Manual de Laboratorio Virologia

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
PROGRAMA EDUCATIVO
QUÌMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO
UNIDAD DE APRENDIZAJE VIROLOGÍA
MANUAL DE LABORATORIO
ELABORARON:
QFB MARTHA HILDA RUIZ MENDOZA
M. en C. JONNATHAN GUADALUPE SANTILLÁN BENÍTEZ
D. en C. ENRIQUE MORALES AVILA
Septiembre 2012
1
Contenido
Introducción.
Formato de la práctica y simbología
Evaluación del curso.
Reglamento de laboratorio de Virología.
Introducción....................................................................................................................................... 3
Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje ................................ 4
Formato de la práctica y simbología ............................................................................................... 5
Evaluación del curso ......................................................................................................................... 6
Reglamento del laboratorio de Virología ........................................................................................ 7
Manejo de residuos peligrosos ......................................................................................................... 8
Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o diagnóstico. ............ 9
Práctica 2. Huevo fértil de ave como modelo biológico para el cultivo e identificación de virus.
........................................................................................................................................................... 13
Práctica 3. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad alantoidea. .............. 18
Práctica 4. Replicación del virus de la bronquitis infecciosa aviar en huevo fértil de pollo (1ª
parte) titulación del virus de la bronquitis infecciosa aviar (DI50) en huevo fértil de pollo (2ª
parte). ............................................................................................................................................... 25
Práctica 5. Hemaglutinación .................................................................................................... 29
Práctica 6. Inhibición de la Hemaglutinación ............................................................................... 33
Práctica 7. Inoculación intracerebral de ratón lactante .............................................................. 38
Práctica 8. Diagnóstico rápido de virus rábico (tinción de Sellers) ............................................ 42
Práctica 9. Cultivo Celular (parte 1) ............................................................................................. 46
Práctica 10. Cultivo Celular (parte 2) ........................................................................................... 51
Práctica 11. Conteo Celular............................................................................................................ 55
Práctica 12. Titulación Viral .......................................................................................................... 58
Práctica 13. Determinación de anticuerpos IgM anti-Rubéola ................................................... 62
Práctica 14. Determinación de anticuerpos IgG Anti-Citomegalovirus ..................................... 65
2
Introducción
El término virus viene del latín veneno, se utilizó a finales del siglo XIX para describir a los
agentes más pequeños que las bacterias causantes de enfermedades. En 1940 el desarrollo
del microscopio electrónico posibilitó por primera vez, la visualización de los virus, años
después la centrifuga de alta velocidad permitió concentrarlos y purificarlos.
En la década de los 50’s con el desarrollo del cultivo celular, actual soporte de la
replicación viral, junto con la inoculación de huevos embrionado y el uso de algunos
animales de laboratorio, se descubren nuevos virus, la mayoría de los cuales fueron
analizados en la década de los 60’s y 70’s con el fin de determinar sus características
físicas, químicas y antigénicas para poder establecer las metodologías apropiadas para
diagnosticarlos por el laboratorio.
El diagnóstico de la etiología viral de las infecciones se ha ido generalizando gracias al

desarrollo tecnológico que ha permitido disponer de métodos cada vez más sencillos,
rápidos y económicos como las técnicas de biología molecular (PCR y RT-PCR). Se debe
eliminar la antigua creencia de que el diagnostico viral es costoso, sumamente tardío y de
interés puramente académico o epidemiológicos.
Es necesario crear en los profesionales de la salud la conciencia de la utilidad del

diagnóstico virológico rápido y de la disponibilidad de nuevos fármacos antivirales, las
infecciones virales impactan la calidad de vida de quienes la padecen, por lo tanto, un
resultado correcto y oportuno emitido por el laboratorio, permite contribuir al diagnóstico y
seguimiento del paciente.
Este manual está dirigido a los estudiantes del noveno semestre de la licenciatura de
Químico Farmacéutico Biólogo de la facultad de química de la UAEM y pretende
proporcionar a los alumnos los conocimientos y habilidades básicas para el manejo de las
principales técnicas diagnósticas de laboratorio relacionadas con las infecciones virales
humanas.
El programa de prácticas está integrado por cuatro secciones:
1. Inoculación en embrión de pollo

2. Animales de laboratorio
3. Cultivo celular
4. Diagnóstico Inmuno virológico
3
Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje
Práctica Nombre de práctica Sesiones Tema

1 Constitución de un laboratorio de
virología de investigación o 1
diagnóstico.
2 Huevo fértil de ave como modelo 1
biológico para el cultivo e
identificación de virus.
3 Inoculación de huevo embrionado 2
en saco vitelino y cavidad Métodos de identificación y
alantoidea. 1.3. purificación.
4 Replicación del virus de la 2
bronquitis infecciosa aviar en 2.2.
huevo fértil de pollo (1ª parte) Relación virus huésped
titulación del virus de la bronquitis
infecciosa aviar (DI50) en huevo
fértil de pollo (2ª parte)
5 Hemaglutinación 1 1.1. Relación virus célula.
6 Inhibición de hemaglutinación
7 Inoculación intracerebral de ratón 1 3.7. Manejo de animales de
lactante. laboratorio
8 Diagnostico rápido de virus rábico 1 1.3. Métodos de identificación.
(tinción de Sellers)
9 Cultivo celular (primera parte) 2 3.4. Nutrientes necesarios para la
10 Cultivo celular (segunda parte) replicación viral
11 Conteo celular 1 3.1 Preparación de medios de
cultivo de crecimiento y
mantenimiento viral
12 Titulación viral 1 3.0 Replicación viral
9 Inhibición de la Hemaglutinación 1 4.1. Métodos citológicos directos
13 Determinación de anticuerpos IgM 1 4.3. Métodos inmunoserológicos
anti-rubeola
14 Determinación de anticuerpos IgG 1 4.3. Métodos inmunoserológicos
anti-citomegalovirus
Nota: el manual de laboratorio se realizó tomando en cuenta los conocimientos que se generan en
una práctica y son necesarios en la mayor parte de los casos para el desarrollo de prácticas
posteriores, además los materiales obtenidos en algunas prácticas se reutilizan en las practicas
consecutivas, tal es el caso de la práctica 2, de donde se obtienen productos útiles en la prácticas 3,
6 y 9.
4
Formato de la práctica y simbología
Introducción
Objetivo
Fundamento teórico
Aspectos de seguridad e higiene
Materiales y reactivos
Procedimiento. Este puede ser considerado como actividad o ejercicios

demostrativos.
Actividades de comprobación o evaluación
Observaciones
Bibliografía
5
Evaluación del curso
Evaluación de laboratorio
Reportes
Procedimiento normalizado de operación Valor
1. Introducción (no más de ½ cuartilla) 10
2. Objetivo 10
3. Alcance
4. Responsabilidades
5. Material y equipo 5
6. Procedimiento 25
7. Anexos I y II 50
7.1. Resultados (25)
7.2. Discusión, conclusiones, cuestionario y referencias (25)
Total 100
Desempeño en laboratorio
Aspecto Valor
Conocimiento de la metodología 30
Desarrollo de la práctica 70
Total 100
Calificación final de Laboratorio Valor

Reportes 50
Desempeño en laboratorio 30
Examen (un examen por parcial) 20
Total 100
6
Reglamento del laboratorio de Virología
1. Uso obligatorio de bata blanca de manga larga y abotonada, sin bolsas y en cada
área usar batas desechables sobre la blanca.
2. Uso obligatorio de guantes en el manejo de animales y muestras clínicas.
3. Usar cubre bocas o careta en el caso de prácticas de mayor riesgo.
4. Limpiar las mesas de trabajo con solución antiséptica (benzal o hipoclorito de sodio
al 1 % al inicio y al finalizar la práctica.
5. No abandonar el laboratorio una vez que ha iniciado la práctica, salvo emergencia
justificada.
6. No correr en el laboratorio.
7. Contar con gasas o papel adsorbente en cada mesa de trabajo.
8. Prohibido tomar alimentos dentro del laboratorio.
9. Evitar corrientes de aire en el laboratorio.
10. Disponer de recipiente con agua clorada para inactivar las puntas de las
micropipetas, material contaminado con reactivos y/o muestras biológicas.
11. Utilizar jabón líquido para aseo de las manos antes de abandonar el laboratorio al
término de la sesión.
12. Esterilizar en autoclave el material que así lo requiera.
13. En caso de algún accidente o percance avisar al profesor de la práctica.
14. Respetar las normas internacionales de bioseguridad en los laboratorios para
trabajar virus.
LA REGLA DE ORO
Toda muestra: sangre, suero, cultivos bacterianos, cultivos celulares y virus deben
manipularse con extremo cuidado, como si fuesen muestras potencialmente
patógenas.
7
Manejo de residuos peligrosos
Los residuos peligrosos son aquellos residuos producidos por el generador con algunas de las
siguientes características: infecciosas, combustibles, inflamables, explosivas, reactivas,
radioactivas, volátiles, corrosivas y/o tóxicas, que pueden causar daño a la salud humana y/o al
medio ambiente. Así mismo se consideran peligrosos los envases, empaques y embalajes que hayan
estado en contacto con ellos.
Al final de cada práctica se presentará una propuesta de clasificación, registro y recolección de los
residuos químicos, para su posterior almacenamiento y confinamiento.
Los residuos peligrosos biológico infecciosos (R.P.B.I.) deben clasificarse y recolectarse de

acuerdo a la norma NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, que considera como R.P.B.I. los
siguientes:
Los cultivos y cepas almacenados de agentes infecciosos.
Los cultivos generados en los procedimientos diagnósticos y de investigación, asi como los
generados en la producción de agentes biológicos.
Su activación y tratamiento se lleva a cabo entre otros, por métodos químicos o térmicos, es el caso
de la desinfección con hipoclorito de sodio y esterilización por calor seco o calór húmedo
frecuentemente utilizados en las áreas de microbiología.
Fuente: Guía para el manejo de residuos peligrosos de la UAEM (julio, 2006).
8
PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo
UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología
Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o

diagnóstico.
Introducción
El material y equipo de un laboratorio de virología es muy parecido a muchos laboratorios,

aunque para muchas metodologías diagnósticas y de investigación se precisa de equipo
especializado como las cámaras de flujo laminar, incubadoras de CO2, instrumentos
ópticos de observación como el microscopio de epifluorescencia y el microscopio invertido,
congeladores e instalaciones de criogénia como el tanque de nitrógeno líquido,
refrigeradores de -20 °C, centrifuga refrigerada, autoclave, micropipetas multicanal,
microdilutores.
Un laboratorio de virología debe tener las paredes pintadas con pintura epóxica, las
esquinas redondeadas y tener un flujo de aire positivo en las puertas para evitar que el aire
externo entre, además debe cumplir con la normatividad vigente así como tener un control
de calidad externo.
Objetivo
El alumno investigará y conocerá el equipo y características fundamentales de un

laboratorio de virología y conocerá las diferencias que tiene respecto a otros laboratorios
biológicos.
Fundamento teórico
La esencia de un laboratorio de virología son el equipo y la asepsia, tanto de las

instalaciones como del aire. El aire se debe mantener bajo presión positiva, después de ser
pasado por un filtro, esta presión positiva creará condiciones para que el polvo y los
microorganismos sean arrastrados hacia fuera. Debe existir un área para el cultivo de
tejidos, instalada en la zona alejada de las vías de paso. Las cámaras de flujo laminar
9
reducen las necesidades del aislamiento del área, pero aun así es necesario mantener un
gradiente de esterilidad, lo ideal es disponer de una habitación aislada.
A continuación se describen los instrumentos de un laboratorio de cultivo celular.
1. Campana de flujo laminar. Su función es mantener un área libre de contaminantes, esto

se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un
filtro superficial (HEPA).
2. Incubadora de CO2. Son estufas que regulan la temperatura a 37 °C, ya que las células
en cultivo no pueden sobrevivir a temperaturas superiores a 39 ° C, además se regula la
presión de CO2 esto controla el pH que hay en el interior de la incubadora, regulan
también la humedad, teniendo todas estas condiciones ideales, se augura un buen
desarrollo y crecimiento de las células.
3. Microscopio de contraste de fases invertido. Permite monitorear el desarrollo
morfológico del cultivo, el hecho de que las muestras observadas se encuentren en
recipientes anchos, precisa el uso del invertoscopio, cuya fuente de luz y objetivos se
encuentran invertidos respecto a un microscopio óptico convencional. Como las
muestras no presentan color, el microscopio está equipado con un dispositivo de
contraste de fases que permite obtener imágenes de calidad.
4. Congeladores y equipo de criogénia. Es el sistema que permite guardar las células
durante años a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 °C).
5. Equipo de filtración, muchas soluciones y medios de cultivo que se utilizan para hacer
crecer a las células necesitan ser esterilizadas por filtración a través de un dispositivo de
filtración de 0.22 micrómetros de poro.
6. Equipo de esterilización o autoclave. Es un sistema que permite la esterilización por
calor tanto de sólidos (material e instrumentos) como de líquidos (medios de cultivo). La
esterilización habitualmente se realiza a 121 °C y 2 atmosferas de presión durante 20
minutos.
7. Centrífugas. Deben ser refrigeradas preferentemente con posibilidades de usar en ellas
tubos con volúmenes de 1 a 2 mL, hasta botellas de 250 a 500 mL, deben instalarse lejos
de las campanas de flujo laminar para evitar las turbulencias de aire que generan.
8. Contador electrónico de células. Este instrumento es capaz de medir y contar partículas
en suspensión, consta de 2 electrodos que transmiten al equipo de amplificación y
análisis los cambios de resistencia que detectan, cada vez que una célula en suspensión
los atraviesa.
1. Durante la visita al Laboratorio de Biología Molecular del CICMED será necesario el

uso de equipo de protección básico como la bata blanca de manga larga y abotonada.
10
2. Conducirse con compostura dentro del laboratorio y seguir las indicaciones del
coordinador.
Procedimiento
1. Se realizará una visita al 2. El alumno elaborará un trabajo de

laboratorio de Biología Molecular investigación documental describiendo el
del CICMED UAEMéx equipo y los aspectos más importantes de
un laboratorio de virología.
3. Investigará la normatividad que debe

cuidarse para el buen funcionamiento de
un laboratorio de virología
1. ¿Cuáles son los usos del tanque de nitrógeno líquido y que temperatura alcanzan?
2. Describe las características de las campanas de seguridad biológica o campanas de

flujo laminar.
3. Describe las diferencias que hay entre los microscopios de epifluorescencia, de luz
ordinaria y el invertoscopio.
4. Describe las diferencias elementales entre una centrifuga ordinaria y una centrifuga
refrigerada.
Observaciones
11
Bibliografía
1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica

2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica
Vol. 1
3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.
Editorial Masson. S.A. Barcelona.
5. http://www.virology.net/
12
Práctica 2. Huevo fértil de ave como modelo biológico para el cultivo e

identificación de virus.
Introducción
Los embriones se han utilizado como el huésped natural para el crecimiento de los virus,
propagación y caracterización de los virus aviares y para la producción de vacunas virales.
Objetivo
Que el alumno conozca la importancia diagnóstica y usos de los huevos embrionados así
como su anatomía, técnicas de inoculación y la susceptibilidad viral al cultivarse en las
diferentes cavidades y observando los efectos citopáticos que producen ciertos virus
humanos.
Fundamento teórico
El embrión y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de células necesarias para el

cultivo de diferentes tipos de virus, depende sobre todo de varias condiciones:
1. Vía de inoculación
2. Edad del embrión
3. Periodo de tiempo de incubación
4. Volumen y dilución del inóculo utilizado
5. Temperatura de incubación
6. El estado inmune de la parvada por el cual los embriones son obtenidos
Manejos preliminares.
La utilización de huevo fértil en el laboratorio, no debe ser obtenida de parvadas infectadas

con agentes virales conocidos u otros agentes microbianos. Después de 4 a 5 días de
incubación cuando el embrión puede ser observado fácilmente, estos son evaluados para
determinar cuáles son fértiles. La incubación es alrededor de 37° C y una humedad de 60 a
70% (un alto exceso de humedad permite un subdesarrollo de la cámara de aire, por lo tanto
una baja de humedad permitirá que haya un desarrollo menor). Los embriones deben estar
13
en movimiento varias veces al día, ya sea automáticamente o manualmente, el periodo de
incubación antes de la inoculación depende sobre todo de la vía de inoculación.
Ovoscopia.
La ovoscopia consiste en revisar los huevos embrionados contra una fuente de luz intensa
en un ovoscopio, de esta manera mostrara el embrión, las membranas asociadas y las
cavidades del embrión se observan fácilmente.
1. En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el

movimiento, las condiciones de las venas de sangre y el estado del embrión. Notar las
diferencias con los embriones de diferentes edades.
2. Con un lápiz, marcar la posición del embrión y la cámara de aire (esta área es mantenida
arriba en el ovoscopio).
3. Comparar los embriones fértiles y los embriones muertos de varias edades, descartar los
embriones infértiles y muertos.
Estructura del huevo embrionado.

Justo bajo el cascarón se encuentra una membrana fibrosa que se disemina a través de la
superficie interna del embrión y forma la cámara de aire en el extremo ancho del huevo.
Esta membrana en conjunto con el cascarón ayuda al intercambio de gases en el huevo.
Esta distribución de gases se facilita por la membrana corioalantoidea altamente
vascularizada que sirve como órgano respiratorio del embrión.
Esta membrana se forma de manera adyacente a la membrana del cascarón y forma una
cavidad conocida como saco alantoideo que contiene entre 5 a 10 ml de fluido alantoideo.
El embrión se encuentra envuelto por la membrana amniótica formando el saco amniótico
que contiene entre 1 y 2 ml de fluido amniótico.
El embrión se encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de nutrientes y se encuentra

localizado aproximadamente al centro del huevo.
Técnicas y/o vías de inoculación.

Las cuatro vías más comunes para la inoculación del huevo embrionado fértil son:
La vía de saco alantoideo

La vía de saco vitelino
La vía de membrana corioalantoidea (MCA)
La vía de saco amniótico.
En situaciones de diagnóstico donde hay un agente no especifico que es sospechoso, es

conveniente utilizar muchas vías como sean posibles. Si una elección ha sido hecha, la vía
MCA es preferida a causa de su sensibilidad a un gran número de virus y porque es menos
probable para afectarse por contaminación bacteriana.
Saco vitelino. La inoculación en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y

propagación del virus de encefalomielitis aviar. Los embriones inoculados por esta vía, son
generalmente incubados de 10 a 13 días postinoculación.
14
Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones al término del periodo de
incubación es parálisis de patas.
Si los embriones se dejan nacer, a partir del tercer día de nacidos se pueden observar pollos
que se sientan en las patas, no se mueven bien y algunos caen hacia los lados. Aparece un
ligero pero rápido temblor del cuello y de la cabeza, que especialmente se nota cuando los
pollitos afectados se mantienen en la mano.
Cavidad alantoidea. La inoculación de embriones en saco alantoideo es utilizada para el

aislamiento y propagación de los Paramyxovirus, Myxovirus y Coronavirus. Los embriones
inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación.
Las lesiones que se presentan en los embriones por los Paramyxovirus y los Myxovirus es
que pueden llegar a causar la muerte de los embriones, siempre y cuando se trate de cepas
altamente patógenas, pero tanto los Paramyxovirus como los Myxovirus normalmente se
evalua a través de fluido alantoideo de los embriones y no tanto por las lesiones.
En el fluido alantoideo lo que se tiene que hacer es una prueba de hemoaglutinación con
glóbulos rojos de ave al 5 % para determinar la presencia de hemoaglutininas en dicho
fluido, que no es otra cosa más que la formación de grumos de color rojo rodeados por
espacios transparentes fácilmente visible.
Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones por los Coronavirus son
enanismo, encorvamiento, desarrollo anormal de la pluma y depósitos de uratos en riñones.
Membrana corioalantoidea (MCA). La inoculación de embriones en MCA es utilizada

para el aislamiento y pases de Poxvirus y virus Herpes. Los embriones inoculados por esta
vía son incubados durante 7 días postinoculación. Las lesiones que presentan los embriones
por los virus Herpes y Poxvirus es principalmente en la membrana. Presencia de áreas
focales (pústulas) engrosadas con necrosis o un engrosamiento generalizado de la
membrana.
Saco amniótico.
La inoculación de embriones en saco amniótico es utilizada para el aislamiento inicial de
los Myxovirus. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a
7 días postinoculación.
Las lesiones que se presentan en los embriones por los Myxovirus son hemorragias
generalizadas en todo el embrión y pueden llegar a causar la muerte, siempre y cuando se
trate de cepas altamente patógenas, pero también se evalúa por la presencia de
hemoaglutininas que se encuentran en el fluido alantoideo del embrión.
Intravenosa. La inoculación por esta vía no tiene aplicación amplia para el estudio de
infecciones experimentales en embriones de pollo. El procedimiento es generalmente
empleado para estudios hematológicos. Embriones de 10 a 15 días de edad son los más
adecuados para esta vía. La cantidad de inóculo puede variar de 0.2 a 0.5 ml.
Intracerebral. La inoculación puede ser realizada con embriones de 8 a 14 días de edad y

el inóculo es de 0.1.a 0.2 ml. Esta vía puede ser empleada en estudios de alteraciones
patológicas del cerebro. Los virus de herpes simple y rabia pueden ser cultivados por esta
vía.
15
Aspectos de higiene y seguridad
El riesgo de infección en el caso de inoculación de pollo y animales se asocia con el peligro

inherente al manejo de agujas y jeringas, las cuales deben purgarse usando un tubo que
contenga un material absorbente para evitar salpicaduras o aerosoles, después de su uso
desecharlas en recipientes rígidos para residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), o
en el contenedor de punzocortantes, jamás re-encapuchar. La cosecha de líquidos y/o
tejidos de los embriones debe realizarse de manera cuidadosa, depositando los residuos en
una bolsa amarilla de RPBI’s.
3 Huevos no embrionados
Ovoscopio
1 Jeringas de 3 mL
2 jeringas de insulina (de aguja desmontable)
Gasas y torundas
Alcohol al 70 %
Barniz para uñas o pegamento liquido blanco
Cajas petri
Azul de metileno al 2 %
Solución de alcohol-benzal (1:1)
Procedimiento
A. Metodología de ensayo de inoculación
1. Revisar
A. las características de los huevos,
Inoculación.
para verificar que se encuentren en 2. Con ayuda del ovoscopio
condiciones satisfactorias para su uso, identificar las estructuras del
deben tener el cascaron completo, sin áreas huevo (ver anexo 1).
frágiles o fracturadas.
3. Encontrar y marcar el saco o

4. Inocular 100 μL de colorante en las cámara de aire en la parte superior
diferentes cavidades. del huevo.
5. Romper los huevos en las cajas petri y

evaluar la correcta inoculación.
16
Anexo 1
1. Realiza un modelado de las estructura del huevo embrionado (puedes usar los
materiales que desees), tu trabajo se presentara la siguiente sesión de laboratorio.
Observaciones
Bibliografía.

Vol. 1
Editorail Masson. S.A. Barcelona.
17
Práctica 3. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad

alantoidea.
Introducción
Los huevos embrionados se usan de manera limitada en la actualidad para el diagnóstico

viral, pues son baratos, de fácil manipulación, estériles y contienen varias cavidades que
permiten inocular varios virus a la vez. Este sistema biológico ha sido utilizado para la
investigación viral en el laboratorio, además en la producción de ciertas vacunas.
Objetivo
Que el alumno conozca la importancia diagnóstica y usos de los huevos embrionados así
como su anatomía, técnicas de inoculación y la susceptibilidad viral al cultivarse en las
diferentes cavidades y observando los efectos citopáticos que producen ciertos virus
humanos.
Fundamento teórico
El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para
el cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con los animales de
laboratorio empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo fértil ofrece diversas
ventajas tales como:
 Son estériles.
 No tienen funciones inmunológicas desarrolladas.
 No son costosos.
 Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica
en comparación con otros sistemas biológicos, tales como el mantenimiento y reproducción

de Cultivos Celulares. El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de
aves sanas ALPES, aves libres de patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés, para
de esta manera eliminar la presencia de virus que comúnmente afectan a las aves como
Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc.
18
Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la viabilidad
del embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de inoculación debido a
la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas células o tejidos.
En la figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que conforman a un huevo

fértil. Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto del
huevo fértil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biológico
empleado.
Los virus pueden inocularse en las diferentes estructuras de los huevos embrionados de
pollo o pato, los huevos se inoculan entre los 5 a los 14 días post-fertilización, dependiendo
del estado de desarrollo de la membrana o cavidad que se desee infectar, el sitio de
inoculación se elige según el tropismo viral y puede ser:
a. En la superficie de la membrana corioalantoidea

b. En la cavidad corioalantoidea
c. En el saco vitelino
d. En el saco amniótico
e. En el sistema vascular (vena corioalantoidea)
f. En el propio embrión (intracerebral)
Para la inoculación del embrión (7-14 días) se practica un pequeño orificio en el cascarón
del huevo, previa asepsia y se inyecta el inoculo, se incuba a 37 ° C, la replicación viral
puede producir la muerte del embrión, lesiones características o la manifestación de
antígenos virales por ejemplo las hemaglutininas.
Los huevos embrionados presentan la ventaja de ser bacteriológicamente estériles y de fácil

manipulación, actualmente su uso está restringido al aislamiento, propagación y
elaboración de vacunas mixovirus, paramixovirus y poxvirus.
Vías de inoculación de huevo hembrionado
19
Embriones de pollo libres de patógenos de 9 a 11 días de incubación.

Virus de New Castle.
Solución de azul de metileno al 2 %.
Solución de alcohol-benzal (1:1)
Solución salina fisiológica.
Jeringas para insulina estériles.
Gasas y torundas.
Tubos de ensayo.
Vasos de pp de 100mL.
Lápiz y marcador.
Esmalte para uñas o pegamento blanco.
Cajas petri.
Equipo de disección (pinzas y tijeras de punta fina).
Ovoscopio.
Estufa a 37 °C.
Recipiente de desechos de RPBI.
3 jeringas de insulina con aguja No. 22
Procedimiento
a. Metodología de inoculación
1. Al llegar los embriones al laboratorio,

B. Inoculación. 2. Con ayuda del ovoscopio verificar
revisar que se encuentren en condiciones que cada huevo tenga un embrión
satisfactorias para su uso en la inoculación vivo, de tamaño adecuado al
de virus, deben tener el cascaron completo, desarrollo normal de 7-9 días de
sin áreas frágiles o fracturadas (ver anexo incubación.
1).
3. Con el ovoscopio marcar con un lápiz 4. Encontrar y marcar el saco o

sobre el cascarón la membrana que separa cámara de aire en la parte superior
al embrión de la cámara de aire. del huevo.
5. Antes de inocular, limpiar el área y 6. Desinfectar la superficie marcada

asegurarse que todos los implementos de en el cascarón con la solución
trabajo estén a la mano. alcohol-benzal o de lugol.
8. Usando el ovoscopio localizar la porción 7. Con ayuda de la jeringa hipodérmica

del embrión para inocular en el saco hacer una punción en el centro de la
amniótico y alantoideo. cámara de aire (ver anexo 2 y figura 1).
20
9. A través del orificio hecho en el cascaron 10. Retirar la aguja de la región
y con Angulo de 10 a 20° introducir amniótica, aproximadamente 1 cm,
cuidadosamente la aguja dirigiéndola a un para situarla en la cavidad
lado del embrión. Tratando de no alantoidea e inocular 0.1 mL de
lastimarlo e inocular 0.1 mL de la muestra. muestra.
12. Los testigos no reciben ningún 11. Sellar el orificio del cascarón con
tratamiento, y se incuban en las mismas parafina, pegamento blanco o
condiciones que los inoculados. esmalte de uñas e incubar a 34 ° C
por 72 h.
13. Al terminar, limpiar y desinfectar

perfectamente el área de trabajo.
Anexo 1: CONFIRMACIÓN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIÓN

Trasluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio. Un
embrión no viable puede reconocerse a través de:
 Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutícula.

 Falta de irrigación.
 Falta de movimiento.
 Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general contaminación
bacteriana.
Anexo 2:
b. Otra formas de inoculación
Inoculación en el Saco Vitelino:
1. El saco vitelino se encuentra en posición contraria al embrión.

2. Observar al ovoscopio y marcar el límite de la cámara de aire, marcando la posición del
embrión. La cámara de aire debe estar en el polo.
3. Realizar un pequeño agujero en el límite de las ¾ partes del huevo.
4. Tomar el inoculo con aguja de inoculación No. 22 con una jeringa de insulina.
5. Inocular en el agujero hecho en posición directa al embrión con ángulo de 90°.
Inoculación en la Cavidad Alantoidea:
1. Colocar el huevo con posición vertical y con un taladro hacer un orificio en posición
directa del embrión.
2. Con aguja N° 22 pinchar en forma oblicua formando un ángulo de 45° en el borde (en
relación al polo de la cámara de aire); introducir las 1½ pulgadas.
21
3 . Otra forma es marcar la cámara de aire, a 0.5 cm de la marca hacer un agujero e inocular
0.3 mL del inoculo con un aguja número 26 ó 27 de insulina.
4 . Hacer un agujero por encima de la cámara de aire y en posición contraria al embrión e
inocular.
Inoculación en la Cavidad Amniótica:
1. Practicar un agujero en posición directa al embrión; con aguja 22 de 1½pulgadas.

Inocular directamente al embrión, introduciendo toda la aguja.
2. Podemos también abrir toda la cámara, añadir 1 gota de solución salina fisiológica o
agua destilada, para que la membrana fárfara, que inicialmente es blanca se haga
transparente.
3. Introducir la pinza y levantar la membrana de la cavidad amniótica, observar el embrión
e inocular.
Inoculación en la Cavidad Coriolantoidea:
1. Se práctica un agujero en el polo más ensanchado del huevo

2. Para inocular:
Utilizando la cámara natural: inoculando por debajo de fárfara que cubre,
depositando el líquido sobre la membrana corioalantoidea, usando jeringa de
insulina y aguja 26 ó 27.
Fabricando una cámara de aire artificial: practicar dos agujeros; uno en el
polo más ensanchado y otro en uno de los costados del huevo en posición
contraria al embrión. Colocar una jeringa en la el agujero y obtener el aire del polo más
ensanchado (cuando sale el aire). La membrana corioalantoidea baja; es decir este se
separa más de la cáscara.
3. Evitar abrir demasiado para que no se contamine.
4. Se inocula con ayuda de una jeringa de 25 o 27 x 1 ó ½ de pulgada.
5. Para inocular se introduce la aguja y enseguida se inocula el fluido, en la inoculación
puede girar la jeringa para que el líquido, quede depositado en la membrana.
6. Después de realizadas las inoculaciones, los agujeros son cubiertos con parafina cera.
c. Cosecha del virus
1. Cortar con las tijeras la cáscara a 2. Con ayuda de una jeringa retirar el
nivel del límite de la cámara de aire. líquido alantoideo.
4. En caso de no haber líquido, 3. Extraer con pipeta Pasteur el

hacer un lavado con suero líquido amniótico.
fisiológico estéril (1mL) y luego
se colecta este líquido.
22
Figura 1. Rutas de inoculación de virus en los huevos embrionados. 1. En la cavidad
alantoidea, 2. En la cavidad amniótica, 3. En el saco vitelino, 4. En la membrana
corioalantoidea.
1. Menciona tres usos de los huevos embrionados en el laboratorio de virología.

2. Esquematiza un huevo embrionado, señalando cada una de las cavidades que los
caracterizan.
3. ¿En qué cavidad es susceptible inocular un herpes virus?
4. Los poxvirus ¿en qué cavidad se inoculan?
5. ¿Qué efecto produce el herpes virus en el embrión?
Identifica las partes de los huevos embrionados.
23
Observaciones
Bibliografía.

Vol. 1
24
Práctica 4. Replicación del virus de la bronquitis infecciosa aviar en

huevo fértil de pollo (1ª parte) titulación del virus de la bronquitis
infecciosa aviar (DI50) en huevo fértil de pollo (2ª parte).
Objetivos
El alumno dominara las técnicas para propagar y titular una cepa vacunal de virus.
El alumno determinará la DLEP50 para la vacuna del Virus de la Bronquitis Aviar (VBA),
calculando sus concentraciónes por unidad de volumen.
Introducción
Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamíferos daños
severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta interacción
induzca una protección inmunológica al individuo como consecuencia del reconocimiento
de antígenos específicos tanto en forma natural como artificial. En el caso de medidas
profilácticas, con el empleo de vacunas se procura inducir una Inmunidad Adquirida Activa
Artificial. Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la
vacuna. Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede efectuar en
sistemas biológicos tales como huevos fértiles de ave que pueden responder a la infección
viral dando lesiones características del virión inoculado que afecte directamente al embrión
y le produce signos tales como músculos distróficos, enanismo o muerte, o bien, afectan
estructuras y líquidos extraembrionarios donde se pueden observar hemorragias, formación
de placas o pústulas así como determinar la presencia de hemaglutininas virales.
Los virus vacunales o de campo pueden titularse en conjunto de huevos fértiles de ave
huando producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP50) o en el
caso de virus hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al 50% (DIEP50) empleando la
reacción de Hemaglutinación de los fluidos cosechados.
Aspectos de higiene y seguridad
El riesgo de infección en el caso de inoculación de pollo y animales se asocia con el peligro

inherente al manejo de agujas y jeringas, las cuales deben purgarse usando un tubo que
contenga un material absorbente para evitar salpicaduras o aerosoles, después de su uso
desecharlas en recipientes rígidos para residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), o
25
en el contenedor de punzocortantes, jamás re-encapuchar. La cosecha de líquidos y/o
tejidos de los embriones debe realizarse de manera cuidadosa, depositando los residuos en
una bolsa amarilla de RPBI’s.
Huevo fértil de ave de 10 dias de incubación (+/- 1 dia) calidad ALPES.

Vacuna de VBA. INTERVET
Solucion salina de Dulbecco
Lápiz, pegamento blanco y perforadores
Hisopos estériles, tintura de yodo.
Estufa a 37°C.
Ovoscopio.
Jeringas de insulina.
Mechero.
Recipiente para desechos.
Procedimiento
1. Realizar con solución salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna viral

desde 10-1 hasta 10-6 a partir de una suspensión concentrada.
2. Trasluminar el huevo fértil de ave y seguir la técnica de inoculación para cavidad
alantoidea
3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculación con tintura de yodo
antes y después de perforar
4. Inocular 0.1 ml de las cuatro últimas diluciones en cada uno de 5 embriones de 9 a
11 días de incubación (20 embriones en total), vía cavidad alantoidea.
5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforación con una gota de pegamento blanco
6. Marcar con lápiz sobre cada embrión la dilución y vacuna inoculadas
7. Incubar a 37°C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los embriones
al ovoscopio, señalando en el primer dia los embriones que resulten muertos por
traumatismo
8. Al termino de la incubación, trasluminar los embriones al ovoscopio y realizar un
recuento de embriones vivos y muertos.
9. Anotar los resultados obtenidos y realizar los cálculos para determinar la DLEP50 /
0.1 ml empleando el método de Reed & Muench, con base en el siguiente ejemplo:
26
Para una mejor explicación, se desgloza a continuación la realización de los cálculos para
cada columna:
1. Realizar la suma acumulada de embriones muertos desde la dilución más alta hasta la
más baja.
2. Realizar la suma acumulada de embriones vivos desde la dilución más baja a la más
alta.
3. Calcular el cociente dado por los acumulados muertos sobre la suma de acumulados
muertos más acumulados vivos de cada dilución.
CALCULAR EL VALOR DE INTERPOLACIÓN (V.I.)
Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de mortalidad En el ejemplo: 10-
4 y 10-5.
Estimar la DLEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor al

50% de efecto.
En el ejemplo : 10-4 + (-0.49) = 10-4.49 = DLEP50
El titulo se obtiene con el inverso de la DLEP50.
Finalmente:
Titulo = 104.49
27
Actividades de evaluación
1. Además de la titulación viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote
vacunal antes de salir al mercado.
2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra viral.
Observaciones
Bibliografía

Vol. 1
28
Práctica 5. Hemaglutinación
Introducción:
La hemoaglutinación es un método donde no se mide la capacidad infecciosa de las

partículas virales. Es una técnica indirecta para medir partículas virales, pues en realidad
mediante esta técnica se mide la cantidad de partículas hemaglutinantes (proteínas virales)
independientemente si estas están incluidas en la partícula viral o libres como antígeno.
Objetivo
Se realizará el reconocimiento del virus de New Castle mediante la Hemoaglutinación
Directa, por su acción sobre los glóbulos rojos de pollo.
Fundamento teórico
La hemoaglutinación es uno de los métodos indirectos más comunes para cuantificar

partículas virales y/o antígenos virales hemaglutinantes en suspensión. En esta los
eritrocitos se pueden sensibilizar con diversos antígenos y se pueden usar como un sistema
indicador. Así, si se descubren los anticuerpos, la reacción se revelará como una
hemoaglutinación que se puede advertir a simple vista. Existe una gran cantidad de
antígenos que se pueden unir a los glóbulos rojos, entre ellos los carbohidratos que se
adhieren con rapidez. En el caso de las proteínas se requiere un proceso de pre-tratamiento
con ácido tánico o con cloruro de cromo. Este sistema se usa para demostrar anticuerpos
contra toxinas como la de la difteria o del tétanos. También para descubrir anticuerpos
contra el virus de la fiebre amarilla, VZV, influenza, parainfluenza y dengue.
Un virus hemaglutinante es aquel capaz de aglutinar glóbulos rojos de determinada especie

animal, p.ej. los virus ya mencionados anteriormente.
El título de una hemoaglutinación está determinado por la última dilución de una serie, en
donde se observa, macroscópicamente, una malla formada por la unión del virus y/o
antígeno libre a receptores en la membrana de los glóbulos rojos y en la siguiente dilución
un sedimento o “botón” de glóbulos rojos.
29
1. Desinfectar el área de trabajo al inicio y al final de la práctica.

2. Uso de protección personal.
3. Adecuada disposición de los residuos en una bolsa amarilla de RPBI’s.
4. Tratamiento químico adecuado para la desinfección del material que tuvo contacto con
los productos biológicos.
Virus New Castle.

Glóbulos Rojos de pollo lavados.
Para el caso de seres humanos: usar grupo sanguíneo “O”.
Solución Salina Fisiológica.
Gradillas.
Tubos de ensayo.
Pipetas.
Espejo.
Centrífuga.
Procedimiento:
Preparación de Glóbulos Rojos Lavados:
1. Extraer la sangre de pollo

(previamente vacunado); y conservarla 2. Centrifugar a 1500 rpm por 5 min.
en un tubo con anticoagulante.
4. Extraer la sangre de pollo (previamente

3. Eliminamos el sobrenadante (plasma). vacunado); y conservarla en un tubo
con anticoagulante.
5. Agregar al tubo (Paquete Celular) 6. Volver a centrifugar a 1500 rpm por 5

solución salina fisiológica y mezclar. min.
7. Luego, tomamos de 0.7 ml. de 8. Eliminamos el sobrenadante y

glóbulos rojos del paquete celular y lo volvemos a repetir el proceso de lavado
suspendemos en 100 ml. de SSF, para 2 – 3 veces más.
obtener el 0.7 % de glóbulos rojos
lavados.
30
Reacción de Hemoaglutinación:
1. Colocamos 8 tubos en un gradilla,

2. Con una pipeta tomar 20 μl. de cepa de
colocándole al primero 180 μl. de SSF
Newcastle y depositarla en el tubo No.
y del tubo 2 al 8 añadir 100 μl. de
1 (dilución 1/5).
Suero Fisiológico.
3. Repetir hasta obtener las diluciones 4. Tomamos 100 μl. del tubo 01 y lo
1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, depositarnos en el tubo Nº 02,
1/1280 (el tubo N° 09 es el control se (dilución 1/10).
le añadirá 0.5 ml. de la cepa New
Castle).
6. Dejamos reposar al medio ambiente por
5. A cada tubo colocamos 100 μl. de los 15 a 20 minutos.
glóbulos rojos lavados al 1 %
(incluyendo el tubo control).
7. Pasado el tiempo, colocamos debajo de
8. La última dilución en la cual aparece la gradilla un espejo, para observar si
HA es el título del virus (este es el hay “hemaglutinación positiva”
inverso de dicha dilución). (formación de una malla delgada, gris)
o hemoaglutinación negativa (se
observa un punto rojo).
31
1. Describe el fenómeno de hemaglutinación

2. ¿Cuál es la diferencia entre aglutinación directa e indirecta?
3. ¿Cuál es la utilidad de la técnica de hemaglutinación por virus?
4. Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de
HA.
5. Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la
prueba de HA.
6. Porqué es importante determinar la dilución que contiene 4 UHA.
Observaciones
Bibliografía.

Vol. 1
32
Práctica 6. Inhibición de la Hemaglutinación
Introducción.
La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no específico de infección

por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva no nos permite asegurar que
este virus sea el agente causal. La prueba de hemaglutinación se basa en una característica
inherente de la estructura de ciertos virus como lo de la influenza y rubéola, los cuales
contienen en su superficie componentes que se asocian a moléculas de superficie de los
eritrocitos y los aglutinan. El virus hemaglutinante forma puentes entre los eritrocitos y
cambia su patrón normal de asentamiento, este fenómeno se llama hemaglutinación, el
bloqueo de este fenómeno es conocido como inhibición de la hemaglutinación.
Objetivo.
Que el alumno conozca el fundamento de la técnica de la inhibición de la hemaglutinación

(IHA) y su aplicación en el diagnóstico, así como determinar si están protegidos contra la
rubéola de acuerdo al título de anticuerpos presentes en suero y principalmente en alumnas.
Fundamento teórico
Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que demuestre una
respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta está representada por la
presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se conoce como Inhibición de la
Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina del

virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este
hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce como neutralización vírica.
Muchas de las familias de virus poseen la capacidad de aglutinar eritrocitos de diversas
especies animales (pollos, patos, bovinos, etc) Esta propiedad fue descubierta en 1941 por
Hirst y McClelland en virus de la gripe.
33
El fenómeno básico se da por la unión de hemaglutininas virales (proteínas de la membrana
de los virus) con los receptores mucoproteicos presentes en las membranas de muchas
células y que son especialmente abundantes en los eritrocitos.
Si la concentración de viriones es suficiente, se formarán múltiples puentes entre ellos y los

eritrocitos, depositándose en el fondo del tubo en forma de retículos, los eritrocitos que no
fueron aglutinados, se depositarán en el fondo del tubo en forma de botón.
Los anticuerpos presentes en el suero pueden inhibir la hemaglutinación originada por

ciertos virus. Si se hace reaccionar a un virus con capacidad de hemaglutinación con su
anticuerpo específico, este anulará su capacidad de hemaglutinación por bloqueo de las
hemaglutininas presentes en la envoltura del virión. La inhibición de la hemaglutinación es
un método diagnóstico utilizado con frecuencia, tanto para identificar virus, como para
determinar la presencia de anticuerpos específicos. Es necesario tratar los sueros para
eliminar inhibidores específicos de la hemaglutinación.
Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos.

Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores
automáticos. Nunca pipetear con la boca.
Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan
hipoclorito de sodio al 1%.
Evitar derrames o salpicaduras del material biológico.
Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.
Equipo de microtitulación
Microplacas de 96 pozos de fondo en U
Microdilutores de 25 L
Pipeta automática multicanal con rango de 25 a 100 L
Puntas para pipeta automática estériles
Suero Humano tratado
Eritrocitos en solución de PBS al 85% (pollo, cobayo o de pato)
Vacuna viral (viriones atenuados New Castle, cepa La Sota, INTERVET )
Solución salina de fosfatos pH 7.2 (PBS)
Solución de hipoclorito de sodio.
Alcohol y algodón.
Recipiente para recolección de desechos.
34
Procedimiento
1. Estandarizacíón de los eritrocitos. Con base 2. Hacer diluciones al doble del suero
en los resultados de la práctica anterior,
problema, desde 1:2 hasta 1:256 de
preparar en un tubo una dilución del virus
del Newcastle que contenga 4 UHA en un
acuerdo al esquema de la figura 1;
volumen suficiente para realizar la prueba incluir un pozo control que no
de IHA (ver ejemplo). contendrá antisuero ni virus.
4. Colocar en el pozo 1 75 μl del suero 3. Agregar 75 μl de SSI a los pozos del

problema y mezclar por aspersión y 1 al 9 de la microplaca.
dispersión de dos a tres veces obteniendo
así la dilución 1:2.
6. Repetir sucesivamente este

5. Transferir 75 μl de ésta dilución al
procedimiento hasta el pozo No. 8 que
pozo 2 y mezclar homogéneamente.
corresponderá a la dilución 1:256.
7. Desechar del pozo 8 75 μl en el

NOTA IMPORTANTE: No se debe
recipiente para recolección de
agregar dilución del suero al pozo No. 9
desechos.
que sirve como control.
8. Agregar a cada uno de los 8 pozos con 9. Agitar la microplaca para que
suero problema, 4 UHA del antígeno viral reaccionen los sustratos y dejar en
en un volumen de 75 μl. reposo durante 10 min.
10. Agregar 75 μl de la suspensión de

glóbulos rojos a todos y cada uno de
11. Determinar el título del antisuero
los pozos, agitar y colocar la
identificando la última dilución que
microplaca a temperatura ambiente
presenta IHA. En la hemaglutinación se
hasta que los glóbulos rojos del pozo
observa una agregación de las células
sanguíneas sobre la superficie del pozo,
que no contiene antisuero y sirve
formando una especie de red. como control haya sedimentado.
35
1. Cita 3 virus con capacidad hemaglutinante diferentes a los que se mencionan en esta
práctica
2. ¿Qué diferencia macroscópica hay entre una sedimentación eritrocitaria y una
hemaglutinación?
3. ¿Por qué se utilizan los glóbulos rojos tipo O?
Ejemplo de estandarización de eritrocitos:
a Resultado de la práctica de HA: Dilución 1:20 de la vacuna viral = 4 UHA

b Volumen suficiente para realizar IHA= 2ml
Entonces.....
Vacuna viral concentrada 100 μl
+
SSI 1900 μl
_________
Volúmen final 2000 μl de dilución con 4 UHA
PATRONES DE SEDIMENTACIÓN:
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA
36
1. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado negativa en la prueba de IHA?
2. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado positivo en la prueba de IHA?
3. Conjuntando las pruebas de HA e IHA, ¿Cómo explica un resultado negativo en la
prueba de HA con uno positivo en la prueba de IHA? y ¿Cuál es el diagnóstico final que
daría después de analizar ambas pruebas?
Observaciones
Bibliografía

2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología
médica Vol. 1
3. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da
Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.
37
Práctica 7. Inoculación intracerebral de ratón lactante
Introducción
La primer técnica emplead en el aislamiento de los virus fue la inoculación en animales de

experimentación. La prueba de infección se lograba si él animal moría o si se observaban
síntomas o lesiones. La aplicación de este método es limitado, los animales son caros así
como su mantenimiento, no todos los animales son susceptibles a las enfermedades que
atacan al hombre, a pesar de estas dificultades, son esenciales para el aislamiento de
algunos virus que causan enfermedades del sistema nervioso central como los arbovirus,
enterovirus, coxsackievirus y rabdovirus.
Objetivo
Que el alumno aprenda a realizar la correcta inoculación de ratones por las vías
intracerebral, intraperitoneal, subcutánea y oral.
Fundamento teórico
Los animales habitualmente utilizados en el laboratorio son ratones lactantes o adultos,

cobayos, conejos y en algunos casos primates, numerosos virus pueden aislarse y cultivarse
en animales de experimentación, resultan indispensables en la investigación de la
patogénesis e inmunidad de las enfermedades virales, en el ensayo de vacunas, en el estudio
de los virus oncogénicos y de la preparación de antisueros con fines diagnósticos.
Debido a la legislación en cuanto a su uso, el alto costo de mantenimiento, a la complejidad

de las instalaciones y al riesgo de manipulación de animales infectados, se utilizan de
manera cada vez más restringida. La inoculación en animales es el método más antiguo
para aislar y conservar virus, dependiendo del virus por aislar se elige el animal, la vía de
inoculación que asegure que el virus alcance el tejido u órgano donde se multiplique con
mayor facilidad, es importante seguir las precauciones de esterilidad necesarias para que la
muestra no se contamine con microorganismos que enmascaren el desarrollo viral. Los
ratones y hámsteres recién nacidos de menos de 48 horas son especialmente susceptibles a
38
los enterovirus, cocksakievirus y rabdovirus, pueden ser inoculados por vía intracerebral o
intraperitoneal, en cambio los ratones adultos son susceptibles a la rabia, la fiebre amarilla
y linfogranuloma, la inoculación se hace por vía intracerebral y los síntomas principales son
la falta de coordinación y ataxia.
1. Purgar las jeringas usando un tubo que contenga material absorbente para evitar
aerosoles.
2. Asegurar que el animal este completamente sedado antes de inocularlo.
3. Aplicar correctamente las técnicas de inoculación y sujetar firmemente al animal para
evitar autoinoculaciones.
4. Las jeringas usadas, jamás se re-encapuchan, desechar en el recipiente rígido para RPBI
o en el contenedor de punzocortantes.
5. Los animales que quedan vivos al final de la práctica los animales muertos se colocan en
una bolsa amarilla para RPBI, la cual será refrigerada antes de su destino final.
Material y equipo
Ratón joven de 30 días y ratón lactante de 2-3 días de nacido.

Jeringas para insulina.
Torundas y gasas.
Equipo de disección.
Ampolleta de agua inyectable estéril.
Solución de alcohol-yodo (1:1)
Solución de azul de metileno al 2 %.
Éter
Vaso de precipitado de 100 y 250 mL
Recipiente rígido para RPBI’s y bolsa amarilla de RPBI.
Procedimiento
Inoculación intracerebral. En el lactante se pueden observar los huesos y las estructuras

cerebrales por la transparencia de la piel.
1. Anestesiar al ratón en un frasco que 2. Colocar el ratón de cúbito ventral sobre la

contenga torunda humedecidas con éter. mesa, se selecciona el sitio de inoculación
entre el conducto auditivo externo y el ojo,
a un lado de la línea media.
4. Se carga la jeringa con 0.01 mL para

ratón lactante y de 0.05 mL para ratón 3. Se desinfecta el área, evitando introducir
adulto con agua destilada estéril. desinfectante al ojo.
39
5. La aguja debe penetrar el cráneo en 6. Sentir como la aguja penetra el hueso,
forma perpendicular para evitar que la controlar la presión que se ejerce, la aguja
punta resbale. solo debe penetrar de 1 – 2 mm.
8. El ratón lactante es difícil de anestesiar 7. Se realiza la inoculación, se retira la

por lo que se realiza la inoculación aguja y se desinfecta nuevamente.
rápido y sin anestesia.
Inoculación oral
2. Se carga la jeringa con 0.05 mL de 1. Se carga la jeringa con 0.05 mL de

solución de azul de metileno. solución de azul de metileno.
4. Se acerca la jeringa a la boca y se 3. Se toma al ratón en posición dorsal.

deposita el inoculo.
5. Se puede seguir la trayectoria del

inoculo por la transparencia de la piel.

1. Menciona tres usos de los ratones en el laboratorio de virología
2. Cita 3 vías de inoculación en animales
3. Que precauciones debes tomar en cuenta al realizar una inoculación.
4. Esquematiza la anatomía abdominal del ratón.
5. Para qué tipo de aislamiento viral es útil la inoculación intracerebral.
40
Observaciones
Bibliografía

Vol.1
41
Práctica 8. Diagnóstico rápido de virus rábico (tinción de Sellers)
Introducción.
Los métodos para el diagnóstico de la rabia deben ofrecer condiciones óptimas de

precisión, rapidez y economía. Dentro de estas técnicas está la investigación microscópica
de los corpúsculos de Negri, que se realizan en un frótis de tejido encefálico infectado con
el virus rábico y es teñido por la técnica de Sellers.
Objetivo.
Aprender a efectuar el diagnóstico rápido del virus rábico usando la técnica de Seller
(simulando que el ratón está inoculado o infectado con este virus).
Fundamento teórico
El virus rábico pertenece a la familia Rhabdoviridae, es un RNA virus de una sola cadena,
tiene forma de bala. La rabia se transmite por mordedura o contacto directo de las mucosas
o heridas con la saliva del animal infectado, es la zoonosis más antigua, cuya importancia
radica en su letalidad cercana al 100 %.
La rabia se caracteriza por un cuadro encefálico cuyo diagnóstico diferencial con otras
encefalitis es difícil y solo el examen del laboratorio permitió establecer un diagnostico
seguro.
El diagnóstico clínico de la rabia en un animal justifica el inicio del tratamiento antirrábico

de la persona que estuvo en contacto con el virus y el diagnostico posterior permite
continuarlo o interrumpirlo. Sin embargo las pruebas de laboratorio son adecuadas cuando
se cumplen ciertos requisitos:
 Buena calidad de la muestra

 Condiciones de transporte correctos
42
 Rapidez con la que se obtiene resultado
 Notificación inmediata de los resultados
La tinción de Sellers es una técnica sencilla, rápida y de bajo costo para el diagnóstico de la
rabia, que es una de las infecciones virales de notificación obligatoria para el sector salud.
Esta tinción pone de manifiesto los corpúsculos de Negri en el cerebro del animal infectado
o que se sospecha tenia rabia. Se ha observado que los corpúsculos de Negri son
especialmente visibles en el asta de Ammon, en las células piramidales de la corteza
cerebral y en las células de Purkinje en el cerebro.
El colorante de Sellers tiñe los corpúsculos de Negri de color rojo violaceo o rojo ladrillo,
con inclusiones basófilas de color azul oscuro a negro. Dejándolos claramente
diferenciados de las células nerviosas y del tejido intersticial que se tiñe de azul claro y rosa
respectivamente. Los corpúsculos de Negri están constituidos por partículas virales y
constituyentes celulares rodeados de una matriz citoplasmática, contienen DNA (sustrato
eosinófilo) y RNA (granulaciones basófilas).
5. Uso de protección personal.

6. Asegurarse que el ratón está completamente sedado antes de sacrificarlo.
7. Sujetar firmemente al ratón para evitar accidentes.
8. Realizar los cortes con el bisturí sujeto del mango (evitar manejar el bisturí directamente
con la mano).
9. Los restos del ratón serán colocados en una bolsa amarilla para RPBI la cual deberá ser
refrigerada.
Estuche de disección
Abate lenguas
Papel filtro
Colorante de Sellers
Puente y charola de tinción
Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5
Cronómetro
Microscopio
Ratones de 3 -5 semanas de nacidos
43
Procedimiento
1. Con ayuda del equipo de disección y de las 2. Se levanta la piel y músculos de la
tijeras de punta fina se realizará un corte cara y cabeza para exponer el cráneo.
entre ambas fosas orbitales del ratón.
4. Se inserta la punta de una tijera para cortar 3. Se dobla el cuello del ratón para
el hueso y se corta la bóveda hasta exponer exponer el agujero magno.
el cerebro.
6. Se saca integro el cerebro
5. Se saca integro el cerebro desprendiéndolo desprendiéndolo de la base del cráneo
de la base del cráneo (incluyendo cerebelo (incluyendo cerebelo y parte de la
y parte de la medula). medula).
7. Con el bisturí se hace una sección transversal tomando

un fragmento del cerebro que contenga el asta de
Ammon o cuerpo de Ammon del hipocampo donde los
corpúsculos de Negri son especialmente visibles.
Preparación de la impronta
1. En el extremo de un abate lenguas se coloca 2. Se toma un portaobjetos y se hacen

una banda de papel filtro y sobre este se de 3 a 4 impresiones del cerebro,
pone el corte del cerebro del ratón. tomando ligeramente y haciendo
presión hasta que quede marcado en
3. Se realiza la tinción de Sellers de acuerdo al el porta objetos la silueta de la pieza
siguiente metodología: de cerebro a estudiar.
a. Cubrir la impronta con el colorante de Sellers durante 15 segundos

b. En seguida enjuagar con buffer pH = 7.5.
c. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
2. Observar y describir las células

nerviosas, no se apreciarán los
corpúsculos de Negri pues el riego de
manejar virus rábico es muy alto (solo
se simulará que el ratón está infectado)
44
Figura 1. Corpúsculos de Negri en tejido neuronal
1. Mencione 3 técnicas para el diagnóstico de virus rábico.
2. Define en qué consiste un estudio histológico.
3. Realiza un esquema de la anatomía macroscópica y microscópica cerebral del ratón.
4. Cita el procedimiento para la preparación del colorante de Sellers.
5. ¿Cuál es el sustrato ideal para la obtención de vacuna antirrábica?
Observaciones
Bibliografía

médica Vol. 1
45
Práctica 9. Cultivo Celular (parte 1)
Introducción.
Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solo
de n t r o d e c é l u l a s v i v a s , l a i n v e s t i g a c i ó n s o b r e v i r u s r e q u i e r e e l u s o
d e h ospedadores apropiados. Para el estudio de los virus bacterianos se
u s a n cultivos axénicos en medio líquido o en medio semisólido con agar.
Como la mayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar, resulta relativamente
simple estudiar los virus bacterianos y por esta razón se dispone de un
crecimiento detallado de la multiplicación de estos virus. En lo que respecta a los virus
de los animales, el hospedador inicial puede ser un animal susceptible al virus, pero
a efectos de investigación es deseable disponer de hospedadores más manejables.
En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville Harrison descubre que los tejidos
vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera de su órgano original. Este fue el
comienzo para el desarrollo d e l o s c u l t i v o s d e t e j i d o s y m á s a d e l a n t e e l d e l os
c u l t i v o s c e l u l a r e s ( l í n e a s celulares).
Objetivo.
1. Obtener un cultivo celular primario (monocapa de células in Vitro).

2. Familiarizarse en el cultivo de tejidos.
Fundamento teórico
Muchos virus animales pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o c u l t i v o s

celulares, y el uso de tales cultivos ha facilitado enormemente la
investigación sobre los virus. Los virus son microorganismos intracelulares y para
evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en líneas celulares que
permitan su desarrollo. Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados
para la propagación de los virus, constituyen, desde 1950, el sistema más
empleado para el aislamiento y propagación de la mayoría de los virus, consisten
en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o
tumoral, mantenidas en medios de c u l t i v o d e c o m p o s i c i ó n q u í m i c a d e f i n i d a
y e n c o n d i c i o n e s d e t e m p e r a t u r a , p H , aireación y humedad controladas. Dentro
de éstos, los más usados son los cultivos en monocapa, aunque hay otros sistemas
46
(cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en
microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa
de células que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene.
Estos cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un
agente que dispersa las células (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados)
para luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico
en donde las células se adhieren y multiplican. La invasión viral se evidencia a
través de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas
complementarias.
No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un

laboratorio de diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares.
Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios,
cepas y líneas celulares (MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus
de la misma familia, el citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de
pulmónfetal humano o bien en algunas cepas celulares derivadas del mismo
órgano y especie (MRC-5). Por otro lado, una línea celular como HEp-2 puede ser
bastante sensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros,
pero no permitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es
posible que los pasajes sucesivos de una línea hagan disminuir su sensibilidad a algunos
virus, como sucede con Hep-2 en relación a VRS
Entre los sistemas de cultivo más utilizados tenemos:
a) Cultivos primarios: S e c a r a c t e r i z a n p o r t e n e r v a r i o s t i p o s d e c é l u l a s .
La m a yo r í a s o n d e c r e c i m i e n t o l i m i t a d o i n v i t r o , g e n e r a l m e n t e
r e s i s t e n 5 a 1 0 subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p.
e., células de riñónembrionario humano (REH).
b) Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la
producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales
tóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su
n ú m e r o cromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón.
c) Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten
(n)número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de
tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células
Vero (riñónde mono verde africano), LLC -MK2 (riñón mono rhesus) y
BSC-1 (también detejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2
derivadas de células humanasmalignas. Éstas generalmente tienen un
número variable de cromosomas y aveces también son denominadas
líneas celulares heteroploides. Otras líneas c e l u l a r e s e x i s t e n t e s
s o n A 9 ( f i b r o b l a s t o s s u b c u t á n e o s d e r a t ó n ) , B H K 2 1 (fibroblastos
de hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI, GH3 (epitelio de rata),
L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitosde
ratón), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratón suizo), 3T3-
A31(fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de riñón de
rata).
Algunos ejemplos de líneas celulares son:
47
HEP-2: C é l u l a s h e t e r o p l o i d e s h u m a n a s d e r i v a d a s d e c a r c i n o m a
l a r í n ge o . Recomendadas para RSV y Adenovirus.
MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para Influenza y ocasionalmente
parainfluenza.
LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se
recomiendapara el aislamiento del virus parainfluenza. Requiere el agregado
de tripsinacristalina al medio.
MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario
humano. Serecomienda para el aislamiento de citomegalovirus, herpesvirus.
Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están las células
Hep-2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas son las líneas
de fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento
decitomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón huma
noembrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como
el herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc. En
todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se quiera
evidenciar.
1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos.

2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
3. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o
pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca.
4. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que
contengan hipoclorito de sodio al 1%.
5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular.
6. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.
Material Biológico:
Huevos embrionados de 10 a 11 días.
Material de Laboratorio:
Estuche de Disección (estéril).
Matraz Tripsinizador.
Agar.
Tripsina.
Diversas Soluciones y Medios de Cultivo.
Pipetas
48
Placas y frascos.
Solución de Yodo alcohol.
Ampolla de estreptomicina y ampicilina.
Agitador magnético.
Solución de Hanks Completo (750 ml):
-Solución A: NaCl (80 g.), KCl (4 g.), CaCl2 (1.4 g.), MgSO2.7H2O (2g.): cada solución
que se va pesando se va diluyendo en 450 ml. H2O.
-Solución B: Na2PO4 ( 0 . 6 g . ) , K P O 4( 0 . 6 g . ) , g l u c o s a ( 1 0 g . ) , H 2O destilada
(450 ml.).
-Solución C: Rojo de Fenol 1% (16 ml.).
Hidrolizado de Lactoalbumina 5%
Suero fetal bovino.
Solución Buffer Fosfato (PBS): NaCl: 8 g, KCl: 0.2 g, Na2PO4: 1.15 g, H2O bidestilada:
1000 ml.
Procedimiento
1. Observar al Ovoscopio para descartar embriones muertos o defectuosos.

2. Colocar los huevos seleccionados sobre un porta huevos con la cámara de
aire hacia arriba.
3. Llevar los huevos a la cámara de flujo laminar (en el caso de la práctica,
entre dos mecheros).
4. Limpiar la cáscara en su mitad superior, primera solución de alcohol
yodado y después con alcohol.
5. Colocar las pinzas y tijeras en un vaso con alcohol y agua hirviente.
6. Con la tijera larga punta curva estéril recortar el casquete o la cáscara
correspondiente a la cámara de aire (las tijeras se enjuagan con el H 2O
hirviente y vuelven al alcohol para volver a usarlas).
7. Coger las pinzas largas y con la punta retirar la cáscara rota así como la
membrana de la cámara de aire (esterilizar las pinzas para volver a usar).
8. Con las pinzas curvas, tomar al embrión del cuello y llevarlo a una placa
estéril (esta operación repetirla con todos los embriones).
9. Con una tijera (estéril) eliminar la cabeza, las alas y las patas; abrir el
embrión con un corte en cruz y retirar las vísceras.
10. Lavar con solución buffer fosfato por un par de veces.
11. Luego, empezar a cortar lo que quede del embrión en pedazos cada vez más
pequeños, hasta formar una especie de papilla.
12. Luego lavar los trozitos de carne en la placa por 2 veces con solución
Buffer Fosfato (PBS).
13. Luego, llevar al matraz Tripsinizador y se agrega tripsina 25%: 4 ml.
por embrión y se deja durante 10 minutos con movimientos giratorios, para
esto se pone en un agitador magnético. Esto se puede repetir 2 veces.
14. T r a n s c u r r i d o e s t e t i e m p o e l s o b r e n a d a n t e s e v i e r t e a u n m a t r a z , s e
guarda en refrigeración (previo agregar solución de PBS) .
15. Se vuelve a tripsinizar el sedimento, utilizando igual cantidad de tripsina.
49
16. Lo q u e s e t i e n e e n r e f r i g e r a c i ó n , s e p a s a p o r f i l t r o ( c a p a d e g a s a
y algodón) a otro matraz.
17. El filtrado se centrífuga a 1 000 rpm por 5 min. luego se refrigera.
18. Se elimina el sobrenadante y se queda el sedimento.
19. Lavar las células con PBS y luego centrifugar a 1 000 rpm por 2 veces más.
20. Se resuspende en el medio de multiplicación (previamente se cuenta
células usando la cámara de New Bauer para obtener 2 x 10 células/ml).
21. Se recogen de 10 a 15 ml. y se lleva a una placa estéril, luego se agrega el
suero de feto bovino (estimulará el crecimiento).
22. Incubamos a 37°C.
23. Las células caen al fondo en la placa, se multiplican por el medio y llenan los
espacios vacíos y forma la monocapa.
24. Se elimina el medio de multiplicación.
25. Cuando se tiene la capa de células homogéneas, ya está listo para el
cultivo y aquí se agrega se puede inocular el virus (cuando esta la
monocapa recién se inocula el virus).
Observaciones
Bibliografía

médica Vol. 1
Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona.
5. ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. México D.F.
6. JAWETZ E., J. MELNICK, E. SDELBERG (1996) Microbiología Médica. 15ºedic.
Edit. El Manual Moderno. México D.F.
50
Práctica 10. Cultivo Celular (parte 2)
Introducción.
Los cultivos celulares son actualmente una herramienta elemental en el laboratorio de

Virología. El cultivo celular es un procedimiento “in vitro” en el que se cultivan las células
disociadas que se pegan a una superficie de vidrio o plástico. Se les provee de nutrientes de
acuerdo a sus exigencias para que puedan multiplicarse, el cultivo celular se maneja bajo
estrictas condiciones de esterilidad.
Básicamente hay tres tipos de cultivos celulares:
1. Cultivos primarios los cuales derivan de tejidos, se mantienen vivos por tiempo
limitado y resistente a dos subcultivos
2. Cultivo de células diploides resisten entre 50 y 70 subcultivos
3. Líneas continuas provienen de células diploides transformadas o de tejidos
neoplásicos como VERO, HeLa, Hep- 2 y KB que pueden ser cultivadas sin límite
aparente.
Objetivo.
El alumno realizará el subcultivo celular, con el conocimiento previo de las condiciones

generales que requiere un cultivo celular.
Fundamento teórico
Enders descubrió que los virus podrían desarrollarse en cultivo de células “in vitro” y esto
constituyó un hito fundamental en el desarrollo de la Virología. Los cultivos celulares
constituyen el método de elección para la replicación de la mayoría de los virus. El cultivo
celular consiste en mantener vivas en botellas o tubos con medios nutritivos enriquecidos
con sueros y antibióticos.
Hay tres tipos de cultivos:
51
Cultivos primarios se obtienen por tratamiento con tripsina de pequeños fragmentos de
tejido humano o animal. Las células disgregadas se lavan, se cuentan en cámaras de
Neubauer o cuenta de eritrocitos y se siembran en tubos cónicos o botellas de Roux,
adicionando medios nutritivos y antibióticos. Se incuban a 37°C, luego de pocas horas las
células se adhieren a la superficie del recipiente y se multiplican formando islotes, que van
cubriendo toda la superficie plástica hasta formar una monocapa.
Estas células pueden usarse para replicar virus e identificarlos, o bien para replicarse las
células y obtener nuevos cultivos. Esto se denomina pasaje o subcultivo. Los cultivos
primarios son altamente sensibles a la replicación viral, su mayor inconveniente es que las
células mueren después de pocos pases.
Cultivo de células diploides. Provienen de células de cultivos primarios que se conserva

intacta su morfología diploide, resiste hasta 70 pases, sin perder su alta sensibilidad a
muchos virus y son aptas para la producción de vacunas. Las cepas más usadas son la
MRC-5 (de riñon de mono Rhesus) y las WI-38 (de origen humano).
Líneas Celulares. Denominadas líneas inmortales porque pueden replicarse de manera

ilimitada. Las hay de origen normal como las células VERO provenientes de riñón de mono
verde africano y las de origen neoplásico como las HeLa derivadas del carcinoma de cérvix
o Hep-2 provinientes del carcinoma de laringe. Se usan para aislar el virus de la polio,
Herpes, Rubéola, Sincitial Respiratorio, Adenovirus, etc. Sin embargo su sensibilidad es
más limitada.

Botellas de Roux con células en cultivo de rabdomiosarcoma/ RD o de cáncer de garganta

(Hep-2c), células de riñón de mono verde (VERO)
Medio de Eagle 20X
Agua tridestilada y desionizada estéril
Suero fetal de ternera frasco de 100mL
52
Amortiguador de bicarbonato al 4.4%
Matraces de Erlenmeyer y pipetas estériles
Solución de antibióticos (penicilina/estreptomicina)
Solución de fosfatos
Microscopio invertido o invertoscopio
Incubadora de CO2
Procedimiento
1. Prepara el medio de Eagle de crecimiento 2. Descongelar y resuspender las
y el de mantenimiento células RD o Hep 2c en 5 mL de
Medio
4. Observar en el microscopio invertido el 3. Incubar A 37°C por una hora

porcentaje de células sedimentadas
5. Eliminar el medio y colocar nuevamente 6. Observar el cultivo a las 24, 28 y 72

10 mL e incubar toda la noche a 37°C hrs hasta la formación de una
monocapa confluente.
8. Posteriormente el cultivo celular se inoculará con un

virus para demostrar el efecto citopático
1. ¿Qué condiciones fisicoquímicas son necesarias controlas en el desarrollo de un

cultivo celular?
2. ¿Qué diferencia hay entre un medio de mantenimiento y uno de crecimiento?
3. ¿Cada cuánto debe cambiarse el medio nutritivo a un cultivo celular y por qué?
4. En un cultivo celular ¿A qué se le denomina inhibición por contacto?
53
Observaciones
Bibliografía

médica Vol. 1
Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona.
54
Práctica 11. Conteo Celular
Introducción.
Para obtener monoesteratos reproducibles, los tubos o frascos deberán ser sembrados con
un número regulado de células o de una concentración celular determinada. Las células se
deben contar con el hemocitómetro y usando un colorante vital se pueden diferenciar las
células viables de las no viables.
Objetivo.
Realizar el conteo de células a partir de un subcultivo celular, determinando el número de

células viables por mililitro.
Fundamento teórico
Las propiedades de las células de adherirse a superficies adecuadas están condicionadas a la

presencia de iones de Calcio (Ca) y Magnesio (Mg). En los subcultivos el monoesterato se
puede desprender usando un agente quelante, el cual actúa retirando los iones Ca y Mg, con
lo cual se liberan las células de la superficie a la cual se hallan adheridas.
El monoesterato celular es dispersado con EDTA y tripsina, ya sea por agitación manual de
la suspensión celular durante 10 minutos o usando un agitador magnético, procediendo al
conteo celular.
El cultivo celular permite realizar subcultivos para obtener nuevas generaciones de células
disponibles para su uso inmediato o como reserva conservándolas en criogenia.
De acuerdo al nivel y equipamiento con que cuenta el laboratorio, el conteo celular puede
realizarse ya sea mediante un contador electrónico o de manera manual. El contador
electrónico de células es un instrumento capaz de medir y contar partículas en suspensión,
consta de dos electrodos que transmiten al equipo de amplificación y análisis, los cambios
de resistencia que detectan, cada vez que una de las células en suspensión los cruza. La otra
manera de realizarlo consiste en el uso de un hemocitómetro, usando un colorante que
permite diferenciar las células viables de las no viables.
55

Botellas de Roux con células en cultivo de rabdomiosarcoma/ RD o de cáncer de garganta

(Hep-2c), células de riñón de mono verde (VERO)
Medio de Eagle 20X
Colorante azul de Tripán
EDTA
Tripsina
Pipetas Pasteur estériles
Hemocitómetro o Cámara de Newbauer
Campana de flujo laminar
Mechero
Contador de Colonias
Procedimiento
1. Observar en el invertoscopio la botella
2. En campana de flujo laminar y con
con el monoestrato celular para verificar
mechero, abrir la botella y decantar
viabilidad y confluencia celular.
el medio de cultivo.
4. Observar periódicamente hasta 3. Agregar 2 mL de la solución de

desprendimiento de la monocapa. tripsina- verseno a la botella e incubar a
37°C
5. Adicionar 1 mL de medio por cada 6. Agitar vigorosamente con la pipeta

integrante que vaya a realizar la para disgregar perfectamente las células
práctica.
Nota. Este paso debe realizarse rápidamente y por una

persona porque las células se unen formando coágulo y
se pierden.
56
7. En un tubo estéril colocar 0.8 mL de
suspensión celular y añadir 0.2 mL de
8. Dejar reposar 3 minutos y llenar
azul de Tripán disuelto en soln. salina
la cámara de recuento.
al 0.85% se Teñirán las células no
viables
10. Realizar los cálculos necesarios 9. Observar al microscopio y se cuentan

los cuatro cuadrantes primarios de las
esquinas de la cámara.
1. ¿Qué función desempeña la solución tripsina-verseno en el cultivo celular?
2. ¿Por qué se tiñen las células no viables?
3. ¿Qué Dimensiones tiene un hemocitómetro?
Observaciones
Bibliografía

médica Vol. 1
57
Práctica 12. Titulación Viral
Introducción.
El desarrollo de la replicación viral, es decir, la amplificación del virus inoculado en el

cultivo, puede identificarse por diferentes procedimientos. Todos ellos tienden a detectar
las modificaciones producidas en el cultivo por efecto de la replicación viral (efecto
citopático). Muchos virus se replican produciendo alteraciones de la monocapa celular, que
pueden observarse directamente en el microscopio invertido y estas alteraciones pueden ser
las formación de sincitios o células gigantes multinucleadas, inclusiones en el núcleo y
citoplasma, redondamiento de las células, lisis o necrosis.
Objetivo.
Que el alumno utilice el cultivo celular como medio de multiplicación del virus de la
poliomielitis y determine el título viral a través del efecto citopático generado.
Fundamento teórico
La detección de los virus en cultivo celular y la replicación viral en un cultivo permite

identificarlo por las alteraciones producidas en las células, el cual es denominado efecto
citopático o acción citopatogénica, estos pueden ser observados en un microscopio
invertido, sin necesidad de efectuar alguna otra coloración.
Por ejemplo el virus de la poliomielitis y los herpesvirus producen redondamiento de las

células y desprendimiento de la monocapa. Por otra parte existen virus que tienen en su
envoltura proteínas de fusión como el virus de la influenza y el virus sincitial respiratorio
los cuales inducen unión de las células vecinas formando sincitios (células gigantes
multinucleadas). El efecto citopático también se manifiesta por cuerpos de inclusión que
pueden ser intranucleares, intracitoplasmáticos o ambos.
Algunos virus se replican en los cultivos celulares sin producir efecto citopático visible al
microscopio, sin embargo como producto de la replicación liberan al medio de cultivo
proteínas virales como las hemaglutininas, que pueden ser detectadas por otros
58
procedimientos. El recuento de placas en agarosa (plaqueo) también se puede emplear
como técnica de identificación viral, ya que se pueden cuantificar los viriones presentes en
el inóculo, por medio de unidades formadoras de placa. Para los virus replicables en cultivo
celular, que no producen placas, se utilizan las pruebas de punto final o dilución, que
permiten determinar en forma aproximada la cantidad de virus presentes en una muestra.

5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo
celular.
Equipo de microtitulación
Microplacas de 96 pozos de fondo en U
Microdilutores de 25 L
Pipeta automática multicanal con rango de 25 a 100 L
Puntas para pipeta automática estériles
Antígeno (virus polio vacunal)
Medio Eagle
Botellas de Roux con monocapa confluente entre el 80 – 100%
Solución de antibióticos (penicilina-estreptimicina)
Invertoscopio
Incubadora de CO2
Mechero
Marcador de tinta indeleble
59
Procedimiento
1. Con el cultivo de células RD o Hep 2c
con el 100% de Confluencia 2. Desprender las células con
tripsina-EDTA
4. Realizar el conteo de células viables en 4. Ajustar a 1000000 de células /mL

cámara de Neubauer
5. En una microplaca de 96 pozos 6. Adicionar 25 L de virus vacunal de

colocar 25 L del medio Eagle de polio en los primero tres pozos.
crecimiento.
7. Realizar las diluciones seriadas del virus de arriba

hacia abajo, es decir, de la fila A a la H con la pipeta
multicanal ajustada a 25 L, se hacen las diluciones de
la primera a la última hilera
8. Adicionar 25 L de la suspensión celular en 9. Se cubre la palca y se incuba a

cada pozo 37°C
10. Observar a las 24,48 y 72 hrs. Las

alteraciones citopatogénicas o efecto
citopático en la monocapa.
¿Qué caracteriza a una línea celular definida?
4. Menciona tres líneas celulares usadas para el aislamiento viral diferentes a las que
se mencionan en este manual.
5. ¿Qué significa en Virología Titulación?

60
Observaciones
Bibliografía

médica Vol. 1
61
Práctica 13. Determinación de anticuerpos IgM anti-Rubéola
Introducción.
La Rubéola es una enfermedad infantil de síntomas benignos, caracterizada por un

exantema generalizado, sin embargo, la rubéola en pacientes gestantes, puede asociarse con
graves complicaciones congénitas, como pueden ser ceguera, sordera, defectos cardíacos o
retraso mental. La evidencia de infección puede fácilmente obtenerse por serología
mediante la prueba ELISA específica.
Objetivo.
Determinar anticuerpos del tipo IgG o IgM contra Rubéola mediante la aplicación de un
inmunoensayo.
Fundamento teórico
La inmunidad adquirida contra el virus de la Rubéola se mantiene durante un largo tiempo,

frecuentemente durante toda la vida del individuo, ya que existe un solo serotipo. Las
mujeres en edad fértil deben vacunarse al menos 3 meses antes de embarazarse contra este
virus. Su control debe ser parte rutinaria de la asistencia prenatal, ya que el mayor riesgo de
padecer alteraciones en el feto, es más común durante el primer trimestre de gestación.
Las manifestaciones clásicas son: exantema maculopapular de inicio en cara, presencia de

linfadenopatías de localización post auricular, que aparecen antes del exantema y perdura
por más de una semana, febrícula y ocasionalmente aparecen complicaciones de vías
respiratorias altas. En los adultos son frecuentes las manifestaciones articulares como las
artralgias.
Numerosos métodos se han desarrollado para realizar el diagnóstico, la inhibición de la

hemaglutinación fue el primer método utilizado y es el considerado estándar por la
Organización Mundial de la Salud, la prueba es fundamentada en que los antígenos
glicoproteícos de superficie inducen anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación.
La evidencia de infección puede obtenerse por serología, mediante ELISA específicos el

empleado en esta práctica es inmunensayo en fase sólida. En la madre infectada los
62
anticuerpos anti- Rubéola tipo IgM o IgG aparecen poco después del comienzo de los
síntomas. En neonatos los anticuerpos IgM pueden persistir durante más de un año y son
indicativos de infección congénita.
1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos.

2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la
práctica.
3. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes
que contengan hipoclorito de sodio al 1%.
4. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del suero de
la paciente.
Micropipetas de volumen variable

Puntas para micropipeta, Gradilla, Tubos de ensaye, Muestra de suero por equipo
Kit comercial para detectar IgG anti- Rubéola el cual debe contener
Controles positivo y negativo
Amortiguador de dilución de la muestra
Conjugado
Cromógeno
Solución de lavado
Solución de paro
Placa de reacción
Si se determina por ELISA se empleará un lector de placas con dos filtros de 450 nm y 620
nm
Procedimiento
1. El procedimiento dependerá del kit 2. Cada integrante del equipo deberá
comercial que se disponga y la marca. anotar en su bitácora el procedimiento
previo a la práctica.
4. Preparar los reactivos necesarios y solicitar 3. Solicitar el inserto del kit al técnico
las micropipetas adcuadas del laboratorio.
6. Comparar los resultados obtenidos con

5. Cada equipo deberá colocar su
la guía de referencia del kit y controles,
muestra de suero en un tubo rotulado
anotar observaciones y concentración
en una gradilla.
obtenida de anticuerpo anti- Rubéola.
63
1. Defina los siguientes términos

Artralgia
Artritis
Enfermedad congénita
Enfermedad teratógenica
2. ¿Qué tipo de inmunoglobulina se denomina de memoria?
Observaciones
Bibliografía

médica Vol. 1
64
Práctica 14. Determinación de anticuerpos IgG Anti-Citomegalovirus
Introducción.
Los citomegalovirus (CMV) es un virus con ADN de la familia de los herpesvirus, son
agentes infecciosos muy comunes en el humano ya que infecta a la mayoría de las personas
en alguna fase de la vida, el 80% de la población adulta en todo el mundo cuenta con
anticuerpos contra CMV, presentando una infección subclínica persistente, la infección es
asintomática, pero puede causar serias complicaciones; infección en el primer trimestre del
embarazo conduciendo a anormalidades en el feto y en pacientes inmunodeficientes.
Objetivo.
Determinar anticuerpos del tipo IgG anti -CMV Rubéola mediante la aplicación de un
inmunoensayo.
Fundamento teórico
La infección por CMV es especialmente grave en dos tipos de casos:
1. En pacientes inmunocomprometidos o inmunosuprimidos ya que pueden presentar

infecciones recurrentes, las cuales, se asociación con complicaciones como
neumonías, hepatitis, corioretinitis, así como la co-infección con el VIH.
2. En los recién nacidos la infección por CMV es la causa más importante de
malformación congénita, los neonatos infectados por vía transplacentaria,
desarrollan infección de inclusión citomegálica que es la responsable del 1% de
todas las muertes neonatales y la causa más importante de microcefalia.
El diagnóstico para detectar CMV puede realizarse por aislamiento del virus a partir de
orina y secreciones orales o genitales en cultivos de células diploides, el efecto citopático
llega a retardarse entre una a tres semanas. La detección de antígenos virales mediante
anticuerpos posibilita un diagnóstico rápido. El hallazgo de conversión serológica de los
títulos de anticuerpos detectados por el método de ELISA indica infección reciente. La
65
determinación de anticuerpos IgG anti CMV, es utilizada para establecer el contacto previo
con CMV.
1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos.

4. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del suero de la paciente.
Micropipetas de volumen variable

Puntas para micropipeta
Gradilla
Tubos de ensaye
Muestra de suero por equipo
Kit comercial para detectar IgG anti-CMV el cual debe contener
Controles positivo y negativo
Amortiguador de dilución de la muestra
Conjugado
Cromógeno
Solución de lavado
Solución de paro
Charola de reacción
Si se determina por ELISA se empleará un lector de placas con dos filtros de 450 y 620 nm
Procedimiento inmunoensayo indirecto en fase sólida

1. Preincubar la charola de reacción 3 2. Prediluir las muestras y controles (10
hrs. Antes de iniciar a temp. amb. o a L de muestra o control + 100L de
37°C durante 30 min. diluyente.
4. Insertar el peine en la fila A, agitar e incubar 3. Agregar 25 L de muestra y controles

por 30 minutos, retirar el peine y absorber el prediluidos en la fila A de la charola y
líquido adherido a los dientes. mezclar.
6. Perforar la línea C, insertar el peine,

5. Perforar la línea B, insertar el peine,
mezclar e incubar por 20 minutos, retirar
mezclar e incubar por 2 minutos,
el peine y absorber el líquido adherido a
retirar el peine y absorber el líquido
los dientes.
adherido a los dientes.
66
8. Perforar la línea E, insertar el peine,
7. Perforar la línea D, insertar el peine, mezclar mezclar e incubar por 2 minutos, retirar
e incubar por 2 minutos, retirar el peine y el peine y absorber el líquido adherido a
absorber el líquido adherido a los dientes. los dientes.
10. Incube el peine por 1 minuto en la línea E, 9. Perforar la línea F, insertar el peine,
y seque al aire. mezclar e incubar por 10 minutos, retirar
el peine y absorber el líquido adherido a
los dientes.
11. Realice la lectura en las áreas

12. Deseche correctamente los RPBI.
sensibilizadas del diente
1. Defina los siguientes términos

Inmunoensayo indirecto
Perinatal
Postnatal
Corioretinitis
2. ¿Qué tipo de inmunoensayos se pueden emplear para diagnóstico virológico?
Observaciones
Bibliografía

médica Vol. 1
67

Manual de Laboratorio Virologia

Caricato da

Informazioni sul documento

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Manual de Laboratorio Virologia

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

UNIDAD DE APRENDIZAJE VIROLOGÍA

El diagnóstico de la etiología viral de las infecciones se ha ido generalizando gracias al

Es necesario crear en los profesionales de la salud la conciencia de la utilidad del

El programa de prácticas está integrado por cuatro secciones:

1. Inoculación en embrión de pollo

Práctica Nombre de práctica Sesiones Tema

Aspectos de seguridad e higiene

Procedimiento. Este puede ser considerado como actividad o ejercicios

Actividades de comprobación o evaluación

Calificación final de Laboratorio Valor

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (R.P.B.I.) deben clasificarse y recolectarse de

Los cultivos y cepas almacenados de agentes infecciosos.

Fuente: Guía para el manejo de residuos peligrosos de la UAEM (julio, 2006).

Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o

El material y equipo de un laboratorio de virología es muy parecido a muchos laboratorios,

El alumno investigará y conocerá el equipo y características fundamentales de un

La esencia de un laboratorio de virología son el equipo y la asepsia, tanto de las

A continuación se describen los instrumentos de un laboratorio de cultivo celular.

1. Campana de flujo laminar. Su función es mantener un área libre de contaminantes, esto

Aspectos de seguridad e higiene

1. Durante la visita al Laboratorio de Biología Molecular del CICMED será necesario el

1. Se realizará una visita al 2. El alumno elaborará un trabajo de

3. Investigará la normatividad que debe

Actividades de comprobación o evaluación

2. Describe las características de las campanas de seguridad biológica o campanas de

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica

Práctica 2. Huevo fértil de ave como modelo biológico para el cultivo e

El embrión y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de células necesarias para el

La utilización de huevo fértil en el laboratorio, no debe ser obtenida de parvadas infectadas

1. En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el

Estructura del huevo embrionado.

El embrión se encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de nutrientes y se encuentra

Técnicas y/o vías de inoculación.

La vía de saco alantoideo

En situaciones de diagnóstico donde hay un agente no especifico que es sospechoso, es

Saco vitelino. La inoculación en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y

Cavidad alantoidea. La inoculación de embriones en saco alantoideo es utilizada para el

Membrana corioalantoidea (MCA). La inoculación de embriones en MCA es utilizada

Intracerebral. La inoculación puede ser realizada con embriones de 8 a 14 días de edad y

El riesgo de infección en el caso de inoculación de pollo y animales se asocia con el peligro

A. Metodología de ensayo de inoculación

3. Encontrar y marcar el saco o

5. Romper los huevos en las cajas petri y

Actividades de comprobación o evaluación

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica

Práctica 3. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad

Los huevos embrionados se usan de manera limitada en la actualidad para el diagnóstico

en comparación con otros sistemas biológicos, tales como el mantenimiento y reproducción

En la figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que conforman a un huevo

a. En la superficie de la membrana corioalantoidea

Los huevos embrionados presentan la ventaja de ser bacteriológicamente estériles y de fácil

Vías de inoculación de huevo hembrionado

Embriones de pollo libres de patógenos de 9 a 11 días de incubación.

1. Al llegar los embriones al laboratorio,

3. Con el ovoscopio marcar con un lápiz 4. Encontrar y marcar el saco o

5. Antes de inocular, limpiar el área y 6. Desinfectar la superficie marcada

8. Usando el ovoscopio localizar la porción 7. Con ayuda de la jeringa hipodérmica

13. Al terminar, limpiar y desinfectar

Anexo 1: CONFIRMACIÓN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIÓN

 Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutícula.

Inoculación en el Saco Vitelino:

1. El saco vitelino se encuentra en posición contraria al embrión.

Inoculación en la Cavidad Alantoidea: