para todas ellas.
En el cálculo del límite de detección, se ha representado señal
(recta 1) y desviación estándar (recta 2) frente a concentración. Con
estos datos, y la ecuación descrita en el apartado material y métodos,
se han obtenido los valores que se indican en la tabla 49 para cada
micotoxina.
Recta 1 Recta 2 LD (ng·L-1)

OTB A=5,2297C - 0,9482 s=-0,8245C + 0,6552 0,32
OTA A=8,1365C - 2,0270 s=0,1669C + 0,0538 0,16
MeOTA A=3,4610C + 0,0014 s=-0,8251C + 0,5375 0,27
OTC A=5,7508C - 1,3204 s=0,2502C + 0,1230 0,17
Tabla 49: Rectas obtenidas para el cálculo del LD y valor obtenido.
ROBUSTEZ
Para el estudio de la robustez se han valorado los factores pH del

vino y volumen de inyección. Los resultados obtenidos se muestran a
continuación.
- pH ajustado del vino
Se ha estudiado el efecto del pH adecuado del vino antes de su

paso por las columnas de inmunoafinidad. El pH al que se ajustan las
muestras de vino en el método desarrollado ha sido de 7,2. Se ha
estudiado la influencia del pH en la recuperación para los valores 6,8 y
7,6. Las áreas obtenidas para un vino fortificado a 0,05 µg·L-1, restando
las áreas del blanco, se compararon con las áreas de una disolución de
calibración de 10 µg·L-1. Los resultados se muestran en la tabla 50.
- 128 -
OTB OTA MeOTA OTC

A Amedia Rec A Amedia Rec A Amedia Rec A Amedia Rec
208 211 190 179
pH=6,8 216 92,7 221 92,4 198 79,9 189 78,1
224 230 207 199
197 212 203 197
pH=7,2 205 88,0 221 92,4 204 82,0 197 81,5
214 229 204 198
190 209 191 187
pH=7,6 202 86,5 223 93,4 201 80,7 198 81,6
257 237 210 208
10 µg·L-1 233 239 249 242
Media 89,1 92,7 80,9 80,4
CV (%) 3,62 0,63 1,34 2,48
Tabla 50: Áreas, áreas medias y recuperación (Rec, %) obtenidas a partir del análisis de
vino fortificado a pH 6,8, 7,2 y 7,6.
El método es robusto a los cambios de pH, como se deduce de los

bajos coeficientes de variación obtenidos para la recuperación para cada
ocratoxina.
- Volumen de inyección.
El volumen de inyección del método analítico desarrollado es de

100 µL. Se ha comprobado la influencia en la exactitud de inyectar un
volumen muy diferente, 20 µL. Se ha realizado la experiencia a tres
niveles de concentración y 9 análisis por cada ocratoxina. En la tabla 51
se muestran las concentraciones calculadas multiplicando por cinco la
concentración obtenida con 20 µL y la exactitud de la media con
respecto a la concentración ensayada.
Los errores relativos obtenidos, todos inferiores al 5%, indican que

el método es robusto al cambio de volumen de inyección, siempre que
se tenga en cuenta la dilución al calcular la concentración.
- 129 -
OTB OTA MeOTA OTC

(µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1)
4,04 3,80 4,01 3,92
4,05 3,91 4,03 4,01
4,13 4,01 4,00 3,89
4,03 3,80 3,92 3,79
-1
4 µg·L 3,91 3,91 3,97 3,80
4,09 4,10 3,95 3,88
4,04 3,84 4,02 3,81
3,99 3,84 3,96 3,86
4,03 3,87 4,04 3,89
Media 4,04 3,90 3,99 3,87
ER (%) 0,89 -2,57 -0,26 -3,19
39,8 39,1 39,4 39,1
39,7 39,1 39,2 39,1
39,1 38,4 38,7 38,4
40,6 39,9 39,9 39,8
-1
40 µg·L 40,3 39,7 39,8 39,6
40,5 39,6 39,8 39,5
41,1 40,2 40,3 40,3
41,0 40,0 40,3 40,0
40,1 39,5 39,5 39,4
Media 40,2 39,5 39,7 39,5
ER (%) 0,58 -1,23 -0,85 -1,38
396 386 387 387
396 386 386 386
393 383 383 383
385 377 376 376
-1
400 µg·L 383 375 375 374
378 370 369 369
405 397 397 397
397 388 388 388
397 388 389 388
Media 392 383 383 383
ER (%) -1,99 -4,18 -4,19 -4,27
Tabla 51: Resultados del estudio de robustez frente a cambios en el volumen de
inyección.
- 130 -
ESTABILIDAD
- Estabilidad de disoluciones de patrones en congelación
En la tabla 52 se muestran las concentraciones obtenidas (n = 3) a

tiempo cero, uno, tres, seis y doce meses (µg·L-1) y el error relativo de
la concentración media con respecto a la concentración inicial.
OTB OTA MeOTA OTC

C t C ER C ER C ER C ER
(μg·L-1) (mes) media (%) media (%) media (%) media (%)
0 3,85 0,00 3,86 0,00 3,89 0,00 3,84 0,00
1 3,88 -0,78 3,85 0,26 3,86 0,77 3,85 -0,33
4 3 3,86 -0,26 3,86 0,00 3,88 0,20 3,84 0,06
6 3,99 -3,64 3,91 -1,30 3,97 -1,93 3,86 -0,54
12 4,04 -4,94 4,05 -4,92 4,05 -4,03 4,03 -4,95
0 38,8 0,00 38,8 0,00 38,6 0,00 38,6 0,00
1 38,8 -0,18 38,5 0,73 38,4 0,47 38,4 0,55
40 3 38,8 -0,08 38,6 0,54 38,6 0,13 38,5 0,20
6 39,2 -1,19 38,4 1,06 38,4 0,46 38,2 0,98
12 39,1 -0,85 39,2 -0,96 39,2 -1,41 39,4 -1,91
0 394 0,00 393 0,00 392 0,00 392 0,00
1 393 0,25 390 0,71 389 0,75 389 0,77
400 3 395 -0,16 392 0,13 392 -0,17 392 -0,06
6 394 0,02 385 1,91 385 1,58 385 1,84
12 405 -2,76 402 -2,34 407 -3,84 408 1,88
Tabla 52: Concentraciones medias (µg·L-1) y ER (%) a t=0, 1, 3, 6 y 12 meses de las
disoluciones de patrones de 4, 40 y 400 µg·L-1 a -20ºC.
El error relativo se mantiene en todos los casos dentro del ±5% de

la concentración a tiempo 0, por lo que las disoluciones en metanol
pueden considerarse estables almacenadas a -20ºC.
- Estabilidad de las ocratoxinas en vial y en el inyector del HPLC
Se han inyectado durante 48 h disoluciones de patrones y muestras

de vino fortificado, a distintos tiempos, y a dos concentraciones
diferentes. En las tablas 53-56 se muestran las concentraciones (μg·L-1)
obtenidas, así cómo su exactitud con respecto al valor inicial. En verde
- 131 -
se han indicado los valores de exactitud superiores al 5% y en rojo los

superiores al 10%.
OTB
Patrón Vino
C C C C
t (h) ER (%) ER (%) ER (%) ER (%)
(µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1)
0 7,75 0,00 96,4 0,00 7,11 0,00 51,6 0,00
3 7,75 0,03 97,2 0,78 7,16 0,81 51,7 0,37
8,5 7,99 3,19 98,6 2,28 7,19 1,15 52,0 0,79
14 7,99 3,15 99,9 3,63 7,28 2,40 51,8 0,41
18,5 7,97 2,91 100 4,00 7,31 2,88 52,0 0,79
21,5 8,06 4,11 100 3,74 7,30 2,67 52,0 0,88
24,5 8,11 4,71 102 5,33 7,29 2,59 52,1 1,02
27,5 8,06 4,04 103 6,66 7,39 4,01 52,2 1,19
30,5 8,13 4,92 103 7,27 7,41 4,29 52,4 1,56
33,5 8,15 5,23 105 8,65 7,42 4,36 52,5 1,81
36,5 8,28 6,85 105 9,05 7,54 6,07 52,7 2,13
39,5 8,31 7,34 106 10,8 7,50 5,48 52,6 2,05
42,5 8,33 7,48 108 11,6 7,53 5,99 52,9 2,53
45,5 8,42 8,72 109 13,5 7,39 4,05 53,0 2,82
48,5 8,44 9,02 111 15,4 7,49 5,41 - -
Tabla 53: Concentraciones de OTB (µg·L-1) y ER (%) a distintos tiempos en el inyector del
HPLC.
OTA
Patrón Vino
C C C C
t (h) ER (%) ER (%) ER (%) ER (%)
(µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1)
0 7,61 0,00 97,1 0,00 8,49 0,00 60,8 0,00
3 7,69 1,08 97,3 0,30 8,72 2,66 61,1 0,50
8,5 7,83 2,83 98,9 1,88 8,73 2,81 61,2 0,60
14 8,00 5,16 100 3,22 8,72 2,65 61,2 0,59
18,5 7,91 3,96 101 3,71 8,84 4,10 61,3 0,79
21,5 7,89 3,63 101 4,23 8,77 3,26 61,6 1,28
24,5 8,02 5,35 102 5,09 8,83 4,03 61,8 1,53
27,5 8,04 5,64 103 6,11 8,97 5,59 61,9 1,70
30,5 8,08 6,19 104 7,32 8,99 5,85 61,9 1,76
33,5 8,14 6,97 105 8,31 8,98 5,77 62,1 2,07
36,5 8,15 7,12 106 9,07 9,00 5,93 62,2 2,32
39,5 8,34 9,59 107 10,7 9,06 6,67 62,5 2,74
42,5 8,27 8,62 109 11,8 9,07 6,83 62,7 3,14
45,5 8,36 9,83 110 13,4 9,06 6,67 62,7 3,12
48,5 8,22 8,04 111 14,7 9,05 6,56 - -
Tabla 54: Concentraciones de OTA (µg·L-1) y ER (%) a distintos tiempos en el inyector del
HPLC.
- 132 -
MeOTA
Patrón Vino
C C C C
t (h) ER (%) ER (%) ER (%) ER (%)
(µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1)
0 7,74 0,00 96,2 0,00 5,77 0,00 53,0 0,00
3 7,76 0,15 96,6 0,42 5,87 1,73 53,0 0,05
8,5 8,00 3,32 98,0 1,83 5,90 2,21 53,2 0,53
14 7,98 3,09 99,3 3,17 5,83 0,99 53,1 0,27
18,5 8,00 3,34 99,3 3,24 5,94 2,87 53,2 0,50
21,5 7,95 2,65 99,9 3,78 5,98 3,61 53,4 0,83
24,5 8,02 3,61 101 4,76 6,03 4,40 53,6 1,12
27,5 8,05 3,92 102 5,96 6,04 4,56 53,7 1,32
30,5 8,08 4,36 103 7,08 6,03 4,54 53,9 1,69
33,5 8,22 6,13 104 7,93 6,10 5,62 53,9 1,68
36,5 8,18 5,68 105 8,74 6,05 4,87 53,9 1,79
39,5 8,28 6,91 106 9,87 6,16 6,75 53,9 1,83
42,5 8,34 7,69 107 11,3 6,15 6,54 54,2 2,39
45,5 8,48 9,50 109 13,0 6,07 5,07 54,2 2,36
48,5 8,47 9,36 110 14,5 6,14 6,40 - -
Tabla 55: Concentraciones de MeOTA (µg·L-1) y ER (%) a distintos tiempos en el inyector
del HPLC.
OTC
Patrón Vino
C C C C
t (h) ER (%) ER (%) ER (%) ER (%)
(µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1) (µg·L-1)
0 7,74 0,00 97,1 0,00 5,96 0,00 55,6 0,00
3 7,87 1,63 97,7 0,66 6,00 0,82 55,8 0,33
8,5 8,04 3,79 98,9 1,89 6,10 2,35 55,9 0,52
14 7,95 2,68 100 3,36 6,10 2,49 55,9 0,54
18,5 7,88 1,81 101 3,47 6,08 2,02 55,9 0,52
21,5 7,96 2,79 101 4,19 6,07 1,94 56,1 0,81
24,5 8,06 4,07 102 5,42 6,19 3,95 56,3 1,10
27,5 8,08 4,33 103 6,01 6,11 2,65 56,4 1,30
30,5 8,01 3,39 104 7,36 6,17 3,64 56,6 1,64
33,5 8,15 5,25 105 8,53 6,10 2,48 56,5 1,55
36,5 8,14 5,08 106 8,92 6,19 3,89 56,7 1,98
39,5 8,26 6,63 107 10,2 6,27 5,23 56,7 1,98
42,5 8,26 6,73 108 11,1 6,24 4,87 57,0 2,43
45,5 8,44 8,29 110 13,1 6,24 4,79 57,1 2,55
48,5 8,44 8,29 111 14,8 6,18 3,83 - -
Tabla 56: Concentraciones de OTC (µg·L-1) y ER (%) a distint0s tiempos en el inyector del
HPLC.
- 133 -
Aunque la estabilidad varía para cada ocratoxina, se ha considerado

que una disolución de todas ellas sería estable (ER < 5%) durante
21,5 h, disueltas en fase móvil (42:58 ACN:H 2O (0,4% ácido fórmico)) a
temperatura ambiente en el inyector del HPLC. En el caso del vino, en
general, las ocratoxinas parecen más estables, aunque se ha
considerado que una muestra de vino que contuviera todas ellas sería
estable 24,5 h. De todas formas, durante el estudio ninguna muestra (ni
de patrón ni de vino) ha permanecido en el inyector del equipo más de
8 h.
Durante el análisis de las muestras del presente trabajo las

disoluciones de patrones analizadas a la vez que las muestras han
presentado valores de exactitud adecuada, por debajo del límite
establecido para aceptación de los mismos. Representando la exactitud,
como error relativo, de los diferentes patrones cada día frente al tiempo,
se observa cómo, en todos los casos, son inferiores a ±10%.
Exactitud (ER %) OTB

10
0
0 5 10 15 20 25
-5
-10
Figura 41: Exactitud de la OTB en los patrones analizados junto con las muestras.
- 134 -
Exactitud (ER %) OTA

10
0
0 5 10 15 20 25
-5
-10
Figura 42 Exactitud de la OTA en los patrones analizados junto con las muestras.
Exactitud (ER %) MeOTA

10
0
0 5 10 15 20 25
-5
-10
Figura 43: Exactitud de la MeOTA en los patrones analizados junto con las muestras.
- 135 -
Exactitud (ER %) OTC

10
0
0 5 10 15 20 25
-5
-10
Figura 44: Exactitud de la OTC en los patrones analizados junto con las muestras.
Estos resultados indican que el método cromatográfico se ha

comportado adecuadamente a lo largo del análisis de las muestras.
- 136 -
RESULTADOS: Transformación de OTC en OTA
3. TRANSFORMACIÓN DE OTC EN OTA

Zimmerli y Dick propusieron que la presencia de ocratoxina C en el
vino podía deberse a que es producida por los mismos hongos que la
ocratoxina A, o que ésta podía sufrir una esterificación, al ser el vino un
medio ácido y con contenido alcohólico (Zimmerli y Dick, 1996).
Conociendo que la OTA es estable en vino durante al menos un año
(López de Cerain y col., 2002), se decidió estudiar el comportamiento de
la OTC en esta matriz.
Se fortificaron 500 mL de 5 vinos a 0,5 µg·L-1 y otros 5 a 2 µg·L-1.

Los 10 vinos se analizaron a tiempo cero, una semana, dos semanas, un
mes, dos meses y un año, almacenados a temperatura ambiente. Los
resultados de concentración de OTC y OTA en el tiempo se muestran en
las tablas 57 y 58 y en las figuras 45 y 46.
Debido a la ausencia de normalidad, detectada con la prueba

d’Agostino Pearson (p < 0,05), las concentraciones se compararon con
el test no paramétrico de Friedman para k muestras relacionadas. Tanto
la concentración de OTC como la de OTA, presentan diferencias
altamente significativas (p< 0,001).
El test a posteriori de comparaciones múltiples de Bonferroni reveló

que la concentración de OTC a la semana 8 difiere significativamente de
la concentración inicial (p=0,035 cuando OTC inicial 0,5 µg·L-1,
p=0,0004 cuando OTC inicial 2 µg·L-1). Para la OTA esta diferencia se
aprecia a las 4 semanas (p=0,016 cuando OTC inicial 0,5 µg·L-1,
p=0,0075 cuando OTC inicial 2 µg·L-1).
- 137 -
OTC inicial 0,5 µg·L-1

Vino t=0 1 sem 2 sem 4 sem 8 sem 1 año
A 0,47 0,44 0,47 0,43 0,39 0,19
B 0,48 0,43 0,41 0,38 0,30 0,04
C OTC C 0,53 0,49 0,53 0,52 0,50 0,22
(µg·L-1) D 0,43 0,42 0,40 0,42 0,39 0,27
E 0,41 0,45 0,49 0,43 0,42 0,18
Media 0,46 0,45 0,46 0,44 0,40 0,18
A 0,01 0,01 0,02 0,03 0,04 0,09
B 0,04 0,06 0,07 0,10 0,13 0,12
C OTA C 0,02 0,02 0,02 0,03 0,03 0,05
(µg·L-1) D 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,04
E 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,05
Media 0,02 0,02 0,03 0,04 0,05 0,07
Tabla 57: Concentraciones en el tiempo de OTC y OTA (µg·L-1) en los cinco vinos
fortificados inicialmente con 0,5 µg·L-1 de OTC.
*
0 1 sem 2 sem 4 sem 8 sem 1 año
Figura 45: Representación gráfica de las concentraciones medias de OTC y OTA frente al
tiempo para los 5 vinos fortificados inicialmente con 0,5 µg·L -1 de OTC. *Diferencia
estadísticamente significativa con respecto a la concentración inicial.
- 138 -
OTC inicial 2 µg·L.1

Vino t=0 1 sem 2 sem 4 sem 8 sem 1 año
F 2,29 2,01 2,16 1,85 1,41 0,60
G 1,98 1,91 1,62 1,49 0,90 0,34
C OTC H 2,24 2,01 1,92 1,74 1,53 0,33
-1
(µg·L ) I 2,08 2,13 2,11 2,11 1,92 0,63
J 1,63 1,59 1,73 1,55 1,42 0,40
Media 2,04 1,93 1,91 1,75 1,44 0,46
F 0,01 0,04 0,07 0,10 0,15 0,27
G 0,02 0,08 0,12 0,22 0,25 0,81
OTA H 0,02 0,11 0,17 0,33 0,55 1,07
-1
(µg·L ) I 0,01 0,02 0,03 0,04 0,06 0,11
J 0,02 0,02 0,04 0,05 0,07 0,15
Media 0,01 0,05 0,08 0,15 0,22 0,48
Tabla 58: Concentraciones en el tiempo de OTC y OTA (µg·L-1) en los cinco vinos
fortificados inicialmente con 2 µg·L-1 de OTC.
*
0 1 sem 2 sem 4 sem 8 sem 1 año
Figura 46: Representación gráfica de las concentraciones medias de OTC y OTA frente al
tiempo para los 5 vinos fortificados inicialmente con 2 µg·L-1 de OTC. *Diferencia
estadísticamente significativa con respecto a la concentración inicial.
- 139 -
RESULTADOS: Presencia de ocratoxinas en vinos navarros
4. PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN VINOS

NAVARROS
VINOS DE AGRICULTURA TRADICIONAL
En la tabla siguiente se muestran las concentraciones obtenidas en
el análisis de 35 vinos tintos de agricultura tradicional de Navarra,
utilizando el método validado para la OTB, OTA, MeOTA y OTC, y las
aproximaciones realizadas para MeOTB y EtOTB.
Concentración (ng·L-1)
Código OTB OTA MeOTA OTC MeOTB EtOTB
1J 70,0 94,9 0,32* 4,47 2,10 2,42 Año cosecha
2J 11,4 26,7 1,28 1,10 1,46 0,31* sin
3J 10,6 5,44 0,95 0,38* 1,10 < LD especificar
2Jb 20,1 33,8 < LD 2,41 0,92 0,20*
4J 4,10 1,35 < LD 0,19* 0,79 < LD
5J 13,5 0,49* 0,37* < LD 1,00 < LD Joven
11J 7,17 6,56 < LD 0,38* 2,81 < LD Cosecha
12J 4,37 3,35 < LD 0,26* 2,14 < LD 2006
13J 19,5 44,8 < LD 3,69 1,08 0,57
14J 8,00 19,0 < LD 2,71 1,07 0,20*
6J 12,8 15,2 < LD 0,82 1,33 < LD
7J 7,15 6,02 0,36* 2,84 0,81 < LD
8J 10,8 15,9 0,55 0,68 1,74 < LD
9J 22,8 3,58 0,78 < LD 1,32 < LD
10J 4,92 3,81 0,33* < LD 0,54 < LD
15J 15,2 6,72 0,65 0,58 2,84 < LD
16J 3,89 3,31 0,32* 2,84 1,45 < LD Joven
17J 7,14 5,30 0,30* 0,39* 8,98 0,63 Cosecha
18J 10,1 10,8 < LD 1,15 5,34 0,25* 2007
19J 7,22 13,5 < LD 1,35 3,49 0,24*
20J 11,5 3,83 < LD < LD 1,78 < LD
21J 10,1 14,6 < LD 1,74 1,57 < LD
22J 3,21 5,20 < LD < LD 1,18 0,18*
23J 5,29 3,22 0,34* < LD 3,80 < LD
24J 6,02 12,2 0,34* 1,17 1,82 < LD
1C 8,28 9,46 < LD 0,49* 1,34 0,62
2C 6,42 6,71 < LD 0,60 0,69 0,50*
3C 8,84 21,33 < LD 1,74 0,57 0,18*
4C 5,12 3,91 0,29* 1,82 0,89 0,77
Crianza
5C 15,3 0,66 < LD < LD 1,20 0,29*
Cosecha
6C 5,38 8,23 < LD 0,72 0,34* < LD
2004
7C 11,1 5,36 < LD 0,50 < LD 0,39*
8C 5,48 4,91 < LD 0,23* < LD < LD
9C 7,07 6,18 < LD 0,56 < LD < LD
10C 5,45 4,26 < LD 0,18* < LD < LD
Tabla 59: Concentraciones de las 6 ocratoxinas en muestras de vino tinto tradicional de
Navarra. *Valor entre límite de detección (LD) y de cuantificación (LC).
- 141 -
Los datos medios agrupados por año y ocratoxina se muestran en la

tabla 60.
OTB (ng·L-1) OTA (ng·L-1)

2006 2007 2004 2006 2007 2004
+/Total 7/7 15/15 10/10 7/7 15/15 10/10
% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
Intervalo 4,10 - 20,1 3,21 - 22,8 5,12 - 15,4 0,49 - 44,8 3,22 - 15,9 0,66 - 21,3
Media 11,0 9,22 7,85 18,1 8,22 7,10
Mediana 7,96 7,22 6,74 6,56 6,02 5,77
Sig. Asint. 0,758 0,963
MeOTA (ng·L-1) OTC (ng·L-1)

2006 2007 2004 2006 2007 2004
+/Total 1/7 9/15 1/10 6/7 10/15 9/10
% 14,3% 60% 10% 85,7% 66,6% 90%
Intervalo < LD - 0,37 < LD - 0,78 < LD - 0,29 < LD - 3,69 < LD - 2,84 < LD - 1,82
Media - 0,67 - 2,94 1,46 0,99
Mediana < LD 0,32* < LD 0,38* 0,68 0,53
Sig. Asint. p < 0,001 0,909
MeOTB (ng·L-1) EtOTB (ng·L-1)

2006 2007 2004 2006 2007 2004
+/Total 7/7 15/15 6/10 3/7 4/15 6/10
% 100% 100% 60% 42,9% 26,6% 60%
Intervalo 0,79 - 2,81 0,54 - 8,98 < LD - 1,34 < LD - 0,57 < LD - 0,65 < LD - 0,77
Media 1,40 2,53 0,94 0,57 0,63 0,70
Mediana 1,07 1,74 0,45* < LD < LD 0,24*
Sig. Asint. p < 0,001 0,562
Tabla 60: Resultados obtenidos de cada ocratoxina en 3 años diferentes de cosecha.
*Valor entre LD y LC. +: valores > LD. Media: valores > LC. Mediana: todos los valores, si
<LD, LD/2 (ng·L-1).
El test no paramétrico de Kruskal-Wallis para muestras

independientes revela que no hay diferencias significativas (p > 0,05)
entre las concentraciones de OTB, OTA, OTC y EtOTB encontradas para
los vinos tintos de la cosecha 2006 y 2007, ni tampoco con los crianzas
del 2004.
- 142 -
Con respecto a los metil ésteres de la ocratoxina A y B, las

diferencias son altamente significativas (p < 0,001). Para ambas
micotoxinas, no hay diferencias entre las concentraciones de vinos
jóvenes, sin embargo los niveles en los vinos de crianza son
estadísticamente menores que los obtenidos para vinos jóvenes, según
el test a posteriori de comparaciones múltiples DMS (tablas 61 y 62).
Z Test DMS para MeOTA

P asint.
2006 2007 2004

2006 0,2149 0,0377
2007 1,240 0,0001
2004 2,078 3,899
Tabla 61: Test a posteriori de comparaciones múltiples DMS para MeOTA.
Z Test DMS para MeOTB

P asint.
2006 2007 2004

2006 0,1847 0,0378
2007 1,326 0,0002
2004 1,897 3,777
Tabla 62: Test a posteriori de comparaciones múltiples DMS para MeOTB.
VINOS DE AGRICULTURA ECOLÓGICA
Se han analizado 16 vinos tintos certificados como producto

ecológico por el CPAEN (Consejo de la Producción Agraria Ecológica de
Navarra) para evaluar si las prácticas ecológicas tienen alguna influencia
en los niveles de ocratoxinas en vinos. Los resultados pueden
observarse en la tabla 63.
- 143 -
Código OTB OTA MeOTA OTC MeOTB EtOTB
1-EC-2007 5,78 7,06 0,38* 0,66 1,58 0,22*
2-EC-2007 24,2 63,0 0,37* 4,75 1,20 0,32*
2-EC-2007b 41,5 142 0,33* 14,3 0,72 0,98
Joven
3-EC-2007 10,1 1,49 < LD < LD 0,67 < LD
Cosecha
4-EC-2007 5,62 4,17 < LD 0,42* 0,60 < LD
2007
5-EC-2007 4,09 2,37 0,88 0,29* 0,40* 0,19*
6-EC-2007 9,37 0,60 4,27 < LD 0,29* < LD
7-EC-2007 7,80 1,24 0,38* < LD 0,62 < LD
1-EC-2008 5,45 4,89 0,45* 0,40* 1,17 0,34*
2-EC-2008 44,3 127 < LD 10,1 0,34* 1,24
3-EC-2008 3,53 0,85 < LD < LD 0,41* < LD
Joven
4-EC-2008 4,44 3,31 < LD 0,17* 0,44* 0,25*
Cosecha
5-EC-2008 4,36 3,83 < LD < LD 0,27* < LD
2008
6-EC-2008 4,00 1,80 < LD < LD 0,46* < LD
7-EC-2008 3,08 1,00 < LD < LD 0,88 < LD
8-EC-2008 4,13 1,19 < LD < LD 0,40* < LD
Tabla 63: Concentraciones de las 6 ocratoxinas en muestras de vino tinto de agricultura
ecológica de Navarra. *Valor entre LD y LC.
Los datos medios agrupados por año y ocratoxina se muestran en la

tabla 64. El test no paramétrico de U de Mann-Whitney indicó que solo
las concentraciones de OTB y MeOTA son significativamente diferentes
entre las cosechas de 2007 y 2008 (p<0,05).
OTB (ng·L-1) OTA (ng·L-1) MeOTA (ng·L-1)

2007 2008 2007 2008 2007 2008
+/Total 8/8 8/8 8/8 8/8 6/8 1/8
% 100% 100% 100% 100% 75% 12,5%
Intervalo 4,09-41,5 3,08-44,3 0,60-142 0,85-127 <LD-4,27 <LD-0,45*
Media 13,6 9,16 27,8 18,0 2,57 -
Mediana 8,59 4,24 3,27 2,56 0,37* < LD
Sig. Exacta p < 0,05 p > 0,10 p < 0,01
OTC (ng·L-1) MeOTB (ng·L-1) EtOTB (ng·L-1)
2007 2008 2007 2008 2007 2008
+/Total 5/8 3/8 8/8 8/8 4/8 3/8
% 62,5% 37,5% 100% 100% 50% 37,5%
Intervalo <LD-14,3 <LD-10,1 0,29-1,58 0,27-1,17 <LD-0,98 <LD-1,24
Media 6,56 10,1 0,90 1,02 0,98 1,24
Mediana 0,36* < LD 0,64 0,43* 0,18* < LD
Sig. Exacta p > 0,10 p > 0,10 p > 0,10
Tabla 64: Resultados obtenidos de cada ocratoxina en las cosechas 2007 y 2008. *Valor
entre LD y LC. +: valores > LD. Media: valores > LC. Mediana: todos los valores, si <LD,
LD/2 (ng·L-1).
- 144 -
PRESENCIA SIMULTÁNEA DE OCRATOXINAS EN

VINOS NAVARROS
En este estudio ha quedado demostrada la presencia simultánea de

varias ocratoxinas en el vino. Considerando los resultados obtenidos de
los 51 vinos navarros, tanto tradicionales como ecológicos, la OTA
aparece conjuntamente con la OTB en el 100% de las muestras. En el
71% de las muestras, ambas aparecen además junto a la OTC. En
algunas de ellas aparecen 2 o 3 de los ésteres estudiados.
En 10 vinos de los 51 analizados hay niveles de 3 ocratoxinas por

encima del límite de detección, 4 aparecen en 16 vinos, 5 en 16, y las
seis estudiadas aparecen juntas en 9. Los porcentajes se indican en la
figura 47.
Figura 47: Porcentaje de aparición simultánea de varias ocratoxinas en el vino tinto.
- 145 -
INFLUENCIA DEL TIPO DE AGRICULTURA EN LA

PRESENCIA DE OCRATOXINAS
Las concentraciones de ocratoxinas en los vinos navarros han sido

comparadas con el test no paramétrico U de Mann-Whitney para
observar si existen diferencias entre las concentraciones obtenidas en
los vinos de agricultura tradicional y los elaborados con prácticas
ecológicas. Los resultados se muestran en la tabla 65.
OTB (ng·L-1)
Tradicional Ecológico Total
+/Total 35/35 16/16 51/51
% 100% 100% 100%
Intervalo 3,21 - 70,0 3,08 - 44,3 3,08 - 70,0
Media 11,0 11,4 11,1
Mediana 7,96 5,54 7,17
P asintótica 0,113 -
OTA (ng·L-1)
+/Total 35/35 16/16 51/51
% 100% 100% 100%
Intervalo 0,49 - 94,9 0,60 - 142 0,49 - 142
Media 12,7 22,9 15,9
Mediana 6,18 2,84 5,30
MeOTA (ng·L-1)
+/Total 14/35 7/16 21/51
% 40,0% 43,8% 41,2%
Intervalo < LD - 0,95 <LD - 4,27 < LD - 4,27
Media 0,84 2,57 1,34
Mediana < LD < LD < LD
OTC (ng·L-1)
+/Total 28/35 8/16 36/51
% 80,0% 50,0% 70,6%
Media 1,70 7,44 2,63
Mediana 0,58 < LD 0,42*
Tabla 65: Concentraciones de ocratoxinas en vinos tradicionales y ecológicos. *Valor entre
LD y LC. +: valores > LD. Media: valores > LC. Mediana: todos los valores, si <LD, LD/2.
- 146 -
MeOTB (ng·L-1)
+/Total 31/35 16/16 47/51
% 88,6% 100% 92,2%
Intervalo < LD - 8,98 <LC - 1,58 < LD - 8,98
Media 1,90 0,93 1,70
Mediana 1,20 0,53 1,00
EtOTB (ng·L-1)
+/Total 15/35 7/16 22/51
% 42,9% 43,8% 43,1%
Media 1,00 1,11 1,03
Mediana < LD < LD < LD
Tabla 65 cont.: Concentraciones de ocratoxinas en vinos tradicionales y ecológicos.
*Valor entre LD y LC. +: valores > LD. Media: valores > LC. Mediana: todos los valores, si
<LD, LD/2.
Las concentraciones medianas de OTA y MeOTB son

estadísticamente menores en los vinos de agricultura ecológica que en
los vinos de viticultura tradicional. Para otras ocratoxinas no se observa
diferencias significativas entre ambos tipos de cultivo.
Considerando la presencia global de las 6 ocratoxinas presentes en

el vino, se observan diferencias significativas entre ambos tipos de
cultivo (tabla 66), obteniéndose valores de mediana menores para el
cultivo ecológico.
Concentraciones totales de ocratoxinas (ng·L-1)

Intervalo 6,71 - 174 5,11 - 200 5,11 - 200
Media 26,6 37,7 30,1
Mediana 17,8 10,7 15,7
Tabla 66: Concentraciones totales de ocratoxinas presentes en cada tipo de vino.
- 147 -
INGESTA DE OTA Y OCRATOXINAS A PARTIR DE

VINO TINTO NAVARRO
La ingesta semanal de OTA y de la suma total de ocratoxinas se ha

calculado teniendo en cuenta el consumo de vino con D.O. por la
población total (24,2 mL·día-1 y 70,2 kg de peso corporal medio) y el
realizado a través de un consumo saludable, típico de la dieta
mediterránea (360 mL·día-1 y 76,8 kg para hombres, y 240 mL·día-1 y
64,2 kg para mujeres). Se ha considerado esta diferenciación en el
consumo con el objetivo de realizar una estimación de la ingesta más
adecuada, como se recomienda en el informe SCOOP (2002). El
consumo de vino por la población total se ha encontrado en la página
web del Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (MARM,
2009). Para el volumen de consumo saludable de vino se ha considerado
el recomendado por la Fundación para la Investigación del Vino y
Nutrición (FIVIN, 2008). Los pesos medios de la población total,
hombres y mujeres se han encontrado en la página web del Instituto
Nacional de Estadística (www.ine.es).
En la tabla 67 se muestran los resultados calculados para las

concentraciones media y máxima de OTA obtenidas de los 51 vinos con
D.O. Navarra (15,9 y 142 ng·L-1, respectivamente) y de la suma total de
las 6 ocratoxinas (OTs) (30,1 y 200 ng·L-1, respectivamente).
Consumidores
Población total
Hombres Mujeres
OTA OTs OTA OTs OTA OTs
C max 4,70 6,61 3,70 5,22 0,34 0,48
C media 0,53 1,00 0,42 0,79 0,04 0,07
Tabla 67: Ingesta semanal de OTA y OTs (ng·kg p.c. -1·semana-1).
- 148 -
RELACIÓN ENTRE LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS
El hecho de que todas las muestras analizadas contengan 3, 4, 5 o

6 ocratoxinas plantea la hipótesis de que pueda existir una relación
entre su presencia.
Se ha realizado un test de correlación para los siguientes pares de

ocratoxinas OTA-OTB, OTA-OTC, OTB-EtOTB, con los niveles de
concentración encontrados para las 51 muestras de vino navarro. Los
gráficos de dispersión junto con el estadístico no paramétrico rho de
Spearman se muestran en las siguientes figuras y tablas:
160
140
120
Ocratoxina A (ng·L -1)
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
-1
Ocratoxina B (ng·L )
Figura 48: Gráfico de dispersión de la concentración de OTA frente a OTB.
Correlación de Spearman
IC95%
rS Sig N L. Inf L. Sup.
0,561 < 0,001 51 0,338 0,725
Tabla 68: Estadísticos de correlación OTA-OTB.
- 149 -
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
-1
Ocratoxina C (ng·L )
Figura 49: Gráfico de dispersión de la concentración de OTA frente a OTC.
IC95%
0,849 < 0,001 51 0,749 0,912
Tabla 69: Estadísticos de correlación OTA-OTC.
80
70
60
Ocratoxina B (ng·L-1)
50
40
30
20
10
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
-1
Etilocratoxina B (ng·L )
Figura 50: Gráfico de dispersión de la concentración de OTB frente a EtOTB.
- 150 -
IC95%
0,427 0,002 51 0,172 0,629
Tabla 70: Estadísticos de correlación OTB-EtOTB.
La probabilidad obtenida de todos los test (p < 0,01) indica una

muy significativa correlación positiva entre todas las variables. El valor
del coeficiente de correlación entre las concentraciones OTA-OTB
muestra una asociación grande entre ambas variables. Para OTA-OTC la
relación es muy elevada y es moderada en el caso de la OTB-EtOTB.
OCRATOXINAS Y CLIMA
Los coeficientes de correlación de Spearman obtenidos entre los

datos climatológicos (temperatura media, humedad relativa media y
precipitación) y las concentraciones de cada ocratoxina, se muestran en
la tabla siguiente:
OTB OTA MeOTA OTC MeOTB EtOTB

Temperatura ns 0,367 ns 0,451 ns ns
Humedad ns -0,415 -0,356 -0,385 -0,346 ns
Precipitación ns -0,301 -0,498 ns -0,337 ns
Tabla 71: Coeficientes de correlación de Spearman entre las concentraciones de cada
ocratoxina y los datos climatológicos.
Las concentraciones de ocratoxina A y C tienen una asociación

positiva moderada con la temperatura media de los meses de julio y
agosto, mientras que no existe relación para los metil ésteres. La
correlación es negativa para la humedad y las concentraciones de OTA,
MeOTA, OTC y MeOTB. También es negativa para la precipitación en el
caso de OTA, MeOTA y MeOTB. La ocratoxina B y su etil éster no
muestran asociación con los datos climatológicos.
- 151 -
RESULTADOS: Ocratoxinas en vinos de países mediterráneos
5. OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES

MEDITERRÁNEOS
Las concentraciones de las 6 ocratoxinas obtenidas del análisis de
vinos tintos de países mediterráneos se muestran en las siguientes
tablas.
VINOS DE ESPAÑA
De los 12 vinos de Cataluña analizados, en 8 (66,7%) aparecen las

6 ocratoxinas de manera simultánea, en 3 (25%) están presentes 5 y en
1 muestra (8,3%) aparecen 4 (tabla 72).
1-CA-XXXX 25,3 46,5 0,89 2,47 1,93 0,61
2-CA-XXXX 31,2 97,5 1,42 7,49 0,99 1,07
7-CA-2006 48,5 104 < LD 14,3 0,99 2,49
3-CA-2007 24,3 56,5 0,61 3,39 2,38 0,92
4-CA-2007 10,8 18,2 0,64 1,13 0,98 0,40*
5-CA-2007 13,9 32,1 0,38* 3,63 0,74 0,54
6-CA-2008 33,7 63,8 2,14 4,87 2,01 1,10
8-CA-2008 8,41 8,61 0,27* 0,58 0,50 0,26*
9-CA-2008 3,78 4,52 < LD 0,39* 0,47* 0,43*
10-CA-2008 6,29 7,05 0,69 0,73 0,34* 0,34*
12-CA-2008 4,66 6,45 1,15 0,73 3,34 < LD
11-CA-2009 5,26 1,05 < LD < LD 0,59 0,30*
Tabla 72: Concentraciones de ocratoxinas en vinos catalanes. *Valor entre LD y LC.
VINOS DE FRANCIA
Las 6 ocratoxinas aparecen de manera simultánea en 3 vinos tintos

franceses (25%), 2 muestras tienen 5 (16,7%), tres vinos presentan 4 y
3 ocratoxinas respectivamente (25%) y en 1 muestra (8,3%) aparecen
solo 2 (tabla 73).
- 153 -
1-FR-2006 9,03 0,89 < LD 1,86 0,55 < LD
9-FR-2006 6,28 0,42* < LD < LD 0,88 < LD
11-FR-2006 2,05 0,25* < LD < LD 0,61 0,29*
12-FR-2007 6,94 6,24 0,69 0,51 1,91 1,31
2-FR-2007 10,0 0,20* < LD 1,25 < LD < LD
3-FR-2007 29,4 66,8 0,42* 5,54 0,62 0,71
4-FR-2007 39,01 88,3 0,61 7,33 1,45 0,88
5-FR-2007 14,9 29,4 < LD 2,58 0,28 0,33*
6-FR-2008 25,5 58,1 0,46* 5,17 < LD 0,64
10-FR-2008 8,03 < LD 2,37 < LD < LD < LD
7-FR-2009 2,41 0,72 0,46* < LD < LD < LD
8-FR-2009 6,53 18,30 0,34* 0,68 < LD < LD
Tabla 73: Concentraciones de ocratoxinas en vinos franceses. *Valor entre LD y LC.
VINOS DE ITALIA
En los vinos italianos, las 6 ocratoxinas aparecen de manera

simultánea en 5 vinos (41,7%), el resto de las muestras (58,3%) están
contaminadas por al menos cinco (tabla 74).
1-IT-XXXX 11,7 20,6 < LD 2,57 4,01 0,64
2-IT-2005 119 286 41,4 23,5 2,85 4,20
10-IT-2005 6,60 7,24 < LD 0,91 1,04 0,23*
11-IT-2005 8,28 15,4 0,31* 1,53 1,88 < LD
12-IT-2006 11,7 30,4 0,27* 3,22 1,22 < LD
3-IT-2006 18,5 36,4 0,79 4,19 2,11 0,80
4-IT-2007 3,12 6,59 0,34* 3,29 1,36 0,22*
5-IT-2007 3,98 5,18 0,48* 1,53 1,94 < LD
7-IT-2007 24,8 81,0 35,2 4,18 4,25 0,59
8-IT-2007 46,8 121 48,2 8,86 1,07 0,94
6-IT-2008 8,45 19,4 0,45* 5,75 1,66 < LD
9-IT-2008 6,76 17,0 < LD 1,57 1,52 0,28*
Tabla 74: Concentraciones de ocratoxinas en vinos italianos. *Valor entre LD y LC.
- 154 -
VINOS DE CROACIA
Solo en un vino croata (8,3%) están presentes las 6 ocratoxinas de

manera simultánea. En 6 muestras (50%) aparecen 5, en 1 (8,3%)
cuatro y en 4 vinos (33,3%) hay al menos 3 ocratoxinas (tabla 75).
Croacia OTB OTA MeOTA OTC MeOTB EtOTB
1-CR-2004 27,0 37,6 < LD 3,01 3,32 2,33
2-CR-2004 2,60 1,70 < LD < LD 0,90 < LD
3-CR-2005 15,2 33,4 0,28* 2,63 0,70 0,76
4-CR-2005 26,3 61,3 < LD 2,97 0,45* 0,82
5-CR-2006 5,01 2,46 0,59 < LD 1,55 0,73
6-CR-2006 13,0 13,3 < LD 0,99 0,29* 0,84
7-CR-2006 4,13 4,88 < LD < LD < LD 0,44*
8-CR-2006 4,88 8,84 < LD 0,92 < LD 0,38*
9-CR-2007 7,85 18,2 < LD 0,88 0,30* 0,80
10-CR-2007 4,39 0,36* < LD < LD < LD 0,18*
11-CR-2008 3,83 6,47 < LD 0,59 0,29* 0,17*
12-CR-2008 3,63 0,40* < LD < LD < LD 0,37*
Tabla 75: Concentraciones de ocratoxinas en vinos croatas. *Valor entre LD y LC.
VINOS DE GRECIA
Las 6 ocratoxinas aparecen de manera simultánea en 10 vinos

tintos griegos (83,3%), y dos muestras (16,7%) están contaminadas
por al menos cinco (tabla 76).
- 155 -
7-GR-XXXX 69,8 212 0,69 23,5 2,44 1,81
8-GR-2003 6,28 4,35 0,68 1,09 0,85 0,26*
9-GR-2004 58,3 174 0,64 20,0 1,10 1,13
10-GR-2004 27,9 49,3 0,44* 4,86 0,29* 0,82
11-GR-2004 8,19 8,29 < LD 1,07 0,40* 0,21*
12-GR-2005 55,9 115,2 0,83 9,58 1,04 0,68
1-GR-2007 19,8 16,8 0,44* 1,15 3,64 0,26*
2-GR-2007 40,5 26,3 0,53 2,59 0,61 0,71
3-GR-2007 23,8 42,5 < LD 3,35 1,58 0,55
4-GR-2007 13,6 37,1 0,31* 3,24 0,57 0,42*
5-GR-2007 8,39 7,93 1,33 0,53 1,07 0,21*
6-GR-2007 9,63 18,8 0,35* 1,50 1,39 0,57
Tabla 76: Concentraciones de ocratoxinas en vinos griegos. *Valor entre LD y LC.
VINOS DE TURQUÍA
En 5 muestras de vino turco (41,7%) aparecen de manera

simultánea las 6 ocratoxinas y 5 están presentes en el resto de las
muestras (58,3%) (tabla 77).
1-TUR-2003 10,4 28,8 0,60 2,24 4,30 3,04
2-TUR-2003 50,3 101 < LD 11,2 0,72 1,99
3-TUR-2005 13,0 52,6 < LD 4,47 0,74 0,88
4-TUR-2005 22,4 62,8 0,27* 6,08 1,46 1,13
5-TUR-2005 5,15 13,7 < LD 0,90 0,70 0,38*
6-TUR-2005 22,6 27,3 < LD 3,21 1,49 0,70
7-TUR-2005 3,50 10,0 < LD 0,90 0,48* 0,19*
8-TUR-2005 6,53 13,5 < LD 1,07 0,81 0,27*
9-TUR-2006 2,06 3,22 1,03 0,27* 1,47 1,26
10-TUR-2006 13,0 48,4 < LD 5,69 1,07 0,40*
11-TUR-2007 6,99 9,45 0,79 0,58 0,97 2,16
12-TUR-2007 3,19 2,91 0,55 0,29* 1,45 1,00
Tabla 77: Concentraciones de ocratoxinas en vinos turcos. *Valor entre LD y LC.
- 156 -
VINOS DE ISRAEL
Ocho muestras de vino israelí (66,7%) están contaminadas con las

6 ocratoxinas estudiadas, y en 4 vinos (33,3%) aparecen 5 (tabla 78).
1-IS-2006 15,8 7,33 1,35 0,98 3,18 2,24
2-IS-2006 12,7 3,63 0,79 0,43* 2,24 < LD
3-IS-2006 22,4 11,0 2,26 1,16 8,11 0,64
4-IS-2007 26,2 49,3 1,77 3,99 3,06 0,89
5-IS-2008 43,8 65,4 2,52 4,41 5,02 < LD
6-IS-2008 13,3 14,6 2,29 1,11 2,28 0,39*
7-IS-2008 7,17 4,64 0,97 0,40* 2,89 < LD
8-IS-2008 21,9 13,4 3,64 1,60 4,74 0,39
12-IS-2008 17,4 7,69 2,88 0,84 2,97 2,65
9-IS-2009 16,3 23,1 1,69 2,39 1,86 0,63
10-IS-2009 19,9 9,69 0,56 1,39 0,40* 0,17*
11-IS-2009 11,4 12,5 1,16 1,24 0,89 < LD
Tabla 78: Concentraciones de ocratoxinas en vinos israelíes. *Valor entre LD y LC.
VINOS DEL NORTE DE ÁFRICA
Las 6 ocratoxinas aparecen juntas en 3 vinos tintos de Argelia y

Túnez (25%), 5 muestras tienen 5 (41,7%), y cuatro vinos presentan 4
ocratoxinas (33,3%) (tabla 79).
1-TU-XXXX 92,7 455 < LD 31,5 < LD 2,66
2-TU-XXXX 45,5 110 < LD 10,6 0,45* 1,16
3-TU-XXXX 75,7 255 0,30* 17,1 4,56 2,39
1-AR-XXXX 64,3 152 0,45* 10,3 < LD 1,46
7-AR-XXXX 36,6 84,4 < LD 5,92 1,26 1,60
2-AR-1998 45,3 101 < LD 12,6 < LD 1,60
3-AR-2004 65,8 180 < LD 14,8 < LD 1,86
4-TU-2005 79,2 326 0,71 22,7 1,82 3,08
5-TU-2006 43,3 181 0,30* 12,3 2,75 1,52
4-AR-2006 87,2 235 < LD 15,6 < LD 2,27
5-AR-2006 61,1 162 0,39* 9,21 < LD 2,03
6-AR-2008 70,1 101 0,60 8,17 < LD 1,68
Tabla 79: Concentraciones de ocratoxinas en vinos argelinos (AR) y de Túnez (TU). *Valor
entre LD y LC.
- 157 -

Teniendo en cuenta las 96 muestras analizadas, los porcentajes de

la presencia simultánea de ocratoxinas en vino tinto se muestran en la
figura 51. Las 6 ocratoxinas estudiadas aparecen juntas en 43 vinos, 5
de ellas aparecen en 36 muestras, en 9 vinos están presentes 4, en 7
aparecen 3 y en una única muestra solo hay dos ocratoxinas.
Figura 51: Presencia simultánea de ocratoxinas en 96 muestras de vino tinto de países

mediterráneos.
Las concentraciones de ocratoxinas (ng·L-1) obtenidas para los 96

vinos tintos de países mediterráneos en conjunto se muestran en la
tabla 80.

+/Total 96/96 95/96 60/96 86/96 80/96 80/96
% 100% 99,0% 62,5% 89,6% 83,3% 83,3%
-1
Min (ng·L ) 2,05 < LD < LD < LD < LD < LD
Max (ng·L-1) 119 455 48,2 31,5 8,11 4,20
-1
Media (ng·L ) 23,5 54,2 4,22 5,20 1,85 1,37
Mediana (ng·L-1) 13,4 19,1 0,38 2,32 0,99 0,62
Tabla 80: Resumen de las concentraciones de ocratoxinas encontradas en los vinos de
países mediterráneos. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los valores, si
<LD, LD/2.
- 158 -
INFLUENCIA DEL PAÍS DE ORIGEN EN LA

Las concentraciones de cada ocratoxina, agrupadas por países se

muestran en las siguientes tablas. Se dan el número de muestras con
concentraciones superiores al LD, su porcentaje, los valores mínimos y
máximos encontrados en cada país y las concentraciones media y
mediana calculadas. Se ha utilizado el test de Kruskal Wallis para
comparar las medianas de cada país y el test a posteriori de
comparaciones múltiples de Bonferroni para detectar el origen de las
diferencias (nº de comparaciones = 28).
- Ocratoxina B
OTB (ng·L-1)
España Francia Italia Croacia Grecia Turquía Israel N.África
+/Total 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12
% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
Min 3,78 2,05 3,12 2,60 6,28 2,06 7,17 36,6
Max 48,5 39,1 119 27,0 69,8 50,3 43,8 92,7
Media 18,0 13,4 22,5 9,82 28,5 13,3 19,0 63,9
Mediana 12,4 8,53 10,1 4,95 21,8 8,71 16,8 65,1
Tabla 81: Resumen de las concentraciones de OTB encontradas en 8 países mediterráneos.
+: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los valores, si <LD, LD/2.
Todos los vinos mediterráneos analizados están contaminados con

ocratoxina B (tabla 81). El mayor valor encontrado (119 ng·L-1)
corresponde a una muestra italiana de la región de Calabria, al sur del
país. El menor valor de concentración se ha encontrado en un vino
francés. Los vinos croatas son los menos contaminados por esta
micotoxina, ya que poseen las menores media y mediana.
Por países, la concentración mediana de OTB sigue el orden:

Croacia < Francia ≈ Turquía < Italia < España < Israel < Grecia < Norte
de África. Solo los vinos de Túnez y Argelia muestran diferencias
- 159 -
significativas con respecto a los demás, según el test de Kruskal-Wallis

(p<0,001) y el test de Bonferroni (tabla 82).
Z
Test de Bonferroni para OTB
P asint.
España Francia Italia Croacia Grecia Turquía Israel N. África
España 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0002
Francia 0,635 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0000
Italia 0,231 0,577 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0184
Croacia 1,732 0,924 1,270 0,1264 1,0000 0,4058 0,0000
Grecia 1,155 1,935 1,386 2,771 0,9308 1,0000 0,0184
Turquía 1,097 0,144 0,635 0,462 2,136 1,0000 0,0002
Israel 0,693 1,905 1,443 2,425 0,577 1,905 0,0001
N. África 3,926 4,099 3,233 4,157 3,233 3,926 4,041
Tabla 82: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para OTB.
- Ocratoxina A
OTA (ng·L-1)
+/Total 12/12 11/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12
% 100% 91,7% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
Min 1,05 <LD 5,18 0,36* 4,35 2,91 3,63 84,4
Max 104 88,3 286 61,3 212 101 65,4 455
Media 37,2 33,6 53,9 18,8 59,4 31,1 18,5 195
Mediana 25,1 3,56 20,0 7,65 31,7 20,5 11,7 171
Tabla 83: Resumen de las concentraciones de OTA encontradas en 8 países mediterráneos.
El 99% de los vinos mediterráneos analizados contienen ocratoxina

A con niveles por encima del límite de detección (>0,16 ng·L -1). Solo un
vino francés de D.O. Beaujolais no presenta OTA. El mayor valor
encontrado (455 ng·L-1) corresponde a una muestra de Túnez. Ningún
vino ha superado el límite máximo permitido por la UE de 2 µg·L -1 para
la ocratoxina A en vino (tabla 83).
Por países, la concentración mediana de OTA sigue el orden:

Francia < Croacia < Israel < Italia ≈ Turquía < España < Grecia < Norte
- 160 -
de África. Sin embargo, solo los vinos de Túnez y Argelia muestran

diferencias significativas con respecto a los demás, según el Test de
Kruskal-Wallis (p<0,001) y el test de de Bonferroni (tabla 84).
Z
Test de Bonferroni para OTA
P asint.
España 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0002
Francia 1,674 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0000
Italia 0,346 1,790 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0104
Croacia 1,559 0,462 1,963 0,7958 1,0000 1,0000 0,0000
Grecia 0,693 1,963 0,520 2,194 1,0000 1,0000 0,0312
Turquía 0,115 1,386 0,520 1,732 0,751 1,0000 0,0000
Israel 0,693 0,924 1,501 0,981 1,848 0,981 0,0000
N. África 3,926 4,099 3,349 4,157 3,118 4,099 4,157
Tabla 84: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para OTA.
- Metilocratoxina A
MeOTA (ng·L-1)
+/Total 9/12 7/12 9/12 2/12 10/12 5/12 12/12 6/12
% 75,0% 58,3% 75,0% 16,7% 83,3% 41,7% 100% 50,0%
Min <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,56 <LD
Max 2,14 2,37 48,2 0,59 1,33 1,03 3,64 0,71
Media 1,08 1,22 31,4 0,59 0,78 0,74 1,82 0,66
Mediana 0,63 0,38* 0,40* <LD 0,48* <LD 1,73 0,28*
Tabla 85: Resumen de las concentraciones de MeOTA de los 8 países mediterráneos.
*Valor entre LD y LC. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los valores, si
<LD, LD/2.
El 62,5% de los vinos presentan MeOTA por encima de 0,27 ng·L -1.
El mayor valor (48,2 ng·L-1) corresponde a una muestra italiana con
Indicación Geográfica Típica (IGT) de Salento, en la región de Apulia.
Croacia y Turquía son los países menos contaminados por esta

micotoxina, cuyas concentraciones medianas están por debajo del límite
de detección. Con concentraciones muy bajas, les siguen los vinos del
Norte de África, Francia, Italia, Grecia, España e Israel. Según el test de
- 161 -
Bonferroni, los vinos croatas presentan diferencias significativas con

respecto a los de Italia, Grecia e Israel. Y la concentración de MeOTA de
los vinos israelíes es estadísticamente diferente a la obtenida en
Croacia, Turquía, Norte de África, Francia y Grecia (tabla 86).
Z
Test de Bonferroni para MeOTA
P asint.
España 1,0000 1,0000 0,1380 1,0000 1,0000 0,5120 1,0000
Francia 0,983 1,0000 0,0512 1,0000 1,0000 0,0040 1,0000
Italia 0,058 0,809 0,0240 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000
Croacia 3,416 3,118 3,266 0,0200 1,0000 0,0000 1,0000
Grecia 0,231 1,214 0,260 3,737 1,0000 0,0020 0,6772
Turquía 1,856 1,074 1,624 2,046 1,939 0,0004 1,0000
Israel 3,002 3,523 1,992 4,210 3,638 3,849 0,0001
N. África 1,914 1,161 1,711 2,140 2,229 0,000 4,051
Tabla 86: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para MeOTA.
- Ocratoxina C
OTC (ng·L-1)
+/Total 11/12 8/12 12/12 7/12 12/12 12/12 12/12 12/12
% 91,7% 66,7% 100% 58,3% 100% 100% 100% 100%
Min <LD <LD 0,91 <LD 0,53 0,27* 0,40* 5,92
Max 14,3 7,33 23,5 3,01 23,5 11,2 4,41 31,5
Media 3,93 3,12 5,09 1,71 6,04 3,63 1,91 14,2
Mediana 1,80 0,97 3,26 0,74 2,92 1,66 1,20 12,5
Tabla 87: Resumen de las concentraciones de OTC encontradas en 8 países mediterráneos.
El 89,6% de los 96 vinos analizados están contaminados con OTC.

Un vino tinto de Túnez presenta el mayor valor de 31,5 ng·L -1
(tabla 87). Las concentraciones obtenidas para los vinos del Norte de
África son estadísticamente diferentes a las demás, que siguen el orden
creciente: Croacia < Francia < Israel < Turquía ≈ Cataluña < Grecia <
Italia < Norte de África. La concentración de OTC de los vinos croatas
difiere además de los vinos italianos (tabla 88).
- 162 -
Z
Test de Bonferroni para OTC
P asint.
España 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0014
Francia 0,810 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0000
Italia 1,328 1,968 0,0240 1,0000 1,0000 0,3386 0,0077
Croacia 1,620 0,588 3,183 0,0816 1,0000 1,0000 0,0000
Grecia 0,982 1,736 0,404 2,893 1,0000 1,0000 0,0264
Turquía 0,029 1,100 1,328 2,026 1,184 1,0000 0,0006
Israel 0,289 0,347 2,483 1,736 1,674 0,404 0,0000
N. África 3,696 4,108 3,407 4,166 2,710 3,811 4,157
Tabla 88: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para OTC.
- Metilocratoxina B
MeOTB (ng·L-1)
+/Total 12/12 7/12 12/12 8/12 12/12 12/12 12/12 5/12
% 100% 58,3% 100% 66,7% 100% 100% 100% 41,7%
Min 0,34* <LD 1,04 <LD 0,29* 0,48* 0,40* <LD
Max 3,34 1,91 4,25 3,32 3,64 4,30 8,11 4,56
Media 1,45 0,90 2,07 1,62 1,43 1,38 3,38 2,60
Mediana 0,98 0,41* 1,77 0,30* 1,06 1,02 2,93 <LD
Tabla 89: Resumen de las concentraciones de MeOTB encontradas en 8 países
mediterráneos. *Valor entre LD y LC. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los
valores, si <LD, LD/2.
El 83,3% de los vinos presentan MeOTB por encima de 0,27 ng·L -1.
El valor más alto de 8,11 ng·L-1 se obtuvo en una muestra israelí de los
Altos del Golán (tabla 89).
Los vinos del norte de África, Croacia y Francia son los países
menos contaminados por MeOTB y muestran diferencias significativas
con respecto a los más contaminados, Italia e Israel (tabla 90).
- 163 -
Z
Test de Bonferroni para MeOTB
P asint.
España 0,5737 0,7958 0,3386 1,0000 1,0000 0,4058 1,0000
Francia 2,312 0,0040 1,0000 0,6772 0,1907 0,0020 1,0000
Italia 2,194 3,525 0,0139 0,5737 0,3380 1,0000 0,0405
Croacia 2,484 0,405 3,292 0,6772 0,2812 0,0139 1,0000
Grecia 0,231 2,225 2,310 2,254 1,0000 0,2322 1,0000
Turquía 0,260 2,630 2,454 2,513 0,318 0,1907 1,0000
Israel 2,425 3,640 1,617 3,292 2,570 2,656 0,0401
N. África 1,849 0,029 2,426 0,491 1,675 1,791 3,061
Tabla 90: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para MeOTB.
- Etilocratoxina B
EtOTB (ng·L-1)
+/Total 11/12 6/12 8/12 11/12 12/12 12/12 8/12 12/12
% 91,7% 50,0% 66,7% 91,7% 100% 100% 66,7% 100%
Min <LD <LD <LD <LD 0,21* 0,19* <LD 1,16
Max 2,49 1,31 4,20 2,33 1,81 3,04 2,65 3,08
Media 1,12 0,89 1,43 1,04 0,89 1,52 1,41 1,94
Mediana 0,49* 0,19* 0,26* 0,59 0,56 0,94 0,39* 1,77
Tabla 91: Resumen de las concentraciones de EtOTB encontradas en 8 países
mediterráneos. *Valor entre LD y LC. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos
los valores, si <LD, LD/2.
El 83,3% de los vinos presentan EtOTB por encima del límite de

detección (0,17 ng·L-1). El valor más alto de 4,20 ng·L-1 corresponde a
una muestra italiana de la región de Calabria (tabla 91).
Francia, Italia e Israel son los países menos contaminados por esta
micotoxina. Con concentraciones muy bajas, les siguen los vinos de
Cataluña, Grecia, Croacia y Turquía. Los vinos del Norte de África
presentan diferencias significativas con respecto a las concentraciones
de los seis primeros (tabla 92).
- 164 -
Z
Test de Bonferroni para EtOTB
P asint.
España 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0029
Francia 1,862 1,0000 1,0000 1,0000 0,2322 1,0000 0,0000
Italia 1,271 0,794 1,0000 1,0000 0,9308 1,0000 0,0056
Croacia 0,289 1,695 0,954 1,0000 1,0000 1,0000 0,0020
Grecia 0,116 1,601 1,098 0,029 1,0000 1,0000 0,0006
Turquía 1,180 2,590 2,137 1,588 1,473 1,0000 0,2322
Israel 0,867 0,979 0,029 0,695 0,925 1,734 0,0312
N. África 3,580 4,132 3,466 3,638 3,813 2,599 3,122
Tabla 92: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para EtOTB.
Se ha realizado un test de correlación para los pares de ocratoxinas

OTA-OTB, OTA-OTC y OTB-EtOTB, con los niveles de concentración
encontrados en las 96 muestras de vino tinto de países mediterráneos.
Los gráficos de dispersión junto con el estadístico no paramétrico r s de
Spearman se muestran en las siguientes figuras y tablas.
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Ocratoxina B (ng·L -1)

Figura 52: Gráfico de dispersión de la concentración de OTA frente a OTB.
- 165 -
IC95%
0,897 < 0,001 96 0,849 0,930
Tabla 93: Estadísticos de correlación OTA-OTB.
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Ocratoxina C (ng·L -1)

Figura 53: Gráfico de dispersión de la concentración de OTA frente a OTC.
IC95%
0,934 < 0,001 96 0,903 0,956
Tabla 94: Estadísticos de correlación OTA-OTC.
- 166 -
140
120
Ocratoxina B (ng·L -1)

100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5
Etilocratoxina B (ng·L -1)

Figura 54: Gráfico de dispersión de la concentración de OTB frente a EtOTB.
IC95%
0,648 < 0,001 96 0,515 0,751
Tabla 95: Estadísticos de correlación OTB-EtOTB.
Los valores del coeficiente de correlación de Spearman obtenidos

son superiores a los del estudio realizado para los vinos navarros,
posiblemente debido al mayor número de muestras. Las concentraciones
de OTA-OTB muestran una asociación muy elevada. Para OTA-OTC la
relación es prácticamente perfecta y es grande en el caso de la OTB-
EtOTB.
- 167 -
DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO

Li y col. propusieron un método para la síntesis de OTC y MeOTA

para utilizarlo como método de confirmación de OTA en muestras
biológicas o para la preparación de patrones de ambas ocratoxinas (Li y
col., 1998).
Estudiaron el porcentaje de conversión de OTA con respecto al

tiempo de incubación, la concentración de ácido clorhídrico, la
proporción disolvente:ácido y la influencia de usar etanol o metanol,
respectivamente. Concluyeron que la OTA se convertía al 100% en sus
ésteres con 48h de incubación de la síntesis, HCl 12M y una proporción
en volumen de metanol:ácido 20:1. Sin embargo, la síntesis cuantitativa
no pudo reproducirse en nuestro laboratorio.
La preparación posterior de las disoluciones patrón de trabajo con

las cuatro ocratoxinas, requiere que cada disolución madre contenga
únicamente la ocratoxina de interés (sin restos de OTA en el caso de los
ésteres sintetizados a partir de ella) para no alterar la concentración de
OTA en la disolución. Sin embargo, tras seguir el procedimiento descrito
por Li y col. para la síntesis de los ésteres de la OTA, se observó
presencia de esta ocratoxina en las disoluciones resultantes. Por esta
razón se necesitó realizar la purificación de la OTC y MeOTA
sintetizadas.
Se decidió emplear la técnica de la extracción líquido-líquido para la

separación de la OTA de sus ésteres. Para ello, era preciso elegir dos
disolventes inmiscibles entre sí y de los que uno de ellos debía
solubilizar la ocratoxina A y el otro retener los ésteres.
- 171 -
DISCUSIÓN
La solubilidad de la OTA en disoluciones acuosas de bicarbonato

sódico y carbonato potásico es conocida. Además, estos disolventes
habían sido utilizados en nuestro laboratorio para eliminar la OTA de la
cáscara de cacao (Amézqueta y col., 2008). Por estas razones, se
consideraron óptimos para ser empleados en la purificación.
Las propiedades de solubilidad de los ésteres de OTA no han sido

tan investigadas como las de la ocratoxina A; sin embargo, por los
mayores tiempos de retención de éstos en cromatografía en fase
reserva, se pudo deducir que su polaridad debía ser menor. Así, para su
extracción, se eligieron disolventes apolares no miscibles con las
soluciones acuosas de bicarbonato sódico y carbonato potásico.
El empleo de NaHCO3 (0,25 %) y diclorometano produjo una

separación completa de los ésteres y la OTA no reaccionante,
consiguiéndose así disoluciones de OTC y MeOTA en las que por
cromatografía de fluorescencia no se pudieron detectar niveles de OTA.
La concentración exacta de estas disoluciones pudo determinarse

por espectrofotometría empleando la Ley de Lambert-Beer, para lo que
se necesitó conocer el coeficiente de absortividad molar a una longitud
de onda característica y un disolvente determinado. Teniendo en cuenta,
que la OTC y MeOTA son compuestos poco estudiados hasta la fecha,
resultó difícil encontrar el coeficiente de estas micotoxinas en la
bibliografía.
Finalmente, se halló el valor de 7.000 M-1·cm-1 a 333 nm en etanol

para la ocratoxina C (Cole y col., 2003). La absorción a esta longitud de
onda se debe al grupo hidroxilo de la isocumarina (Steyn, 1971), por lo
que se asumió que la sustitución del grupo etilo del éster por un grupo
metilo no ofrecería cambios sustanciales en las propiedades ultravioleta-
visible de ambos compuestos. Así, se utilizó este valor para calcular las
- 172 -
DISCUSIÓN
concentraciones de las disoluciones madre tanto de OTC como de

MeOTA.
Inicialmente se utilizó acetonitrilo para la preparación de las

disoluciones estándar de trabajo de las 4 ocratoxinas. Se descartó
utilizar un alcohol, por ejemplo metanol, para evitar que la OTC pudiera
sufrir una transesterificación a MeOTA. Sin embargo, se observó que al
preparar las disoluciones en acetonitrilo, la concentración de OTA y OTB
era menor a la esperada, especialmente en la concentración más baja
preparada (4 µg·L-1).
Este hecho se advirtió en los cromatogramas debido a que, a una

misma concentración, los 4 compuestos presentan áreas similares y al
analizar la disolución de menor concentración en acetonitrilo, las áreas
de los picos de OTA y OTB eran mucho menores que las de MeOTA y
OTC. Además, las áreas de pico para OTA y OTB obtenidas al analizar
patrones de 4 µg·L-1 preparados por dilución de las disoluciones de 40 y
400 µg·L-1 no coincidían con las áreas del patrón de 4 µg·L-1 preparado
independientemente.
Este fenómeno no se observó al utilizar metanol como disolvente.

Esto, y el hecho de que fueran los compuestos ácidos y no los ésteres
los que vieran afectada su concentración, hizo suponer como posible
explicación, que los grupos hidroxilo del metanol podrían bloquear los
posibles lugares de unión del vidrio con la OTA y OTB, retenidas a través
del OH del ácido carboxílico.
Por lo tanto, a partir de esta observación, se evitó la utilización

conjunta de vidrio y acetonitrilo (como único disolvente) cuando se
trabajó con las ocratoxinas A y B.
- 173 -
DISCUSIÓN
Las columnas de inmunoafinidad (CIA) son un método ampliamente

utilizado para la extracción de la OTA de diferentes matrices
alimenticias, incluido el vino (Fabiani y col., 2010; Wu y col., 2011;
Solfrizzo y col., 2008).
Inicialmente, se utilizaron las columnas Ochratest ® de la marca

comercial Vicam, ya que eran las que se habían utilizado en el
laboratorio en la purificación de OTA a partir de diferentes matrices
(López de Cerain y col., 2002; Murillo y col., 2007; Araguás y col.,
2005; Amézqueta y col., 2004).
En las columnas de inmunoafinidad de cualquier marca comercial se

incluyen indicaciones con respecto a su uso para el análisis de
ocratoxina A, pero no se menciona nada sobre el comportamiento de las
columnas para compuestos análogos. De esta forma, resultó que las
columnas de la casa Vicam retuvieron la OTA y sus ésteres, pero no la
OTB, por lo que su uso habría imposibilitado el análisis de esta
ocratoxina.
La tendencia actual del análisis simultáneo de micotoxinas ha hecho

que se desarrollen columnas de inmunoafinidad para la extracción de
varias micotoxinas a la vez. Por ejemplo, se pueden encontrar columnas
de inmunoafinidad que permitan el análisis simultáneo de aflatoxinas,
ocratoxina A y zearalenona; aflatoxinas y zearalenona; aflatoxinas y
patulina o para el análisis conjunto de tricotecenos tipo A y B. Sin
embargo, la familia de ocratoxinas sigue sin explorarse.
La extracción en fase sólida con columnas C18 podría ser una

opción para analizar las 4 ocratoxinas simultáneamente. Sin embargo,
se les puede suponer algunas desventajas: en primer lugar, para
propiciar la detección de compuestos minoritarios como la OTC o la
- 174 -
DISCUSIÓN
MeOTA se necesitan menores límites de detección que los conseguidos

en general con ellas (Saéz y col., 2004; Tessini y col., 2010; Berente y
col., 2005). Por otro lado, el grado de concentración de la matriz
necesario para conseguir límites de detección lo suficientemente bajos,
conduciría probablemente a cromatogramas con picos interferentes o
con ruido y, más aún, cuando se trata de una matriz compleja como es
el vino.
Boudra y Morgavi (2006) desarrollaron un método analítico para la

determinación de OTA, OTB y OTα en plasma y leche cruda de ovejas
alimentadas con pienso contaminado (Boudra y Morgavi, 2006).
Utilizaron las columnas de inmunoafinidad Ochraprep® de R-Biopharm
para la extracción de las ocratoxinas de la leche y apuntaron que la OTα
no era retenida por ellas pero sí la OTA y OTB. No se mencionaba nada
acerca de los ésteres de la ocratoxina A. Con esta información, se
decidió probar esta marca comercial para la cuantificación de OTA, OTB,
OTC y MeOTA.
Sin embargo, las instrucciones de estas columnas explican los

procedimientos para la extracción de OTA desde cerveza, cereales y café
verde o soluble, pero no describen, curiosamente, el método a seguir
con el vino. Por esta razón, se decidió utilizar una modificación del
protocolo propuesto para la extracción de OTA en cerveza, ya que al
tratarse de una matriz líquida era la más parecida al vino. Las
modificaciones realizadas respecto al método propuesto por la casa
comercial fueron las siguientes: se utilizaron 50 mL de muestra en lugar
de 20 mL con la intención de disminuir los límites de detección y
cuantificación, comprobando previamente que la columna no sufría
saturación al paso de este volumen de muestra. La elución de las
ocratoxinas se realizó con 4 mL de metanol en lugar de emplear 1,5 mL
de disolución metanol:ácido acético (98:2 v/v) para evitar problemas de
- 175 -
DISCUSIÓN
estabilidad en la disolución ácida. Finalmente, en el procedimiento

descrito para la purificación de OTA desde la cerveza, se indica que el
eluido puede ser analizado directamente en el HPLC; sin embargo, al
incluir un paso de evaporación y reconstitución del eluido en un volumen
inferior de fase móvil se ha conseguido una mayor concentración de la
OTA desde la muestra.
Extrayendo 50 mL de muestra, evaporando los 4 mL de metanol de

elución y redisolviendo el residuo en 250 µL de fase móvil se consigue
concentrar 200 veces los niveles de ocratoxinas en el vino, en vez de las
13,3 propuestas en el protocolo de las CIA. Esto ha permitido obtener
un método analítico con un límite de detección para la OTA inferior a los
descritos en la bibliografía y con límites de detección adecuados para la
determinación de sus análogos.
PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO
El método cromatográfico desarrollado es una modificación del

propuesto por la Organización de la Vid y el Vino y del utilizado
anteriormente en el laboratorio para la determinación de OTA en vino
(OIV, 2001; López de Cerain y col., 2002).
Las modificaciones realizadas sobre el método de López de Cerain y

col. fueron las siguientes. En primer lugar, la columna (25 x 0,4 cm,
5 µm) se sustituyó por una de 15 x 0,46 cm (5 µm) con el objetivo de
reducir disolventes y residuos. Esto llevó también a un cambio del flujo
de 1,5 a 1 mL·min-1. Como fase móvil, en vez de utilizar una mezcla
isocrática ternaria acetonitrilo:metanol:agua (acetato sódico 5 mM) se
eligió una mezcla binaria acetonitrilo:agua (ácido fórmico 0,4%), con la
que resultó más fácil optimizar el gradiente. Respecto al método de la
OIV se cambió la separación isocrática por una en gradiente.
- 176 -
DISCUSIÓN
Los tiempos de retención de los cuatro compuestos resultaron muy

diferentes. Mientras la OTB aparecía al principio del cromatograma muy
poco retenida, la MeOTA y OTC resultaban tan afines por la fase
estacionaria que presentaron tiempos de retención grandes (40 min)
incluso con una fase móvil isocrática con un 60% de acetonitrilo. Para
obtener un tiempo de análisis moderado se hizo necesario el uso de
gradiente, con baja proporción de fase orgánica al inicio, para evitar la
interferencia de la OTB con el frente, y mayor proporción de acetonitrilo
al final del análisis para la elución de los ésteres.
Para disminuir el tiempo de análisis se evaluó también la posibilidad

de aumentar la temperatura del horno de columna hasta 60ºC; sin
embargo, no supuso un descenso significativo del tiempo necesario para
la elución de las ocratoxinas y empeoraba la selectividad.
Por estas razones, las condiciones que se fijaron para la fase móvil
fueron, una mezcla de acetonitrilo:agua (ácido fórmico 0,4%) en
gradiente 42:58 de 0 a 10 min y 60:40 de 15 a 25 min. La temperatura
de la columna se fijó en 40ºC. Estas condiciones dieron lugar a la
separación y elución de todos los analitos en 25 minutos.
En cuanto a las condiciones de la detección por fluorescencia, la

longitud de onda de excitación más utilizada en la bibliografía para la
OTA es 333 nm, que corresponde con un máximo en el espectro de
absorción UV-visible. La OTA presenta otro máximo en torno a 225 nm,
que al utilizarlo como λ de excitación produce una mayor respuesta en
la fluorescencia (Murillo y col., 2007; Amézqueta y col., 2004). Sin
embargo, se observó que el ruido de fondo también era mayor, y por
tanto, la relación señal/ruido. La longitud de onda de excitación de
333 nm permitió conseguir límites de detección más bajos. Esto coincide
con Soufleros y col. (2003), quienes apuntan que la OTA puede
- 177 -
DISCUSIÓN
excitarse en ultravioleta o visible según la necesidad de una señal más

alta o una línea base más estable (Soufleros y col., 2003).
La longitud de onda de emisión de 333 nm corresponde también

con el máximo del espectro de absorción de los ésteres de la OTA. En el
caso de la OTB presenta un máximo a 318 nm, y fue la que se utilizó
como λ de excitación para este compuesto.
Durante la puesta a punto del método analítico, se observó como en

algunos análisis aparecía una interferencia en forma de pico a tiempos
de retención altos (figura 24), que afectaba a la cuantificación de la
MeOTA y solo aparecía al aumentar el porcentaje de fase orgánica en la
fase móvil. Se pensó en el deterioro de la columna, de la precolumna,
en la contaminación del equipo, fases móviles, filtros, inyector,
problemas en la extracción, compuestos interferentes de la matriz… Las
múltiples pruebas que se realizaron mostraron que la interferencia era
causada por los viales de HPLC de plástico en contacto con la fase móvil
durante más de 4h y que desaparecía al utilizar viales de vidrio
desactivados. Por ello, durante la validación y análisis de las muestras
se utilizaron viales de vidrio.
METIL Y ETIL ÉSTERES DE LA OTB Y DE LA OTα
En los cromatogramas de algunas muestras de vino analizadas se

percibió cómo, además de los cuatro picos correspondientes a las 4
ocratoxinas estudiadas, aparecían otros no interferentes. Utilizar
durante la extracción columnas de inmunoafinidad especificas para la
OTA, y durante el análisis por HPLC longitudes de onda de emisión y
excitación de fluorescencia propias de los compuestos estudiados, hizo
suponer que esos picos podrían corresponder a otras ocratoxinas.
Debido a que los esteres de la ocratoxina B también han sido

descritos como compuestos producidos naturalmente por Aspergillus
- 178 -
DISCUSIÓN
ochraceus (Steyn, 1971; Steyn y Holzapfel, 1967a), se probó la síntesis

de sus etil y metil ésteres por el mismo procedimiento por el que la OTC
y la MeOTA se sintetizaron a partir de la OTA. De la misma manera, se
sintetizaron los metil y etil ésteres de la ocratoxina α. Las disoluciones
obtenidas de estos compuestos se cromatografiaron en las condiciones
del método para comprobar sus tiempos de retención.
Los tiempos de retención de la ocratoxina alpha y sus ésteres en las

condiciones analíticas empleadas resultaron ser 2,7, 8,9 y 14,2 min. Sin
embargo, se comprobó que no eran retenidos por las columnas de
inmunoafinidad utilizadas, por lo que no pueden aparecer en los
cromatogramas a partir de muestras de vino.
El metil y etil éster de la ocratoxina B tienen tiempos de retención

de 14,3 y 17 minutos, respectivamente que coinciden con picos que
aparecen en los cromatogramas de las muestras. No interfieren en el
análisis de OTB, OTA, MeOTA y OTC y son retenidos por las columnas de
inmunoafinidad empleadas. Además, en el estudio de confirmación de la
presencia de las ocratoxinas en las muestras por LC-MS se obtuvieron,
para los picos a estos tiempos de retención, los espectros de masas
característicos de estos compuestos.
No se encontraron en la bibliografía los coeficientes de absortividad

molar de MeOTB y EtOTB, por lo que no pudieron prepararse patrones
de concentración conocida para la validación.
Se decidió calcular las concentraciones aproximadas de estos

compuestos en las muestras suponiendo un comportamiento analítico
semejante a sus análogos de la ocratoxina A. Así, se utilizaron las
rectas, recuperación, LC y LD obtenidos para la MeOTA para la
cuantificación de la MeOTB, y los de la OTC para la EtOTB.
- 179 -
DISCUSIÓN
La detección por espectrometría de masas requiere flujos menores

que el utilizado en el método por HPLC-FLD desarrollado. Aunque los
equipos permiten la utilización de hasta 1 mL·min-1, se recomiendan
flujos más bajos para una mejor ionización en la fuente electrospray
(ESI).
Tener en cuenta las fórmulas teóricas para la transferencia de

métodos permite la optimización de las nuevas condiciones en menor
tiempo y aporta un conocimiento anticipado de los posibles resultados.
El flujo y el volumen de inyección se redujeron a 0,2 mL·min-1 y

20 µL, respectivamente. Para ello, se utilizó una columna de diámetro
interior de 2,1 µm en vez de la de 4,6 µm utilizada en HPLC-FLD. Y, a su
vez, para mantener la eficacia de la separación y emplear menores
tiempos de retención, se eligió una columna de menor longitud y
diámetro de partícula, 5 cm y 3,5 µm, respectivamente.
Con la relación teórica se pueden obtener

los nuevos tiempos del gradiente de fase móvil. Sin embargo, al no
cambiar solo la longitud de la columna sino también el diámetro interior
y de partícula, se necesitó una optimización de las condiciones. Ésta se
llevó a cabo en un equipo HPLC 1200 con detector de fluorescencia, ya
que su manejo es más sencillo que los detectores de masas a utilizar
(MS-IT y MS-TOF) y las condiciones de fluorescencia son conocidas.
Además, este modelo de HPLC era similar al acoplado tanto a la trampa
de iones como al TOF, lo que permite transferir de manera muy sencilla
esta optimización previa a cualquiera de los dos equipos de masas.
La utilización de los dos detectores de espectroscopía de masas

permite una confirmación inequívoca de la presencia de las 6
ocratoxinas en muestras de vino tinto. En el TOF, el m/z [M+H] +
- 180 -
DISCUSIÓN
extraído con cuatro decimales para cada ocratoxina en disoluciones

patrón coincide con los de muestras de vino contaminadas
naturalmente, a los mismos tiempos de retención.
La trampa iónica además de aislar el mismo m/z que en el TOF, en

un intervalo de tiempo concreto, ofrece los espectros de masas de los
compuestos encontrados. Las áreas de cada pico en el cromatograma de
ion extraído (EIC), tanto de muestras como de patrones, se obtienen por
la abundancia de tres iones de fragmentación característicos de cada
compuesto, lo que ofrece cinco puntos de confirmación. Los fragmentos
utilizados coinciden con los descritos por otros autores (Reinsch y col.,
2005; Tabata y col., 2008b; Nielsen y Smedsgaard, 2003).
Por lo tanto, en este trabajo y por primera vez, se ha puesto a

punto un método analítico por cromatografía de líquidos y detección de
fluorescencia capaz de cuantificar simultáneamente 6 ocratoxinas (OTA,
OTB, MeOTA, OTC, MeOTB y EtOTB) en vino tinto.
- 181 -
DISCUSIÓN
2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

El método analítico desarrollado fue validado para la cuantificación
simultánea de OTB, OTA, MeOTA y OTC en muestras de vino tinto y
cumplió los objetivos establecidos para los criterios de selectividad,
linealidad, precisión, exactitud, recuperación, límite de detección, límite
de cuantificación, robustez y estabilidad.
SELECTIVIDAD
La selectividad del método se ha favorecido con la especificidad de

las columnas de inmunoafinidad usadas en el proceso de extracción, la
separación cromatográfica y el uso de un detector de fluorescencia, con
longitudes de onda de excitación y emisión características para estos
compuestos.
El uso de columnas de inmunoafinidad en el proceso de extracción

de la ocratoxina A de cualquier matriz es un método ampliamente
utilizado, debido a su especificidad. El hecho de que las CIA retengan no
solo la OTA, sino también sus compuestos análogos, ha supuesto una
gran ventaja en esta investigación, pero puede ser inconveniente en
otras aplicaciones en las que no se haya comprobado la selectividad del
método para las otras ocratoxinas.
Los tiempos de retención de las ocratoxinas, coincidentes entre

patrón y muestra sirven para la confirmación de la identidad de los
analitos. Además, se ha comprobado que los picos de muestras
fortificadas no presentan hombros ni deformaciones.
Los parámetros de resolución cromatográfica estudiados aseguran

también la selectividad, demostrando que el alto factor de concentración
aplicado a las muestras de vino no causa interferencias debidas a la
matriz.
- 183 -
DISCUSIÓN
El factor de capacidad k’ determina la retención de un soluto. Para

que la selectividad no se vea comprometida, el primer compuesto de
interés debe eluir al menos dos veces el tiempo muerto (Decisión
2002/657/CE). Esto es k’>1, valores mayores de 2 aseguran una óptima
resolución (AEFI, 2001). Como se observa en la tabla 29, el menor valor
de este factor lo da el compuesto menos retenido, la OTB, y es cercano
a 5.
Todos los compuestos tienen un factor de simetría próximo a 0,9,

menos la OTB (0,78) que es el compuesto más influenciado por la
matriz. Como norma general, el factor de asimetría debería encontrarse
entre 0,8 y 1,5 (AEFI, 2001).
El número de platos teóricos (N) es una medida de la eficacia del

sistema. Aunque existen varias fórmulas para determinarlo, se basa en
la relación entre el tiempo de retención y la anchura del pico y en
general, se recomiendan valores superiores a 2.000 (AEFI, 2001). Para
todos los compuestos se han obtenido valores de N superiores a 5.000.
La resolución (Rs) es la medida de la separación entre dos picos. Un

valor de 1,5 representa una separación hasta la línea base de picos de
tamaño similar (AEFI, 2001). OTA y OTC presentan una muy buena
separación con valores de 2,3 y 9,5 respectivamente. El valor de 1,4 de
OTB y MeOTA se debe a la presencia de picos cercanos con tamaño muy
diferente, que no afectan a la cuantificación.
LINEALIDAD
Se han cumplido todos los objetivos establecidos para verificar la

linealidad:
Los coeficientes de correlación (r) y determinación (r 2) son

superiores a 0,999 en las doce rectas de calibración.
- 184 -
DISCUSIÓN
El test t de Student muestra que las pendientes son

estadísticamente diferentes de cero y sus intervalos de confianza al 95%
no incluyen al cero. Por el contrario, los intervalos de confianza de las
ordenadas en el origen incluyen el cero (p=0,95).
El coeficiente de variación de los factores respuesta es inferior al

5%, excepto para las rectas de niveles inferiores (0,1 a 1 µg·L-1), en las
que se ha aceptado un 10%. De los valores obtenidos, se deduce que
esta mayor variabilidad en las rectas de concentraciones menores se
debe a la menor respuesta del extremo más bajo (0,1 µg·L-1), límite de
cuantificación, para el que se han admitido errores relativos mayores.
El test de Cochran indica que la concentración no influye en la

variabilidad de los resultados (las varianzas de los factores respuesta
son homogéneas). Para ello, la G calculada tiene que ser menor que la G
tabulada, Gtab (α=0,05, k=5, n=3) = 0,68. Se cumple en todas las
rectas, salvo en la del intervalo de concentraciones más pequeñas de
OTA (0,1-1 µg·L-1) y por la misma razón que en el caso anterior, es
decir, la variabilidad al nivel de concentración 0,1 µg·L-1.
La representación de los residuales exhibe una distribución de los

puntos al azar y no refleja ninguna tendencia. La normalidad (p>0,05)
se cumple para todas las rectas, excepto en las rectas a niveles bajos de
concentración MeOTA y OTC. En estos casos, el test no paramétrico de
regresión robusta de Kendall-Theil arroja la misma conclusión y valores
muy similares de pendiente y ordenada en el origen que los obtenidos
con el test t de Student.
En todos los casos, el test significativo del ANOVA (p<0,001)

prueba la dependencia lineal del área respecto de la concentración.
Se han obtenido adecuados valores de precisión y exactitud de la

linealidad, ya que los coeficientes de variación y error relativo obtenidos
del estudio de repetibilidad (n = 3) y precisión intermedia (n = 9) son
- 185 -
DISCUSIÓN
inferiores al 10% para las 4 ocratoxinas. En el caso de la concentración

más baja de 0,1 µg·L-1 se han aceptado, y obtenido, valores menores al
15%.
RECUPERACIÓN
La exactitud y precisión del método analítico, expresadas como

recuperación y coeficiente de variación respectivamente, se evaluaron
en todo el intervalo de concentración estudiado (0,0005-2 µg·L-1),
fortificando muestras de vino tinto a 5 niveles de concentración.
Los estudios de repetibilidad (1 día, n = 15) y de precisión

intermedia (3 días, n = 45) muestran valores semejantes de
recuperación para cada una de las ocratoxinas. Todos los valores están
dentro del intervalo 50-120% recomendado para la ocratoxina A por el
Reglamento (CE) Nº 401/2006 por el que se establecen los métodos de
muestreo y análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas
en los productos alimenticios. Concretamente, los valores encontrados
oscilan entre 73,4 y 93,5%. Asimismo, el coeficiente de variación es
inferior al 20% en todos los casos (entre el 4,8 y el 16 %).
Se ha obtenido experimentalmente un límite de cuantificación de

0,5 ng·L-1 para todas las ocratoxinas, considerando la mínima cantidad
de analito que puede determinarse cuantitativamente con una adecuada
exactitud (recuperación entre 50-120%) y precisión (CV% < 20%)
(AEFI, 2001). Para una concentración de 0,5 ng·L-1 de cada ocratoxina
en vino tinto fortificado, el valor de recuperación ha sido superior al
65,7% y la precisión menor del 18,8% para todas ellas.
Los límites de detección, calculados a partir del procedimiento

explicado en el apartado Material y métodos, han resultado ser 0,32,
- 186 -
DISCUSIÓN
0,16, 0,27 y 0,17 ng·L-1 para OTB, OTA, MeOTA y OTC,

respectivamente.
Tanto el límite de cuantificación, como los límites de detección

obtenidos en este trabajo, son los más bajos encontrados en la
literatura para la cuantificación de ocratoxina A en muestras de vino
tinto. Los límites de cuantificación descritos hasta ahora están dentro del
intervalo 0,001 – 0,5 µg·L-1, y los de detección entre 0,0006 y 0,2 µg·L-1
(ver tabla 3 de la Introducción).
ROBUSTEZ
El estudio de robustez se ha llevado a cabo con el objetivo de

controlar los factores que pueden afectar a la cuantificación de las
ocratoxinas.
El pH de la muestra antes de su paso por las columnas de

inmunoafinidad considerado es un punto importante para evitar la
pérdida de OTA en la cuantificación (Castegnaro y col., 2006). Por ello,
se estudió la robustez del método a tres pH diferentes: 6,8, 7,2 y 7,6.
Los valores de recuperación próximos entre sí y los bajos coeficientes de
variación obtenidos demuestran que el método es robusto a este
cambio.
El método permite un volumen de inyección de 20 µL en caso de no

haber muestra suficiente o tener que repetir un análisis. Se obtiene un
error relativo inferior al 5% al corregir la concentración teniendo en
cuenta la dilución.
ESTABILIDAD
La estabilidad de la ocratoxina A en metanol a -20ºC ha sido

descrita anteriormente (Valenta, 1998). Sin embargo, no se tenían
- 187 -
DISCUSIÓN
datos de las otras ocratoxinas y se temía por la estabilidad y posible

transesterificación de los ésteres.
La disoluciones de calibración de 4, 40 y 400 µg·L-1, preparadas en

metanol como se indica en Material y métodos, de las 4 ocratoxinas
juntas y conservadas en congelación, han resultado estables durante al
menos un año. El pequeño aumento de la concentración de las
disoluciones desde el momento de su preparación hasta los 12 meses
sugiere posibles pérdidas ocasionadas por evaporación del disolvente al
almacenar estas disoluciones, pero este hecho no ha afectado a la
exactitud de la cuantificación.
La estabilidad de los analitos disueltos en fase móvil en el inyector

del HPLC a temperatura ambiente, a dos concentraciones diferentes,
tanto de patrón como después de la extracción de muestras de vino
fortificadas, ha quedado demostrada. Tomando como criterio un error
relativo inferior al 5% con respecto a la concentración inicial, las 4
ocratoxinas han resultado estables durante al menos 21,5 h. Se observa
una mayor estabilidad en las disoluciones obtenidas a partir de vino
fortificado, que llega a ser de 45 h, con la concentración superior.
Se ha garantizado el perfecto funcionamiento del equipo durante el

análisis de las muestras analizando patrones de calibrado de ocratoxinas
a la vez que los extractos de vino tinto. La exactitud de todos los
patrones ha mostrado un error relativo inferior al 10% de las
concentraciones ensayadas.
- 188 -
DISCUSIÓN
3. TRANSFORMACIÓN DE OTC EN OTA

La concentración de ocratoxina C en el vino disminuye con el tiempo
mientras que la de OTA aumenta, incluso hasta hacerse prácticamente
iguales. Esto sugiere que la OTC se hidroliza a OTA y el equilibrio se
desplaza hacia la forma no esterificada, en presencia de agua.
Estadísticamente, a los dos meses la concentración de OTC

comienza a ser significativamente muy diferente con respecto al valor
inicial, tanto en el caso de la fortificación a 0,5 µg·L-1 como en el de a
2 µg·L-1. Para la OTA, esta diferencia se muestra a las 4 semanas.
Si la OTC estuviera presente en el vino como contaminante fúngico

natural, con el tiempo podría transformarse en OTA. Esto hace necesario
determinar las concentraciones de ambas ocratoxinas para cumplir con
los niveles máximos permitidos y evitar subestimar la ingesta total de
ocratoxina A.
- 189 -
DISCUSIÓN
4. PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN VINOS

NAVARROS
VINOS DE AGRICULTURA TRADICIONAL
Los 35 vinos de agricultura tradicional con D.O. Navarra, adquiridos

en comercios navarros, se clasificaron en base al año de la vendimia.
Así, en 3 muestras no está especificada, 7 son vinos jóvenes de la
cosecha 2006, 15 son del 2007 y 10 son vinos crianza del 2004.
Con el test estadístico de Kruskal-Wallis se estudió la influencia del

año de cosecha y del proceso de crianza en las concentraciones
encontradas de las 6 ocratoxinas.
Las concentraciones medianas de OTB, OTA, OTC y EtOTB

encontradas no difieren estadísticamente entre los vinos tintos de las
cosechas 2006 y 2007, ni tampoco con los crianzas del 2004. Otros
autores también confirman que el proceso de crianza no afecta a los
niveles de OTA en el vino (Bellí y col., 2004; Quintela y col., 2011). Sin
embargo, López de Cerain y col. (2002) encontraron diferencias entre
los niveles de OTA de los vinos de 1997 y 1998, posiblemente debidas a
las diferentes condiciones climáticas de ambos veranos (López de Cerain
y col., 2002).
Con respecto a los metil ésteres de las ocratoxinas A y B, las

diferencias son altamente significativas. Las concentraciones de vinos
jóvenes de 2006 y 2007 no difieren entre sí, pero sí lo hacen con los
vinos de crianza. Esto puede ser debido a la baja concentración e
incidencia (mediana < LC) encontradas para estas micotoxinas en el año
2004.
- 191 -
DISCUSIÓN
VINOS DE AGRICULTURA ECOLÓGICA
Los 16 vinos de agricultura ecológica analizados han sido

suministrados por siete bodegas navarras y provienen de las cosechas
2007 y 2008. Todas ellas están inscritas como elaboradores de
productos ecológicos en el Consejo de la Producción Agraria Ecológica de
Navarra (CPAEN).
Al igual que para los vinos tradicionales se han comparado los

niveles de ocratoxinas entre las cosechas de los dos años. Las
concentraciones medianas de las seis ocratoxinas son menores en 2008
que en el año anterior, pero solo se han encontrado diferencias
significativas en el caso de OTB y MeOTA.

VINOS NAVARROS
Los bajos límites de detección y cuantificación obtenidos con el

método analítico han permitido demostrar la presencia simultánea de
varias ocratoxinas en vinos tintos navarros. Todas las muestras están
contaminadas con al menos 3 ocratoxinas. Así, la OTA va acompañada
de la OTB en el 100% de las muestras, y ambas van acompañadas a su
vez de 1, 2, 3 ó 4 de los ésteres estudiados. De los 51 vinos navarros
analizados, en 10 hay niveles de 3 ocratoxinas por encima del límite de
detección (19,6%), 4 aparecen en 16 vinos (31,4%), 5 en 16 (31,4%),
y las seis estudiadas aparecen simultáneamente en 9 (17,6%).
Las concentraciones de OTA media y mediana encontradas en los

51 vinos navarros fueron 15,9 y 5,30 ng·L-1, respectivamente, valores
mucho más bajos que los 2 µg·L-1 permitidos por la UE en vino. Además,
ninguna muestra ha superado este valor.
La concentración media de OTA encontrada por otros autores en

vinos de La Rioja (0,035 µg·L-1) (Quintela y col., 2011) es similar a los
- 192 -
DISCUSIÓN
valores descritos en este estudio. Sin embargo, vinos tintos analizados

en regiones más al sur de España parecen tener mayores valores de
esta micotoxina (0,25 µg·L-1) (Blesa y col., 2004).
Las concentraciones medianas de 7,17 y 5,30 ng·L-1 obtenidas para

OTB y OTA confirma la hipótesis de que la OTA va acompañada de la
OTB en alimentos y que su presencia e incidencia son similares (EFSA,
2006).
Zimmerli y Dick describieron la presencia simultánea de OTA y OTC

en vino, sin embargo, no se han llevado a cabo más estudios al
respecto. En este estudio, la OTC aparece en el 71% de las muestras de
vino tinto y su concentración mediana (0,42 ng·L-1) verifica que su nivel
es aproximadamente el 10% del de la ocratoxina A (Zimmerli y Dick,
1996).
INFLUENCIA DEL TIPO DE CULTIVO EN LA

Con el objetivo de observar si las prácticas ecológicas tienen

influencia en los niveles de ocratoxinas se han comparado las muestras
de los 35 vinos tradicionales y los 16 orgánicos.
Las concentraciones medianas de las 6 ocratoxinas son menores en

los vinos tintos de agricultura ecológica y hay diferencias significativas
en el caso de la OTA y MeOTB. Chiodini y col. (2006) analizaron 44 vinos
tintos, rosados y blancos de diferentes orígenes geográficos y obtenidos
tradicional y orgánicamente. Tratando en conjunto los diferentes tipos
de vinos, concluyeron que las concentraciones de OTA en vinos
ecológicos y tradicionales no difierían significativamente, pero no
efectuaron ninguna conclusión al considerar vinos tintos únicamente
(Chiodini y col., 2006).
- 193 -
DISCUSIÓN
Miceli y col. (2003) también mencionan que la concentración de

ocratoxina A en vinos tintos ecológicos es menor, sin embargo solo
analizaron 6 vinos con esta característica y 9 tradicionales (Miceli y col.,
2003).
Si se considera la suma total de las concentraciones de las 6

ocratoxinas presentes en cada vino, también se observan diferencias
significativas, siendo menor la concentración mediana en vinos
ecológicos. Al igual que ocurre con la ocratoxina A, la media de las
concentraciones es superior en el caso de los vinos ecológicos. Esto es
debido a que el mayor valor de OTA encontrado en los 51 vinos
(142 ng·L-1) corresponde a un vino ecológico.
INGESTA DE OTA Y OCRATOXINAS A PARTIR DE

VINO TINTO NAVARRO
El conocimiento sobre la presencia de micotoxinas en alimentos y el

desarrollo de métodos analíticos sensibles que lo permitan, cobran
especial importancia al hablar de seguridad alimentaria y evaluación del
riesgo para la población.
Según el informe relativo a la evaluación de la ingesta diaria de

Ocratoxina A por la población de los Estados miembros de la UE
(SCOOP, 2002) y el Comité mixto FAO/WHO de expertos en aditivos
alimentarios (JECFA, 2001), el vino representa en Europa la segunda
fuente de ingesta de OTA, detrás de los cereales. La ingesta media
diaria de OTA en España a través del vino tinto, publicada en el informe
SCOOP, es de 0,03 ng·kg p.c.-1·día-1 (SCOOP, 2002).
Para establecer la exposición a ocratoxinas en Navarra a través del

consumo de vino, se calculó la ingesta semanal de OTA y de ocratoxinas
totales en base a las concentraciones media y máxima de OTA (15,9 y
142 ng·L-1, respectivamente) y de la suma total de las 6 ocratoxinas
- 194 -
DISCUSIÓN
(30,1 y 200 ng·L-1, respectivamente), obtenidas de los 51 vinos con

D.O. Navarra.
La ingesta semanal media de OTA y ocratoxinas es inferior a 1

ng·kg p.c.-1 en los tres grupos de consumidores estudiados. En el peor
caso, hombres consumidores de vino con la mayor contaminación, la
ingesta semanal es de 4,70 y 6,61 ng·kg p.c.-1 para la ocratoxina A y la
suma total de ocratoxinas, respectivamente. Considerando la ingesta
semanal tolerable provisional de OTA establecida por la JECFA en 2007
de 100 ng·kg p.c.-1, los valores calculados contribuyen un 4,7 y 6,6% a
esta exposición.
Con los bajos niveles encontrados, el consumo de vino no parece

ser un factor de riesgo importante en la ingesta de ocratoxina A para los
consumidores navarros. Sin embargo, también se ha demostrado en
este estudio que la ingesta de ocratoxinas se infravalora si se calcula
solamente con el análisis de OTA en vino.
Para evaluar el riesgo real para el consumidor de la presencia

simultánea de ocratoxinas en alimentos, son necesarios más estudios en
relación a su presencia conjunta en otras matrices y estudios de su
toxicidad combinada.
Los estadísticos de correlación de Spearman obtenidos para los

pares de ocratoxinas OTA-OTB y OTB-EtOTB, de 0,561 y 0,427
respectivamente, muestran una relación moderada positiva entre sus
concentraciones. El valor de 0,849 obtenido para OTA y OTC describe
una asociación muy elevada entre ambas.
Esto refleja que cuanto mayor sea la concentración de ocratoxina A

mayor será también la presencia de las otras ocratoxinas, por lo que
será necesario extender la vigilancia y control a estas últimas.
- 195 -
DISCUSIÓN
OCRATOXINAS Y CLIMA
La contaminación fúngica de las uvas en el campo depende de las

condiciones climáticas. Algunos trabajos han estudiado la infección de
Aspergillus en relación a las temperaturas máximas, mínimas y medias
del mes anterior a la recogida de muestra, la humedad relativa y las
precipitaciones. Bellí y col. revelaron una significativa correlación

positiva con las temperaturas y no encontraron correlación ni con la
humedad ni con las precipitaciones (Bellí y col., 2006).
Visto que las concentraciones de ocratoxinas en el vino pueden

variar entre cosechas, se estudió la relación de las condiciones
meteorológicas con los niveles encontrados. En general, aparecen
relaciones moderadas entre las variables.
Las concentraciones de ocratoxina A y C tienen una asociación

positiva moderada con la temperatura media de los meses de julio y
agosto anteriores a la vendimia, mientras que no existe relación para las
demás ocratoxinas. La correlación es negativa con la humedad para
OTA, MeOTA, OTC y MeOTB. También es negativa para la precipitación,
en el caso de OTA, MeOTA y MeOTB. La ocratoxina B y su etil éster no
muestran asociación con los datos climatológicos.
Esto coincide con la hipótesis de que la frecuencia y concentración

de OTA sea mayor en climas cálidos del sur de Europa (Brera y col.,
2008; Blesa y col., 2006; Otteneder y Majerus, 2000; Mateo y col.,
2007). Cuanto mayor sea la temperatura del verano anterior a la
vendimia, y menores las precipitaciones y el porcentaje de humedad
relativa, mayores podrían ser las concentraciones de ocratoxina A en el
vino.
- 196 -
DISCUSIÓN
5. OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES

MEDITERRÁNEOS
Diversos trabajos han concluido que los vinos de los países del Sur
de Europa son más susceptibles de contaminación por ocratoxina A
debido al clima cálido, tipo mediterráneo (Brera y col., 2008; Blesa y
col., 2006; Otteneder y Majerus, 2000; Mateo y col., 2007).
No se ha publicado nada acerca de la presencia de los análogos de

OTA en los vinos producidos en esta región. Con el objetivo de estudiar
de manera novedosa la presencia simultánea de seis ocratoxinas en el
vino de los países ribereños del mediterráneo se analizaron vinos tintos
de 9 países de la región mediterránea: España, Francia, Italia, Croacia,
Grecia, Turquía, Israel y Túnez y Argelia.
VINOS DE ESPAÑA
Dentro de todas las denominaciones de origen de vino tinto de

España se ha elegido Cataluña como zona de clima típicamente
mediterráneo.
Los 12 vinos catalanes analizados están contaminados con al menos

4 ocratoxinas con niveles superiores al límite de detección. De los 12
vinos de Cataluña analizados, en 8 (66,7%) aparecen las 6 ocratoxinas
de manera simultánea, en 3 (25%) están presentes 5 y en 1 muestra
(8,3%) aparecen 4.
Con respecto a la ocratoxina A, se obtuvieron concentraciones entre

1,05 y 104 ng·L-1, con una media de 37,2 ng·L-1. Este valor es similar al
descrito por Burdaspal y Legarda en vinos tintos españoles de
0,038 µg·L-1, aunque su nivel máximo es superior (0,603 µg·L-1)
(Burdaspal y Legarda, 1999).
- 197 -
DISCUSIÓN
Bellí y col. (2004) analizaron 20 vinos tintos jóvenes catalanes

(D.O. Penedés y Costers del Segre) y encontraron 3 muestras por
encima del límite de detección (0,05 µg·L-1) con valores entre 0,06 y
0,69 µg·L-1, superiores a los obtenidos en este estudio.
VINOS DE FRANCIA
Todos los vinos franceses están contaminados con ocratoxina B y al

menos otra ocratoxina. Un vino con D.O. Beaujolais es el único de todo
el estudio que no ha resultado contaminado con OTA (< 0,16 ng·L -1),
este vino tampoco contiene OTC o los ésteres de la OTB, en él solo
están presentes la OTB y MeOTA.
Las 6 ocratoxinas aparecen de manera simultánea en 3 vinos tintos

(25%), 2 muestras tienen 5 (16,7%), tres vinos presentan 4 y 3
ocratoxinas respectivamente (25%).
El intervalo de concentraciones de ocratoxina A en las muestras

positivas va de 0,20 a 88,3 ng·L-1. La media es de 33,6 ng·L-1 y la
mediana de 3,56 ng·L-1. Otros autores encuentran valores medios
similares: 0,038 µg·L-1 (Rosa y col., 2004), 0,070 µg·L-1 (Otteneder y
Majerus, 2000) o superiores 0,225 µg·L-1 (Burdaspal y Legarda, 1999)
en vinos franceses.
VINOS DE ITALIA
Los 12 vinos italianos están contaminados por al menos 5 de las

ocratoxinas estudiadas. Las 6 aparecen de manera simultánea en 5
muestras (41,7%).
Italia es el país en el que más se ha estudiado la presencia de

ocratoxina A en vinos, y uno de los que ha ofrecido valores más altos de
contaminación, cerca de los 8 µg·L-1 (Brera y col., 2008; Visconti y col.,
1999).
- 198 -
DISCUSIÓN
Los valores encontrados en este estudio van de 5,18 a 286 ng·L-1

(media 53,9 ng·L-1, mediana 20,0 ng·L-1) y son inferiores a los
encontrados por otros autores (Castellari y col., 2000; Aresta y col.,
2006; Campone y col., 2011; Dall'Asta y col., 2004; Pietri y col., 2001;
Brera y col., 2005; Perrone y col., 2007; Spadaro y col., 2010). Solo
Bacaloni y col. (2005) describen valores similares con una media de
0,031 µg·L-1 en 36 de 43 muestras positivas (Bacaloni y col., 2005).
VINOS DE CROACIA
Solo en un vino croata (8,3%) están presentes las 6 ocratoxinas de

manera simultánea. En 6 muestras (50%) aparecen 5, en 1 cuatro
(8,3%) y en 4 vinos (33,3%) hay al menos 3 ocratoxinas.
Los valores máximos de OTB, OTA, MeOTA y OTC encontrados en

este país son los más bajos en comparación con el resto de países
estudiados, por lo que parece que los vinos croatas son los menos
contaminados por estas micotoxinas. En el caso de los ésteres de la
ocratoxina B, son los segundos con una concentración máxima menor.
Las concentraciones de ocratoxina A van de 0,36 a 61,3 ng·L -1 con

una media de 18,8 ng·L-1. Esta media es similar a la descrita por
Domijan (22 ng·L-1) y Flajs (15 ng·L-1), aunque el valor máximo de este
estudio es algo superior a los encontrados por estos autores; de 47 y
21 ng·L-1 (Flajs y col., 2009; Domijan y Peraica, 2005).
VINOS DE GRECIA
Diez de los doce vinos griegos están contaminados por las 6

ocratoxinas estudiadas y en los dos restantes no aparece la MeOTA.
Los valores de ocratoxina A encontrados van de 4,35 a 212 ng·L -1,

con una media y mediana de 59,4 y 31,7 ng·L-1 respectivamente.
Stefanaki y col. (2003) analizan 104 muestras de vino tinto griego,
- 199 -
DISCUSIÓN
encontrando 71 positivas con una media de 0,34 µg·L-1 (mediana =

0,09 µg·L-1, máximo 2,69 µg·L-1). Estos autores apuntan, además, un
gradiente de concentración Norte-Sur en Grecia, obteniendo mayores
concentraciones en las islas del mar Egeo (Stefanaki y col., 2003). El
presente estudio tiene pocas muestras para confirmar esta hipótesis, sin
embargo los dos valores más altos de OTA encontrados aparecen en
vinos originarios de esta región.
VINOS DE TURQUÍA
Todos los vinos de Turquía están contaminados por OTB, OTA, OTC,
MeOTB y EtOTB. Además en 5 muestras (41,7%) aparece también la
MeOTA, con la que estarían presentes las 6 ocratoxinas de manera
simultánea.
Los valores de ocratoxina A en los vinos turcos están dentro del

intervalo 2,91 a 101 ng·L-1 (media, 31,1 ng·L-1; mediana, 20,5 ng·L-1).
Las concentraciones medias de otros autores son superiores a estos
valores (Altiokka y col., 2009; Anli y col., 2005; Var y Kabak, 2007). En
el estudio de Altiokka y col. se encuentra un valor de OTA de incluso
7,96 µg·L-1.
VINOS DE ISRAEL
Ocho muestras de vino de Israel (66,7%) están contaminadas con

las 6 ocratoxinas estudiadas, y en 4 vinos (33,3%) aparecen todas ellas
a excepción de la EtOTB.
El intervalo de concentraciones de ocratoxina A en las muestras va

de 3,63 a 65,4 ng·L-1. La media es 18,5 ng·L-1 y la mediana, 11,7 ng·L-1.
No se han encontrado en la bibliografía estudios sobre la presencia de
OTA en vinos de este país.
- 200 -
DISCUSIÓN
Las concentraciones medianas de MeOTA y MeOTB (1,73 y

2,93 ng·L-1, respectivamente) son estadísticamente superiores a las de
los otros países mediterráneos.
VINOS DEL NORTE DE ÁFRICA
Se han analizado 7 vinos de Argelia y 5 de Túnez y las

concentraciones obtenidas se han estudiado en conjunto debido a la
dificultad de obtener 12 muestras de un mismo país.
Las 6 ocratoxinas aparecen juntas en 3 vinos tintos de Argelia y

Túnez (25%), 5 muestras tienen 5 (41,7%), y cuatro vinos presentan 4
ocratoxinas (33,3%).
Todos los vinos presentan OTB, OTA, OTC y EtOTB y sus

concentraciones medianas son estadísticamente superiores a las del
resto de los países estudiados.
Las concentraciones de OTA varían entre 84,4 y 455 ng·L-1, con una
media y mediana de 195 y 171 ng·L-1, respectivamente. Este valor es el
mayor obtenido en este estudio y corresponde a un vino de Túnez de la
región de Muaskar. Los niveles encontrados son similares a los descritos
por Zimmerli y Dick en dos muestras de vino tinto de Argelia y una de
Túnez: 194, 292 y 388 ng·L-1, respectivamente (Zimmerli y Dick, 1996).
No se ha encontrado en la bibliografía más estudios acerca de los
niveles de ocratoxinas en vinos de estos países.

De nuevo, los bajos límites de detección y cuantificación del método

analítico han permitido demostrar, por primera vez, la presencia
simultánea de varias ocratoxinas en vinos tintos de esta zona
geográfica.
- 201 -
DISCUSIÓN
Considerando los valores hallados en los 96 vinos de países

mediterráneos, la OTB, OTA, MeOTA, OTC, MeOTB y EtOTB están
presentes en el 100%, 99%, 62,5%, 89,6%, 83,3% y 83,3% de las
muestras, respectivamente. La concentraciones medias encontradas han
sido de 23,5, 54,2, 5,22, 5,20, 1,85 y 1,37 ng·L-1 respectivamente.
Ningún vino ha superado el límite máximo permitido para la OTA de
2 µg·L-1 establecido por la UE para esta matriz.
El 44,8% de los vinos tintos presenta las 6 ocratoxinas estudiadas

de manera simultánea. Cinco aparecen en un 37,5%, cuatro en un 9,4%
y en un 7,3 y 1,0% de las muestras aparecen 3 y 2, respectivamente.
Las concentraciones medianas de 13,4 y 19,4 ng·L-1 obtenidas para

OTB y OTA de nuevo confirman la hipótesis de que OTA va acompañada
de la OTB en alimentos y que su presencia e incidencia son similares
(EFSA, 2006).
En cuanto a la presencia simultánea de OTA y OTC en las muestras,

la OTC aparece en el 89,6% de ellas y su concentración mediana
(2,32 ng·L-1) supone aproximadamente el 10% de la de ocratoxina A
(Zimmerli y Dick, 1996)
INFLUENCIA DEL PAÍS DE ORIGEN EN LA

En general, las concentraciones obtenidas de cada ocratoxina en

cada país son del mismo orden, por lo que no puede afirmarse que los
niveles dependan del origen geográfico, salvo para el caso de los vinos
de Túnez y Argelia que presentan diferencias significativas con respecto
a los demás para OTB, OTA, OTC y EtOTB. En el caso de los metil
ésteres de la OTA y OTB los niveles son superiores en los vinos de
origen israelí.
- 202 -
DISCUSIÓN
En relación al supuesto de que los vinos del Norte de Europa poseen

menores cantidades de OTA, se han encontrado en la literatura valores
medios de 0,48 y 2,9 µg·L-1 en vinos de Holanda y Rusia,
respectivamente (Czerwiecki y col., 2005; Rusanova y col., 2009). Este
último trabajo solo analiza 7 vinos tintos y encuentra OTA en 3 de ellos,
en un intervalo de 1,8-4,4 µg·L-1, valores muy superiores a los
encontrados en este estudio. Los valores de esta investigación parecen
similares a los encontrados en Hungría (intervalo: 0,03-0,53 µg·L-1,
media: 0,12 µg·L-1) o Eslovaquia (intervalo: < 0,01-0,46 µg·L-1) (Varga
y col., 2005; Belajová y Rauova, 2007). Esto confirma los resultados del
informe SCOOP (2002), donde se apunta que los niveles de ocratoxina A
en vinos originarios del Norte de Europa parecen ser cercanos a los
valores del Sur del continente.
En cualquier caso, hay que indicar que es difícil comparar los

resultados de este estudio con los encontrados en la literatura, debido
sobre todo a los diferentes límites de detección de los métodos
analíticos.
En cuanto a la relación entre la presencia de ocratoxinas, de nuevo

se observan correlaciones altamente significativas. Los valores del
coeficiente de correlación de Spearman obtenidos son superiores a los
del estudio realizado para los vinos navarros, posiblemente debido al
mayor número de muestras. Las concentraciones de OTA-OTB muestran
una asociación muy elevada, con un coeficiente de correlación de 0,897.
Para OTA-OTC la relación es prácticamente perfecta debido al alto valor
del coeficiente de correlación de 0,934 y es grande en el caso de la OTB-
EtOTB (rs = 0,648).
- 203 -
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
1. Se ha desarrollado un método analítico por HPLC-FLD que ha

permitido, por primera vez, la cuantificación simultánea de 6
ocratoxinas: ocratoxina B, ocratoxina A, metilocratoxina B,
etilocratoxina B, metilocratoxina A y ocratoxina C en vino.
2. La validación del método analítico ha demostrado que presenta

adecuada selectividad, linealidad, exactitud, precisión, recuperación,
límites de detección y cuantificación, estabilidad y robustez para la
cuantificación de estas ocratoxinas en vino. Además, el límite de
detección obtenido para la OTA en esta matriz es el más bajo descrito
hasta ahora en la literatura.
3. Se ha demostrado, por primera vez, la presencia simultánea de

OTB, MeOTB, EtOTB, OTA, MeOTA y OTC, en vinos tintos de Navarra y
de diferentes países que circundan el Mediterráneo. Además, en este
trabajo se ha evidenciado que la OTC se transforma en OTA en el vino.
Todo esto indica que la ingesta de ocratoxinas a través de esta matriz se
infravalora si se tienen en cuenta únicamente los niveles de OTA.
4. En relación a los vinos navarros, la OTA va acompañada de la

OTB en el 100% de las muestras analizadas. En un 71% aparece
además la OTC. Las 6 ocratoxinas aparecen simultáneamente en el
17,6% de las muestras.
5. En los vinos navarros, no se han observado diferencias

significativas en la presencia de ocratoxinas en cuanto al año de
cosecha. Se obtienen menores niveles de ocratoxina A y de ocratoxinas
totales en vinos tintos de agricultura ecológica.
6. Las concentraciones de ocratoxina A y C tienen una asociación

positiva moderada con la temperatura, mientras que no existe relación
para las demás ocratoxinas. La correlación es negativa con la humedad
para OTA, MeOTA, OTC y MeOTB. También es negativa para la
- 207 -
CONCLUSIONES
precipitación, en el caso de OTA, MeOTA y MeOTB. La ocratoxina B y su

etil éster no muestran asociación con los datos climatológicos.
7. En el caso de los vinos de países mediterráneos, la OTA va

acompañada de la OTB prácticamente en el 100% de las muestras
analizadas. En un 90%, aparece además la OTC.
8. En general, los vinos tintos de España, Francia, Italia, Croacia,

Grecia, Turquía e Israel presentan niveles de ocratoxinas del mismo
orden, por lo que no puede afirmarse que los niveles dependan del
origen geográfico, salvo para el caso de los vinos de Túnez y Argelia que
presentan diferencias significativas con respecto a los demás para OTB,
OTA, OTC y EtOTB
9. Por los resultados obtenidos en este estudio, no se puede afirmar

que los niveles de ocratoxina A en los vinos de países del sur de Europa
sean mayores que los descritos en países del norte de Europa, lo que
coincide con los resultados del informe SCOOP en 2002.
10. Se ha encontrado una asociación estadística muy elevada para

la presencia conjunta de OTA-OTB y OTA-OTC en el vino tinto. Las
concentraciones de OTB-EtOTB también muestran una relación
significativa, aunque en este caso el coeficiente de correlación es menor.
11. Dado que se ha demostrado la presencia conjunta de varias

ocratoxinas en el vino, y con el fin de evaluar el riesgo real para el
consumidor, sería necesario realizar estudios de su toxicidad combinada
así como de su presencia en otras matrices.
- 208 -
BIBLIOGRAFÍA
BIBLIOGRAFÍA
Aboul-Enein, H.Y., Kutluk, O.B., Altiokka, G. & Tunçel, M. 2002, "A modified
HPLC method for the determination of ochratoxin A by fluorescence detection",
Biomedical Chromatography, vol. 16, pp. 470-474.
Adanyi, N., Levkovets, I.A., Rodriguez-Gil, S., Ronald, A., Varadi, M. &
Szendro, I. 2007, "Development of immunosensor based on OWLS technique for
determining Aflatoxin B1 and Ochratoxin A", Biosensors & Bioelectronics, vol.
22, pp. 797-802.
AEFI 2001, Validación de métodos analíticos. Asociación Española de

Farmaceúticos de la Industria. ISBN 84-89602-33-6
Agilent 2009, “LC Columns for Reducing Solvent Use and Waste”,
Techical overview 5990-3972EN. Disponible en:
http://www.chem.agilent.com/Library/technicaloverviews/Public/5990-3972EN.pdf
Alarcón, S.H., Micheli, L., Palleschi, G. & Compagnone, D. 2004,

"Development of an electrochemical immunosensor for ochratoxin A", Analytical
Letters, vol. 37, pp. 1545-1558.
Almeda, S., Arce, L. & Valcarcel, M. 2008, "Combined use of supported

liquid membrane and solid-phase extraction to enhance selectivity and
sensitivity in capillary electrophoresis for the determination of ochratoxin A in
wine", Electrophoresis, vol. 29, pp. 1573-1581.
Altiokka, G., Can, N.O., Atkosar, Z. & Aboul-Enein, H.Y. 2009,

"Determination of Ochratoxin A in Turkish Wines", Journal of Food and Drug
Analysis, vol. 17, pp. 467-473.
Amézqueta, S., González-Peñas, E., Murillo, M. & López de Cerain, A. 2005,

"Occurrence of ochratoxin A in cocoa beans: Effect of shelling", Food Additives
and Contaminants, vol. 22, pp. 590-596.
Amézqueta, S., Gonzalez-Peñas, E., Lizarraga, T., Murillo-Arbizu, M. &

López de Cerain, A. 2008, "A simple chemical method reduces ochratoxin A in
contaminated cocoa shells", Journal of Food Protection, vol. 71, pp. 1422.
Amézqueta, S., González-Peñas, E., Murillo, M. & López de Cerain, A. 2004,

"Validation of a high-performance liquid chromatography analytical method for
- 211 -
BIBLIOGRAFÍA
ochratoxin A quantification in cocoa beans", Food Additives and Contaminants,

vol. 21, pp. 1096-1106.
Anli, E., Çabuk, B., Vural, N. & Başpinar, E. 2005, "Ochratoxin A in Turkish
wines", Journal of Food Biochemistry, vol. 29, pp. 611-623.
AOAC 2002a, “AOAC Guidelines for single laboratory validation of chemical

methods for dietary supplements and botanicals”, Scientific Association
Dedicated to Analytical Excellence (AOAC International).
AOAC 2002b, “AOAC Guidelines for collaborative study procedures to

validate characteristics of a method of analysis”, Scientific Association Dedicated
to Analytical Excellence (AOAC International).
Araguás, C., González-Peñas, E. & López De Cerain, A. 2005, "Study on

ochratoxin A in cereal-derived products from Spain", Food Chemistry, vol. 92,
pp. 459-464.
Arbillaga, L., Azqueta, A., van Delft, J.H. & López de Cerain, A. 2007, "In
vitro gene expression data supporting a DNA non-reactive genotoxic mechanism
for ochratoxin A", Toxicology and Applied Pharmacology, vol 222, pp. 216-224.
Arbillaga, L., Ezpeleta, O. & López De Cerain, A. 2004, "Is the ochratoxin A
a mutagenic mycotoxine? [¿Es la ocratoxina A una micotoxina mutagénica?]",
Revista de Toxicologia, vol. 21, pp. 1-10.
Aresta, A., Vatinno, R., Palmisano, F. & Zambonin, C.G. 2006,

"Determination of ochratoxin A in wine at sub ng/mL levels by solid-phase
microextraction coupled to liquid chromatography with fluorescence detection",
Journal of Chromatography A, vol. 1115, pp. 196-201.
Arroyo-Manzanares, N., García-Campaña, A.M. & Gámiz-Gracia, L. 2011,

"Comparison of different sample treatments for the analysis of ochratoxin A in
wine by capillary HPLC with laser-induced fluorescence detection", Analytical and
Bioanalytical Chemistry, vol. 401, pp. 2987-2994.
Bacaloni, A., Cavaliere, C., Faberi, A., Pastorini, E., Samperi, R. & Lagana,
A. 2005, "Automated on-line solid-phase extraction-liquid chromatography-
electrospray tandem mass spectrometry method for the determination of
- 212 -
BIBLIOGRAFÍA
ochratoxin A in wine and beer", Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol.
53, pp. 5518-5525.
Bamias, G. & Boletis, J. 2008, "Balkan nephropathy: Evolution of our

knowledge", American Journal of Kidney Diseases, vol. 52, pp. 606-616.
Belajova, E. & Rauova, D. 2007, "Determination of ochratoxin A and its

occurrence in wines of Slovakian retail", Journal of Food and Nutrition Research,
vol. 46, pp. 68-74.
Bellí, N., Marín, S., Duaigües, A., Ramos, A.J. & Sanchis, V. 2004,
"Ochratoxin A in wines, musts and grape juices from Spain", Journal of the
Science of Food and Agriculture, vol. 84, pp. 591-594.
Bellí, N., Bau, M., Marín, S., Abarca, M.L., Ramos, A.J. & Bragulat, M.R.
2006, "Mycobiota and ochratoxin A producing fungi from Spanish wine grapes",
International Journal of Food Microbiology, vol. 111, pp. S40-S45.
Bennett, J.W. & Klich, M. 2003, "Mycotoxins", Clinical Microbiology Reviews,

vol. 16, pp. 497.
Berente, B., Móricz, A., H.-Otta, K., Záray, G., Lékó, L. & Rácz, L. 2005,
"Determination of ochratoxin A in Hungarian wines", Microchemical Journal, vol.
79, pp. 103-107.
Binder, E.M., Tan, L.M., Chin, L.J., Handl, J. & Richard, J. 2007, "Worldwide
occurrence of mycotoxins in commodities, feeds and feed ingredients", Animal
Feed Science and Technology, vol. 137, pp. 265-282.
Blesa, J., Soriano, J.M., Moltó, J.C. & Mañés, J. 2006, "Factors affecting the
presence of Ochratoxin A in wines", Critical Reviews in Food Science and
Nutrition, vol. 46, pp. 473-478.
Blesa, J., Soriano, J.M., Moltó, J.C. & Mañes, J. 2004, "Concentration of
ochratoxin A in wines from supermarkets and stores of Valencian Community
(Spain)", Journal of Chromatography A, vol. 1054, pp. 397-401.
Boudra, H. & Morgavi, D. 2006, "Development and validation of a HPLC

method for the quantitation of ochratoxins in plasma and raw milk", Journal of
Chromatography B, vol. 843, pp. 295.
- 213 -
BIBLIOGRAFÍA
Braicu, C., Puia, C., Bodoki, E. & Socaciu, C. 2008, "Screening and
quantification of aflatoxins and ochratoxin A in different cereals cultivated in
romania using thin-layer chromatography-densitometry", Journal of Food
Quality, vol. 31, pp. 108-120.
Brera, C., Debegnach, F., De Santis, B., Pannunzi, E., Berdini, C., Prantera,
E., Gregori, E. & Miraglia, M. 2011, "Simultaneous determination of aflatoxins
and ochratoxin A in baby foods and paprika by HPLC with fluorescence
detection: A single-laboratory validation study", Talanta, vol. 83, pp. 1442-
1446.
Brera, C., Debegnach, F., Minardi, V., Prantera, E., Pannunzi, E., Faleo, S.,
De Santis, B. & Miraglia, M. 2008, "Ochratoxin A contamination in Italian wine
samples and evaluation of the exposure in the Italian population", Journal of
Agricultural and Food Chemistry, vol. 56, pp. 10611.
Brera, C., Debegnach, F., Miraglia, M. & Soriano, J.M. 2005, "Exposure
assessment to ochratoxin A from the consumption of Italian and Hungarian
wines", Microchemical Journal, vol. 79, pp. 109-113.
Brera, C., Grossi, S., De Santis, B. & Miraglia, M. 2003, "Automated HPLC
method for the determination of Ochratoxin A in wine samples", Journal of Liquid
Chromatography and Related Technologies, vol. 26, pp. 119-133
Burdaspal, P.A. & Legarda, T.M. 1999, "Ocratoxina A en vinos, mostos y

zumos de uva elaborados en España y en otros paises europeos", Alimentaria,
vol. 36, pp. 107-113.
Buttinger, G., Fuchs, E., Knapp, H., Berthiller, F., Schuhmacher, R., Binder,
E.M. & Krska, R. 2004, "Performance of new clean-up column for the
determination of ochratoxin A in cereals and foodstuffs by HPLC-FLD", Food
Additives and Contaminants, vol. 21, pp. 1107-1114.
Cameán, A.M. & Repetto, M. 2007, Toxicología alimentaria, Ediciones Díaz

de Santos, España. ISBN: 978-84-7978-727-1.
Campone, L., Piccinelli, A.L. & Rastrelli, L. 2011, "Dispersive liquid-liquid

microextraction combined with high-performance liquid chromatography-tandem
mass spectrometry for the identification and the accurate quantification by
- 214 -
BIBLIOGRAFÍA
isotope dilution assay of ochratoxin A in wine samples", Analytical and

Castegnaro, M., Tozlovanu, M., Wild, C., Molinie, A., Sylla, A. & Pfohl-
Leszkowicz, A. 2006, "Advantages and drawbacks of immunoaffinity columns in
analysis of mycotoxins in food", Molecular Nutrition & Food Research, vol. 50,
pp. 480-487.
Castellari, M., Fabbri, S., Fabiani, A., Amati, A. & Galassi, S. 2000,
"Comparison of different immunoaffinity clean-up procedures for high-
performance liquid chromatographic analysis of ochratoxin A in wines", Journal
of Chromatography A, vol. 888, pp. 129-136.
Chiodini, A.M., Scherpenisse, P. & Bergwerff, A.A. 2006, "Ochratoxin A

contents in wine: Comparison of organically and conventionally produced
products", Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 54, pp. 7399-7404.
Cigić, I.K., Strlic, M., Schreiber, A., Kocjancic, M. & Pihlar, B. 2006,
"Ochratoxin A in wine: Its determination and photostability", Analytical Letters,
vol. 39, pp. 1475-1488.
Czerwiecki, L., Wilczynska, G. & Kwiecien, A. 2005, "Ochratoxin A: an

improvement clean-up and HPLC method used to investigate wine and grape
juice on the Polish market", Food Additives and Contaminants, vol. 22, pp. 158-
162.
Cole, R.J., Scheweikert, M.A. & Jarvis, B.B. 2003, Handbook of secondary
fungal metabolites, vol.3, Academic Press. ISBN: 978-0-12-179460-6.
Dall'Asta, C., Galaverna, G., Dossena, A. & Marchelli, R. 2004, "Reversed-

phase liquid chromatographic method for the determination of ochratoxin A in
wine", Journal of Chromatography A, vol. 1024, pp. 275-279.
Decisión 2002/657/CE, Decisión de la Comisión de 12 de agosto de 2002

por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al
funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados,
Diario Oficial de la Unión Europea, L 221, pp. 8-36.
- 215 -
BIBLIOGRAFÍA
Dietrich, D.R., O'Brien, E., Stack, M.E. & Heussner, A.H. 2001, "Species-
and sex-specific renal cytotoxicity of ochratoxin A and B in vitro", Experimental
and Toxicologic Pathology, vol. 53, pp. 215-225.
Domijan, A.M. & Peraica, M. 2005, "Ochratoxin A in wine", Arhiv za Higijenu

Rada i Toksikologiju, vol. 56, pp. 17-20.
Doster, R.C., Sinnhuber, R.O. & Wales, J.H. 1972, "Acute Intraperitoneal
Toxicity of Ochratoxin A and Ochratoxin B in Rainbow Trout (Salmo-Gairdneri)",
Food and Cosmetics Toxicology, vol. 10, pp. 85-88.
Doster, R.C., Sinnhuber, R.O. & Pawlowski, N.E. 1974, "Acute

intraperitoneal toxicity of ochratoxin A and B derivatives in rainbow trout (Salmo
gairdneri)", Food and Cosmetics toxicology, vol. 12, pp. 499-505.
EFSA 2006, "Opinion of the Scientific Panel on contaminants in the food

chain on a request from the Commission related to ochratoxin A in food.
Question Nº EFSA-Q-2005-154", The EFSA Journal, vol. 365, pp. 1-56.
El Khoury, A., Rizk, T., Lteif, R., Azouri, H., Delia, M.L. & Lebrihi, A. 2006,
"Occurrence of ochratoxin A- and aflatoxin B1-producing fungi in Lebanese
grapes and ochratoxin A content in musts and finished wines during 2004",
Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 54, pp. 8977-8982.
EURACHEM 1998, “The fitness for purpose of analytical methods. A

laboratory guide to method validation and related topics”, EURACHEM Guide, pp.
1-75.
FAO, Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la

Alimentación 2004, “Reglamentos a nivel mundial para las micotoxinas en
alimentos y en las raciones en el año 2003”, Estudio FAO Alimentación y
Nutrición 81.
Fabiani, A., Corzani, C. & Arfelli, G. 2010, "Correlation between different

clean-up methods and analytical techniques performances to detect ochratoxin A
in wine", Talanta, vol. 83, pp. 281-285.
FDA 2000, “Guidance for Industry. Analytical procedures and methods

validation: Chemistry, manufacturing, and controls documentation”, Food and
Drug Administration.
- 216 -
BIBLIOGRAFÍA
FDA 2011, “Guidance for Industry. Process validation. General principles

and practices” Food and Drug Administration.
Filali, A., Ouammi, L., Betbeder, A.M., Baudrimont, I., Soulaymani, R.,
Benayada, A. & Creppy, E.E. 2001, "Ochratoxin A in beverages from Morocco: A
preliminary survey", Food Additives and Contaminants, vol. 18, pp. 565-568.
FIVIN (2008). Fundación para la Investigación del Vino y Nutrición.

http://www.lacienciadelvino.com/index.php?accion=documentacion.
Flajs, D., Domijan, A.M., Ivic, D., Cvjetkovic, B. & Peraica, M. 2009, "ELISA
and HPLC analysis of ochratoxin A in red wines of Croatia", Food Control, vol.
20, pp. 590-592.
Garcia-Fonseca, S., Ballesteros-Gomez, A., Rubio, S. & Perez-Bendito, D.

2008, "Coacervative extraction of ochratoxin A in wines prior to liquid
chromatography/fluorescence determination", Analytica Chimica Acta, vol. 617,
pp. 3-10.
García-Granero, M. 2010, “Bioestadística aplicada”.
Gareis, M. 1999, "Contamination of German malting barley and of malt-

produced from it with the mycotoxins ochratoxin A and B", Archiv Fur
Lebensmittelhygiene, vol. 50, pp. 83-87.
Giesen, C., Jakubowski, N., Panne, U. & Weller, M.G. 2010, "Comparison of
ICP-MS and photometric detection of an immunoassay for the determination of
ochratoxin A in wine", Journal of Analytical Atomic Spectrometry, vol. 25, pp.
1567-1572.
Gimeno, A. & Martins, M. L. 2005, “Riesgo de micotoxicosis que algunas

micotoxinas (como contaminantes de los alimentos) pueden provocar en
humanos. Disponible en: http://www.engormix.com/MA-micotoxinas/articulos/riesgos-
micotoxicosis-algunas-micotoxinas-t366/p0.htm.
González-Peñas, E., Leache, C., López De Cerain, A. & Lizarraga, E. 2006,

"Comparison between capillary electrophoresis and HPLC-FL for ochratoxin A
quantification in wine", Food Chemistry, vol. 97, pp. 349-354.
González-Peñas, E., Leache, C., Viscarret, M., Pérez de Obanos, A.,

Araguás, C. & López de Cerain, A. 2004, "Determination of ochratoxin A in wine
- 217 -
BIBLIOGRAFÍA
using liquid-phase microextraction combined with liquid chromatography with

fluorescence detection", Journal of Chromatography A, vol. 1025, pp. 163-168.
Grosse, Y., Baudrimont, I., Castegnaro, M., Betbeder, A., Creppy, E.E.,
Dirheimer, G. & Pfohl-Leszkowicz, A. 1995, "Formation of ochratoxin A
metabolites and DNA-adducts in monkey kidney cells", Chemico-Biological
Interactions, vol. 95, pp. 175-187.
Han, Z., Zheng, Y.L., Luan, L.J., Ren, Y.P. & Wu, Y.J. 2010, "Analysis of
ochratoxin A and ochratoxin B in traditional Chinese medicines by ultra-high-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry using [13C20]-
ochratoxin A as an internal standard", Journal of Chromatography A, vol. 1217,
pp. 4365-4374.
Harris, J.P. & Mantle, P.G. 2001, "Biosynthesis of ochratoxins by Aspergillus

ochraceus", Phytochemistry, vol. 58, pp. 709-716.
Hernández, M.J., García-Moreno, M.V., Durán, E., Guilln, D. & Barroso, C.G.
2006, "Validation of two analytical methods for the determination of ochratoxin
A by reversed-phased high-performance liquid chromatography coupled to
fluorescence detection in musts and sweet wines from Andalusia", Analytica
Chimica Acta, vol. 566, pp. 117-121.
Heussner, A.H., Dietrich, D.R. & O'Brien, E. 2006, "In vitro investigation of
individual and combined cytotoxic effects of ochratoxin A and other selected
mycotoxins on renal cells", Toxicology in Vitro, vol. 20, pp. 332-341.
Hocking, A.D., Varelis, P., Pitt, J.I., Cameron, S.F. & Leong, S.L. 2003,
"Occurrence of ochratoxin A in Australian wine", Australian Journal of Grape and
Wine Research, vol. 9, pp. 72-78.
IARC 1993, "Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to

humans, some naturally ocurring substances: Food items and constituents,
heterocyclic aromatic amines and mycotoxins", International Agency for
Research on Cancer, vol. 56, pp. 489-521.
Ibáñez-Vea, M., Corcuera, L.A., Remiro, R., Murillo-Arbizu, M.T., González-

Peñas, E. & Lizarraga, E. 2011, "Validation of a UHPLC-FLD method for the
- 218 -
BIBLIOGRAFÍA
simultaneous quantification of aflatoxins, ochratoxin A and zearalenone in

barley", Food Chemistry, vol. 127, pp. 351-358.
Ibe, A., Nishijima, M. & Yasuda, K. 1984, "High performance liquid

chromatographic method for the determination of ochratoxins A and B in foods",
Journal of the Food Hygienic Society of Japan, vol. 25, pp. 334-341.
ICH 2005, “Validation of analytical procedures: Text and methodology Q2

(R1)”, International Conference on Harmonisation of Technical Requeriments for
Registration of Pharmaceuticals for Human Use.
IUPAC 2002, “Harmonized guidelines for single-laboratory validation of

methods of analysis”, International Union of Pure and Applied Chemistry.
JECFA 1991, Evaluation of certain food additives and contaminants. Thirty-

seventh report of the Joint FAO/WHO Expert Committee of Food Additives, WHO
Technical Report Series Nº 806.
JECFA 1995, Evaluation of certain food additives and contaminants. Forty-

fourth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee of Food Additives, WHO
JECFA 2001, Evaluation of certain mycotoxins. Fifty-sixth report of the Joint

FAO/WHO Expert Committee of Food Additives, WHO Technical Report Series Nº
906.
JECFA 2007, Evaluation of certain food additives and contaminants. Sixty-

eighth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee of Food Additives, WHO
Jiménez, A.M., López de Cerain, A., Gonzalez-Peñas, E. & Bello, J. 2001,

"Determination of ochratoxin A in pig liver-derived pâtés by high-performance
liquid chromatography", Food Additives and Contaminants, vol. 18, pp. 559-563.
Jonsyn-Ellis, F.E. 2001, "Seasonal variation in exposure frequency and

concentration levels of aflatoxins and ochratoxins in urine samples of boys and
girls", Mycopathologia, vol. 152, pp. 35-40.
Jørgensen, K. 1998, "Survey of pork, poultry, coffee, beer and pulses for
ochratoxin A", Food Additives and Contaminants, vol. 15, pp. 550-554.
- 219 -
BIBLIOGRAFÍA
Jornet, D., Busto, O. & Guasch, J. 2000, "Solid-phase extraction applied to

the determination of ochratoxin A in wines by reversed-phase high-performance
liquid chromatography", Journal of Chromatography A, vol. 882, pp. 29-35.
Kawamura, O. 2010, "Improvement of DEA solid phase extraction column

method for the determination of ochratoxin A and B in green and roasted coffee
and cereals by HPLC", Kagawa Daigaku Nogakubu Gakujutsu Hokoku, vol. 62,
pp. 77-82.
Knasmuller, S., Cavin, C., Chakraborty, A., Darroudi, F., Majer, B.J., Huber,
W.W. & Ehrlich, V.A. 2004, "Structurally related mycotoxins ochratoxin A,
ochratoxin B, and citrinin differ in their genotoxic activities and in their mode of
action in human-derived liver (HepG2) cells: Implications for risk assessment",
Nutrition and Cancer, vol. 50, pp. 190-197.
Koller, G., Wichmann, G., Rolle Kampczyk, U., Popp, P. & Herbarth, O.
2006, "Comparison of ELISA and capillary electrophoresis with laser-induced
fluorescence detection in the analysis of ochratoxin A in low volumes of human
blood serum", Journal of Chromatography B, vol. 840, pp. 94-98.
Krska, R. & Molinelli, A. 2007, "Mycotoxin analysis: State-of-the-art and

future trends", Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 387, pp. 145-148.
Kuiper-Goodman, T. 1996, "Risk assessment of ochratoxin A: An update",

Food Additives and Contaminants, vol. 13, pp. 53-57.
Kuiper-Goodman, T., Hilts, C., Billiard, S.M., Kiparissis, Y., Richard, I.D.K.
& Hayward, S. 2010, "Health risk assessment of ochratoxin A for all age-sex
strata in a market economy", Food Additives and Contaminants, vol. 27, pp.
212-240.
Kumagai, S., Nakajima, M., Tabata, S., Ishikuro, E., Tanaka, T., Norizuki,
H., Itoh, Y., Aoyama, K., Fujita, K., Kai, S., Sato, T., Saito, S., Yoshiike, N. &
Sugita-Konishi, Y. 2008, "Aflatoxin and ochratoxin A contamination of retail
foods and intake of these mycotoxins in Japan", Food Additives and
Contaminants, vol. 25, pp. 1101-1106.
Leitner, A., Zöllner, P., Paolillo, A., Stroka, J., Papadopoulou-Bouraoui, A.,
Jaborek, S., Anklam, E. & Lindner, W. 2002, "Comparison of methods for the
- 220 -
BIBLIOGRAFÍA
determination of ochratoxin A in wine", Analytica Chimica Acta, vol. 453, pp. 33-
41.
Lerch, c. & Muller, h. 1990, "Analysis of ochratoxins from buffered rumen

fluid by reversed-phase high-performance liquid-chromatography (HPLC)",
Chromatographia, vol. 30, pp. 424-427.
Li, S., Marquardt, R.R. & Frohlich, A.A. 2000, "Identification of ochratoxins
and some of their metabolites in bile and urine of rats", Food and Chemical
Toxicology, vol. 38, pp. 141-152.
Li, S., Marquardt, R.R. & Frohlich, A.A. 1998, "Confirmation of ochratoxins
in biological samples by conversion into methyl esters in acidified methanol",
Li, S., Marquardt, R.R., Frohlich, A.A., Vitti, T.G. & Crow, G. 1997,
"Pharmacokinetics of ochratoxin A and its metabolites in rats", Toxicology and
Applied Pharmacology, vol. 145, pp. 82-90.
Lin, L., Chen, P., Fu, Y. & Shih, D.Y. 2005, "Ochratoxin A contamination in
coffees, cereals, red wines and beers in Taiwan", Journal of Food and Drug
Analysis, vol. 13, pp. 84-92.
Lo Curto, R., Pellicanò, T., Vilasi, F., Munafò, P. & Dugo, G. 2004,
"Ochratoxin A occurrence in experimental wines in relationship with different
pesticide treatments on grapes", Food Chemistry, vol. 84, pp. 71-75.
López de Cerain, A., González-Peñas, E., Jiménez, A.M. & Bello, J. 2002,
"Contribution to the study of ochratoxin A in Spanish wines", Food Additives and
López de Cerain, A., Jiménez, A.M., Ezpeleta, O. & Bello, J. 2000, "Toxic
effects of ochratoxin A [Efectos toxicos de la ocratoxina A]", Revista de
Toxicologia, vol. 17, pp. 61-69.
MacDonald, S.J., Anderson, S., Brereton, P. & Wood, R. 2003,

"Determination of ochratoxin A in currants, raisins, sultanas, mixed dried fruit,
and dried figs by immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography:
Interlaboratory study", Journal of AOAC International, vol. 86, pp. 1164-1171.
- 221 -
BIBLIOGRAFÍA
Maggon, K., Gupta, S. & Venkitasubramanian, T. 1977, "Biosynthesis of

aflatoxins", Bacteriological Reviews, vol. 41, pp. 822-855.
Maier, N.M., Buttinger, G., Welhartizki, S., Gavioli, E. & Lindner, W. 2004,
"Molecularly imprinted polymer-assisted sample clean-up of ochratoxin A from
red wine: Merits and limitations", Journal of Chromatography B, vol. 804, pp.
103-111.
Mally, A., Dekant, W., Pepe, G., Fiore, M., Mosesso, P., Ravoori, S. &
Gupta, R.C. 2005a, "Ochratoxin A causes DNA damage and cytogenetic effects
but no DNA adducts in rats", Chemical Research in Toxicology, vol. 18, pp.
1253-1261.
Mally, A., Keim-Heusler, H., Amberg, A., Kurz, M., Zepnik, H., Mantle, P.,
Volkel, W., Hard, G.C. & Dekant, W. 2005b, "Biotransformation and
nephrotoxicity of ochratoxin B in rats", Toxicology and Applied Pharmacology,
vol. 206, pp. 43-53.
Markaki, P., Delpont-Binet, C., Grosso, F. & Dragacci, S. 2001,

"Determination of ochratoxin A in red wine and vinegar by immunoaffinity high-
pressure liquid chromatography", Journal of Food Protection, vol. 64, pp. 533-
537.
MARM 2009, Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino,

disponible en: http://www.marm.es/es/alimentacion/temas/consumo-y-
comercializacion-y-distribucion-alimentaria/panel-de-consumo-alimentario/
Marquardt, R.R. & Frohlich, A.A. 1992, "A review of recent advances in
understanding ochratoxicosis", Journal of Animal Science, vol. 70, pp. 3968-
3988.
Mateo, R., Medina, A., Mateo, E.M., Mateo, F. & Jimenez, M. 2007, "An
overview of ochratoxin A in beer and wine", International Journal of Food
Microbiology, vol. 119, pp. 79-83.
Miceli, A., Negro, C., Tommasi, L. & De Leo, P. 2003, "Polyphenols,

resveratrol, antioxidant activity and ochratoxin A contamination in red table
wines, controlled denomination of origin (DOC) wines and wines obtained from
organic farming", Journal of Wine Research, vol. 14, pp. 115-120.
- 222 -
BIBLIOGRAFÍA
Monaci, L. & Palmisano, F. 2004, "Determination of ochratoxin A in foods:

State-of-the-art and analytical challenges", Analytical and Bioanalytical
Chemistry, vol. 378, pp. 96-103.
Müller, G., Burkert, B., Möller, U., Diller, R., Rohrmann, B., Köhler, H. &
Rosner, H. 2004, "Ochratoxin A and some of its derivatives modulate radical
formation of porcine blood monocytes and granulocytes", Toxicology, vol. 199,
pp. 251-259.
Müller, G., Burkert, B., Rosner, H. & Köhler, H. 2003, "Effects of the
mycotoxin ochratoxin A and some of its metabolites on human kidney cell lines",
Toxicology in Vitro, vol. 17, pp. 441-448.
Murillo, M.T., Gonzalez-Peñas, E., Amézqueta, S. & López de Cerain, A.

2007, "In-house validation of a high-performance liquid chromatography
analytical method for quantification of ochratoxin A in unfermented grape juice",
Journal of the Science of Food and Agriculture, vol. 87, pp. 2164.
Nakazato M, Saito K, Ishikawa F, Fujinuma K, Moriyasu T, Nishima T,

Tamura Y & Tomomatsu T 1996, "Determination of ochratoxin A, ochratoxin B
and citrinin in cereals, beans and their products.", Annual Report of Tokyo
Metropolitan Research Laboratory of Public Health, vol. 47, pp. 100-104.
Ng, W., Mankotia, M., Pantazopoulos, P., Neil, R.J. & Scott, P.M. 2004,
"Ochratoxin A in wine and grape juice sold in Canada", Food Additives and
Ngundi, M.M., Shriver-Lake, L.C., Moore, M.H., Lassman, M.E., Ligler, F.S.
& Taitt, C.R. 2005, "Array biosensor for detection of ochratoxin A in cereals and
beverages", Analytical Chemistry, vol. 77, pp. 148-154.
Nielsen, K.F. & Smedsgaard, J. 2003, "Fungal metabolite screening:

database of 474 mycotoxins and fungal metabolites for dereplication by
standardised liquid chromatography–UV–mass spectrometry methodology",
Journal of Chromatography A, vol. 1002, pp. 111-136.
Noba, S., Omote, M., Kitagawa, Y. & Mochizuki, N. 2008, "Determination of

ochratoxin A in wine by immunoaffinity cleanup and liquid chromatography
tandem mass spectrometry", Journal of Food Protection, vol. 71, pp. 1038-1042.
- 223 -
BIBLIOGRAFÍA
O'Brien, E., Prietz, A. & Dietrich, D.R. 2005, "Investigation of the

teratogenic potential of ochratoxin A and B using the FETAX system", Birth
Defects Research. Part B, Developmental and Reproductive Toxicology, vol. 74,
pp. 417-423.
OIV 2001, "Resolution OENO 16/2001. Determination of ochratoxin A by

column of immuno-affinity", International Organisation of Vine and Wine.
OIV 2005a, “Resolución OENO 8/2005. Recomendaciones armonizadas para

la validación de métodos de análisis en un solo laboratorio”, International
Organisation of Vine and Wine.
OIV 2005b, “Resolución OENO 10/2005. Guía práctica para la validación, el

control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis
enológico alternativo”, International Organisation of Vine and Wine.
Otteneder, H. & Majerus, P. 2000, "Occurrence of ochratoxin A (OTA) in

wines: Influence of the type of wine and its geographical origin", Food Additives
Pacin, A., Resnik, S., Vega, M., Saelzer, R., Ciancio Bovier, E., Ríos, G. &
Martinez, N. 2005, "Occurrence of ochratoxin A in wines in the Argentinian and
Chilean markets", ARKIVOC, pp. 214-223.
Paterson, R.R.M. & Lima, N. 2010, “Toxicology of mycotoxins”, Molecular,

Clinical and Environmental Toxicology, vol. 100, pp. 31-63.
Pena, A., Cerejo, F., Silva, L.J.G. & Lino, C.M. 2010, "Ochratoxin A survey
in Portuguese wine by LC-FD with direct injection", Talanta, vol. 82, pp. 1556-
1561.
Perrone, G., Nicoletti, I., Pascale, M., De Rossi, A., De Girolamo, A. &
Visconti, A. 2007, "Positive correlation between high levels of ochratoxin A and
resveratrol-related compounds in red wines", Journal of Agricultural and Food
Pfohl-Leszkowicz, A., Grosse, Y., Kane, A., Creppy, E.E. & Dirheimer, G.
1993, "Differential DNA adduct formation and disappearance in three mouse
tissues after treatment with the mycotoxin ochratoxin A", Mutation Research -
Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 289, pp. 265-273.
- 224 -
BIBLIOGRAFÍA
Pfohl-Leszkowicz, A., Petkova-Bocharova, T., Chernozemsky, I.N. &

Castegnaro, M. 2002, "Balkan endemic nephropathy and associated urinary tract
tumours: A review on aetiological causes and the potential role of mycotoxins",
Pfohl-Leszkowicz, A. & Manderville, R.A. 2007, "Ochratoxin A: An overview

on toxicity and carcinogenicity in animals and humans", Molecular Nutrition &
Food Research, vol. 51, pp. 61-99.
Pietri, A., Bertuzzi, T., Pallaroni, L. & Piva, G. 2001, "Occurrence of

ochratoxin A in Italian wines", Food Additives and Contaminants, vol. 18, pp.
647-654.
Prieto-Simon, B., Campas, M., Marty, J.L. & Noguer, T. 2008, "Novel
highly-performing immunosensor-based strategy for ochratoxin A detection in
wine samples", Biosensors & Bioelectronics, vol. 23, pp. 995-1002.
Quintela, S., Villaran, M.C., López de Armentia, I. & Elejalde, E. 2011,

"Occurrence of ochratoxin A in Rioja Alavesa wines.", Food Chemistry, vol. 126,
pp. 302-305.
Radoi, A., Dumitru, L., Barthelmebs, L. & Marty, J.L. 2009, "Ochratoxin A in
some French wines: Application of a direct competitive ELISA based on an OTA-
HRP conjugate", Analytical Letters, vol. 42, pp. 1187-1202.
Reglamento (CE) Nº 401/2006 de la Comisión de 23 de febrero de 2006

por el que se establecen los métodos de muestreo y de análisis para el control
oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios. Diario Oficial
de la Unión Europea, L 70, pp. 12-34.
Reglamento (CE) Nº 1881/2006 de la Comisión, de 19 de diciembre de

2006, por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en
los productos alimenticios. Diario Oficial de la Unión Europea, L 364, pp. 5-24.
Reglamento (CE) Nº 1126/2007 de la Comisión, de 28 de septiembre de

2007, que modifica el Reglamento (CE) Nº 1881/2006 por el que se fija el
contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios
por lo que se refiere a las toxinas de Fusarium en el maíz y los productos del
maíz. Diario Oficial de la Unión Europea, L 255, pp. 14-17.
- 225 -
BIBLIOGRAFÍA
Reglamento (EU) Nº 105/2010 de la Comisión, de 5 de febrero de 2010,

que modifica el Reglamento (CE) Nº 1881/2006, por el que se fija el contenido
máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios por lo que
se refiere a la ocratoxina A. Diario Oficial de la Unión Europea, L 35, pp. 7-8.
Reglamento (EU) Nº 165/2010 de la Comisión, de 26 de febrero de 2010,

que modifica, en lo que respecta a las aflatoxinas, el Reglamento (CE) Nº
1881/2006 por el que se fija el contenido máximo de determinados
contaminantes en los productos alimenticios. Diario Oficial de la Unión Europea,
L 50, pp. 8-12.
Reinsch, M., Topfer, A., Lehmann, A. & Nehls, I. 2005, "Determination of

ochratoxin A in wine by liquid chromatography tandem mass spectrometry after
combined anion-exchange/reversed-phase clean-up", Analytical and
Reinsch, M., Töpfer, A., Lehmann, A., Nehls, I. & Panne, U. 2007,
"Determination of ochratoxin A in beer by LC–MS/MS ion trap detection", Food
Romero-González, R., Frenich, A.G., Vidal, J.L.M. & Aguilera-Luiz, M.M.

2010, "Determination of ochratoxin A and T-2 toxin in alcoholic beverages by
hollow fiber liquid phase microextraction and ultra high-pressure liquid
chromatography coupled to tandem mass spectrometry", Talanta, vol. 82, pp.
171-176.
Rosa, C.A.R., Fraga, M.E., Santana, D.M.N., Magnoli, C.E. & Dalcero, A.M.
2004, "Occurrence of ochratoxin A in wine and grape juice marketed in Rio de
Janeiro, Brazil", Food Additives and Contaminants, vol. 21, pp. 358-364.
Ruhland, M., Engelhardt, G., Schafer, W. & Wallnofer, P.R. 1996,

"Transformation of the mycotoxin ochratoxin A in plants: 1. Isolation and
identification of metabolites formed in cell suspension cultures of wheat and
maize", Natural Toxins, vol. 4, pp. 254-260.
Rusanova, T.Y., Beloglazova, N.V., Goryacheva, I.Y., Lobeau, M., Van

Peteghem, C. & De Saeger, S. 2009, "Non-instrumental immunochemical tests
for rapid ochratoxin A detection in red wine", Analytica Chimica Acta, vol. 653,
pp. 97-102.
- 226 -
BIBLIOGRAFÍA
Saéz, J.M., Medina, A., Gimeno-Adelantado, J.V., Mateo, R. & Jiménez, M.

2004, "Comparison of different sample treatments for the analysis of ochratoxin
A in must, wine and beer by liquid chromatography", Journal of Chromatography
A, vol. 1029, pp. 125-133.
Santos, E.A. & Vargas, E.A. 2002, "Immunoaffinity column clean-up and
thin layer chromatography for determination of ochratoxin A in green coffee",
SCOOP 1995, Task 3.2.2 “Assesment of dietary intake of ochratoxin A by

the population of EU Members States”, Reports EUR 17523.
SCOOP 2002, Task 3.2.7 “Assesment of dietary intake of ochratoxin A by

the population of EU Members States”, Reports on tasks for Scientific
Cooperation. Co-ordinators Miraglia, M. y Brera, C.
Scott, P.M. 2002, "Methods of analysis for ochratoxin A", Advances in

Experimental Medicine and Biology, vol. 504, pp. 117-134.
Scudamore, K.A. & MacDonald, S.J. 1998, "A collaborative study of an

HPLC method for determination of ochratoxin A in wheat using immunoaffinity
column clean-up", Food Additives and Contaminants, vol. 15, pp. 401-410.
Senyuva, H.Z., Gilbert, J., Ozcan, S. & Ulken, U. 2005, "Survey for co-
occurrence of ochratoxin A and aflatoxin B1 in dried figs in Turkey by using a
single laboratory-validated alkaline extraction method for ochratoxin A", Journal
of Food Protection, vol. 68, pp. 1512-1515.
Serra, R., Mendonça, C., Abrunhosa, L., Venâncio, A. & Pietri, A. 2004,
"Determination of ochratoxin A in wine grapes: Comparison of extraction
procedures and method validation", Analytica Chimica Acta, vol. 513, pp. 41-47.
Sforza, S., Dall'asta, C. & Marchelli, R. 2006, "Recent advances in

mycotoxin determination in food and feed by hyphenated chromatographic
techniques/mass spectrometry", Mass Spectrometry Reviews, vol. 25, pp. 54-
76.
Shephard, G.S., Stockenström, S., Mshicileli, N., Sewram, V. & Fabiani, A.

2003, "Quantitation of ochratoxin A in South African wines", Journal of
Agricultural and Food Chemistry, vol. 51, pp. 1102-1106.
- 227 -
BIBLIOGRAFÍA
Shundo, L., De Almeida, A.P., Alaburda, J., Ruvieri, V., Navas, S.A.,
Lamardo, L.C.A. & Sabino, M. 2006, "Ochratoxin A in wines and grape juices
commercialized in the city of São Paulo, Brazil", Brazilian Journal of
Microbiology, vol. 37, pp. 533-537.
Soleas, G.J., Yan, J. & Goldberg, D.M. 2001, "Assay of ochratoxin A in wine
and beer by high-pressure liquid chromatography photodiode array and gas
chromatography mass selective detection", Journal of Agricultural and Food
Solfrizzo, M., Panzarini, G. & Visconti, A. 2008, "Determination of

ochratoxin A in grapes, dried vine fruits, and winery byproducts by high-
performance liquid chromatography with fluorometric detection (HPLC-FLD) and
immunoaffinity cleanup", Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 56,
pp. 11081-11086.
Soriano, J.M. 2007, “Micotoxinas en alimentos”, Editorial Díaz de Santos,

Madrid. ISBN: 84-7978-808-9.
Soufleros, E.H., Bouloumpasi, E.C. & Tricard, C. 2003, "Occurrence of

ochratoxin A in Greek wines", Journal of the Science of Food and Agriculture,
vol. 83, pp. 173-179.
Spadaro, D., Lore, A., Garibaldi, A. & Gullino, M.L. 2010, "Occurrence of
ochratoxin A before bottling in DOC and DOCG wines produced in Piedmont
(Northern Italy)", Food Control, vol. 21, pp. 1294-1297.
Speijers, G.J.A. & Speijers, M.H.M. 2004, "Combined toxic effects of

mycotoxins", Toxicology Letters, vol. 153, pp. 91-98.
Stander, M.A., Steyn, P.S., Van der Westhuizen, F.H. & Payne, B.E. 2001,
"A kinetic study into the hydrolysis of the ochratoxins and analogues by
carboxypeptidase A", Chemical Research in Toxicology, vol. 14, pp. 302-304.
Stefanaki, I., Foufa, E., Tsatsou-Dritsa, A. & Dais, P. 2003, "Ochratoxin A

concentrations in Greek domestic wines and dried vine fruits", Food Additives
- 228 -
BIBLIOGRAFÍA
Steyn, P.S. 1971, "Ochratoxin and other dihydroisocoumarins" in Microbial

Toxins, eds. A. Ciegler, S. Kadis & S.J. Ajl, Academic Press, New York, pp. 179-
205.
Steyn, P.S. & Holzapfel .C.W. 1967a, "Isolation of methyl and ethyl esters
of ochratoxins A and B, metabolites of Aspergillus Ochraceus Wilh", Journal of
the South African Chemical Institute, vol. 20, pp. 186-&.
Steyn, P.S. & Holzapfel .C.W. 1967b, "The synthesis of ochratoxins A and
B: Metabolites of Aspergillus Ochraceus Wilh", Tetrahedron, vol. 23, pp. 4449-
4461.
Stormer, F.C., Storen, O. & Hansen, C.E. 1983, "Formation of (4R)- and
(4S)-4-hydroxyochratoxin A and 10-hydroxyochratoxin A from ochratoxin A by
rabbit liver microsomes", Applied and Environmental Microbiology, vol. 45, pp.
1183-1187.
Tabata, S., Iida, K., Kimura, K., Iwasaki, Y., Nakazato, M., Kamata, K. &
Hirokado, M. 2008a, "Investigation of ochratoxin A, B and citrinin contamination
in various commercial foods", Journal of the Food Hygienic Society of Japan, vol.
49, pp. 111-115.
Tabata, S., Iida, K., Kimura, K., Iwasaki, Y., Nakazato, M., Kamata, K. &
Hirokado, M. 2008b, "Simultaneous determination of ochratoxin A, B and citrinin
in foods by HPLC-FL and LC/MS/MS", Journal of the Food Hygienic Society of
Japan, vol. 49, pp. 100-105.
Tafuri, A., Meca, G. & Ritieni, A. 2008, "A rapid high-performance liquid
chromatography with fluorescence detection method developed to analyze
ochratoxin A in wine", Journal of Food Protection, vol. 71, pp. 2133-2137.
Tessini, C., Mardones, C., von Baer, D., Vega, M., Herlitz, E., Saelzer, R.,
Silva, J. & Torres, O. 2010, "Alternatives for sample pre-treatment and HPLC
determination of ochratoxin A in red wine using fluorescence detection",
Analytica Chimica Acta, vol. 660, pp. 119-126.
USP 2009, “USP 32 – NF 27, U. S. Pharmacopeia”.
- 229 -
BIBLIOGRAFÍA
Valenta, H. 1998, "Chromatographic methods for the determination of

ochratoxin A in animal and human tissues and fluids", Journal of
Chromatography A, pp. 75-92.
Valero, A., Marin, S., Ramos, A. & Sanchis, V. 2008, "Survey: Ochratoxin A
in European special wines", Food Chemistry, vol. 108, pp. 593.
Van der Merwe, K.J., Steyn, P.S. & Fourie, L. 1965a, "Mycotoxins. Part II.
Constitution of ochratoxins A, B and C, metabolites of Aspergillus Ochraceus
Wilh", Journal of the Chemical Society, pp. 7083-7088.
Van der Merwe, K.J., Steyn, P.S. & Fourie, L. 1965b, "Ochratoxin A, a toxic
metabolite produced by Aspergillus ochraceus Wilh", Nature, vol. 205, pp. 1112-
1113.
Var, I. & Kabak, B. 2007, "Occurrence of ochratoxin A in Turkish wines",

Microchemical Journal, vol. 86, pp. 241.
Varelis, P., Leong, S.L., Hocking, A. & Giannikopoulos, G. 2006,

"Quantitative analysis of ochratoxin A in wine and beer using solid phase
extraction and high performance liquid chromatography-fluorescence detection",
Varga, J., Kiss, R., Mátrai, T., Mátrai, T. & Téren, J. 2005, "Detection of
ochratoxin A in Hungarian wines and beers", Acta Alimentaria, vol. 34, pp. 381-
392.
Visconti, A. & Bottalico, A. 1983, "High levels of ochratoxin A and

ochratoxin B in moldy bread responsible for mycotoxicosis in farm animals",
Visconti, A. & De Girolamo, A. 2005, "Fitness for purpose - ochratoxin A

analytical developments", Food Additives and Contaminants, vol. 22, Supp 1, pp.
37-44.
Visconti, A., Pascale, M. & Centonze, G. 2001, "Determination of ochratoxin

A in wine and beer by immunoaffinity column clean-up and liquid
chromatographic analysis with fluorometric detection: Collaborative study",
Journal of AOAC International, vol. 84, pp. 1818-1827.
- 230 -
BIBLIOGRAFÍA
Visconti, A., Pascale, M. & Centonze, G. 1999, "Determination of ochratoxin

A in wine by means of immunoaffinity column clean-up and high-performance
liquid chromatography", Journal of Chromatography A, vol. 864, pp. 89-101.
Walker, R. 2002, "Risk assessment of ochratoxin: Current views of the

European Scientific Committee on Food, the JECFA and the CODEX Committee
on food additives and contaminants", Advances in Experimental Medicine and
Biology, vol. 504, pp. 249-255.
Wei, Y., Qiu, L.H., Yu, J.C.C. & Lai, E.P.C. 2007, "Molecularly imprinted
solid phase extraction in a syringe needle packed with polypyrrole-encapsulated
carbon nanotubes for determination of ochratoxin A in red wine", Food Science
and Technology International, vol. 13, pp. 375-380.
Welke, J.E., Hoeltz, M., Dottori, H.A. & Noll, I.B. 2010, "Determination of
ochratoxin A in wine by high-performance thin-layer chromatography using
charged coupled device", Journal of the Brazilian Chemical Society, vol. 21, pp.
441-446.
Wu, J., Tan, Y., Wang, Y. & Xu, R. 2011, "Occurrence of ochratoxin A in
grain and manufactured food products in China detected by HPLC with
fluorescence detection and confirmed by LC-ESI-MS/MS", Mycopathologia,
Online.
Xiao, H., Madhyastha, S., Marquardt, R.R., Li, S., Frohlich, A.A., Vodela,
J.K. & Kemppainen, B.W. 1996a, "Toxicity of ochratoxin A, its opened lactone
form and several of its analogs: Structure-activity relationships", Toxicology and
Applied Pharmacology, vol. 137, pp. 182-192.
Xiao, H., Marquardt, R.R., Abramson, D. & Frohlich, A.A. 1996b,

"Metabolites of ochratoxins in rat urine and in a culture of Aspergillus
ochraceus", Applied and Environmental Microbiology, vol. 62, pp. 648-655.
Yu, J.C.C. & Lai, E.P.C. 2007, "Determination of ochratoxin A in red wines
by multiple pulsed elutions from molecularly imprinted polypyrrole", Food
Yu, J.C.C. & Lai, E.P.C. 2006, "Molecularly imprinted polypyrrole modified
carbon nanotubes on stainless steel frit for selective micro solid phase pre-
- 231 -
BIBLIOGRAFÍA
concentration of ochratoxin A", Reactive and Functional Polymers, vol. 66, pp.
702-711.
Yu, J.C.C. & Lai, E.P.C. 2005, "Polypyrrole modified stainless steel frits for
on-line micro solid phase extraction of ochratoxin A", Analytical and Bioanalytical
Yuan, J., Deng, D., Lauren, D.R., Aguilar, M.-. & Wu, Y. 2009, "Surface
plasmon resonance biosensor for the detection of ochratoxin A in cereals and
beverages", Analytica Chimica Acta, vol. 656, pp. 63-71.
Zaied, C., Abid, S., Bouaziz, C., Chouchane, S., Jomaa, M. & Bacha, H.
2010, "Ochratoxin A levels in spices and dried nuts consumed in Tunisia", Food
Additives and Contaminants, vol. 3, pp. 52-57.
Zezza, F., Longobardi, F., Pascale, M., Eremin, S.A. & Visconti, A. 2009,
"Fluorescence polarization immunoassay for rapid screening of ochratoxin A in
red wine", Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 395, pp. 1317-1323.
Zimmerli, B. & Dick, R. 1996, "Ochratoxin A in table wine and grape-juice:

Occurrence and risk assessment", Food Additives and Contaminants, vol. 13, pp.
655-668.
Zimmerli, B. & Dick, R. 1995, "Determination of ochratoxin A at the ppt

level in human blood, serum, milk and some foodstuffs by high-performance
liquid chromatography with enhanced fluorescence detection and immunoaffinity
column clean-up: Methodology and Swiss data", Journal of Chromatography B,
vol. 666, pp. 85-99.
Zöllner, P., Leitner, A., Lubda, D., Cabrera, K. & Lindner, W. 2000,
"Application of a Chromolith SpeedROD RP-18e HPLC column: Determination of
ochratoxin A in different wines by high-performance liquid chromatography-
tandem mass spectrometry", Chromatographia, vol. 52, pp. 818-820.
Zöllner, P. & Mayer-Helm, B. 2006, "Trace mycotoxin analysis in complex

biological and food matrices by liquid chromatography-atmospheric pressure
ionisation mass spectrometry", Journal of Chromatography A, vol. 1136, pp.
123-169.
- 232 -

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