Preguntas Fermenta: afectan a las propiedades intrínsecas de la enzima.

1. ¿Por qué la actividad enzimática se mide a tiempos cortos?

la actividad enzimática está en función con su velocidad y para medir la
velocidad el tiempo debe ser tan cortos que la velocidad de la reacción de
reserva es insignificante
=1 -> La actividad de la enzima no se ha reducido por la inmovilización.
<1 -> Se ha perdido parte de la actividad durante la inmovilización y
por los efectos de partición y difusionales.

2. ¿Cuáles son los parámetros de RDI y RDC en un proceso reactivo

>1 -> Al romper células inmovilizada, cuando hay división celular,
con enzimas inmovilizadas? cuando los inhibidores se excluyen selectivamente, aumento de
RD externas: temperatura, cuando la enzima inmovilizada es más estable.

𝛼: (𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝐷𝑎𝑚𝑘ℎ𝑒𝑙𝑒𝑟 )

𝜂 = (𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 ): 𝑓(𝛼, 𝛽0)

● Resultan como consecuencia de la existencia de una zona de líquido RD internas:

estanco donde hay difusión molecular y no transporte convectivo.
● Si la limitación es muy fuerte, la velocidad de la reacción es la velocidad
de difusión.
● Estas restricciones disminuyen aumentando la agitación para mejorar el
mezclado.
● En una situación ideal de mezcla sin limitación de la difusión, la
reacción tendrá los parámetros cinéticos idénticos a los de la enzima
libre.
▪ Módulo de Damkholer ()
✓ Número adimensional que expresa la relación entre la velocidad
máxima de una reacción enzimática y la de transferencia de sustrato
en las proximidades de una enzima inmovilizada
✓ Indica los factores que limitan la actividad de la enzima inmovilizada
y cuanto se aleja del máximo posible.
∅ = (𝑚𝑜𝑑𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑇ℎ𝑖𝑒𝑙𝑒 ), 𝛽 = 𝑓(𝑧, ∅)
𝜂: 𝑓(∅, 𝛽0)
● Se deben al tamaño y tortuosidad de los poros del soporte.
● Efecto complejo porque la difusión se produce simultáneamente con la
reacción, creando gradientes de concentración alrededor de las
partículas.
● El efecto sobre la Km es el mismo que para la limitación difusional
externa (K´m> Km)
● El sustrato es más difícil y siempre se tendrán valores de V´max
< Vmax porque la enzima ubicada en el centro de la partícula
permanecerá inactiva.
● Es importante controlar la cantidad de enzima inmovilizada.

Incidencia del fenómeno de transporte de ▪ Módulo de Thiele ()

sustrato en la expresión del potencial catalítico ✓ Método para cuantificar las restricciones difusionales internas y
de la enzima. externas.
✓ Relación entre velocidad de reacción química y proceso difusivo en
Si  es pequeño -> baja incidencia de RDE los poros.
Si  es grande -> alta incidencia de RDE
✓ Los valores pequeños: no influye el proceso difusivo (mayor factor
▪ Factor de Efectividad () de efectividad); y los valores altos: tienen mayor influencia de
difusión en los poros (menor factor de efectividad)
✓ Expresa los efectos ✓ La definición sólo es válida para una ecuación cinética concreta
combinados de los factores que (primer orden).
 L = Espesor medio de la partícula.
[E] = Contenido en enzima de la
partícula.
De = Difusividad efectiva del
sustrato.
3. Porque es fundamental el K y Vmax de enzimas como
biocatalizadores en un reactor.
● K es la constante de velocidad o también constantes microscópicas
de velocidad
● Esta condición (las condiciones óptimas de pH,temperatura,
presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones
saturantes de sustrato), la velocidad de reacción observada es la
velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien
midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los
reactivos.
▪ Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de
desaparición del sustrato) en función del tiempo se
obtiene la llamada curva de progreso de la reacción.
4. Mencione un objetivo de las estrategias de operación en un
biorreactor enzimático.
La operación de reactores enzimáticos requiere producto de calidad
uniforme (X= cte)
En bioreactores por lotes :
E soluble: X:f(E,t)
E inmovilizado: Pérdida de capacidad catalítica
La pérdida de la capacidad catalítica durante la operación del birreactor;
básicamente se debe a la temperatura y al tiempo que está expuesto.
El estudio del fenómeno de inactivación térmica del biocatalizador y la
determinación de la T de operación de un birreactor enzimático son
aspectos de la mayor relevancia.
5. Defina UI.
UNIDAD INTERNACIONAL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: Es la
cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de
substrato por minuto, bajo condiciones bien definidas (condiciones
estándar). Esta es la expresión básica de la velocidad de la reacción.
Se ha sugerido que la temperatura debe ser, en lo posible, de 30°C
y que las otras condiciones, tales como pH y concentraciones de
substratos, debieran ser las óptimas para la actividad enzimática.
En base a eso es posible expresar la cantidad de una enzima en un
fluido biológico en UI/cm 3 o en UI/ mg. de proteína total. Esta última
expresión denominada actividad específica es la cantidad de moles
de sustrato transformados por minuto y por mg. de proteína,
debiéndose indicar la temperatura, el pH, etc.Es importante recordar
que la actividad específica de una enzima es una medida indirecta
de la fracción de la proteína total en una preparación que contienen
a la enzima.

6. Mencione las ventajas de usar biorreactores con enzimas
inmovilizadas.
Biorreactores con Enzimas Inmovilizadas
CREADO EL MARZO 30, 2011 POR AMARIN
ARCHIVADO COMO BIOTECNOLOGÍA Y ECONOMÍA, PRODUCTOS
BIOTECNOLÓGICOS | DEJA UN COMENTARIO
Las enzimas son macromoléculas de carácter proteico que poseen
capacidad catalítica. Esto quiere decir que hacen que las reacciones
químicas se produzcan más rápidamente. Esta extraordinaria propiedad
junto con otras, como por ejemplo la especificidad de sustrato o la
esteroselectividad, justifican el gran interés que han suscitado en el mundo
de la química. Cada día se intentan encontrar más y más procesos que se
puedan llevar a la práctica por vía enzimática. Pero el empleo de esta
tecnología genera problemas derivados principalmente de su alto coste y de
la imposibilidad de reutilizarlos cuando se trata de reacciones con enzimas
solubles. Es por ello por lo que se han desarrollado diversos tipos de
inmovilización para estas enzimas.
Figura 1. Esquema de un reactor de membrana con lipasas inmovilizadas en
la membrana
La inmovilización de enzimas presenta una serie de ventajas clave que
justifican su utilización en la industria, pero esta técnica también tiene algún
que otro inconveniente. Entre las ventajas podemos destacar que la
inmovilización de enzimas permite la reutilización de las mismas, a la vez
que aumenta su estabilidad frente a amplios valores de temperatura y pH.
También posibilita su operación en continuo así como el diseño de reactores
enzimáticos de más fácil manejo y control. Por otro lado, podemos
mencionar que el proceso de inmovilización puede bloquear centros activos
de la enzima, haciendo que la actividad global disminuya. Y también la
proteína puede ver modificada su conformación con respecto al estado
nativo. Otra desventaja es el coste de la inmovilización, pero este se ve
compensado por la reutilización de la enzima [1].
Existen distintos tipos de reactores que operan con enzimas inmovilizadas.
Destacan los reactores que utilizan enzimas inmovilizadas en partículas
porosas con forma esférica. En el interior de dichos poros, las enzimas
pueden quedar fijadas por métodos físicos y químicos, que aquí no se
detallan. Los reactores que operan con este tipo de partículas lo pueden
hacer bien en lecho fijo [2], lecho fluidizado [3] o suspendidas en el seno del
líquido (tanque agitado o CSTR). También existen otro tipo de reactores que
utilizan enzimas incluidas en una membrana semipermeable [5]. Un
esquema de este tipo de reactor se muestra en la Figura 1
● Permite la utilización continua del biocatalizador, dado que éste queda
fácilmente retenido en el interior del reactor utilizado, mientras se
mantiene en flujo continuo de entrada y salida de líquido.
● Favorece la re-utilización del biocatalizador en el caso de reacciones en
discontinuo.
● Con la inmovilización se puede aumentar sensiblemente
la concentración de biocatalizador, con respecto a un proceso en el que
el mismo se encuentre en suspensión.
● En cuanto a sistemas operando en continuo, éstos permiten un aumento
en las productividades de los correspondientes biorreactores, dado que
permiten operara a mayor concentración decatalizador, (mayor
conversión de substrato) y con caudales más altos.
● En el caso de enzimas inmovilizadas es frecuente observar un aumento
de su estabilidad y su resistencia a la desnaturalización y proteolisis.
● Permite reducir los efectos de contaminación accidentales del proceso
en las células; dado que la población de células contaminantes se
encuentran en suspensión y en concentración mucho menor que la
población de células inmovilizadas, ésta puede ser eliminada mucho
más fácilmente del reactor.
7. ¿Cómo se mide la actividad de una enzima?
Se mide mediante la siguiente ecuación:
𝑉 × 𝑆0
𝑣=
𝐾 + 𝑆0

8. En el rango de linealidad de la invertasa ¿Cuál fue el objetivo de
emplear un blanco?
El blanco es una muestra cultivada de la célula sin las sustancias que se
quiere emplear, y el objetivo es que permita saber si el comportamiento
del cultivo se debe a la sustancia que le añadiste o si simplemente se
debe a otro factor distinto de la sustancia.
9. ¿Por qué la determinación de experimental de rango de linealidad
de la invertasa soluble se tuvo que ensayar a diferentes diluciones
del extracto enzimático de levadura?
𝐾𝑒𝑡
10. ¿Para qué es útil obtener el perfil X vs ?
𝐾
11. Porque es indispensable en el experimento determinar los valores
de los parámetros de una enzima soluble e inmovilizada en tu
experiencia de catálisis de la invertasa inmovilizada podrías intuir
que sus valores fueran equivalentes o semejantes a las obtenidas
con invertasa soluble ¿por qué?
Cuando estudiamos la acción de una enzima en un organismo es importante
saber su Vmax porque es el parámetro cinético por excelencia. Tenemos
que saber su velocidad máxima para poder conocer su 1/2 Vmax, del cual
hallamos Km, que es la concentración de sustrato a la que una enzima
trabaja a la mitad de la Vmax. De esta manera, añadiendo los distintos
sustratos de la enzima sabremos, según su Km, con cual trabaja mejor, por
cual tiene más o menos afinidad etc. Asimismo, podremos estudiar
inhibidores y activadores de la enzima, que según sean Competitivos, no
competitivos o Mixtos modificarán su Vmax pero no su Km, o modificarán su
Km pero no su Vmax, o modificarán ambos parámetros.
No hay semejanza porque los parámetros cinéticos de la enzima soluble son
mayores que de la enzima inmovilizada, la inmovilización puede limitar el
acceso del sustrato al centro activo de la enzima, lo que afecta en la
actividad.
12. ¿Cómo se halla el Vmax y Kmax?
● Para determinar la velocidad máxima de una reacción enzimática, la
concentración de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una
velocidad constante de formación de producto. Esa es lavelocidad
máxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la
enzima están saturados con sustrato.
●
● Aunque es imposible medir exactamente la concentración de sustrato
que da Vmax, las enzimas pueden caracterizarse mediante la
concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la
mitad de la velocidad máxima. Esta concentración de sustrato se
conoce como constante de Michaelis-Menten (KM). Se obtendrá
una KM diferente según el sustrato específico sobre el que actúe la
enzima (como sucede en el caso de enzimas que actúan sobre
sustratos análogos) y según las condiciones de reacción en que se
realicen las mediciones.
● Se puede hallar ambas constantes (Vmax y Kmax) con el diagrama de
Lineweaver-Burk que se emplea como herramienta gráfica para
calcular los parámetros cinéticos de una enzima.
o
● Cuyo recíproco es:
 o

● Donde V es la velocidad de reacción, Km es la constante de

Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es
la concentración de sustrato.
● La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el
Km y Vmax; el punto de corte con el eje de ordenadas es el
equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas es el valor de -
1/Km.

13. ¿Cuál es el verdadero parámetro cinético que determina la

eficiencia de la enzima?
Pues K es una cnstante que ayuda a definir la actividad enzimática,es decir
la eficiencia de una enzima.

K=K0.e ED/RT

Es K m como la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad

de la velocidad máxima de la
reacción.

14. ¿Cuál es el procedimiento para obtener el rango de linealidad y

enzima inmovilizada?