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Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
Itajaí (SC)
agosto de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
Bibliografia: p. 77-84
CDU: 615.1
CDU: 612.78
Dedicatória
A minha família por me amparar nos momentos difíceis, me dar força para superar
as dificuldades, mostrar o caminho nas horas incertas e me suprir em todas as
minhas necessidades. O meu amor eterno.
Aos meus amigos que sempre estiveram ao meu lado nessa jornada, me apoiando e
entendendo meus momentos de ausência.
Due to the nature of the excipients that compose them, pharmaceutical formulations
are particularly susceptible to microbial contamination. Failures in preventive
measures and/or process control during manufacture and storage can result in
products that are unfit for consumption. It is known that preservatives are used to
increase the shelf life of products, but their effectiveness can be compromised by
interactions with excipients that interfere in their solubility and/or availability, so that
their concentration does not achieve the desired antimicrobial effect. This study
aimed to evaluate the influence of pharmaceutical excipients in the effectiveness of
preservatives used in semi-solid formulations. The methodology consisted of
inoculating the known population with suspensions of five different pathogenic micro-
organisms, in mixtures with the excipients polyethoxylated hydrogenated castor oil
[ALKEST® CSO 400 H (A)], polysorbate [Tween® 80 (T)], carboxymethylcellulose
sodium (CS) and xanthan gum (GX), all at different concentrations with the same
prefixed amount of preservative systems methylparaben (M), Phenonip ® (P)
Verstatil® BP (BP) and Verstatil® PC (PC). After analyzing the efficacy of the
excipient-preservative mixtures, the preservatives were added in micro and
namoemulsion. Studies of the influence on the nonionic surfactants A and T on the
antimicrobial action of the preservative systems showed that M and P were
inactivated, independent of concentration; the BP was effective in all the tested
conditions, except for Candida albicans at 40 g/L, while PC was effective only for
Aspergillus niger, C. albicans and Escherichia coli. The preservative systems were
effective against fungus and yeast in the presence of CS, but ineffective against
Staphylococcus aureus. The preservatives incorporated into GX were also effective
for fungi and yeast, and in the presence of bacteria, the preservatives P and PC had
its antimicrobial actions inactivated. The preservatives M and BP incorporated into
nanoemulsioned formulations were effective only for A. niger. Preservative system P
was effective when incorporated into the formulations, except for C. albicans. The
results demonstrate that although the preservative action is described in the
literature, the potential for inactivation depended on the the type of excipient, the
composition of the preservative systems, the ratio of excipient to preservative, and
their availability in the formulation.
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 21
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 23
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 23
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 25
3.1 Contaminação microbiana ...................................................................... 25
3.2 Sistema Conservantes ............................................................................ 28
3.2.1 Parabenos ....................................................................................................... 31
3.2.2 Fenoxietanol ................................................................................................... 34
3.2.3 Outros conservantes...................................................................................... 35
3.3 Cosméticos .............................................................................................. 36
3.4 Excipientes farmacêuticos em produtos semissólidos ................. 39
3.4.1 Tensoativos ................................................................................................. 40
3.4.2 Macromoléculas ................................................................................. 41
3.5 Interações entre conservantes e demais excipientes .................... 43
3.6 Teste de Eficácia de Conservantes – Challenge test ...................... 45
3.6.1 Micro-organismos testes ................................................................... 45
3.7 Neutralização do Sistema Conservante ........................................... 47
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 49
4.1 Seleção de conservantes e excipientes para o estudo ....................... 49
4.2 Micro-organismos padrões..................................................................... 49
4.2.1 Preparação do inóculo ......................................................................... 50
4.2.1.1 Bactérias ...................................................................................................... 50
4.2.1.2 Fungos leveduriformes ............................................................................... 50
4.2.1.3 Fungos filamentosos .................................................................................. 50
4.3 Análise de compatibilidade entre conservantes e excipientes........... 51
4.4 Análise de eficácia dos conservantes incorporados em formulações
emulsivas (micro e namoemulsão) .............................................................. 52
4.4.1 Formulações ................................................................................................... 52
4.4.2 Inoculação dos micro-organismos padrões ................................................ 53
4.4.3 Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ........................... 54
4.5 Categoria de produto, critérios para a eficácia antimicrobiana e
análise dos resultados .................................................................................. 54
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 57
5.1 Análises de compatibilidade entre conservantes e excipientes ........ 57
5.2 Teste de Eficácia do Sistema Conservante – Teste do Desafio ......... 68
6 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 75
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 77
ANEXO A ................................................................................................................. 85
APÊNDICE A............................................................................................................ 87
APÊNDICE B ............................................................................................................ 88
APÊNDICE C ............................................................................................................ 89
APÊNDICE D ............................................................................................................ 90
APÊNCIDE E ............................................................................................................ 91
21
1 INTRODUÇÃO
2 OBJETIVOS
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.2.1 Parabenos
3.2.2 Fenoxietanol
3.3 Cosméticos
terem sido reconhecidas como uma tendência chave na ciência do século XXI, o que
tem ocasionado um aumento nos recursos humanos e financeiros na indústria
mundial (BRUXEL et al., 2012).
A produção de cosméticos que emprega nanotecnologia, nanocosméticos,
especificamente falando, encontra-se mundialmente inserida na indústria de
cosméticos convencionais, constituindo-se em uma linha de produtos diferenciados
de base nanotecnológica, sendo geralmente classificada como um setor específico
da indústria química juntamente com os produtos de higiene pessoal e perfumaria
(FRONZA et al., 2007).
O interesse no uso da nanotecnologia aplicada a cosméticos é recente no
Brasil e vem crescendo, trazendo mais pesquisadores das principais universidades
brasileiras. Além disso, já existem empresas nacionais produtoras de matérias-
primas com base nanotecnológica (LIZÁRRAGA, 2014).
As nanoemulsões são dispersões estáveis com diâmetro médio de gota em
tamanho manométrico. Este sistema é composto por óleo, água e um ou mais
agentes surfactantes, podendo ser uma dispersão óleo em água (O/A) ou água em
óleo (A/O) (BENITA; MARTINI; SEILLER, 1996).
No setor cosmético, nanomateriais, como as nanopartículas, estão presentes
em xampus, condicionadores, cremes dentais, cremes antirrugas, cremes
anticelulites, clareador de pele, hidratantes, pós-faciais, loções pós-barba,
desodorantes, sabonetes, foto protetores, maquiagens de modo geral, perfumes e
esmaltes (FRONZA; et al., 2007).
As microemulsões são sistemas isotrópicos, transparentes, de baixa
viscosidade e termodinamicamente estáveis, obtidas quando uma mistura de
tensoativos apropriada é usada pela facilidade de aplicação e adesão na pele, como
hidratantes, preparações de protetor solar, produtos de bronzeamento, produtos
antienvelhecimento, desodorantes, perfumes, entre outros (ADNAN, et al., 2008;
NEMEN, LEMOS-SENNA, 2011; VICENTINI, 2008).
39
3.4.1 Tensoativos
Fonte: PubChem
3.4.2 Macromoléculas
4 MATERIAL E MÉTODOS
Quadro 8 – Condições para reconstituição das cepas de micro-organismos para o estudo de eficácia
do conservante.
Tempo de Tempo de incubação
Temp. de
incubação do para a recuperação
Micro-organismos inoculação
inoculo microbiana
ºC
(h) (dias)
Escherichia coli - ATCC 8739 32,5 ± 2,5 18 – 24 3–5
4.4.1 Formulações
Tempo (dia)
Micro-
Tipo de produto
organismo
7º 14º 28º
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
59
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
Figura 10: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre conservante
metilparabeno (M) (0,2%) e Phenonip® (P) (0,2%) e goma xantana, nas concentrações (1, 3, 5 e 7 g/L),
frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de incubação.
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
concentração inicial (104 células/mL) para o 14º dia e permaneceram com a mesma
quantidade de UFC/mL entre os dias 14 e 28 de incubação. (Figura 10)
Em todas as concentrações de goma xantana (1, 3, 5 e 7 g/L) na combinação
com o conservante metilparabeno (0,2%) a bactéria Escherichia coli teve redução
logarítmica (2 logs) de UFC/mL após 28 dias de incubação, portanto o conservante
foi eficaz.
A Pseudomonas aeruginosa apresentou redução logarítmica frente à goma
xantana na concentração de 1 g/L na combinação com o conservante metilparabeno
(0,2%) e para as demais concentrações (3, 5 e 7 g/L) o conservante não teve sua
ação microbiana eficaz para esta bactéria.
Na concentração de 3 g/L de goma xantana na combinação com o
conservante metilparabeno (0,2%) a bactéria Staphylococcus aureus apresentou
uma redução de 2 log da concentração inicial (105 células/mL) para o 14º dia, mas
apenas 1 log após 28 dias. Na concentração de 5 g/L houve a redução de 2 logs
após 28º dias, mostrando que o conservante foi eficaz nessas das concentrações de
goma xantana.
O conservante Phenonip® (0,2%) na combinação 1 e 5 g/L de goma xantana
(Figura 10), não apresentou uma conservação eficaz para as bactérias Escherichia
coli e Pseudomonas aeruginosa, pois não houve uma redução logarítmica de mais
de 2 logs após 28 dias de incubação. Para a bactéria Staphylococcus aureus na
concentração de 1, 3 e 5 g/L de goma xantana houve redução logarítmica de 2 logs
após 28 dias de incubação.
Segundo Doorne (2007), espessantes semissintéticos, tais como a celulose
modificada, pode diminuir a concentração de conservantes. Portanto, se aumentar a
concentração do conservante a tendência é de diminuir o crescimento dos micro-
organismos.
Os conservantes Verstatil® BP e PC (0,5%) foram eficazes para os micro-
organismos Aspergillus niger e Cadida albicans em todas as concentrações de (1, 3,
5 e 7 g/L) de goma xantana. Na concentração de 1 g/L de goma xantana (Figura 11),
houve redução do crescimento das bactérias Escherichia coli e Pseudomonas
aeruginosa no 14º dia em comparação com o inoculo inicial.
A ação antimicrobiana do Verstatil® PC não foi eficaz para as bactérias
Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, pois houve um aumento do
67
Figura 11: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre conservante
Verstatil® BP e PC (0,5%) e goma xantana nas concentrações (1, 3, 5 e 7 g/L), frente aos cinco micro-
organismos testes, após 28 dias de incubação.
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
71
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
Figura 14 – Testes de eficácia dos conservantes Phenonip® (P) na concentração de 0,2% em micro
e nanoemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
6 CONCLUSÕES
REFERÊNCIAS
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84
microemulsion: in vitro and in vivo skin penetration and efficacy against UVB-induced
skin damages evaluated in vivo. Eur. J. Pharm. Biopharm., v. 69, n. 948, 2008.
ANEXO A
Caldo Nutriente
Dextrose...............................................................................................................40,0 g
Peptonas..............................................................................................................10,0 g
Agar......................................................................................................................15,0 g
Água purificada................................................................................................1000 mL
pH após esterilização.......................................................................................5,6 ± 0,2
Meios líquidos
87
88
APÊNDICE B
Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e os tensoativos não iônicos ALKEST®
CSO 400 H e Tween® 80, frente aos cinco micro-organismos testes.
Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre os conservantes metilparabeno e Phenonip® (0,2%) e Verstatil® BP e PC (0,5%)
e a carboximetilcelulose sódica, frente aos cinco micro-organismos testes.
Carboximetilcelulose sódica
Concentração Micro-organismo 14 d 28 d
M P BP PC M P BP PC
Aspergillus niger < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹
Candida albicans < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10²
2 g/L Escherichia coli < 10¹ < 10¹ 10² < 10¹ 10¹ < 10¹ 10¹ 10³
Pseudomonas aeruginosa 104 10³ 10¹ < 10¹ 10³ < 10¹ 10² 10²
Staphylococcus aureus 10² 10¹ 108 106 104 10² >108 105
Aspergillus niger < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹
Candida albicans < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10¹ 10² 10¹ 10¹ < 10¹
4 g/L Escherichia coli 103 10² 105 10¹ 10³ 10² < 10¹ < 10¹
Pseudomonas aeruginosa < 10¹ 10³ < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10³ 10¹ 10²
Staphylococcus aureus 10³ 104 > 108 106 10³ 10³ >108 >108
89
90
APÊNDICE D
Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre os conservantes metilparabeno e Phenonip ® (0,2%) e Verstatil® BP e PC (0,5%) e a
goma xantana, frente aos cinco micro-organismos testes.
Goma xantana
Concentração Micro-organismo 14 d 28 d
M P BP PC M P BP PC
Aspergillus niger < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101
Candida albicans 102 < 101 < 101 < 101 101 < 101 < 101 < 101
1 g/L Escherichia coli 102 105 102 102 102 103 102 102
Pseudomonas aeruginosa 103 >108 10³ 104 103 103 10³ < 101
Staphylococcus aureus 106 102 >108 >108 105 102 >108 >108
Aspergillus niger < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101
Candida albicans < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 101
3 g/L Escherichia coli 101 >108 101 10² < 101 >108 < 101 10²
Pseudomonas aeruginosa >108 >108 10³ 106 >108 >108 10² >108
Staphylococcus aureus 103 102 < 101 10³ 102 < 101 102 105
Aspergillus niger < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 101 < 101 101
Candida albicans < 101 102 < 101 < 101 < 101 101 < 101 101
5 g/L Escherichia coli < 101 >108 10² 106 < 101 >108 102 102
Pseudomonas aeruginosa >108 >108 106 106 >108 106 >108 106
Staphylococcus aureus < 101 103 < 101 103 < 101 103 < 101 103
Aspergillus niger < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101
Candida albicans < 101 104 < 101 104 < 101 102 < 101 101
7 g/L Escherichia coli < 101 >108 < 101 < 101 102 >108 < 101 102
Pseudomonas aeruginosa 105 106 105 106 105 107 105 >108
Staphylococcus aureus < 101 105 102 105 104 < 101 < 101 104
APÊNCIDE E
Testes de eficácia dos conservantes metilparabenos (M) e Phenonip® na concentração de 0,2% e de Verstatil® BP (BP) na concentração de 0,5%
em microemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.
7d 14 d 28 d
Micro-organismo
M P BP M P BP M P BP
Aspergillus niger 10¹ 10² 10¹ 10² 10¹ 10² 10¹ < 10¹ 10¹
8 8 5 5 8 8
Candida albicans > 10 > 108 > 10 10 10 > 10 > 10 103 > 108
Microemulsão Escherichia coli < 10¹ 104 < 10¹ < 10¹ 103 104 < 10¹ 10² > 108
Pseudomonas < 10¹ 103 104 < 10¹ 103 10³ 10³ < 10¹ > 108
aeruginosaaureus
Staphylococcus > 108 105 < 10¹ < 10¹ 10² > 108 > 108 < 10¹ > 108
Aspergillus niger 10¹ 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹
6
Candida albicans > 10 8
10 8
> 10 8
> 10 8 10 > 10 8
> 10 8
104
> 108
Nanoemulsão Escherichia coli > 108 105 105 > 108 103 105 > 108 < 10¹ > 108
Pseudomonas > 108 103 > 108 > 108 103 > 108 > 108 10² > 108
aeruginosaaureus
Staphylococcus > 108 104 > 108 > 108 103 104 > 108 < 10¹ > 108
91