DR.

FEDERICO ANTONIO GUTIERREZ MICELI

DR. CARLOS ALBERTO LECONA GUZMÁN
 PRACTICA 1

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STOCK Y MEDIO DE CULTIVO

OBJETIVO.

Preparar soluciones stock necesarias para la composición de los medios de cultivo

que se emplearán en el conjunto de las prácticas de la asignatura.

Composición del Medio MS (Murashige & Skoog 1962)

Preparación de soluciones stock

Reactivoc

Solución A. Concentración: 1000 X Volumen 50 ml

Cloruro de calcio CaCl2- 2 H2O 22.0 g

Solución B. Concentración: 1000 X Volumen 50 ml

Yoduro de Potasio KI 41.50 mg

Cloruro de Cobalto CoCl2-6 H2O 1.25 mg

Solución C. Concentración: 400X Volumen: 50 ml

Fosfato monobásico de potasio KH2PO4 3.4 g

Ac. Bórico H2BO 0.124 g
Molibnato de sodio NaMoO4 0.005 g

Solución D. Concentración: 400 X Volumen: 50 ml

Sulfato de magnesio MgSO4- 7 H2O 7.4 g

Sulfato de Magnaneso MnSO4- H2O 0.34 g
Sulfato de Zinc ZnSO4- 7 H2O 0.172 g
Sulfato de cobre CuSO4- 5 H2O 0.5 mg

Solución E. Concentración: 200 X Volumen 100 ml

Sulfato Ferroso FeSO4 -7 H2O 0.557 g

EDTA Disódico Na2EDTA 0.745 g

Disolver ambos componentes, para lo cual requiere calentar. Agregar popo a poco la
solución de Fe a la de EDTA y aforar. Debe de quedar de color amarillo sin
precipitados.
Solucion F. Concentración: 100 X Volumen: 100 ml

Glicina 20.0 mg
Piridoxina 5.0 mg
Ac. Nicotínico 5.0 mg
Tiamina HCl 1.0 mg
Mio Inositol 1.0 g

Otros reactivos

Agua destilada
Sacarosa 30.0 g
Nitrato de Potasio 1.9 g
Nitrato de amonio 1.65 g
NaOH
HCl
phytagel

Materiales:

1 vasos de precipitado de 1 L
4 vasos de precipitado de 50 ml
2 vasos de precipitado de 100 ml
4 probetas de 100 ml
4 probetas de 50 ml
25 frascos gerber
Agitadores
Espátulas
 PREPARACIÓN DE UN LITRO DE MEDIO MS

En un vaso de precipitado colocar 850 ml de agua destilada. Agregar el volumen

indicado de las soluciones concentradas

Pesar, añadir y agitar hasta disolver, los siguientes compuestos:

Sacarosa 30.0 g
Nitrato de Potasio 1.9 g
Nitrato de amonio 1.65 g
Ajustar el pH a 5.7 con NaOH 0 HCl 0.1 N. Aforar a 1 L con agua destilada

Pesar 2.5 gr de phytagel, agregar y disolver, calentar hasta hervir, una vez que el
phytagel esté totalmente disuelto.

Con la ayuda de una probeta colocar 20 ml de medio en frascos gerber.

Colocar los frascos en la autoclave y esterilizar por 15 min.

 PRACTICA 2

ESCARIFICACIÓN Y GERMINACION DE SEMILLAS

OBJETIVO

Determinar el efecto de tres diferentes técnicas de escarificación en el proceso de

germinación de semillas

METODOLOGÍA

1. Tratamiento testigo. En una caja Petri colocar algodón y humedecerlo con 5 ml de

agua destilada envolver la caja Petri para ayudar al proceso de germinación. Colocar
10 semillas para evaluar el tiempo de germinación.

2. Tratamiento mecánico. A 10 semillas se realizara un pequeño corte (uno o dos es

suficiente) o en su defecto raspado de la superficie (usar lija de agua N° 180). Realizar
los cortes con mucho cuidado. Coloque las semillas escarificadas a germinar en un
frasco Gerber con medio ms (5 semillas por frasco).

3. Tratamiento de ácido sulfúrico. Colocar las semillas en un vaso de precipitado de

250 ml con 15-20 mL de H2SO4 concentrado, durante el tratamiento de las semillas
con el ácido sulfúrico se debe agitar eventualmente con un agitador. Evaluar
diferentes tiempos de inmersión (5, 10 y 15 min) pasando el tiempo de inmersión las
semillas se enjuagaran tres veces con agua destilada a fin de retirar los restos del
ácido y no afectar el embrión. Por último colocar las semillas escarificadas a germinar
en un frasco Gerber con medio ms (5 semillas por frasco).

4.- tratamiento de ac. Sulfúrico + Acido giberélico. Repetir el procedimiento del

tratamiento 3 y dejar en inmersión las semillas por 24 hrs en una solución de ac.
Giberélico en tres concentraciones 0.5, 1 y 2 mg por litro.

NOTA: Todos los tratamientos deben realizarse por triplicado para realizar el análisis
estadístico correspondiente
Reactivos

Agua destilada
H2SO4
Ac. Giberélico
Captan
Tween 80
Cloro comercial
Alcohol etílico

Materiales

Cajas Petri
Bisturís
Algodón
Lija N 180
4 Vasos de precipitado de 500 ml
4 probetas de 500 ml
Previo a la siembra de las semillas escarificadas a los frascos Gerber con
medio ms, se deberán lavar con detergente y tween 80. Posteriormente
realizar el siguiente proceso de desinfección se realizara en la campana de
flujo laminar para eliminar contaminantes (bacterias-Hongos).

PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN

1.- Preparar una solución de captan al 0.5%.

2.- Colocar las semillas escarificadas en la solución de captan por 15 min
con agitación constante.
3.- Lavar tres veces con agua destilada.
4.- preparar una solución de alcohol etílico al 70 %, colocar las semillas en
esta solución por 5 min.
5.- Lavar tres veces con agua destilada.
6.- Preparar una solución de cloro comercial al 30%.
7.- Colocar las semillas en la solución de cloro por 15 min.
8.- Lavar tres veces.
9.- Sembrar las semillas en el los frascos con medio ms.

NOTA: El agua destilada utilizada y el material utilizado en todos los pasos

debe ser estéril.

Evaluar el efecto de cada tratamiento en el proceso de germinación de la

semilla cada dos días.
 PRACTICA 3

REGULADORES DE CRECIMIENTO

Los reguladores de crecimiento (hormonas vegetales) son aquellas substancias que

son sintetizadas en un determinado lugar de la planta y se translocan a otro, donde
actúan a muy bajas concentraciones, regulando el crecimiento, desarrollo o
metabolismo del vegetal. Las hormonas vegetales se clasifican en cinco grupos:
Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Etileno, Acido abcísico.

OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es evaluar el efecto de diferentes sustancias reguladoras

del crecimiento vegetal a diferentes concentraciones en la respuesta morfogénica del
cultivo in vitro de orquídeas

METODOLOGÍA

Preparar medio Ms suplementado con 0.5, 1.0 y 2.0 mg/L de diferentes reguladores
de crecimiento (TDZ, PBZ, zeatina, Acido Indol Acetico), para evaluar el efecto en el
cultivo in vitro de orquídeas.

Sembrar explantes de hojas 2 cm aproximadamente de plantas provenientes in vitro.

Evaluar la respuesta morfogenica cada 8 días.

Reactivos Materiales

Agua destilada frascos Gerber

Paclobutrazol 12 vasos de precipitado de 250 ml
Zeatina, 4 probetas de 100 ml
Ácido Indol Acetico pinzas de disección
Thidiazuron bisturís
 Practica 4

Micropropagación de orquídeas en sistemas de inmersión

temporal RITA®

Dentro de lo que es la producción in vitro, la multiplicación de plantas en medios de

cultivo líquido por medio de biorreactores, representa una posibilidad de generar un
mayor número de plantas en menos tiempo y con costos inferiores en comparación al
sistema de producción en medio sólido. Los problemas a superar en este sistema de
multiplicación de plantas, son la contaminación con hongos y bacterias, y la
deformación de los tejidos causada por la hiperhidricidad o vitrificación, que sufren los
explantes sumergidos en el medio de cultivo, afectando la anatomía y fisiología de las
plantas y por lo tanto, su sobrevivencia.

En esta práctica se utilizaran explantes de orquídeas inducidas en diferentes

tratamientos con diferentes hormonas (2,4-D, ANA y BAP) a diferentes
concentraciones con el objetivo de ajustar la tecnología de los biorreactores de
inmersión temporal RITA con dos frecuencias de inmersiones, la primera, de 2
minutos cada 2 horas, y la segunda de 2 minutos cada 4 horas.

Los parámetros a medir serán, nivel de proliferación alcanzado, el porcentaje de

vitrificación que presentaban las plántulas, fenolización del medio.

Metodología

- Medio de cultivo MS suplementado con 0.5, 1 y 2 mg de BA; 0.5, 1 y 2 mg de 2,4-D;

0.5, 1 y 2 mg de TDZ (cada biorreactor lleva medio litro de medio) utilizar al menos un
biorreactores por cada frecuencia de inmersión.

- Esterilizar filtros y biorreactores con el medio. (Antes de esterilizar lavar

adecuadamente los biorreactores y filtros con cloro al 3% y jabón líquido)

- Sembrar en campana los explantes inducidos previamente que presentaron

formación de brotes o callos en los biorreactores.

Reactivos Materiales

Alcohol etílico Mechero de alcohol

Agua destilada 9 vasos de precipitado de 500 ml
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 4 Pinzas de disección
6-bencilaminopurina 10 Cajas Petri de cristal
Thidiazuron Algodón
Cloro