¿Por qué se utiliza el agar Mueller-Hinton para la sensibilidad bacteriana de los antibióticos?

¿Cuál es la importancia de determinar para una bacteria los parámetros de CIM y CLM?

La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la medida de la sensibìlidad de

una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como la menor concentración de una gama de
diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor
fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a diferentes
especies bacterianas.
Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa,
las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes métodos de
rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al antibiótico
probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótìco.
Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:
Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un
tratamiento a la dosìs habitual.
Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de
esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto
terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la
posología).
Ciertas moléculas son representativas de un grupo de antibióticos. Los resultados (S, I, R) obtenidos con estas
moléculas pueden ser ampliados a los antibióticos del grupo, que en ese caso no es necesario ensayar
(Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina que se ensaya y las restantes cefalosporinas de 1ª generación que
no es necesario probar, ya que el resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotina).
Este hecho permite ensayar un número reducido de antibióticos, sin limitar por ello las posibilidades
terapéuticas.
Concentración Letal Mínima (CLM), la cual es la concentración más baja de un antibiótico
necesaria para matar a las bacterias. Para descubrir si el agente ha matado en realidad la bacteria
en lugar de inhibirla, las diluciones de prueba se subcultivan en un medio adecuado sin el
antibiótico, y se incuban de 18 a 24 horas. Se considera bactericida al antibiótico si la CLM es igual
o menos de cuatro veces a CIM.

3) Dibuje las estructuras químicas de:

a) Beta-lactámicos

b) Eritromicina

c) Tetraciclina
4) Describa brevemente el mecanismo de acción de los antibióticos que inhiben la síntesis de la
pared bacteriana y de algunos ejemplos.

Antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular:

Actúan a distintos niveles de la biosíntesis del peptidoglucano, capa esencial para la supervivencia
de las bacterias, y el daño se produce por la pérdida de la rigidez de la célula bacteriana que
puede causarle la muerte; por lo tanto son considerados como agentes bactericidas. La síntesis del
peptidoglucano se lleva a cabo en tres etapas y los distintos antimicrobianos pueden afectar cada
una de ellas. Los representantes de este grupo son las penicilinas y cefalosporinas.

Antibióticos de familia de penicilinas Antibióticos de familia de cefalosporinas

Primera generación (espectro estrecho)
— Cefadroxil
— Cefazolina
Penicilinas Naturales
— Cefalexina
— Penicilina G (bencil)
— Cefaloridina
— Penicilina G procaína
— Cefalotina
— Penicilina G benzatina
— Cefapirina
— Cefadrina
— Cefminox
Segunda generación (espectro aumentado)
— Cefaclor
— Cefamandol
— Defonicid
Penicilinas orales
— Ceforanide
— Penicilina V
— Cefuroxima
— Feniticilina
— Loracarbef
— Propicilina
— Cefotetan
— Cefoxitin
— Cefprozil
— Cefonicida
Semisintéticas Tercera generación (amplio espectro)
• Resistentes a penicilinasa — Cefdinir
 — Meticilina — Cefixime
— Nafcilina — Cefoperazona
— Cloxacilina — Cefotaxima
— Dicloxacilina — Ceftazidima
— Oxacilina — Ceftriaxona
— Flucloxacilina — Cefpodoxima
— Cefditoren pivoxilo
— Ceftibuteno
— Tazicef
— Cefpiramida
— Cefsulodin
Amplio espectro
— Ampicilina Cuarta generación (espectro mejorado)
— Amoxicilina — Cefepime
— Bacampicilina — Cefetecol
— Pivampicilina — Cefquinone
— Carbenicilina — Flomoxef
— Ticarcilina — Cefoselis
— Azlocilina — Cefozopran
— Mezlocilina — Cefpirome
— Piperacilina — Ceflaprenam
— Apalcilina
Aminopenicilinas
— Hetacilina
— Espicilina
— Metampicilina
— Talampicilina
— Ciclacilina
Amidinopenicilinas
— Mecilinam y
— Pivmecilinam

5) Describa brevemente el mecanismo de acción de los antibióticos que alteran la permeabilidad

de la membrana bacteriana y de algunos ejemplos.
La membrana plasmática cumple funciones importantes para la vitalidad de la bacteria. Entre sus propiedades
incluye el actuar como barrera de permeabilidad selectiva, controlando de esta forma la composición del
medio interno celular.
Los antibióticos utilizados en clínica, que actúan modificando la membrana celular, son las polimixinas y los
polienos (nistatina y anfotericina B)
Actúan como detergentes o tensioactivos catiónicos y provocan una grave alteración de la membrana celular,
modificando la permeabilidad y permitiendo el escape de aminoácidos intracelulares, purinas, pirimidinas y
otras moléculas fundamentales para la vida celular. Las polimixinas actúan de este modo, interactuando sobre
los fosfolípidos de la membrana celular, mientras que la nistatina y la anfotericina B son activos frente a
hongos, se unen a un grupo esterol de la membrana que solamente contienen los microorganismos contra los
cuales se utilizan estos ATB.
Las bacterias más susceptibles son las que tienen en su membrana un mayor contenido de fosfolípidos
(gramnegativas). La insensibilidad o resistencia está en relación con la impermeabilidad de la pared celular
para estos fármacos, como el caso de las grampositivas que tienen una pared celular muy gruesa.
Todos estos antibióticos son líticos, incluso en bacterias en reposo y tienen cierto potencial tóxico,
especialmente la anfotericina B, ya que son capaces de unirse con los lípidos de membranas citoplasmáticas
de las células de los mamíferos.
 6) Describa la técnica de Kirby-Bauer.

Este método incorpora el antimicrobiano a discos de

papel de filtro. Su introducción permitió agilizar la
determinación de la sensibilidad de las cepas
bacterianas frente a un número importante de
antimicrobianos de forma simultanea. El empleo de
los discos de papel de filtro para las pruebas de
sensibilidad está estandarizado y se correlaciona con
las CMIs. Durante muchos años, y a pesar de ser una
técnica puramente cualitativa, el método de difusión
por disco (o método Kirby-Bauer), en función sobre
todo de su comodidad, economía y fiabilidad, ha sido
uno de los más utilizados en los laboratorios.

Sobre la superficie de una placa de agar Müller-

Hinton (medio de cultivo rico, diseñado
especialmente para hacer ensayos de sensibilidad)
se inocula una cantidad estandarizada de bacterias,
sembrándolas de forma uniforme para obtener
después de la inoculación un "césped" bacteriano. A
continuación se colocan discos de papel de filtro impregnados con concentraciones conocidas de los
diferentes antibióticos. La elección de los antibióticos a probar dependen del germen y del foco de infección.
El antibiótico difundirá desde el papel filtro al agar de forma radial. Se incuba la placa durante 18-24 horas a
37 °C (respetar este parámetro, porque temperaturas menores pueden disminuir la velocidad del crecimiento
del germen y la difusión del antibiótico, dando halos irregulares difíciles de medir), y luego se miden los halos
de inhibición de desarrollo, interpretándose de acuerdo a tablas confeccionadas previamente. Los resultados
se expresan como: Sensible (S), Intermedio o Moderadamente sensible (I) y Resistente (R).

El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su superficie se disponen los
discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas y se estudia el
crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y se
compara con las referencias oportunas publicadas por la NCCLS. De esta manera se sabe si el microorganismo
es Sensible, Intermedio o Resistente a cada uno de los antibióticos.

7) Mencione el mecanismo de acción de los siguientes antibióticos

i) Sulfonamidas

Mecanismo de acción de las sulfamidas (descubierto por Woods y cols. en 1940):

Las sulfamidas tienen un efecto bacteriostático. Su acción antibacteriana se debe al hecho de que
funcionan como análogos estructurales del ácido para-aminobenzoico (PABA), inhibiendo
competitivamente por el acceso a la enzima dihidropteroil-sintetasa

Como se puede ver, la dihidropteroil-sintetasa cataliza la condensación del PABA con el 2-amino,4-
hidroxi, 6-hidroximetil dihidropteroil-pirofosfato, que lleva a la síntesis de ácido dihidropteroico
(una de las fases intermedias de la síntesis del tetrahidrofólico -THF). En la figura se puede apreciar
que el PABA y las sulfamidas son muy parecidas. De hecho, la sulfamida es usada por la enzima como
un sustrato alternativo al PABA. En este caso, la enzima cataliza una reacción que genera un
producto que no puede actuar como intermediario en los siguientes pasos de la ruta de síntesis del
THF.

Los microorganismos son sensibles a las sulfamidas porque sus necesidades de THF las han de
satisfacer sintetizándolo a partir de PABA usando la ruta de la que estamos hablando. Sin embargo,
los animales son resistentes, debido a que carecen de esta ruta, y en cambio, se aprovisionan de
fólico directamente en su dieta. Pero áun más: en teoría el ácido fólico de la dieta del organismo
hospedador podría anular el efecto terapéutico si fuera captado por la bacteria, pero en la realidad
esto no ocurre, porque el fólico no puede entra a la célula bacteriana.

El notable éxito terapéutico de las sulfamidas, junto con el desentrañamiento de su mecanismo de

acción, condujo durante los años 40 y 50 a una gran línea de investigación consistente en sintetizar
compuestos que fueran análogos de factores bacterianos de crecimiento, con la esperanza de
"diseñar" racionalmente nuevos quimioterápicos. Sin embargo, el gran esfuerzo de búsqueda no
rindió apenas frutos. Y la razón hay que buscarla de nuevo en la excepcional confluencia de hechos
que acabamos de citar para las sulfamidas y que hacen que las sulfamidas funcionan tan bien:
inhibición competitiva, presencia de la ruta en bacterias pero ausencia en animales, la no entrada
del fólico en bacterias pero sí en las células animales. Esta "suerte" no ha acompañado cuando se
ha investigado el posible potencial de análogos de otros metabolitos.

ii) Ceftriaxona

Actúan a distintos niveles de la biosíntesis del peptidoglucano, capa esencial para la supervivencia
de las bacterias, y el daño se produce por la pérdida de la rigidez de la célula bacteriana que puede
causarle la muerte; por lo tanto son considerados como agentes bactericidas. La síntesis del
peptidoglucano se lleva a cabo en tres etapas y los distintos antimicrobianos pueden afectar cada
una de ellas. Los representantes de este grupo son las penicilinas y cefalosporinas.

la ceftriaxona, como todos los antibióticos beta-lactámicos es bactericida, inhibiendo la

síntesis de la pared bacteriana al unirse específicamente a unas proteínas llamadas "proteínas
ligandos de la penicilina (PBPs)" que se localizan en dicha pared. Las PBPs son responsables
de varios de los pasos en la síntesis de la pared bacteriana y su número oscila entre varios
cientos a varios miles de moléculas en cada bacteria. Estas proteínas son diferentes para cada
especie bacteriana, por lo que la actividad de cada uno de los antibióticos b-lactámicos
depende de la capacidad de estos para acceder y unirse a dichas proteínas. En todos los casos,
una vez que el antibiótico se ha unido a las PBPs estas pierden su capacidad funcional, con
lo que la bacteria pierde su capacidad para formar la pared, siendo el resultado final la lisis
de la bacteria. Esta lisis se debe a las autolisinas bacterianas cuya actividad es, al parecer
exaltada por los cefalosporinas de segunda y tercera generación, que son capaces de interferir
con un inhibidor de las autolisinas. La presencia de un grupo aminotiazolilacetilo y de una
cadena lateral en la posición 7 de un grupo metoximino aumenta la actividad antibacteriana
de la ceftriaxona, en particular frente a las enterobacterias. Aunque no todas, muchas cepas
de Pseudomonas aeruginosa son sensibles a la ceftriaxona. Otras cepas susceptibles son las
Enterobacter, Citrobacter, Morganella, Providencia, Moraxella (Branhamella) catarrhalis, y
N. meningitidis. Es particularmente intensa la actividad antimicrobiana de la ceftriaxona
frente a las Enterobacteriaceae (E. coli, Klebsiella, Proteus, y Serratia) y frente a las H.
influenzae y N. gonorrhoeae siendo considerada como el fármaco de elección en el
tratamiento de las infecciones gonocócicas. Aunque la ceftriaxona es activa frente a la mayor
parte de las bacterias gram-positivas incluyendo las cepas de estafilococos productoras de
penicilinasa, las cefalosporinas de primera generación suelen ser más activas.

iii) Ácido nalidíxico

QUINOLONAS

El ácido nalidíxico (=4-oxo, 8-azaquinolina) se sintetizó en 1962, y encontró su aplicación en el tratamiento de

infecciones por Gram-negativas del tracto urinario, donde se concentra.

Recientemente se han sintetizado las llamadas fluoroquinolonas, como por ejemplo el ciprofloxacín.
Presentan 600 veces más actividad que el nalidíxico, y actualmente se recetan frecuentemente como
quimioterápicos de amplio espectro.

Mecanismo de acción: Las quinolonas bloquean la ADN-girasa, uniéndose a la subunidad de tipo A.

Recordemos que las bacterias poseen una clase especial de topoisomerasas de tipo II, llamadas girasas, que
introducen superenrollamiento negativo en la doble hélice del ADN. La ADN-girasa está constituida por dos
subunidades de tipo A y dos de tipo B (A2B2); las de tipo A producen los cortes y empalmes sucesivos en la
doble cadena, mientras que las subunidades B son ATPasas que proporcionan la energía para la reacción.

El bloqueo de las quinolonas sobre la girasa supone que ésta queda "congelada" en la fase en que el ADN está
unido al enzima. Ello provoca la acumulación de roturas de doble cadena, lo que conduce a la muerte de la
bacteria.

8) Mencione cómo adquieren algunas bacterias, de manera natural, resistencia a los antibióticos.

Las bacterias pueden volverse resistentes a los antimicrobianos, pero, ¿por qué mecanismos? Así
como el primer mecanismo de acción de un agente infeccioso conocido fue el de las sulfamidas, el
primer mecanismo de resistencia conocido también fue el de los microorganismos a estas drogas.
Si bien son varios los mecanismos de resistencia a las sulfas que actualmente se conocen, podemos
decir que la hiperproducción de PABA fue el primero en determinarse, siendo el más conocido.
Además de la hiperproducción metabólica, otros mecanismos incluyen:

13.4.1 Inactivación enzimática de los antibióticos, como es el caso de las enzimas beta lactamasas.
En este caso la enzima, elaborada por la bacteria, inactiva a la molécula de la droga volviéndola
incapaz de actuar. Hay que tener presente que este mecanismo es el único capaz de inactivar a la
molécula de antimicrobiano.

13.4.2 Impermeabilidad de la membrana o pared celular. Por ejemplo modificaciones en las porinas,
lo que repercutirá en resistencias de bajo nivel a diversos antimicrobianos.

13.4.3 Expulsión por mecanismos activos del antibiótico. Las resistencias a las tetraciclinas pueden
se debidas a este tipo de mecanismos.

13.4.4 Modificación del sitio blanco del antibiótico en la bacteria. El algunos casos hay una reducción
de la afinidad del receptor por la molécula de antimicrobiano. Una mutación de la girasa de ADN, por
ejemplo, puede dar lugar a una menor afinidad de las quinolonas por la citada enzima. Otro ejemplo
es el cambio de las enzimas involucradas en la síntesis de ácido paraaminobenzoico, lo que da lugar
a resistencias a sulfas y trimetoprima, mecanismo que se suma al mencionado en primer lugar.
9) Mencione cómo se manifiestan los mecanismos de drogorresistencia.

Las bacterias pueden volverse resistentes a los antimicrobianos, pero, ¿por qué mecanismos? Así
como el primer mecanismo de acción de un agente infeccioso conocido fue el de las sulfamidas, el
primer mecanismo de resistencia conocido también fue el de los microorganismos a estas drogas.
Si bien son varios los mecanismos de resistencia a las sulfas que actualmente se conocen, podemos
decir que la hiperproducción de PABA fue el primero en determinarse, siendo el más conocido.
Además de la hiperproducción metabólica, otros mecanismos incluyen:

13.4.1 Inactivación enzimática de los antibióticos, como es el caso de las enzimas beta lactamasas.
En este caso la enzima, elaborada por la bacteria, inactiva a la molécula de la droga volviéndola
incapaz de actuar. Hay que tener presente que este mecanismo es el único capaz de inactivar a la
molécula de antimicrobiano.

13.4.2 Impermeabilidad de la membrana o pared celular. Por ejemplo modificaciones en las porinas,
lo que repercutirá en resistencias de bajo nivel a diversos antimicrobianos.

13.4.3 Expulsión por mecanismos activos del antibiótico. Las resistencias a las tetraciclinas pueden
se debidas a este tipo de mecanismos.

13.4.4 Modificación del sitio blanco del antibiótico en la bacteria. El algunos casos hay una reducción
de la afinidad del receptor por la molécula de antimicrobiano. Una mutación de la girasa de ADN, por
ejemplo, puede dar lugar a una menor afinidad de las quinolonas por la citada enzima. Otro ejemplo
es el cambio de las enzimas involucradas en la síntesis de ácido paraaminobenzoico, lo que da lugar
a resistencias a sulfas y trimetoprima, mecanismo que se suma al mencionado en primer lugar.

10) ¿Qué factores intervienen o modifican los resultados de un antibiograma?

Componentes del medio de cultivo

Las propiedades que debiera tener un medio ideal para antibiograma son las siguientes:

1. Debe permitir el crecimiento de la mayoría de los patógenos

2. Deben estar definidos sus componentes básicos

3. Las pruebas de sensibilidad deben ser reproducibles con diferentes lotes del medio preparados por
diferentes productores

4. Debe estar libre de componentes que antagonicen a los antimicrobianos

5. No debe sufrir oscilaciones importantes del pH durante el crecimiento de los microorganismos

6. Las versiones en caldo y sólida del medio debe tener la misma composición excepto en la presencia de un
agente solidificante

7. Debe ser aproximadamente isotónico para las bacterias y permitir la adición de sangre cuando se requiere
el estudio de microorganismos de difícil crecimiento

Se han desarrollado una serie de medios químicamente definidos (SAAM: Synthetic Amino Acid
Medium, DM: Defined medium ) que pretenden cumplir la mayor parte de las exigencias antes indicadas,
aunque estos medios no se han popularizado.

En un estudio en colaboración internacional se decidió la utilización del Mueller-Hinton (MH), por tener una
buena reproducibilidad, la sencillez de su composición y su bajo contenido en ácido paraaminobenzoico, que
antagoniza la actividad de las sulfamidas. También se utilizan en la actualidad los medios DST (Diagnostic
Sensitivity Test ) e Isosensitest.

Concentración en cationes y osmolaridad

Las concentraciones de Ca2+ y Mg2+ tienen un efecto importante en la actividad de los aminoglicósidos; en
medios no suplementados con estos cationes pueden obtenerse valores de CMI falsamente bajos, sobre
todo en Pseudomonas.

Las concentraciones de Mg2+, Ca2+ y Fe2+ también influyen en la CMI de tetraciclinas. Éstas son más
elevadas cuando el MH se suplementa con estos cationes.

Los cationes monovalentes (Na+ y K+) afectan la actividad de bacitracina, ácido fusídico y novobiocina frente
a Staphylococcus aureus y las de penicilinas frente a Proteus.

El aumento de la osmolaridad del medio, condicionado por una alta concentración de ClNa, determina un
aumento en la CMI de los aminoglicósidos. La detección de resistencia a meticilina en S. aureus se manifiesta
con una concentración elevada de ClNa en el medio de cultivo; estas cepas se detectan fácilmente con la
técnica de difusión con disco en agar tripticasa de soja con ClNa al 5 %.

Carbohidratos

Los carbohidratos del medio de cultivo pueden influir en el tamaño de los halos de inhibición: en el método
de difusión el almidón disminuye la zona de inhibición de Enterococcus faecalis con penicilina y ampicilina y
aumenta la de Haemophilus influenzae con cefalosporinas.

Sangre

El medio de cultivo con sangre suele producir en la técnica de difusión con disco, diámetros menores y CMI
más altas que el método de dilución en medio sólido.

pH del medio y atmósfera de incubación

El pH del medio debería mantenerse próximo al pH fisiológico. Para algunos antimicrobianos los cambios de
la CMI ocasionados por las variaciones del pH del medio entre 6 y 8 tienen importancia clínica; sobre todo
con macrólidos y aminoglicósidos, más activos en un medio ligeramente básico, y las tetraciclinas y
penicilinas que son más activas en un medio ácido. Sin embargo, las cefalosporinas se ven poco afectadas.

La existencia de glucosa puede ocasionar una disminución del pH durante el crecimiento de cepas que la
metabolizan, la adición de un tampón al medio determina alteraciones que afectan más la actividad de los
antimicrobianos que los cambios de pH que se pretenden corregir.

La atmósfera de incubación es importante para la estabilidad del pH del medio, sobre todo en el
antibiograma en medio sólido debido a la gran superficie expuesta. La incubación en atmósfera de C02
tiende a disminuir el pH del medio de cultivo; en ella la CMI de aminoglicósidos y eritromicina es mayor que
en atmósfera aerobia sin C02. Cuando el microorganismo requiera para su crecimiento atmósfera con C02
deben compararse los resultados de las cepas patrón en estas condiciones y en aerobiosis, paralelamente,
para evitar errores de interpretación.
Densidad del inóculo

El inóculo del antibiograma ha de ser lo suficientemente alto para detectar las tasas bajas de mutación hacia
la resistencia en el microorganismo problema y no debe ser inferior al número de microorganismos que se
encuentran normalmente en las infecciones clínicas.

La densidad del inóculo es una de las variables más importantes, por ello debe ser cuidadosamente
estandarizada para asegurar la reproducibilidad del antibiograma.

El inóculo de las técnicas de dilución en caldo, en particular, puede plantear otros problemas; por ejemplo,
las cepas de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) no se detectan con facilidad con un inóculo reducido.
Se pueden observar discrepancias importantes en la CMI de S. aureus productor de b-lactamasa cuando se
empleen inóculos pequeños respecto a inóculos elevados.

Para preparar el inóculo se aconseja ajustar la turbidez de un cultivo en caldo en fase de crecimiento activo
con la del estándar 0,5 de McFarland (aprox. 10 e8 UFC/ml). Esta suspensión inicial debe ajustarse luego
hasta conseguir un inóculo final de más o menos
5 x 10 e6 UFC/ml.

Para los sistemas de microdilución se ajusta habitualmente la turbidez por nefelometría, siguiendo una
posterior dilución en agua destilada o en caldo. También se puede preparar tomando 5 colonias, que se
emulsionan en suero salino.

Temperatura y tiempo de incubación

La temperatura óptima de incubación en la mayoría de los patógenos humanos es de 35 °C. Se ha

comprobado que un aumento de la temperatura de 35 a 41,5 °C disminuye significativamente los valores de
la CMI en un 20 % de los casos.

Las subpoblaciones heterorresistentes a meticilina de S. aureus (MRSA) se detectan fácilmente a 30 °C y con

dificultad a 37 °C. Para la detección de MRSA se ha propuesto prolongar la incubación durante 24 o 48 h.

Métodos

Método de difusión

Ha sido un método muy utilizado, pero en la actualidad empieza a ser desplazado por otros, en especial por
los sistemas comerciales de microdilución en caldo.

El fundamento es sencillo: se inocula un agar nutritivo y sobre su superficie se aplican discos de papel
impregnados con antimicrobiano. Tras un período de incubación se obtiene alrededor del disco de
antimicrobiano una zona de inhibición de crecimiento del microorganismo (si éste es sensible); el diámetro
de esta zona determina el grado de sensibilidad del microorganismo al antimicrobiano. La aparición del halo
de inhibición es consecuencia del doble proceso de difusión del antimicrobiano en el medio de cultivo desde
el disco y de crecimiento del microorganismo. Además de los factores ya conocidos influyen en el tamaño
del halo la concentración de antimicrobiano en el disco, la capacidad de difusión del antimicrobiano, la
composición y profundidad de la capa del medio de cultivo, la concentración de agar, y la velocidad de
crecimiento del microorganismo.

Con este método no se obtienen directamente los valores de la CMI, aunque se podrian conocer elaborando
una recta de regresión o concordancia (relación entre la CMI obtenida por dilución y el diámetro de halo de
inhibición obtenido por difusión) y una recta estándar, que permite el control de la anterior al relacionar la
CMI de una cepa sensible con los diámetros de inhibición producidos por discos con diferentes cargas de
antimicrobiano.

Los resultados de la prueba de difusión con disco, si la prueba está bien estandarizada, permiten clasificar
los microorganismos en cuatro categorías en función de lo que midan los diámetros de las zonas de
inhibición: resistentes, intermedios, moderadamente sensibles y sensibles.

Aplicaciones y limitaciones de la técnica de difusión con disco. Es un método sencillo y flexible en cuanto a
los antimicrobianos a estudiar, pero requiere un riguroso control de todas sus variables para obtener
resultados fiables. Está ideado para determinar la sensibilidad de microorganismos de crecimiento rápido y
no debe aplicarse a bacterias de crecimiento lento, anaerobios ni capnófilos; no pueden estudiarse
antimicrobianos que difunden mal (de otro modo pueden obtenerse falsos resultados de resistencia), ni
determinar con seguridad la resistencia a penicilina G de Staphylococcus.

La inestabilidad de los antimicrobianos contenidos en los discos, sobre todo penicilinas y cefalosporinas,
exige un cuidadoso almacenamiento de los mismos. No es posible, por otra parte, estandarizar la carga de
los discos, siendo erróneo asumir que uno de ellos asegura las condiciones de todo un lote.

Esta técnica no puede determinar la actividad bactericida y es menos fiable para predecir la sensibilidad que
la resistencia.

Salvo para trimetroprim-sulfametoxazol y las combinaciones ácido clavulánico-penicilinas, no puede

ensayarse la combinación de dos o más antimicrobianos en el mismo disco.

La inclusión de cepas patrones no presupone el control de todos los factores que influyen en la
determinación de sensibilidad de las otras bacterias, ya que se realiza en placas separadas.

A pesar de estas objeciones debe reconocerse la mayor definición cuantitativa de este método, cuando se
estandariza correctamente. Los halos de inhibición se pueden medir con menos de 0,5 mm de error y con ±
2 mm de reproducibilidad y al estar basados en una escala continua, los puntos de corte son más precisos
que los obtenidos con los métodos de dilución por dos razones: a) la verdadera CMI en dilución
normalmente es menor que el valor leído (una CMI de 8 mg/ml realmente corresponde a una CMI entre 4 y
8 mg/ml). b) La reproducibilidad de la CMI en dilución está sometida a una variabilidad de ± 1 dilución.

Métodos de dilución

La dilución es el método cuantitativo de referencia para la determinación de la sensibilidad y la resistencia

de los microorganismos. Su fundamento es la determinación del crecimiento del microorganismo en
presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de cultivo

Inicialmente se utilizaron medios de cultivo líquidos (caldo) y posteriormente, al describirse un sistema de

inoculación múltiple para la superficie de placas de agar (inoculador de Steers), se popularizó el método en
medio sólido. Actualmente se ha generalizado el empleo de los métodos automatizados de microdilución en
caldo, realizados en placas de plástico con múltiples pocillos.

Para el empleo rutinario de este método es necesario mantener soluciones madre de antimicrobianos
regularmente, y controlar el inóculo y las concentraciones críticas de interpretación de resultados.

Los antimicrobianos en polvo de actividad conocida se conservarán a 4 °C en desecador. Algunos preparados

comerciales (en polvo, nunca en tabletas o cápsulas) son aptos para el empleo en esta técnica; otros, sin
embargo, no lo son (succinato sódico de cloranfenicol, fosfato de clindamicina, etc.) pues, para tener
actividad antimicrobiana se requiere su biotransformación en el organismo humano. Las soluciones madre
deben prepararse a una concentración no inferior a 1.000 mg/l para asegurar la estabilidad. Ésta suele ser
de unos 6 meses a -20 °C, y mejor a -60 °C; las penicilinas y cefalosporinas son más inestables: amoxicilina y
ampicilina se pueden conservar 6 semanas a -20 °C y 6 meses a -60 °C; la rifampicina es tan inestable que
debe prepararse la solución cada vez que se usa. En la tabla 2 se indican los solventes y diluyentes para
preparar soluciones de antimicrobianos.

Los resultados obtenidos permiten clasificar los microorganismos en sensibles, moderadamente sensibles y
resistentes.

Métodos de dilución en medio líquido. Macrométodo: se emplea habitualmente caldo de Mueller Hinton
con suplemento catiónico (Ca3+ y Mg2+) aunque para algunos microorganismos puede ser necesario un
caldo más rico, así caldo tripticasa de soja o DST suplementado.

Se emplea una batería de tubos estériles que contiene concentraciones decrecientes en base 2 del
antimicrobiano a estudiar en caldo. Los tubos se siembran con un inóculo (preparado en el mismo tipo de
caldo) que contenga 5 x 10 e6 UFC/ml; se agitan para obtener una mezcla homogénea y se incuban a 35 °C
durante 18 h. Se incluye un control de esterilidad de caldo y otro de crecimiento del inóculo.

Se define la CMI como la menor concentración de antimicrobiano donde no se observa crecimiento a simple
vista. Haciendo un subcultivo en medio sólido de los tubos sin crecimiento visible y del primero con
crecimiento visible puede establecerse la CMB, definida como la menor concentración de antimicrobiano
capaz de matar el 99,9 % de las bacterias viables del inóculo inicial.

Micrométodo: se usa el caldo antes descrito y placas de poliestireno con múltiples pocillos, en lugar de
tubos; en cada placa se estudia un microorganismo y una serie de antimicrobianos. La disponibilidad de
dispensadores semiautomáticos de antimicrobianos permite preparar una gran cantidad de placas de una
vez y congelarlas hasta el momento de su empleo (6 semanas a -20°C, 3 meses a -70°C).

Los pocillos de la placa se llenan con 100 ml de caldo con antimicrobiano y 1-5 ml de inóculo ajustado. Una
vez inoculadas las placas se incuban tapadas para evitar la evaporación durante 16-20 h a 35 °C realizando la
lectura de la CMI y determinando la CMB, por subcultivo a placas de agar si fuese necesario. La CMI se
establece donde aparece una inhibición brusca o total del crecimiento.

Las CMI obtenidas por dilución en caldo suelen ser superiores a las obtenidas por dilución en agar, salvo
para el caso de las tetraciclinas, por la acción quelante de los componentes minerales del agar.

Métodos de dilución en medio sólido. En esta técnica cada tubo o pocillo de los métodos de dilución en
medio líquido se sustituye por una placa de medio sólido (agar) donde se inoculan simultáneamente varias
cepas.

La solución del antimicrobiano se suele mezclar con el agar fundente en la proporción 2:18 (ml) y la mezcla
se deja solidificar situando las placas en una superficie horizontal. Las placas conteniendo antimicrobianos
se pueden conservar en bolsas de plástico durante 1 semana a 4 °C.

Las placas se inoculan con un asa calibrada o un replicador de Steers (hasta 36 microorganismos/placa) que
depositan de 1 a 2 ml con 10 e4 UFC.

En caso de estudiar Proteus para impedir la invasión de la placa se colocan cilindros de porcelana, plástico o
metal alrededor del punto de inoculación.

Como controles se incluirán cepas patrón con CMI conocida y una placa sin antimicrobiano en la que deben
crecer todas las cepas inoculadas.

Métodos mecanizados y automatizados

Métodos mecanizados y automatizados

La mayoría de estos sistemas se basa en la determinación del crecimiento bacteriano mediante

espectrofotometría y nefelometría. También se han evaluado otras técnicas como radiometría,
microcalorimetría, bioluminiscencia y resistencia e impedancia eléctricas.

Con estos sistemas el resultado se facilita como categoría de sensible, resistente, intermedio y/o como CMI.