Universidad Nacional Autónoma de México

Departamento de Biología
Laboratorio de Microbiología Experimental

“Esterilización de material y medios de cultivo”

Equipo 4 .Ríos Garcés Daniela. Serrano Ortiz Itzy Natalia

Resumen.
En el laboratorio de microbiología experimental es de gran importancia el manejo del material de
trabajo que se emplea para llevar a cabo las técnicas de siembra e inoculación de
microorganismos.
En este artículo se expone la manera correcta de promover la esterilidad y de mantener el material
en asepsia; para evitar que crezcan microorganismos ajenos a lo que se requiera para trabajar o
estudiar. Esto va encaminado a la preparación de medios de cultivo donde el microorganismo
pueda obtener los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo así como el control sobre
cualquier otro microorganismo que pudiera generar competencia para la supervivencia del objeto
de estudio.
Se prepararon tres diferentes medios de cultivo de ​Agar Triptona Soja​, clasificados por el
porcentaje de agar que contenían: sólido, semisólido y caldo nutritivo. Todos ellos se sometieron a
esterilización para su posterior uso en la siembra de microorganismos.

Palabras clave​:​ esterilización, autoclave, medios de cultivo, agar, asepsia, crecimiento.

Resultados. ● Las paredes no se encuentren

Lavado del material
El material de vidrio se lavó con el fin de
eliminar la mayor parte de carga microbiana,
así como cualquier partícula de tamaño
considerable que estuviera contenida en el
material. Para ello se utilizó la menor
cantidad de agua y jabón posibles, que no
dejará residuos difíciles de eliminar. Una vez
limpio, se realizó un enjuague con agua
corriente para asegurar que no hubiera
residuos de jabón, para posteriormente
realizar un último enjuague con agua
destilada o solución salina isotónica. El
material se colocó debajo de una toalla
absorbente y se dejó secar al aire.
En el lavado de material hay que verificar
que:
manchadas
● No haya residuos dentro como
espuma o pelusas
● El pH sea neutro
Para corroborar que el agua con la que se
enjuago el material es neutra, se realizó la
primera verificación que consistió en la
medición del pH a través de tiras reactivas de
dos de los materiales usados siguiendo el
concepto de que todos los materiales se
lavaron de la misma manera obteniéndose
los siguientes resultados:
material analizado pH obtenido
Matraz erlenmeyer de 200 mL neutro
Tubo de ensayo de 18 x 150 mm neutro
Empacado del material Recuadro
Se
de algodón
colocaron
de aprox.
Se realizó el empaquetamiento del material todos los Se esterilizó
5x7 cm que
tubos dentro en el
para enviarlo a esterilización mediante cubra la
de una lata autoclave
boca del
autoclave a 121 ºC por 15 min. Ésta técnica de metal a del salón el
tubo,
tubos de la que cual alcanzó
se llevó a cabo en el autoclave del dejando a 2
ensaye posteriorme una
cm dentro
nte se le temperatura
laboratorio 1D, pero también se puede de él sin
colocó un de 121°C,
apretarlo
realizar en los autoclaves del departamento demasiado
capuchón 15 lb por 20
en forma de min.
de Biología. pero, que
tapa de la
evite que se
En la siguiente tabla se resume la manera en humedezca.
lata.
que se prepara cada material para su
Se
esterilización (figura 5, 7, 10). Se esterilizaron
Es importante recalcar que la esterilización envuelven en el
en paquetes autoclave
de matraces y tubos de ensaye se llevó a de tres, del
No usan
cabo con el medio de cultivo en ellos, pues cajas petri
algodón.
situándose departament
en el centro o, el cual
su función es contenerlo para su posterior y doblando esteriliza a
uso en las cajas de petri. las 121°C, 15 lb
esquinas. por 15-20
minutos.
Preparació Manera de Condicione
Material n con empaqueta s de Se
torunda de do esterilizaci Se esterilizaron
algodón ón. colocaron en el
envueltos en autoclave
Hisopos de
paquetes de del
Recuadro algodón y
Con un ---------- 3 ó 4 de una departament
de algodón palillos de
capuchón manera o, el cual
de aprox. madera.
de papel similar a las esteriliza a
8x16 cm Se esterilizó
estraza en pipetas 121°C, 15 lb
que cubriera en el
forma de serológicas. por 15-20
la boca del autoclave
barco que minutos.
matraz, sin del salón el
cubriera la
matraz apretarlo cual alcanzó
torunda de Pequeña Se
erlenmeyer demasiado una
algodón así porción de envuelven Se
pero, que temperatura
como ⅓ del algodón que de la misma esterilizaron
evite que se de121°C, 15
cuello del cubriera el manera que en el
humedezca lb por 20
matraz. extremo al las pipetas autoclave
el interior min.
Asegurar que se serológicas, del
con el vapor pipetas
con maskin conecta de solo que se departament
del pasteur
tape. la propipeta comienza o, el cual
autoclave.
y que por la parte esteriliza a
permitiera la más gruesa 121°C, 15 lb
Con tiras de
toma del para evitar por 15-20
papel kraft
líquido sin romperlas. minutos.
se
quitarla.
Pequeña envuelven
porción de por Se
algodón que separado y esterilizaron
cubriera el en forma en el Para utilizar el esterilizador del departamento
extremo al diagonal autoclave
que se comenzand del
es necesario llenar unas papeletas que se
pipetas
serológicas
conecta de o con la departament colocan en el exterior de lo que se vaya a
la propipeta punta. Se o, el cual
y que depositan esteriliza a
esterilizar para mantener el control. Se llenan
permitiera la en un 121°C, 15 lb con la siguiente información (figura 12).
toma del cilindro por 15-20
líquido sin metálico o minutos. ● nombre
quitarla. en un papel ● materia y grupo
de mayor
tamaño ● descripción del material
todas juntas. ● fecha de entrada y salida.
Indicadores
Se introdujeron dos indicadores diferentes
para asegurar que el proceso de
esterilización en los autoclaves utilizados es
efectivo. (figuras 4 y 6).
Indicador Autoclave
Tipo biológico: Lab. 1D de
Ampolleta de microbiología.
Geobacillus
stearothermophil
us ATCC 7953.
Tipo químico: autoclave del
Steam-Clox departamento de
Biología.
círculo del centro
Medios de cultivo
Agar Triptona de Soja
Peptona de caseína…… 15 g
Peptona de soja…………. 5 g
Cloruro de Sodio………….5 g
Agar……………………... 15 g
En la etiqueta del medio de cultivo se
especifica que se necesitan 40 g del medio
para preparar 1000,0 mL de medio. Con
estos datos se pueden calcular los gramos
necesarios para preparar 160,0 mL:
40 g de medio
160, 0 mL de dis. ( 1000,0 mL de disolución ) = 6, 4 g de medio
Caldo Nutritivo
Peptona de caseína…… 17 g
Peptona de soja…………. 3 g
Cloruro de Sodio………….5 g
K​2​HPO​4​…...…………..... 2.5 g
Dextrosa……..…………. 2.5 g
Para éste caso se especifica que se
necesitan 30,0 g para preparar 1000,0 mL de
medio. Por lo tanto:
30 g de medio
10, 0 mL de dis. ( 1000,0 mL de disolución ) = 0, 3 g de medio
1. Agar sólido
Se prepararon 160,0 ml de ​Agar Triptona de
Soja disolviendo 6,4 g del medio granulado
en aproximadamente 80,0 mL de solución
Resultado salina y cuando la mezcla resultó
homogénea, se llevó hasta un volumen de
No viró el color
de la ampolleta 160 mL. Posteriormente se calentó hasta
tras la observar una variación de color de un tono
incubación.
ambarino opaco a uno un poco más
anaranjado, brillante y translúcido. Después
Tres medios
círculos se empaquetó y se llevó a esterilizar bajo las
superiores de condiciones descritas con anterioridad.
color verde y el
Una vez estéril, se calentó a baño maría
de color rosa. hasta que no se observaran grumos o
coágulos y que estuviera perfectamente
líquido. Finalmente se repartió en seis cajas
petri y en un tubo de ensayo (estériles)
cuidando vaciar el medio cerca del mechero
y evitando quitar la tapa de la caja de petri
por completo; en resumen, con una
apropiada técnica aséptica para evitar el
crecimiento de microorganismos antes de la
inoculación.
Para que el agar quede distribuido de
manera homogénea en las placas, es
necesario realizar movimientos circulares,
hacia la izquierda y hacia la derecha, hacia
arriba y hacia abajo y de un lado al otro por
lo menos unas seis veces cada uno y dejar
solidificar.
Para el caso del tubo, se buscó obtener un
medio de cultivo con forma de “pico de flauta”
donde la superficie de contacto del medio
sea mucho mayor, por lo que se inclinó un
poco el tubo hasta solidificar. (figura 8).
2. Agar semisólido
Para la realización de este medio, se partió
de un caldo nutritivo y se añadió 0,5% de
agar. Es por ello que se disolvieron 0,3 g del
medio granulado (​Agar Triptona de Soja)​ y
0,05 g de agar en 10,0 mL de solución salina
en un matraz Erlenmeyer. Se calentó hasta
apreciar nuevamente el cambio de color sin
que el medio comenzará a burbujear y se
proyectara. Se vertió el medio ya disuelto en
un tubo de ensaye y se tapó con su
respectiva torunda de algodón. Finalmente
se llevó a esterilizar dentro de una lata de
metal junto con los demás medios
semisólidos del grupo.
3. Caldo nutritivo
Se prepararon 10,0 mL de ​Caldo Triptona
Soja​ mediante la disolución de 0,3 g de
medio granulado en 10,0 mL de solución
salina. A éste medio no se le agregó agar, ni
tampoco se calentó para homogeneizar.
Porcentaje de eficiencia de preparación de
los medios de cultivo
De las seis cajas de petri preparadas con
cultivo ninguna se reportó con turbidez,
pelusa, ni con algún crecimiento de
microorganismos o colonia.
Se obtuvo el 100% de eficiencia. (Ver figura
9)
Análisis de resultados​.
Lavado del material
La limpieza del material es la primer parte de
los procesos de desinfección y esterilización.
Normalmente se creería que la limpieza con
agua y jabón o alguna otra sustancia
detergente no causa gran impacto sobre el
alto contenido de microorganismos en el
material, sin embargo es muy importante que
se realice correctamente ya que al hacerlo se
elimina la suciedad contenida en las
superficies del material que generan una
barrera que impide la acción de los agentes
desinfectantes y esterilizantes. (El Crisol
Blog,​ 2017).
Al no presentarse restos de jabón en el
material, ni polvo o pelusas y al obtener un
pH neutro durante el segundo enjuague del
mismo, se concluyó que el lavado de material
se llevó a cabo de manera eficiente (figura
1).
Empacado del material
Es importante que el material se empaque
antes de ser enviado a esterilizar para que
ningún microorganismo pueda entrar o salir
de éste (una vez estéril) y no se contamine.
El empacado que se llevó a cabo en el
laboratorio se considera eficiente, ya que
ninguna torunda de algodón se humedeció y
no se apreciaba condensación de agua en
ninguno de los materiales de vidrio.
Uso de autoclave
El autoclave es una herramienta de suma
importancia en el laboratorio de
microbiología, tanto como el microscopio.
Es ​un recipiente de presión metálico de
paredes gruesas con un cierre hermético que
permite trabajar a alta presión para realizar
una esterilización con vapor de agua.
Estos equipos emplean vapor de agua
saturado, a una presión de 15 libras que
permite alcanzar una temperatura de 121 ºC
dentro de la cámara. El tiempo de
esterilización usualmente es de 15 minutos,
sin embargo, en algunas oportunidades,
dadas las características del material, es
necesario variar el tiempo de esterilización.
(Gutiérrez, 2008).
Dentro de las ventajas que trae el uso del
autoclave se encuentran el rápido
calentamiento, la buena penetración, el corto
tiempo de esterilización, el bajo deterioro del
material expuesto y la economicidad (López,
2006).
Es muy importante conocer el correcto uso y
manejo de un autoclave, en específico de los
que se encuentran en el laboratorio pues con
ellos se trabaja.
Para ello primero hay que revisar que tenga
agua suficiente, prenderlo y esperar a que se
caliente. Después se introduce con cuidado
el material a esterilizar cuidando que quede Un medio se puede dividir de varias
bien acomodado para que no se rompa. maneras, de acuerdo a su composición, a su
Hay que ser muy cuidadosos al colocar la estado físico o a su aplicación.
tapa y seguir la guía que conecta al depósito
De acuerdo a su composición:
del agua para que el autoclave quede sellado
herméticamente. ● Naturales o complejos: Son aquellos
Es importante que al momento de cerrar las en los que la composición es
llaves se haga de forma contralateral, es químicamente desconocida o no está
decir cerrar dos llaves en posición contraria definida y por lo tanto no puede ser
al mismo tiempo y con la misma fuerza. constante. Estos se elaboran con
Las válvulas deben encontrarse abiertas ingredientes de naturaleza como
hasta alcanzar una temperatura de 121 ºC. tejidos, sueros, etc.
Una vez a estas condiciones, se cierran y se ● Sintéticos: Estos medios se
cronometran 15 minutos para asegurar una preparan añadiendo concentraciones
correcta esterilización. precisas de compuestos orgánicos
o inorgánicos o sea se conoce la
Indicadores composición exacta.
Los Indicadores biológicos son dispositivos
preparados de esporas no patógenas y Por su estado:
altamente resistentes a los procesos de ● Líquido: Tienen componentes
esterilización y por lo tanto son útiles y completamente solubles, pero no
eficaces para establecer la capacidad del pueden detectar contaminaciones.
ciclo de esterilización para destruir ● Fluido (0.1% de agar): El medio tiene
microorganismos específicos. Este tipo de una composición de agar lo que lo
esporas (Bacillus stearothermophilus) ​se hace que disminuya la velocidad de
utilizan para la esterilización por vapor a disolución del oxígeno ambiental.
presión, plasma de peróxido de hidrógeno y ● Semisólido: Contienen agar entre el
formaldehído. 0.2% y el 0.8%, son suaves y
Bacillus stearothermophilus es una bacteria permiten observar la movilidad del
Gram-positiva con forma de bacilo, termófila microorganismo.
extensamente distribuida en el suelo y es ● Sólido: Contienen de 1.5% a 2.0% de
causa de descomposición de los productos agar lo que lo hace tener una
alimenticios. Es usada comúnmente como consistencia dura que forma un
organismo de validación en los estudios de soporte para el crecimiento
esterilización. En las autoclaves de vapor se microbiano.
utiliza una ampolleta con esta bacteria. La
ampolleta se pone en el centro del autoclave ​Por su uso:
sin ningún tipo de carga, se le da el ciclo ● Enriquecidos o nutritivos: Contienen
normal de 30 a 45 minutos incluyendo el componentes ricos nutritivamente y
secado y cuando termine se saca del permite el crecimiento de
autoclave y se envía al laboratorio para su microorganismos no exigentes.
incubación y observación por 48 hrs. ● De enriquecimiento: Contiene
componentes que permiten el
Medios de Cultivo desarrollo de un tipo microbiano y
disminuyen la velocidad de
 crecimiento de la microbiota
acompañante.
● Selectivos: Contiene componentes
que inhiben el crecimiento de demás
bacterias, pero permiten el desarrollo
de un tipo microbiano.
● Diferenciales: Contiene componentes
que permiten diferenciar las
actividades metabólicas de los
microorganismos inoculados, la
presencia de indicadores o el uso de
reveladores ponen de manifiesto la
actividad.
● De mantenimiento o de conservación:
Se utilizan para conservar una cepa o
como controles de calidad en
laboratorios.
● De transporte: Se emplean para el
transporte de muestras sin alterar la
viabilidad y proporción de
microorganismos. Tienen una
consistencia semisólida,
amortiguadora de pH y reducidos en
nutrientes.
● Pruebas bioquímicas: Son medios de
cultivo que tienen nutrientes para
poner en evidencia la actividad
metabólica de un microorganismo
puro.
El medio utilizado en éste experimento se
trata de uno complejo ya que contiene
peptonas cuya composición no está definida
y se prepararon en los tres estados: sólidos
en seis cajas de petri y un tubo de ensaye;
semisólido en un tubo de ensaye y líquido en
otro tubo de ensaye.
Después de dejar los medios incubar por
unos días, se percató que la técnica de
preparación de éstos, así como la aséptica,
son eficientes pues ningún microorganismo
creció en ninguno de los medios.
Así mismo, las placas de agar quedaron
homogéneas, sin ningún rastro de grumos en
ellas.
Conclusiones
1. Un objeto se considera estéril cuando
no contiene ninguna forma de vida
microbiana en él; incluyendo esporas.
2. Es muy importante que el material
que será enviado a esterilizar esté
bien envuelto en papel kraft o de
estraza y debidamente etiquetado
para mantener su esterilidad hasta su
uso.
3. El uso de indicadores es muy
importante ya que gracias a estos se
puede saber si las condiciones de
esterilidad se están cumpliendo o no.
4. Los medios de cultivo preparados
tuvieron un 100% de eficiencia y no
presentaron microorganismos durante
su incubación, por lo que se concluye
que se tuvo una adecuada técnica de
asepsia.
Bibliografía
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Anexos