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Secondary metabolites in grasses: characterization and biological activity

Article · February 2011


DOI: 10.4081/ija.2007.4s.441 · Source: DOAJ

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0 146

1 author:

Aldo Tava
CRA-FLC Centro di Ricerca per le Produzioni Foraggere e Lattiero Casearie
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Ital. J. Agron. / Riv. Agron., 2007, 4:441-450

Metaboliti secondari in piante di interesse agrario:


caratterizzazione e attività biologica
Aldo Tava*
CRA – SLC Centro di Ricerca per le Produzioni Foraggere e Lattiero-Casearie
Viale Piacenza 29, 26900 Lodi

Data di presentazione: 20 marzo 2005


Data di accettazione: 2 settembre 2005

Riassunto
Nell’ambito di indagini sul valore nutrizionale di specie foraggere, si è dato sempre più ampio spazio allo studio di
componenti minori, definiti metaboliti secondari, che possono influenzare alcuni aspetti nutrizionali del foraggio.
Infatti, accanto ai componenti principali, protidi, glucidi, lipidi, fibre, che ne determinano le caratteristiche nutri-
zionali, vi sono i metaboliti secondari che ne possono influenzare, in alcuni casi, l’utilizzo. Il nome metaboliti se-
condari, deriva dal fatto che queste sostanze sono presenti nella pianta in concentrazione molto inferiore rispetto
agli altri costituenti principali, ma sono indispensabili alla pianta stessa perchè entrano a far parte dei suoi com-
plessi processi fisiologici. Queste sostanze sono spesso dotate di particolari attività biologiche e ciò li rende impor-
tanti dal punto di vista nutrizionale ed interessanti anche per il loro possibile utilizzo in ambito farmacologico. Nel
presente lavoro sono riportati i vari metaboliti indagati, nonché indicazioni sui metodi di analisi, la loro presenza
nel materiale vegetale e la loro attività biologica.

Parole chiave: metaboliti secondari, sostanze volatili, saponine, inibitori di proteasi, fitoestrogeni, glucosidi cianoge-
nici, alcaloidi.

Summary

SECONDARY METABOLITES IN GRASSES: CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY


In a series of studies dealing on the nutritional value of forage species, more attention was focussed on several com-
pounds, named secondary metabolites, that are important in determining nutritional characteristics. Secondary me-
tabolites are compounds detected in the green materials in low concentration compared to primary metabolites
(proteins, sugars, lipids, fibers), but of fundamental importance for the plant physiology. The possess several biolo-
gical activities and this contribute to their possible pharmacological use. In the present paper studies on secondary
metabolites from herbaceous plants are reviewed. Indications of the chemical methods used for their analyses, their
presence in the green material and their biological activity are also reported.

Key-words: secondary metabolites, volatiles, saponins, protease inhibitors, phytoestrogens, cyanogenic glucosides, alka-
loids.

*
Autore corrispondente: Tel.: +39 0371 404740; Fax: +39 0371 31853. Indirizzo e-mail: aldo.tava@entecra.it

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Tava A.

1. Introduzione carburi, aldeidi , acidi, alcoli, ammine, ammidi,


composti eterociclici, ecc., mentre dal punto di
Nell’ambito di indagini sul valore nutrizionale
vista della loro struttura e/o della loro via bio-
di specie foraggere, si è dato sempre più ampio
sintetica, le sostanze più rappresentative appar-
spazio allo studio di componenti minori, defini-
tengono alla classe dei terpeni e terpenoidi, al-
ti metaboliti secondari, che possono influenzare
caloidi e sostanze fenoliche (Goodwin e Mer-
alcuni aspetti nutrizionali del foraggio. Infatti,
cer, 1985).
accanto ai componenti principali, protidi, gluci-
Lo studio dei metaboliti secondari è abba-
di, lipidi, fibre, che ne determinano le caratteri-
stanza complesso data la loro relativa bassa con-
stiche nutritive (contribuiscono all’accrescimen-
centrazione nel materiale vegetale ed a causa
to corporeo, alla produzione di latte, ecc.), vi so- della complessità della matrice organica dalla
no i metaboliti secondari che ne possono in- quale vanno estratti e purificati. Queste sostan-
fluenzare, in alcuni casi, l’utilizzo (Makkar, 1993; ze inoltre sono presenti in miscela e questo
Sen et al., 1998). comporta l’uso di tecniche particolari che per-
È noto da tempo che alcune di queste so- mettono la loro separazione, oltre che la loro
stanze possono influenzare l’appetibilità, ad caratterizzazione e quantificazione.
esempio per il loro sapore, possono essere re- L’estrazione solitamente viene effettuata con
sponsabili di tossicità, quali gli alcaloidi ed i l’impiego di solventi a partire dal materiale ve-
composti cianogenici, o possono invece conferi- getale disidratato a basse temperature (di soli-
re caratteristiche positive, come nel caso dei tan- to non oltre i 50 °C) o liofilizzato. L’uso del ma-
nini. teriale vegetale fresco è indispensabile per quei
Il nome metaboliti secondari deriva dal fat- composti, come ad esempio le sostanze volatili,
to che queste sostanze sono presenti nella pian- che possono essere persi o subire alterazioni du-
ta in concentrazione molto inferiore rispetto rante i processi di disidratazione. Dall’estratto
agli altri costituenti principali, ma sono indi- grezzo si procede poi alla purificazione dei va-
spensabili alla fisiologia delle pianta stessa, in ri metaboliti mediante cromatografia in fase
quanto entrano a far parte dei vari processi bio- normale (silica gel) o in fase inversa (RP 18),
logici (es. enzimi, coenzimi, ecc.). Alcuni di que- mentre per le valutazioni quali-quantitative si
sti composti, costituiscono i meccanismi di dife- utilizzano tecniche gascromatografiche (GC) e
sa della pianta, ed in genere sono accumulati in di gascromatografia accoppiata alla spettrome-
particolari organuli o sintetizzati come precur- tria di massa (GC/MS), o di cromatografia li-
sori ed immediatamente attivati ad opera di en- quida HPLC (High Performance Liquid Chro-
zimi specifici in risposta ad attacchi esterni. Al- matography). La caratterizzazione della struttu-
tri, come accennato, sono elementi importanti ra chimica dei vari metaboliti è di solito effet-
alla fisiologia della pianta, come nel caso dei tuata mediante tecniche chimico-fisiche e spet-
composti odorosi emessi dai fiori quali attratto- troscopiche quali 1H e 13C NMR (Nuclear Ma-
ri di insetti pronubi ai fini dell’impollinazione. gnetic Resonance), massa, Infra Red spectro-
Negli ultimi anni, inoltre, si è rivalutato il con- scopy (IR) e UltraViolet spectroscopy (UV) a
cetto di “fitoterapia animale” e si cerca quindi partire dai vari composti purificati. Le tecniche
di riconsiderare a tale scopo queste sostanze, so- di analisi usate sono stabilite di volta in volta a
prattutto quelle che possono in qualche modo seconda del tipo di sostanze da analizzare.
apportare effetti positivi all’animale e, di con- Di seguito sono riportati i vari metaboliti in-
seguenza, ai prodotti da esso derivati destinati dagati nonché indicazioni sui metodi di analisi,
all’alimentazione umana (Tedesco, 2001; Grea- sulla loro presenza nel materiale vegetale e sul-
thead, 2003). D’altro canto questi composti so- la loro attività biologica.
no molto spesso dotati di particolari “attività
biologiche” (battericida, fungicida, citotossica)
che li rendono interessanti anche in ambito far- 2. Classe di composti esaminati
macologico.
Dal punto di vista chimico i metaboliti se- 2.1 Sostanze volatili
condari sono praticamente rappresentati da Lo studio delle sostanze volatili, è stato inizial-
quasi tutte le classi di composti organici: idro- mente condotto su una varietà di Festuca arun-

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dinacea, per indagare la natura chimica di que- devole odore. Questa sostanza rappresenta il
sti composti (Tava et al., 1991), ed è poi prose- 95% dell’olio essenziale estratto da materiale
guito considerando alcune cultivars di questa fo- fresco (circa 43 mg/g ss) ed il 45% dell’olio es-
raggera a diversi stadi vegetativi per meglio va- senziale dal fieno (circa 22 mg/g ss) (Tava,
lutare la relazione fra appetibilità e composi- 2001). Tali concentrazioni non sono da conside-
zione chimica (Tava et al., 1993a; 1995). Tale stu- rarsi pericolose per l’animale.
dio ha dimostrato che i componenti principali Infine, lo studio dell’olio essenziale di Bellis
della frazione volatile di F. arundinacea sono al- perennis, altra specie spontanea di prati polifiti,
coli, aldeidi ed esteri a sei atomi di carbonio, fra ha portato all’identificazione di nuovi composti
cui cis-3-esenolo, trans-2-esenale e cis-3-esenil poliacetilenici (Fig. 1) (Avato e Tava, 1995) che
acetato sono i più rappresentativi. Questi com- hanno dimostrato interessanti proprietà antimi-
posti sono caratteristici e tipici dell’odore di er- cotiche (Avato et al., 1997).
ba appena falciata, e sono prodotti in tutti i tes-
suti vegetali per rottura enzimatica della catena CH3 CH2 CH2 C C C C CH2 CH2 CH3
dell’acido linolenico (Hatanaka et al., 1987). deca-4,6-diynoic acid methyl ester
L’indagine non ha mostrato differenze qualita-
tive nella composizione dei volatili nelle diver-
CH3 CH2 CH2 C C C C CH CH CH3
se cultivars esaminate, ma ha evidenziato una
lachnophyllum ester
notevole variabilità del loro contenuto durante
la stagione di crescita (cis-3-esenolo 2.0-7.7 µg/g,
trans-2-esenale 0.4-1.5 µg/g e cis-3-esenil aceta- CH3 CH CH C C C C CH CH CH3
to 0.3-1.2 µg/g, calcolati sul peso del materiale matricaria ester
fresco). Queste valutazioni, insieme alle varie
determinazioni bromatologiche (proteine, fibre, CH3 CH2 CH2 C C C C CH2 CH2 CH3
zuccheri solubili), non hanno permesso di sta- deca-4,6-diynoic acid
bilire una chiara relazione fra appetibilità e
composizione chimica. CH3 CH2 CH2 C C C C CH CH CH3
Al contrario, lo studio dei volatili da fiori di lachnophyllum acid
Medicago sativa (Tava e Pecetti, 1997; Tava et
Figura 1. Composti poliacetilenici trovati in Bellis perennis.
al., 2000a), condotto per meglio comprendere i
meccanismi che regolano l’impollinazione di Figure 1. Polyacethylenic compounds found in Belli perennis.
questa foraggera, ha mostrato interessanti cor-
relazioni fra il contenuto in sostanze volatili ed
il colore dei fiori (Pecetti e Tava, 2000). Le prin- 2.2 Saponine
cipali sostanze identificate sono: i composti a sei Le saponine sono sostanze glicosidiche costitui-
atomi di carbonio tipici del materiale vegetale te da un triterpene pentaciclico o steroideo
(trans-2-esenale 6.7-59.8 µg/g peso fresco, esa- (aglicone) e da un numero variabile di unità mo-
nale 1.7-17.3 µg/g, 2-metil-4-pentenale 1.4-21.1 nosaccaridiche, sia pentosi che esosi (Hostett-
µg/g, cis-3-esenolo 1.3-7.5 µg/g), alcuni composti mann e Marston, 1995). Le saponine sono state
a otto atoni di carbonio (1-otten-3-olo 1.0-9.2 identificate in numerose specie vegetali, fra cui
µg/g, 1,5-ottadien-3-olo 1.0-11.5 µg/g, ottan-3- le Leguminose, dove sembra facciano parte dei
one 0.7-5.1 µg/g) e alcuni monoterpeni (trans- vari meccanismi di difesa della pianta verso at-
ocimeme 0.1-3.7 µg/g, limonane 0.1-3.3µg/g). In tacchi di erbivori e patogeni, soprattutto per le
un lavoro successivo si è potuto inoltre stabili- loro particolari attività biologiche. Nel genere
re anche quale tra i vari composti identificati, Medicago l’unità agliconica è costituita da un
sia maggiormente responsabile dell’attività ver- triterpene pentaciclico (acido medicagenico,
so insetti pronubi (Pecetti et al., 2002). ederagenico, zanhico e soiasapogenoli) e da zuc-
Lo studio delle sostanze volatili ha previsto cheri (arabinosio, ramnosio, xilosio, glucosio,
anche l’indagine di specie spontanee di prati po- acido glucuronico, apiosio) fino ad un massimo
lifiti, come nel caso di Anthoxanthum odoratum, di 7 unità (Oleszek, 1996) legati alla struttura
dove la presenza di curarina, sostanza tossica, triterpenica all’ossidrile in posizione 3 e, quan-
conferisce all’erba e al fieno un particolare gra- do presenti, al carbossile in posizione 28 (Fig.

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Tava A.

2). È noto da tempo che le saponine sono as- pillare (Tava et al., 2000b) per la quantificazio-
sociate a effetti antinutrizionali ed in M. sativa ne in M. sativa anche ai fini del miglioramento
un notevole lavoro di breeder è stato svolto per genetico (Tava e Pecetti, 1998; Tava et al., 1999a)
abbassarne il contenuto (Rotili e Zannone, e la valutazione della loro attività emolitica e
1976). È stato infatti dimostrato che un alto con- delle loro proprietà chimico-fisiche (Mella et al.,
tenuto di saponine nella dieta inibisce la cresci- 2002; Tava et al., 2003a) per meglio compren-
ta corporea in specie avicole e suini, e questo dere il loro effetto quali sostanze antinutrizio-
effetto può essere diminuito aggiungendo nella nali.
dieta colesterolo (Fenwick et al., 1991). È stato Le saponine vengono estratte dal materiale
inoltre dimostrato che le saponine di erba me- vegetale con metanolo-acqua 30:70 e prepurifi-
dica sono responsabili della riduzione della fer- cate su resina RP 18. Le singole saponine pure
mentazione ruminale e della conseguente de- vengono ottenute dalla separazione della mi-
gradazione degli alimenti (Lu e Jorgensen, scela mediante l’uso di colonne cromarografiche
1987), nonché di effetti di alterazione di assor- in fase normale (gel di silice) ed in fase inver-
bimento dei nutrienti a livello intestinale sa (RP 18) ed analizzate in spettrometria di
(Cheeke, 1996). massa per determinarne il peso molecolare e
La valutazione del contenuto in saponine nel mediante tecniche 1H e 13C NMR per determi-
materiale vegetale risulta quindi di fondamen- narne la struttura chimica. Dalla miscela di sa-
tale importanza anche ai fini della selezione ge- ponine mediante idrolisi acida si ottengono le
netica. I metodi comunemente utilizzati a tale sapogenine che sono valutate con analisi GC e
scopo sono i test biologici con Trichoderma vi- GC/MS per ottenere i dati quantitativi. A dif-
ride (Zimmer et al., 1967) ed il blood test (Jurzy- ferenza dei vari test biologici, questo metodo
sta, 1979) che sfruttano le proprietà antimicoti- permette la quantificazione dei vari agliconi che
che ed emolitiche delle saponine di erba medi- costituiscono la miscela di saponine.
ca. Sebbene questi test siano relativamente ve- Da queste indagini si è visto che il contenu-
loci e permettano quindi una rapida valutazio- to in saponine e sapogenine in erba medica va-
ne di numerosi campioni, non danno però nes- ria in relazione a numerosi fattori intrinseci ed
suna indicazione sulla natura e composizione estrinseci. Le saponine sono contenute in mag-
dei costituenti la miscela di saponine. gior quantità nelle radici (3.0-3.7% DM) rispet-
Lo studio di queste sostanze ha previsto la to alle parti aeree della pianta (0.5-2.5% DM),
messa a punto di tecniche analitiche GC e dove il contenuto varia in modo significativo in
GC/MS (Tava et al., 1993b) e in elettroforesi ca- funzione della varietà e dello stadio fisiologico.

29 30
29 30

19 20 21
19 20 21
12 18
12 18
11 22
11 22
25 26 13 17
25 26 13 17
COOH 1 9 COOH
1 9 14 28
14
HO 2 16
28 2 16
10 8 15
10 8 15
3 27
3 27 7
7 4 5
4 5 HO
HO 6
6
23
24 COOH acido medicagenico 24 ederagenina
23
OH
29 30
29 30

Figura 2. Principali sapogenine 19 20 21


19 20 21
identificate in M. sativa. Nelle sa- 12 18 22
ponine gli zuccheri sono attacca- 12 18 11
13 OH
11 22 25 26 17
ti all’ossidrile in C-3 e, quando 25 26 13 17 1 9 14 28
COOH 16
presenti, al carbossile in C-28. HO
1 9 14 28
2
10 8
2 16 15
10 8
Figure 2. Most abundant sapoge- 15 OH 3 27
4 5 7
3 27
HO
nins found in M. sativa. In sapo- 4 5 7 6
HO 24
nins sugars are linked at C-3 po- 6
acido zanhico
23 soyasapogenolo B
24 COOH
sition and, when present, at C-28. 23 OH

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Relativamente all’acido medicagenico, la sapo- loro alto contenuto in cisteina, pare che queste
genina più abbondante riscontrata in M. sativa, sostanze abbiano anche la funzione di proteine
si è visto che il suo contenuto varia da 0.2-1.0 di riserva e vengano quindi degradate durante
mg/g DM in Sinesap, varietà selezionata per il la germinazione del seme e le prime fasi di cre-
basso tenore in queste sostanze, a 0.5-2.5 mg/g scita della plantula (Papastoitsis e Wilson, 1991).
DM in varietà commerciali quali Boreal, Equi- Fra le varie attività biologiche riscontrate, è
pe, DuPuits, LaRocca, Lodi e Prosementi, fino inoltre noto che diversi inibitori di proteasi pos-
ad arrivare a 0.5-3.5 mg/g DM in Romagnola siedono attività antitumorale (Kennedy, 1993;
(Tava et al., 1993b, 1999a, 1999b). È stato inol- Clark et al., 1993).
tre dimostrato che il contenuto in saponine va- Il lavoro è iniziato con una prima indagine
ria durante la stagione di crescita mostrando un volta alla valutazione dell’attività antitriptica in
accumulo nel periodo estivo-autunnale. Le sa- semi di alcune specie di Medicago, mostrando
ponine dell’acido medicagenico aumentano dal- una notevole variabilità nel contenuto in queste
la primavera, raggiungono la concentrazione sostanze (Odoardi et al., 1994). Lo studio si è
massima nel periodo estivo e successivamente quindi focalizzato sulla caratterizzazione di que-
mostrano un lieve decremento, mentre le sapo- sta proteina da M. scutellata, in cui era stato ri-
nine dell’acido zanhico crescono con andamen- scontrato il valore più elevato di attività anti-
to pressoché uniforme fino a raggiungere il va- triptica. Si è quindi provveduto ad ottenere que-
lore massimo in autunno (Tava et al., 1999a, sta proteina nativa altamente purificata (MsTI)
1999b). che è servita per la determinazione della sua se-
È stata inoltre studiata la presenza di que- quenza amminoacidica e del suo peso moleco-
ste sostanze in altre specie del genere Medica- lare. Ne è stata inoltre valutata l’attività su pro-
go, quali M. arabica (Bialy et al., 2004a), M. hy- teasi estratte da insetti fitofagi. Questa proteina
brida (Bialy et al., 2004b) e M. arborea (Tava et è risultata essere un inibitore di proteasi a seri-
al., 2004). Inoltre, in vista di un possibile utiliz- na del tipo Bowman-Birk contenente sette pon-
zo di queste sostanze per le loro proprietà bio- ti disolfuro e con un peso molecolare di 6925
cide, le saponine sono state anche studiate qua- Da (Ceciliani et al., 1997).
li agenti antimicrobici e di biocontrollo su mi- Lo sviluppo determinante a questo lavoro è
croorganismi patogeni umani e vegetali e su in- stato affrontato con la valutazione dell’attività
setti dannosi (Tava e Odoardi, 1996; Avato et antitumorale di questa nuova proteina e con in-
al., 2003; Avato et al., 2004). Queste sostanze so- dagini più dettagliate sulla sua struttura tridi-
no attualmente oggetto di studio per le loro pro- mensionale nell’ambito di uno specifico pro-
prietà citotossiche. gramma di ricerca. Le ricerche in vitro su linee
tumorali umane, hanno evidenziato l’effetto ci-
2.3 Inibitori di proteasi totossico di questa proteina anche su linee cel-
Gli inibitori di proteasi, sono una classe di pro- lulari che hanno sviluppato resistenza al cis-pla-
teine a basso peso molecolare (6-9 KDa), pre- tino (Lanza et al., 2004).
senti in piccola quantità nei semi e negli orga- Le indagini strutturali della proteina in so-
ni di riserva di piante appartenenti a diverse fa- luzione a differenti pH mediante tecniche 1H
miglie, fra cui le Leguminose. I semi di legumi- NMR, hanno portato a definirne l’esatta se-
nose contengono infatti inibitori di proteasi a quenza amminoacidica (Catalano et al., 2002),
serina che possono essere distinti in due fami- nonché studiarne la sua struttura tridimensio-
glie: quelli appartenenti al gruppo degli inibito- nale e le sue proprietà fisico-chimiche (Fig. 3).
ri di proteasi tipo Kunitz, e quelli di tipo Bow- I risultati di questa indagine hanno evidenziato
man-Birk (Birk, 1994). Questi inibitori sembra che: dalla sovrapposizione delle 15 strutture più
siano coinvolti nei meccanismi di difesa della probabili, nel primo dominio (Fig. 3c) è presen-
pianta in quanto attivi anche sulle proteasi di te un legame idrogeno (evidenziato in verde)
insetti fitofagi (Ryan, 1990), sembra svolgano un tra la Thr e la posizione P5, mentre nel secon-
ruolo di controllo sulle proteasi endogene du- do dominio (Fig. 3d) solo alcune delle 15 strut-
rante le fasi metaboliche di stoccaggio delle pro- ture mostrano questa possibilità. Ciò si traduce
teine di riserva del seme e durante la fase di in una maggiore mobilità e flessibilità del se-
dormienza (Richardson, 1991). Infine, grazie al condo dominio rispetto al primo e quindi in una

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Tava A.

P1 produttive soprattutto in ovini causando un de-


cremento della fertilità e aborti spontanei. La
a loro attività estrogenica ha fatto sì che vengano
b
considerate sostanze interessanti anche dal pun-
to di vista farmacologico. La valutazione del
contenuto in fitoestrogeni nel materiale vegeta-
le è quindi di notevole importanza, non solo ai
fini del loro utilizzo, ma anche in programmi di
miglioramento genetico.
Con lo scopo di verificare la presenza di fi-
P1 toestrogeni in una collezione di Trifolium di ori-
gine siciliana, sono stati valutati i principali iso-
flavoni: daidzeina, formononetina, genisteina e
biochanina A (Fig. 4), mediante un metodo se-
c d mi-quantitativo in TLC (Thin Layer Chromato-
1st domain 2nd domain graphy). Mediante l’uso di standards l’indagine
THR THR è stata effettuata su diverse popolazioni di trifo-
glio a diversi stadi fenologici, per poter anche
stabilire il picco di concentrazione di queste so-
P5 stanze. Il metodo relativamente semplice preve-
de l’impiego di materiale fresco dove l’idrolisi
Figura 3. Struttura 3D dell’MsTI. a) ponti disolfuro. b) so-
vrapposizione delle 15 strutture finali nel range dei residui
dei precursori dei fitoestrogeni (glicosidi) viene
6-61. I filamenti β-sheet sono indicati rispettivamente in fatta sfruttando le glicosidasi endogene maci-
giallo e in rosso. c) e d) mostrano le sovrapposizioni delle nando il materiale vegetale con della sabbia. Gli
15 strutture nei range dei residui che costituiscono i due do- enzimi posti a contatto con i vari glicosidi libe-
mini. rano gli isoflavoni che, estratti con etanolo, ven-
Figure 3. MsTI 3D structure. a) Disulphide bridges b) Back- gono analizzati in TLC e rivelati mediante UV
bone superposition of the 15 final structures in the range of e/o con reazioni colorimetriche.
residues 6-61. The first three-stranded β-sheet is indicated
in yellow while the second is shown in red. c) and d) su-
Da questa serie di analisi si è visto che il con-
perposition of the 15 structures in the range of residues tenuto in daidzeina è risultato essere molto bas-
that form the two domains. so in tutti i campioni esaminati, mentre il con-
tenuto degli altri tre composti è risultato esse-
minore affinità per la tripsina. Sulla base di que- re variabile. Maggiori quantità di isoflavoni so-
ste evidenze sono state poi estrapolate importan- no presenti alla fioritura, ed il contenuto in iso-
ti conclusioni in relazione alla sua attività anti-
cellulare (Catalano et al., 2003; Tava et al., 2003b). HO O HO O
Successivamente, dalla proteina ad elevato
grado di purezza è stato ottenuto il corrispon-
dente anticorpo e dalla conoscenza dell’esatta O O
OH
sequenza amminoacidica, è stato possibile clo- daidzein formononetin
nare il gene corrispondente (Balestrazzi et al.,
2004) da potersi utilizzare in ulteriori program-
HO O HO O
mi di ricerca.

2.4 Fitoestrogeni
OH O OH O
I fitoestrogeni, sono sostanze ad attività estro- OH
genistein biochanin A
genica e sono presenti in molte leguminose tra
cui in trifoglio nelle specie T. subterraneum e T. Figura 4. Struttura degli isoflavoni da Trifolium subterra-
brachycalycinum dove appartengono alla classe neum.
degli isoflavoni. Queste sostanze infatti se inge- Figure 4. Chemical structure of isoflavones from Trifolium
rite in quantità elevata provocano anomalie ri- subterraneum.

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flavoni totali è risultato essere inferiore in T. CH3 CH3


brachycalycinum rispetto a T. subterraneum
(0.25-1.62 mg/g ss e 0.28-2.35 mg/g ss, rispetti- O C CH3 O C
CH2OH CH2OH
vamente). In T. subterraneum inoltre, sono stati
O CN O CN
distinti due gruppi: piante che producono mol-
ta formononetina rispetto a genisteina e bio- OH OH
chanina A e piante che producono molta geni- OH OH
steina e biochanina A rispetto alla formonone- OH OH
tina (Spanu et al., 1993; Piano et al., 1993). Que-
sto può fornire interessanti indicazioni sulla via linamarin lotaustralin
biosintetica che porta alla formazione della for-
mononetina, la sostanza a più alta attività estro- Figura 5. Glucosidi cianogenici di Trifolium repens.
genica, e della genisteina insieme al suo metil
Figure 5. Cyanogenic glucosides from Trifolium repens.
derivato la biochanina A.
Infine, indagini quantitative mediante HPLC
(dati non pubblicati) hanno mostrato un’ottima do dei campioni (Tava e Annicchiarico, 2000).
correlazione con i dati semi-quantitativi ottenu- Il potenziale cianogenico di varie popolazio-
ti dalle TLC, dimostrando che quest’ultimo me- ni naturali di trifoglio bianco raccolte in Italia
todo può essere usato soprattutto quando si ha è risultato essere molto variabile e compreso fra
a che fare con un grande numero di campioni, i 5 ed i 530 mg HCN/g ss (Annicchiarico e Ta-
come richiedono i programmi di miglioramento va, 2004). Questo metodo, rispetto ai metodi ri-
genetico. portati in letteratura, permette di valutare con
più esattezza e precisione il contenuto in gluco-
2.5 Glucosidi cianogenici sidi cianogenici nel materiale vegetale e di di-
I glucosidi cianogenici sono sostanze che rila- scriminare meglio fra i vari campioni esaminati.
sciano acido cianidrico (HCN) per idrolisi enzi-
matica e sono presenti in diverse specie vege- 2.6 Alcaloidi ergopeptidici e pirrolizzidinici (loline)
tali, fra cui anche in specie di trifoglio. In trifo- Lo studio di queste sostanze è stato condotto su
glio bianco (T. repens L.) è accertata la presen- F. arundinacea in cui l’associazione con funghi
za di linamarina e lotaustralina (Fig. 5) da cui endofiti del genere Neotyphodium, porta alla
per idrolisi si ottengono rispettivamente aceto- produzione di una vasta gamma di metaboliti
ne e butan-2-one oltre a glucosio e HCN (Hu- (alcaloidi ergopeptidici e pirrolizzidinici, pera-
ges e Conn, 1976). L’HCN è fortemente tossico mine e lolitrem) che sono responsabili di feno-
se ingerito e crea notevoli problemi sul meta- meni di tossicosi in animali. L’endofita vive in-
bolismo, ed in alcuni casi la morte dell’animale. teramente all’interno della pianta, ha abolito la
L’indagine ha previsto innanzitutto la messa fase riproduttiva e si propaga solo attraverso il
a punto di un metodo rapido, efficace e veloce seme infetto dell’ospite. La pianta fornisce pro-
per la valutazione del potenziale cianogenico tezione, nutrimento ed un facile mezzo di pro-
nei diversi campioni vegetali. Il metodo sfrutta- pagazione al fungo e questo conferisce alla pian-
va una reazione nota in letteratura per la valu- ta diversi vantaggi adattativi soprattutto in re-
tazione dell’HCN e consisteva nel “catturare” lazione alla resistenza a stress biotici e abiotici
l’HCN che si sviluppava da un quantitativo no- (Latch, 1997).
to di foglie fresche poste in una provetta tap- Questa indagine è stata effettuata in popo-
pata, con cartine imbevute di una soluzione di lazioni di F. arundinacea di origine sarda, carat-
sodio picrato che da giallo passava a rosso com- terizzate dalla presenza di endofiti a “conidi cor-
binandosi con l’HCN. Le cartine venivano poi ti” ad a “conidi lunghi”, ed ha previsto la de-
trattate con una quantità nota di acqua e l’in- terminazione del contenuto in alcaloidi pirro-
tensità della soluzione rossa ottenuta veniva va- lizzidinici (loline) ed alcaloidi ergopeptidici sia
lutata allo spettrofotometro a 520 nm. I dati nelle cariossidi che nelle parti vegetative della
quantitativi venivano estrapolati da una curva pianta (Bertoli, 1999).
di taratura ottenuta utilizzando quantità esatta- L’analisi delle loline è stata effettuata me-
mente note di HCN fatto reagire allo stesso mo- diante GC col metodo dello standard interno. I

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Tava A.

R1 R1 R2 il contenuto in ergovalina in varietà controllo


lolina H CH3 infettate da N. coenophialum è compreso fra 4.5
O N R2 N-metil lolina CH3 CH3
e 8.0 ppm e tali valori si confermano nelle ac-
N-formil lolina CHO CH3
N-acetil lolina COCH3 CH3 cessioni sarde infettate dall’endofita a “conidi
norlolina H H
lunghi”. Nelle accessioni infettate da Neotypho-
N N-formil norlolina
N-acetil norlolina
CHO
COCH3
H
H dium spp. a “conidi corti” tale valore risulta in-
vece essere compreso tra 0.4 e 3.2 ppm. Non è
Figura 6. Struttura degli alcalodi pirrolizzidinici in Festuca
arundinacea.
stata registrata la presenza di ergopeptidi in
campioni non infettati.
Figure 6. Chemical structure of pyrrolizidine alkaloids from
Festuca arundinacea.

3. Conclusioni
vari composti pirrolizzidinici usati come stan-
dards (Fig. 6) sono stati sintetizzati dalla lolina Da quanto riportato, le indagini sul contenuto
preventivamente estratta e purificata da semi di in metaboliti secondari in specie foraggere han-
piante infette. Dall’analisi quantitativa si è po- no mostrato la diversa e complessa natura di
tuto valutare che il contenuto in loline totali in queste sostanze e, come accennato, come la lo-
piante infettate da endofita a “conidi lunghi” va- ro presenza nella pianta possa influenzarne in
ria da 1.4 a 4.3 mg g-1 ss, mentre non sono pre- qualche modo le caratteristche nutrizionali. Lo
senti loline, o quantificate in tracce (< 10-3 mg g-1 studio di queste sostanze si rende quindi neces-
ss), in piante infettate da endofita a “conidi cor- sario per una migliore conoscenza che porta ad
ti”. Non è stata trovata la presenza di loline nei un utilizzo appropriato delle materiale foragge-
campioni non infettati. ro ai fini della nutrizione animale. D’altro can-
Le valutazioni del contenuto in ergopeptidi to le particolari attività biologiche di cui sono
sono state invece effettuate mediante analisi dotati rende questi composti interessanti anche
HPLC utilizzando un detector a fluorescenza per altri settori. Infatti, nella ricerca di nuove
(Fig. 7). L’analisi quantitativa ha mostrato che sostanze naturali ad attività biologica da impie-

H
O OH
N O
H N
H N
O O
H CH2
100 N
CH 3

H H
OH O OH N
O N N O
95 O H
N N
H H H
H N N
O O O
O
H
N
H
Ergotamine (IS)
N CH3
90 CH 3

N
O NH2 N H
H
85 H Ergosine + Ergonine
N
CH 3
80 H
H OH
O N O
N O N H N
H OH H N Ergotaminine
H O O
75
Ergine N
H Ergovalinine
CH3
N
CH3 Erginine Ergosinine +
70 N
Ergovaline Ergoninine
N H
H

Ergonovine
65

60

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44

Figura 7. Analisi HPLC degli alcalodi ergpeptidici da Festuca arundinacea infettata dal fungo endofita.
Figure 7. HPLC analyses of ergopeptine alkaloids from endohyte-infected tall fescue (Festuca arundinacea).

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Ital. J. Agron. / Riv. Agron., 2007, 4:441-450

gare per usi diversi, in particolare come biocidi Catalano M., Ragona L., Molinari H., Tava A., Zetta, L.
e/o farmaceutici, le specie foraggere costituisco- 2003. Anticarcinogenic Bowman Birk Inhibitor Isola-
ted from Snail Medic Seeds (Medicago scutellata):
no una ampia fonte di molecole utilizzabili. È Solution Structure and Analysis of Self-Association
proprio dallo studio dell’azione tossica o in va- Behavior. Biochem., 42:2836-2846.
ria misura nociva di queste sostanze che si so- Ceciliani F., Tava A., Iori R., Mortorino M., Odoardi M.,
no acquisiti dati su una loro azione positiva, sia Ronchi S. 1997. A trypsin inhibitor from snail me-
perché dotate di proprietà farmacologiche, sia dic seeds active against pest proteases. Phytochem.,
per una benefica azione biocida o insetticida. E 44:393-398.
questo potrebbe portare anche all’uso non con- Cheeke P.R. 1996. Biological effects of feed and forage
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