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Annamaria

 Bevilacqua  

Insegnamento   NUTRIZIONE  A  LIVELLO  METABOLICO:  STRUTTURE  


BIOCHIMICHE,  REAZIONI  E  REGOLAZIONE  
Professore   ANNAMARIA  BEVILACQUA  
Argomento   CINETICA  ENZIMATICA  I  

Cine2ca  enzima2ca  I   1  di  27  


Annamaria  Bevilacqua  

CINETICA  ENZIMATICA  
La  cine<ca  enzima<ca  è  lo  studio  della  velocità  
di  reazioni  catalizzate  da  enzimi.  
 
Il  suo  studio  consente  di  individuare  il  
meccanismo  di  catalisi.  

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Annamaria  Bevilacqua  

Velocità  di  una  reazione  


La  velocità  di  una  reazione,  definita  come  il  numero  di  moli  di  
prodoKo  formate  nell’unità  di  tempo,  dipende  dalla  
concentrazione  del  substrato  [S]  e  da  una  costante  di  velocità  (k)    
 
 

V  =  k[S]  
 k  =  costante  di  velocità  
Unità  di  misura  di    k  =  reciproco  del  tempo  (es.  s-­‐1)  
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Annamaria  Bevilacqua  

Ruolo  della  concentrazione  di  substrato  

•  [S]  varia  durante  il  corso  della  reazione  perché  il  


substrato  viene  conver<to  in  prodoKo.  
•  Per  semplificare  l’analisi  degli  esperimen<  di  
cine<ca  enzima<ca,  si  può  valutare  la  velocità  
iniziale  (V0),  quando  la  [S]  è  in  genere  molto  più  
grande  della  concentrazione  dell’enzima.    
•  Se  l’analisi  è  rapida  la  variazione  di  [S]  può  essere  
trascurata  e  [S]  può  essere  considerata  costante.    
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Annamaria  Bevilacqua  

Velocità  delle  reazioni  enzima<che  

Il  grafico  riporta  la  


formazione  del  prodoGo  in  
funzione  del  tempo  a  
concentrazione  di  E  
costante  

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Annamaria  Bevilacqua  

Velocità  delle  reazioni  enzima<che  

Sono  rappresentate    
concentrazioni  di    
substrato  [S]  variabili  
 

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Annamaria  Bevilacqua  

Velocità  delle  reazioni  enzima<che  


Andamento  della  velocità  
iniziale  in  funzione  della  
concentrazione  di  substrato  
in  presenza  di  concentrazione  
enzima<ca  costante  
La  velocità  iniziale  (V0)  
 di  una  reazione  enzima<ca    
è  la  velocità  misurata  all’inizio    
della  reazione  (in  genere  non  
 più  dei  primi  60  secondi)  
 

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Annamaria  Bevilacqua  

Velocità  delle  reazioni  enzima<che  


La  velocità    iniziale    
è  la  tangente  alla      
curva  [P]  versus  tempo  

d[P]  
V=  
dt  

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Annamaria  Bevilacqua  

Variazione  di  V0  in  funzione  di  [S]  


Il  grafico  riporta  
l’andamento  della  
velocità  iniziale  in  
funzione  della  
concentrazione  di  
substrato  in  presenza  di  
concentrazione  
enzima<ca  costante  

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Annamaria  Bevilacqua  

Variazione  di  V0  in  funzione  di  [S]  

A  concentrazioni  di  
substrato  basse  la  V0  
aumenta  linearmente  
con  l’aumento  della  
concentrazione  di  S  

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Annamaria  Bevilacqua  

Variazione  di  V0  in  funzione  di  [S]  


A  concentrazioni  di  
substrato  alte  la  V0  si  
avvicina  alla  velocità  
massima  Vmax  

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Michaelis  e  Menten    
•  La  cine<ca  enzima<ca  è  stata  
studiata  in  deKaglio  da  
Michaelis  e  Menten  (1913).  
•  Alla  base  della  catalisi  
enzima<ca  c’è  la  formazione  del  
complesso  enzima-­‐substrato  (ES)  
che  successivamente  si  dissocia  
in  enzima  libero  (E)  e  prodoKo  
(P):  
E  +  S  ⇆  ES  ⇆  E  +  P  
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Modello  di  Michaelis  e  Menten    


E  +  S  ⇆  ES  ⇆  E  +  P  
 
1^  tappa  
Veloce  e  reversibile    

2^  tappa   Tappa  limitante  


Più  lenta   della  reazione  

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Annamaria  Bevilacqua  

Modello  di  Michaelis  e  Menten    

•  La  velocità  della  reazione  complessiva  è  proporzionale  alla  concentrazione  


della  specie  chimica  che  reagisce  nella  seconda  tappa,  cioè  ES.  
•  Quando  la  concentrazione  di  substrato  [S]  è  bassa,  la  maggior  parte  
dell’enzima  è  nella  forma  libera  E.  Quindi  la  velocità  è  proporzionale  a  [S].  
•  La  velocità  iniziale  massima  della  reazione  catalizzata  (Vmax)  si  osserva  
quando  tuGo  l’enzima  è  presente  nella  forma  di  complesso  ES.    
•  Questo  comportamento  viene  deGo  cine2ca  di  saturazione.  
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Equazione  di  Michaelis  e  Menten    


•  La  curva  che  descrive  la  relazione  tra  concentrazione  
del  substrato  e  velocità  della  reazione  è  un’iperbole  
ed  è  espressa  algebricamente  dall’equazione  di  
Michaelis-­‐Menten:  

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Annamaria  Bevilacqua  
L’equazione  è  in  accordo  con  i  da<  cine<ci  
sperimentali  

V [S]  
[S]  >>>  KM            V0  =            max
                                           V0  =  Vmax  
[S]  
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L’equazione  è  in  accordo  con  i  da<  cine<ci  
sperimentali  

Vmax[S]  
[S]  <<<  KM            V0  =  
 KM    
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L’equazione  è  in  accordo  con  i  da<  cine<ci  
sperimentali  

V [S]   V  
[S]  =  KM            V0  =          max
                                           V0  =   max
2[S]   2  
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Costante  di  Michaelis-­‐Menten    

 
KM  è  la  costante  di  Michaelis-­‐Menten  
 
 
 
KM =
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Annamaria  Bevilacqua  

Valore  di  Km  

•  È  equivalente  alla  concentrazione  del  substrato  a  cui  V0  è  


metà  della  Vmax  
•  È  misurato  con  la  stessa  unità  di  misura  della  
concentrazione  di  [S]    
•  Varia  considerevolmente  da  un  enzima  all’altro  
•  Varia  per  substra<  diversi  dello  stesso  enzima  
•  Varia  in  funzione  della  temperatura  e  del  pH  
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Km  è  indipendente  dalla  
concentrazione  di  enzima  

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Kcat  
•  Si  definisce  Kcat    (costante  catali2ca)  la  
costante  di  velocità  della  tappa  limitante:  

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Annamaria  Bevilacqua  

Numero  di  turnover  (Kcat)  


•  Kcat  è  una  costante  di  primo  ordine  espressa  dal  
reciproco  del  tempo  

•  Viene  anche  definita  numero  di  turnover,  ossia  il  


numero  di  molecole  di  substrato  che  vengono  
conver<te  in  prodoKo  nell’unità  di  tempo  da  una  
singola  molecola  di  enzima  quando  l’enzima  è  
saturato  con  il  substrato  

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Equazione  di  Michaelis-­‐Menten  e  Kcat  

Concentrazione  
totale  di  Enzima  

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Numero  di  turnover  (Kcat)  di  alcuni  enzimi  

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Annamaria  Bevilacqua  

Costante  di  specificità  


•  PermeKe  di  confrontare  l’efficienza  catali2ca  di  enzimi  
diversi  oppure  dello  stesso  enzima  con  substra<  diversi  

•  Costante  di  specificità  =  

•  Se  [S]  <<  KM    

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Annamaria  Bevilacqua  

ISOENZIMI  
•  Gli  isoenzimi  sono  forme  mul2ple  dello  stesso  enzima  
(catalizzano  quindi  la  stessa  reazione),  in  genere  sono  
differentemente  distribui<  nei  vari  tessu<.  
•  Hanno  sequenze  aa  simili,  ma  non  iden2che  ed  i  
rispegvi  geni  codifican<  hanno  in  genere  un’origine  
evolu<va  comune.  
•  Il  meccanismo  di  catalisi  degli  isoenzimi  è  lo  stesso,  ma  
variano  i  loro  parametri  cine2ci  (Km  e  Vmax),  così  come  
la  loro  eventuale  regolazione.  
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