TDUEX 2018 Gonzalez de Murillo Godoy

TESIS DOCTORAL
INFLUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS EN LA

RESPUESTA TERAPÉUTICA A METOTREXATO DE
PACIENTES CON NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
Silvia González de Murillo Godoy
PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOMARCADORES DE SALUD Y

ESTADOS PATOLÓGICOS
Conformidad de los directores:
Fdo: Guillermo Gervasini Rodríguez Fdo: José Manuel Vagace Valero
2018
I
D. GUILLERMO GERVASINI RODRÍGUEZ, Profesor Titular de Farmacología del
Departamento de Terapéutica Médico-Quirúrgica de la Universidad de Extremadura, y D.
JOSÉ MANUEL VAGACE VALERO, Profesor Asociado de Hematología en la Universidad
de Extremadura y Facultativo Especialista de Área en el Hospital Materno Infantil de
Badajoz
CERTIFICAN:
Que Dª Silvia González de Murillo Godoy, Licenciada en Farmacia, ha realizado
bajo su dirección el presente trabajo titulado “INFLUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS
GENÉTICOS EN LA RESPUESTA TERAPÉUTICA A METOTREXATO DE PACIENTES
CON NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS”.
Como directores de dicho trabajo hacemos constar que éste ha sido realizado con
todas las garantías técnicas y metodológicas, y que las conclusiones obtenidas son
plenamente válidas, considerando además que reúne las condiciones necesarias para ser
presentado como Tesis Doctoral.
Para que conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en
Badajoz a 23 de Noviembre de 2017.
Fdo. D. Guillermo Gervasini Rodríguez Fdo. José Manuel Vagace Valero
II
Los resultados de la presente memoria se han recogido en las siguientes publicaciones y
comunicaciones a congresos:
Publicaciones
 Dihydrofolate reductase genetic polymorphisms affect methotrexate dose
requirements in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia on
maintenance therapy.
Gervasini G, de Murillo SG, Jiménez M, de la Maya MD, Vagace JM.
J Pediatr Hematol Oncol. 2017 Nov; 39(8):589-595
 Effect of polymorphisms in transporter genes on dosing, efficacy and toxicity of
maintenance therapy in children with acute lymphoblastic leukemia.
Gene. 2017 Sep 10; 628:72-77
Congresos Internacionales
 Dihydrofolate reductase genetic polymorphisms affect methotrexate dose
requirements in pedatric patients with acute lymphoblastic leukemia in maintenance
therapy.
13th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and
Therapeutics (EACTP)
Praga, 24-27 Junio 2017
III
AGRADECIMIENTOS
Una vez finalizado este arduo trabajo de investigación, me gustaría agradecer a todos los
que, de alguna manera, han formado parte de este apasionante proyecto.
A mis directores, José Manuel, y especialmente a Guillermo, por darme esta gran
oportunidad, confiar en mi desde el principio, y haber entendido mi ritmo y dificultades.
Ambos me han ofrecido los recursos disponibles, sus conocimientos y su apoyo
inestimable. Gracias por todo.
A Mercedes, mi compañera de laboratorio, su colaboración y ayuda han sido
imprescindibles para la consecución de este trabajo.
A mis padres, por transmitirme siempre la ilusión y el afán de superación necesarios para
llegar a la meta. Y a mi hermana Pilar, un ejemplo para mí de constancia y esfuerzo en el
trabajo diario.
A Soto, mi compañero de éste y de todos los viajes, por su ayuda y paciencia infinita. Y a
nuestro hijo Diego, el motor que me ha impulsado en la parte final de este proyecto.
Al resto de familiares y amigos, por mostrarme su apoyo y reconocimiento sincero.
Y por supuesto, a los pacientes que han participado en el estudio, entre todos hemos
aportado nuestro pequeño grano de arena a la CIENCIA.
GRACIAS
IV
ABREVIATURAS
6-MP 6-Mercaptopurina
ABCB1 ATP-binding cassette subfamilia B miembro 1
ABCC2 ATP-binding cassette subfamilia C miembro 2
ABCC4 ATP-binding cassette subfamilia C miembro 4
ABCG2 ATP-binding cassette subfamilia G miembro 2
ADME Absorción, distribución, metabolismo y excreción
AICAR Aminoimidazol ribonucleótido carboxamida
ALT Alanina aminotransferasa
AO Aldehído oxidasa
AR Artritis reumatoide
AST Aspartato aminotransferasa
ATIC Aminoimidazol ribonucleótido carboxamida transformilasa
CAR Receptor de antígeno quimérico
CCND1 Ciclina D1
CIE-O Clasificación Internacional de Enfermedades para Oncología
CTCAE Criterios Terminológicos Comunes para Eventos Adversos
DHF Dihidrofolato
DHFR Dihidrofolato reductasa
dTMP Desoxitimidina trifosfato
ECG Electrocardiograma
EFS Supervivencia libre de eventos
EICH Enfermedad de injerto contra huésped
EMR Enfermedad mínima residual
ESPT European Society of Pharmacogenomics and Personalised Therapy
FH2 Ácido dihidrofólico
FH4 Tetrahidrofólico
V
FPGS Folipoli-γ-glutamato sintetasa
GGH γ-glutamil hidrolasa
IARC International Agency for Research on Cancer
ICCC-3 International Classification of Childhood Cancer-3
LDH Lactato deshidrogenasa
LAL Leucemia aguda linfoblástica
LLC Leucemia linfocítica crónica
LMA Leucemia mieloide aguda
LMA Leucemia mieloide aguda
MS/MTR Metionina sintasa
MTHFR Metilentetrahidrofolato reductasa
MTRR Metionina sintasa reductasa
MTX Metotrexato
MTX-PGs MTX poliglutamatos activos
OMS Organización Mundial de la Salud
PCR Proteína C reactiva / Reacción en cadena de la polimerasa
Pgp Glicoproteína P
Ph Cromosoma Filadelfia
RA Riesgo alto
RAM Reacciones adversas a medicamentos
RE Riesgo estándar
RFC Transportador de folato reducido
RI Riesgo intemedio
RIQ Rango intercuartílico
RNTI Registro Nacional de Tumores Infantiles
SEHOP Sociedad Española de Hematología y Oncología Pediátricas
SHMT1 Serina hidroximetiltransferasa
SLC19A1 Solute Carrier Familia19 Miembro1
VI
SNC Sistema nervioso central
SNP Polimorfismo de nucleótido simple
SSC Supervivencia sin complicaciones
THF Tetrahidrofolato
TIT Triple intratecal
TP Tiempo de protrombina
TPH Trasplante de progenitores hematopoyéticos
TS Timidilato sintasa
TTPa Tiempo de cefalina
WBC Rango terapéutico de leucocitos
VII
ÍNDICE GENERAL
1.RESUMEN ........................................................................................................................ XIV
2. INTRODUCCIÓN................................................................................................................ 1
2.1. DEFINICIÓN E INCIDENCIA DEL CÁNCER INFANTIL .......................................... 2
2.2. LEUCEMIA AGUDA LINFOBLÁSTICA ....................................................................... 4
2.2.1. CONCEPTO ............................................................................................................ 4
2.2.2. HISTORIA ................................................................................................................ 5
2.2.3. CLASIFICACIÓN .................................................................................................... 9
2.2.4. PATOGENIA Y ETIOLOGÍA: BASES GENÉTICAS ........................................ 11
2.2.5. PRONÓSTICO ...................................................................................................... 14
2.2.6. MANIFESTACIONES CLÍNICAS ....................................................................... 15
2.2.7. TRATAMIENTO .................................................................................................... 16
2.3. METOTREXATO .......................................................................................................... 26
2.3.1. VÍAS DE ADMINISTRACIÓN E INDICACIONES ............................................ 26
2.3.2. FARMACOCINÉTICA .......................................................................................... 28
2.3.3. MECANISMO DE ACCIÓN ................................................................................. 30
2.4. FARMACOGENÉTICA ................................................................................................ 33
2.4.1. POLIMORFISMOS EN EL GEN METILENTETRAHIDROFOLATO
REDUCTASA (MTHFR) .................................................................................................. 35
2.4.2. POLIMORFISMOS EN GENES INVOLUCRADOS EN LA SÍNTESIS DE
PIRIMIDINAS Y HOMEOSTASIS DEL FOLATO........................................................ 39
METIONINA ...................................................................................................................... 44
2.4.4. POLIMORFISMOS EN GENES IMPLICADOS EN EL TRANSPORTE DE
MTX.................................................................................................................................... 46
3. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 54
4. PACIENTES, MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 57
4.1. SELECCIÓN DE PACIENTES Y DISEÑO DEL ESTUDIO ................................... 58
VIII
4.2. EVALUACIÓN CLÍNICA DE LOS PACIENTES ....................................................... 59
4.3. ESTUDIO DE LABORATORIO .................................................................................. 60
4.3.1. REACTIVOS .......................................................................................................... 61
4.3.2. MATERIALES ........................................................................................................ 62
4.3.3. MÉTODOS ANALÍTICOS .................................................................................... 62
4.4. MÉTODOS ESTADÍSTICOS ...................................................................................... 73
5. RESULTADOS ................................................................................................................. 77
5.1. ESTUDIO EN DIHIDROFOLATO REDUCTASA ..................................................... 79
5.1.1. Estudio del efecto de las variantes DHFR sobre la dosificación de MTX .... 81
5.1.2. Asociación de genotipos de DHFR con la toxicidad ....................................... 87
5.1.3. Estudio de haplotipos ........................................................................................... 89
5.2. ESTUDIO EN TRANSPORTADORES DE FÁRMACOS ....................................... 90
5.2.1. Efecto de polimorfismos en transportadores sobre la dosificación y la
eficacia del tratamiento ................................................................................................... 92
5.2.2. Estudio sobre el efecto de polimorfismos en transportadores en la toxicidad
del tratamiento.................................................................................................................. 94
5.3. ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN OTROS GENES RELACIONADOS CON
EL CICLO DEL FOLATO .................................................................................................... 97
6. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 108
7. CONCLUSIONES........................................................................................................... 117
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 120
ANEXO I. CLASIFICACIÓN INTERNACIONAL PARA CÁNCER INFANTIL (ICCC-3) .... 120
ANEXO II. DIAGNÓSTICO DE LEUCEMIA AGUDA LINFOBLÁSTICA ........................... 145
ANEXO III. CERTIFICADO DEL COMITÉ DE BIOÉTICA………………..………………....146
ANEXO III. ARTÍCULOS CIENTÍFICOS PUBLICADOS ................................................... 147
IX
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales etapas en el tratamiento de la leucemia aguda linfoblástica……..……7
Tabla 2. Clasificación de la OMS ......................................................................................... 10
Tabla 3. Factores pronósticos en Leucemia aguda linfoblástica ........................................ 15
Tabla 4. Grupos de riesgo ................................................................................................... 22
Tabla 5. Dosis de quimioterapia intratecal en Leucemias y Linfomas Linfoblásticos ......... 23
Tabla 6. Resumen de oligonucleótidos utilizados en los análisis genéticos ....................... 66
Tabla 7. Polimorfismos genéticos estudiados ..................................................................... 68
Tabla 8. Características clínicas de los pacientes con LAL ................................................ 79
Tabla 9. Distribución de genotipos y frecuencias alélicas en la población de estudio ....... 80
Tabla 10. Porcentaje de dosis administradas de MTX según protocolo ............................. 83
Tabla 11. Influencia de los polimorfismos genéticos en regiones no codificantes del gen
DHFR sobre el número de recuentos sanguíneos dentro del rango de glóbulos blancos
indicado. ............................................................................................................................... 85
Tabla 12. Número de recuentos sanguíneos dentro del rango en portadores de los tres
genotipos en los cuatro polimorfismos estudiados. ............................................................. 86
Tabla 13. Parámetros de toxicidad según el genotipo DHFR. Se muestran valores medios
con error estándar ................................................................................................................ 88
Tabla 14. Frecuencias de los cuatro haplotipos del gen DHFR identificados..................... 89
Tabla 15. Frecuencias genotípicas y alélicas observadas y comparación con las
encontradas en individuos caucásicos en HapMap ............................................................. 91
Tabla 16. Impacto del genotipo ABCB1 C1236T en el número de eventos tóxicos
hematológicas en niños en terapia de mantenimiento con leucemia aguda linfoblástica. .. 96
Tabla 17. Distribución de genotipos con porcentajes .......................................................... 98
Tabla 18. Asociación de SNPs con porcentaje de MTX adminstrado................................. 99
Tabla 19. Influencia de polimorfismos sobre los recuentos de leucocitos ........................ 100
X
Tabla 20. Asociación de polimorfismos con días de tratamiento interrumpidos y toxicidad
hematológica ...................................................................................................................... 102
Tabla 21. Asociación de polimorfismos con parámetros bioquímicos .............................. 104
Tabla 22. Asociación con el número de complicaciones durante el tratamiento .............. 106
XI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Modelo de diferenciación linfocitaria .................................................................... 11
Figura 2. Esquema de tratamiento de la LAL SEHOP/PETHEMA2013 ............................. 23
Figura 3. Fármacos administrados en cada etapa .............................................................. 25
Figura 4. Vías de administración del MTX .......................................................................... 27
Figura 5. Fórmulas químicas del MTX y del ácido fólico .................................................... 32
Figura 6. Esquema de las vías metabólicoas en las que está implicado el ácido fólico y
enzimas sobre las que actúa el metotrexato. ...................................................................... 33
Figura 7. Detección del polimorfismo MTHFR C677T ........................................................ 69
Figura 8. Detección del polimorfismo MTHFR A1298C ...................................................... 69
Figura 9. Detección del polimorfismo TS 2R/3R ................................................................. 69
Figura 10. Detección del polimorfismo TS1494del6 ........................................................... 70
Figura 11. Detección del polimorfismo DHFR A317G ........................................................ 70
Figura 12. Detección del polimorfismo DHFR C680A ......................................................... 70
Figura 13. Detección del polimorfismo SHMT1 C1420T..................................................... 71
Figura 14. Detección del polimorfismo MSA2756G ............................................................ 71
Figura 15. Detección del polimorfismo MTRRA66G ........................................................... 72
Figura 16. Detección del polimorfismo RFC1 G80A ........................................................... 72
Figura 17. Detección del polimorfismo CCND1A870G ....................................................... 72
Figura 18. Detección del polimorfismo DHFR19 bp ins/del ................................................ 73
Figura 19. Detección del polimorfismo ABCC2 C24T ......................................................... 73
Figura 20. Detección del polimorfismo ABCC2IVS 23+56 T>C G1249A ........................... 74
Figura 21. Detección del polimorfismo ABCC2 ................................................................... 73
Figura 22. Detección del polimorfismo ABCC4T1393C ...................................................... 74
Figura 24. Detección del polimorfismo ABCG2C421A ....................................................... 75
Figura 25. Detección del polimorfismo ABCB1C3435T ...................................................... 75
Figura 26. Detección del polimorfismo ABCB1 C1236T 2677GG ...................................... 75
XII
Figura 28. Haplotipos identificados en la serie de pacientes e información completa de
desequilibrio de ligamiento ................................................................................................... 81
Figura 29. Porcentaje de dosis inicial estándar de metotrexato administrada según los
polimorfismos de DHFR. ...................................................................................................... 82
polimorfismos de DHFR. S ................................................................................................... 84
Figura 31. Impacto de los polimorfismos ABCC4 C934A y ABCB1 C1236T sobre los
requerimientos de dosis de metotrexato .............................................................................. 93
Figura 32. Efecto del polimorfismo ABCB1 C1236T en el porcentaje de análisis de sangre
que muestran una mielosupresión eficaz ( .......................................................................... 94
Figura 33. Influencia de los polimorfismos ABCB1 C1236T (A) y ABCC4 C934A (B) sobre
el número total de eventos adversos hematológicos observados en nuestros pacientes
durante el tratamiento de mantenimiento............................................................................. 95
XIII
1. RESUMEN
XIV
Resumen
1. RESUMEN
El metrotexato (MTX) constituye la piedra angular de los protocolos para el tratamiento de
la Leucemia Aguda Linfoblástica (LAL), la neoplasia infantil más frecuente. A pesar de la
mejora en los regímenes de dosificación, todavía hay gran variabilidad en las respuestas
terapéuticas al fármaco. Este estudio ha tenido como objetivo determinar cómo afecta la
presencia de polimorfimos genéticos en (i) el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y
(ii) en transportadores implicados en la biodisponibilidad del MTX, a la dosificación,
eficacia y toxicidad del fármaco en pacientes pediátricos con LAL sometidos a
quimioterapia en mantenimiento.
Los resultados de la primera parte de nuestro trabajo indican que los pacientes portadores
del genotipo DHFR -680AA experimentaron más episodios de neutropenia severos y un
mayor número de controles con niveles elevados de LDH. Además, este genotipo se
asoció con un porcentaje menor de MTX administrado respecto a la dosis estándar, y con
un mayor número de controles sanguíneos con leucocitos bajos y en rango terapéutico.
En la segunda parte del trabajo observamos un efecto marcado del polimorfismo ABCB1
C1236T sobre el porcentaje de controles sanguíneos con mielosupresión eficaz y sobre la
aparición de neutropenia. Además, los portadores del genotipo homocigoto ABCB1
1236TT recibieron un porcentaje menor de dosis de 6-MP que los pacientes con los
genotipos CC y CT. Por otro lado, los portadores del genotipo ABCC4 934A recibieron un
porcentaje de dosis inicial de MTX mayor de la estándar en comparación con aquellos
pacientes que no presentaron esta variante.
En conclusión, existen variantes genéticas en los genes analizados que pueden afectar
tanto a la eficacia como a la toxicidad del MTX. Su identificación podría ayudar a
personalizar las dosis de fármaco administradas en mantenimiento.
XV
Resumen
Summary
Methotrexate (MTX) is the cornerstone of the protocols for the treatment of acute
lymphoblastic leukemia (LAL), the most frequent malignancy in children. Despite the
improvement in dosing regimens, there is still great variability in the therapeutic responses
to the drug. The objective of this study was to determine how the presence of genetic
polymorphisms in (i) the dihydrofolate reductase (DHFR) gene and (ii) in transporters
involved in the bioavailability of MTX, affects the dosage, efficacy and toxicity of the drug in
pediatric LAL patients undergoing maintenance chemotherapy.
The results of the first part of our work indicate that patients carrying the DHFR -680AA
genotype experienced more episodes of severe neutropenia and a greater number of
controls with elevated LDH levels. In addition, this genotype was associated with a lower
percentage of MTX administered with respect to standard doses, and with a greater
number of blood controls with both low leukocytes and leukocytes in therapeutic range.
In the second part of this study, we observed a marked effect of the ABCB1 C1236T
polymorphism on the percentage of blood controls with effective myelosuppression and on
the appearance of neutropenia. In addition, carriers of the homozygous ABCB1 1236TT
genotype received a lower percentage of 6-MP dose than patients with the CC or CT
genotypes. On the other hand, carriers of the ABCC4 934A genotype received an initial
dose percentage of MTX higher than the standard in comparison with patients who did not
present this variant.
In conclusion, there are genetic variants in the genes analyzed that can affect both the
efficacy and the toxicity of MTX. Their identification could help customize the doses
administered in maintenance.
XVI
2. INTRODUCCIÓN
1
Introducción
2. INTRODUCCIÓN
2.1. DEFINICIÓN E INCIDENCIA DEL CÁNCER INFANTIL
El cáncer es una enfermedad que se caracteriza por la transformación de las células, que
proliferan de manera anormal e incontrolada. Es una de las principales causas de muerte
en los países desarrollados. Los datos de los últimos 100 años reflejan que la enfermedad
está aumentando en estos países. El término cáncer, neoplasia maligna y tumor maligno
son sinónimos. Se distinguen de los tumores benignos por las propiedades de
desdiferenciación, invasividad y capacidad de producir metástasis (diseminación a otras
partes del cuerpo) (Rang y cols., 2004).
En la infancia y adolescencia presenta unas características histológicas, clínicas y
epidemiológicas distintas al de los adultos. Siendo la incidencia de cáncer infantil en
España estable y similar a la de Europa, su mortalidad ha disminuido gracias al éxito de
los avances terapéuticos (MSPS, 2013). La incidencia es muy baja, considerándose una
enfermedad poco frecuente. Se realizan alrededor de 1000 diagnósticos al año de cáncer
infantil en España, lo que representa el 3% de todos los casos. Los tipos más frecuentes
se pueden dividir en dos grandes grupos: las enfermedades hematológicas (leucemias y
linfomas) y los tumores sólidos. En el caso de las hemopatías malignas, la Leucemia
aguda linfoblástica (LAL) es la neoplasia más común con diferencia, siendo el cáncer
infantil más frecuente.
Los linfomas malignos son la tercera neoplasia más común entre los niños y adolescentes.
En menores de15 años, el Linfoma No Hodgkin (LNH) es el más común. En niños, por lo
general, se difunden de forma extraganglionar y son tumores de alto grado, mientras que
los linfomas nodales de grado bajo e intermedio predominan en los adultos. Estas
diferencias reflejan los cambios madurativos en la función y la composición del sistema
inmune. Las diferencias histológicas explican, en parte, las características de diferentes
2
Introducción
clínicas, curso de la enfermedad, y las estrategias de tratamiento utilizadas en adultos y
niños. Es motivo de preocupación en la actualidad los efectos secundarios derivados del
tratamiento del cáncer infantil y del adolescente, de forma que en el diseño de nuevos
protocolos se pretende modificar o reducir el tratamiento en niños con buen pronóstico,
mientras continúa intensificándose el mismo en aquellos tumores aún incurables. Son bien
conocidas las secuelas del tratamiento del cáncer en el niño: muerte temprana, tumores
secundarios, secuelas orgánicas (cardíacas, pulmonares, endocrinológicas, neurológicas),
psicológicas y sociales. En definitiva, secuelas que pueden derivar en una calidad de vida
inferior a la de sus congéneres que no presentaron la enfermedad.
La puesta en marcha de protocolos nacionales coordinados por la Sociedad Española de
Hematología y Oncología Pediátricas (SEHOP) y con la colaboración de la misma en
protocolos internacionales, ha determinado que la supervivencia de un niño diagnosticado
de cáncer en España sea similar a la de los países de nuestro entorno y que se aproxime
al 76,1%. El estudio de los factores que predisponen a desarrollar un cáncer en la infancia
es un tema de máximo interés. Considerando los síndromes de cáncer familiar que solo
representan el 4-10% de los casos, la investigación de factores de riesgo se centra en
factores medioambientales. La Comisión Europea, en su Estrategia “Medio Ambiente y
Salud” (Bruselas, 2003), establece entre las prioridades básicas en los contenidos de su
primer ciclo (2004-2010) la mejora de la comprensión de la relación entre distintos factores
medioambientales y el cáncer infantil. En este sentido, existen publicaciones que se
refieren a un aumento de la incidencia del cáncer infantil asociado a exposiciones
preconcepcionales, concepcionales, transplancentarias y postnatales (MSPS, 2013)
El RNTI-SEHOP (Registro Nacional de Tumores Infantiles) es el mayor sistema de
información sobre cáncer infantil en España enfocado a investigación epidemiológica,
clínica y de evaluación de los resultados asistenciales en el contexto nacional e
internacional.
3
Introducción
Este Registro utiliza la clasificación estándar propuesta por la Organización Mundial de la
Salud (OMS) y la International Agency for Research on Cancer (IARC), para adaptarse a
las normas de los registros de cáncer de Europa o EEUU y para poder participar en las
bases de datos europeas. Po ello, en 2012 cambió de la CIE-O-2 (Clasificación
Internacional de Enfermedades para Oncología) a la CIE-O-3, lo que implicó una
recodificación de todos los registros de su base de datos desde su inicio en 1980 hasta el
año 2012. Actualmente se utiliza la tercera versión de la CIE-O, presentándose los
resultados de acuerdo a la ICCC-3 (International Classification of Childhood Cancer-3)
(Anexo I). Los datos extraídos del RNTI reflejan que, en cuanto a las leucemias y
enfermedades mieloproliferativas y mielodisplásicas desarrolladas en individuos de 0 a 14
años, tuvieron su pico máximo de incidencia en el periodo 2010-2014, y su pico mínimo
entre 1995-1999. En total se han diagnosticado 6951 casos nuevos desde el año 1980
hasta 2016. Se han registrado más casos en el grupo de edad comprendido entre 1 y 4
años, siendo más frecuente en niños que en niñas.
Las leucemias y enfermedades mieloproliferativas y mielodisplásicas suponen un 27,1%
de todos los tumores infantiles diagnosticados. De ellas, el 79% se corresponden con
casos de LAL, siendo en su mayoría LAL en células precursoras (97,2%).
La supervivencia a 3 años de los pacientes infantiles diagnosticados de LAL ha pasado del
65% en 1980 al 88% en 2012. La supervivencia a 5 años del diagnóstico también ha
mejorado, pasando del 56% en 1980 al 84% en 2010 (RNTI-SEHOP, 2013)
2.2. LEUCEMIA AGUDA LINFOBLÁSTICA
2.2.1. CONCEPTO
La LAL es la consecuencia de la transformación maligna de una célula progenitora linfoide
inmadura que tiene la capacidad de expandirse y formar un clon de células progenitoras
4
Introducción
idénticas bloqueadas en un punto de su diferenciación. La secuencia de acontecimientos
que derivan en la transformación maligna de una célula es multifactorial. Estos eventos se
producen durante el desarrollo de la estirpe linfoide. Estos precursores linfoides presentan
una alta tasa de proliferación y de reordenamientos genéticos; características que
favorecen la aparición de mutaciones espontáneas y otras alteraciones citogenéticas que
facilitan la transformación maligna (Arber y cols., 2016). Los modelos experimentales han
permitido conocer que, para que se desarrolle una leucemia son necesarias varias
alteraciones genéticas (Tasian y cols., 2015).
La LAL surge de una sola célula madre que ha adquirido cambios genéticos somáticos que
llevan a una proliferación descontrolada y a la pérdida de diferenciación. Esta idea surgió
por primera vez con la identificación del cromosoma Philadelphia en la leucemia mieloide
crónica. A partir de entonces varios estudios han confirmado esta teoría que ahora es
ampliamente aceptada. Las anormalidades cromosómicas, estructurales y numéricas son
detectadas frecuentemente en los linfoblastos leucémicos de un paciente. Se ha
demostrado en todas las poblaciones de células leucémicas la misma reordenación de
genes Ig o TCR, que son somáticos originalmente. Además, se han observado patrones
idénticos de inactivación del cromosoma X en las células de pacientes con LAL mediante
el análisis del gen de la glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa en el cromosoma X, confirmando
así la clonalidad de esta neoplasia (Hoffman y cols., 2013).
2.2.2. HISTORIA
La palabra leucemia (Leukämie) significa “sangre blanca”, (del griego leuco, λευκός:
“blanca” y emia, αἷμα: “sangre”) (Nese, 2010, Ortiz-Hidalgo, 2013).
5
Introducción
La primera descripción de casos de esta enfermedad fue presentada por Velpeau en 1827.
En 1948, Sidney Farber dedujo que los antagonistas del ácido fólico podrían tener un
efecto antileucémico, al observar que cuando se administraba ácido fólico a los pacientes
para corregir la anemia, se desarrollaba una fase acelerada de la enfermedad. Por primera
vez en la historia se obtuvo la remisión en un paciente con leucemia utilizando
aminopterina (Ortiz-Hidalgo, 2013).
En los años 60 se descubrieron fármacos como la vincristina, asparaginasa, ciclofosfamida
o daunorubicina que serían utilizados en los primeros esquemas de poliquimioterapia
desarrollados por Donald Pinkel en 1968, que incluía una fase de inducción a la remisión,
el tratamiento sobre el sistema nervioso central (SNC) y, por último, el tratamiento de
continuación o mantenimiento durante 2 o 3 años, ya que este era el periodo en el que se
observaba el mayor número de recaídas. Este esquema denominado “terapia total” sería la
base de los sucesivos tratamientos para esta enfermedad. La mejoría en la terapia de
soporte (antibióticos y transfusiones de plaquetas), junto al empleo de la asparraginasa en
los años 80 del siglo pasado, supusieron otro importante avance en la supervivencia de la
LAL que se curaba ya en el 50% de los casos.
En la década de los 90, el grupo alemán BFM introdujo los tratamientos de intensificación
cíclicos con quimioterapia a altas dosis que incrementaron la supervivencia hasta más de
un 70% y que fueron adoptados por la mayoría de los grupos colaborativos. Avances más
recientes como los tratamientos específicos para subtipos de LAL, el descubrimiento de la
influencia de los polimorfismos genéticos en la toxicidad de citostáticos (mercaptopurina,
metotrexato), los primeros inhibidores de la tirosina cinasa (imatinib) para en el tratamiento
de la LAL Ph-positiva, la adaptación del tratamiento a la evolución de la enfermedad
mínima residual, la aplicación de nuevas formas de inmunoterapia con anticuerpos
6
Introducción
monoclonales, o células T CAR para pacientes con LAL resistentes o en recaída, han
contribuido en diverso grado a los resultados que se obtienen en la actualidad (Tabla 1).
Hoy se logra curar casi en el 90% de los pacientes, debido principalmente a un mejor
conocimiento de los factores pronósticos (relacionados con la biología del tumor, las
características del huésped y la monitorización de la respuesta al tratamiento), lo que ha
permitido estratificar el tratamiento en función del riesgo de cada paciente.
Además, el hecho de que con los mismos fármacos utilizados hace 20 años, hoy se logren
mucho mejores resultados, hace a esta enfermedad susceptible de ser curada en el tercer
mundo donde se dispone de pocos recursos económicos (Longo, 2015).
Ahora el gran reto es individualizar con éxito el tratamiento para mejorar las tasas de
curación y reducir la intensidad de la quimioterapia, de tal manera que en niños con muy
bajo riesgo de recaída se evite un exceso de toxicidad indebida (Hoffman y cols., 2013).
Tabla 1. Principales etapas en el tratamiento de la leucemia aguda linfoblástica (LAL)
AÑOS EVENTO
1948 Sydney Farber. Primer tratamiento de la LAL con aminopterina (antifólico).
1959 George Hitchings y Gertrude Ellis. Síntesis de la mercaptopurina.
1950-1960 Emili Frei, Emili Freireich y James Holland. Primera combinación de
citostáticos
1960-1970 Síntesis de nuevos fármacos: vincristina, asparaginasa, ciclofosfamida,
daunorubicina.
Aplicación de combinaciones de citostáticos más allá de la inducción (terapia
7
Introducción
de continuación, reinducciones).
Primeros criterios diagnósticos de LAL.
1970-1980 Donald Pinkel. Aplicación de la terapia total, que incluía profilaxis de la
leucemia en el sistema nervioso central (SNC). Curación en alrededor del
50% de los niños con LAL.
Tratamiento de soporto: transfusiones y antibióticos.
Clasificación de la LAL en subtipos.
1980-1990 Mejoría del pronóstico con el tratamiento de reinducción.
Empleo de asparaginasa en los protocolos de tratamiento.
Utilidad del MTX intravenoso a dosis intermedias, con rescate con ácido
folínico para prevención de recaídas sistémicas y testiculares.
Introducción de la terapia triple intratecal como profilaxis eficaz del SNC.
Identificación de grupos de riesgo. Tratamiento adaptado al riesgo.
Primeras experiencias de trasplante de progenitores hematopoyéticos en
pacientes con LAL en recaída.
1990-2000 Tratamiento de intensificación con quimioterapia a altas dosis y cíclica (BFM).
Auge de los protocolos de tratamiento de los grupos cooperativos.
Inicio de tratamientos específicos para subtipos de LAL.
Descubrimiento de la influencia de los polimorfismos genéticos en la toxicidad
de citostáticos (mercaptopurina, metotrexato).
2000- La quimioterapia intratecal y sistémica elimina la necesidad de radioterapia
presente holocraneal.
Los primeros inhibidores de la tirosina cinasa (imatinib) demuestran eficacia
en el tratamiento de la LAL Ph-positiva.
Empleo de tratamientos pediátricos para los adultos jóvenes con LAL.
Reconocimiento de la enfermedad residual como factor pronóstico de primer
8
Introducción
orden. Adaptación del tratamiento de la LAL a la evolución de la enfermedad
residual.
Desarrollo y aplicación de la “omica” (genómica, proteómica, transcriptómica
y metabolómica) al diagnóstico y el tratamiento de la LAL.
Aplicación de la inmunoterapia con anticuerpos monoclonales.
Aplicación de las células T CAR al tratamiento de pacientes con LAL
resistentes o en recaída.
Primeros resultados de estudios de atenuación del tratamiento en niños con
factores de buen pronóstico.
Tratamiento individualizado como objetivo final.
Modificado de (Ribera, 2017)
2.2.3. CLASIFICACIÓN
Atendiendo a su idéntico origen celular, las leucemias y linfomas linfoblásticos se agrupan
en una sola categoría dentro del grupo de leucemias en la clasificación de la Organización
Mundial de la Salud (OMS) que ha sido revisada recientemente (Arber y cols., 2016). La
nueva clasificación integra datos del inmunofenotipo y de la genética.
En general, el inmunofenotipo B corresponde con un fenotipo leucémico mientras que el
inmunofenotipo T a menudo se presenta con expresión linfomatosa y frecuente masa
mediastínica. Ambos procesos se tratan con protocolos terapéuticos similares que incluyen
una fase de mantenimiento con mercaptopurina y metotrexato.
9
Introducción
Tabla 2. Clasificación de la OMS
LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA (LMA) Y NEOPLASIAS RELACIONADAS

LMA CON ANOMALÍAS GENÉTICAS RECURRENTES:
LMA con t(8;21)(q22;q22.1);RUNX1-RUNX1T1
LMA con inv(16)(p13.1q22) o t(16;16)(p13.1;q22);CBFB-MYH11
LPA con PML-RARA
LMA con t(9;11)(p21.3;q23.3);MLLT3-KMT2A
LMA con t(6;9)(p23;q34.1);DEK-NUP214
LMA con inv(3)(q21.3q26.2) or t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2, MECOM
LMA (megacarioblástica) con t(1;22)(p13.3;q13.3);RBM15-MKL1
Entidad provisional: AML con BCR-ABL1
LMA con NPM1 mutado
LMA con mutaciones bialélicas de CEBPA
Entidad provisional: LMA con mutación RUNX1
- LMA CON CAMBIOS RELACIONADOS CON MIELODISPLASIA
- NEOPLASIAS MIELOIDES RELACIONADAS CON LA TERAPIA
- LMA, NOS:
LMA con mínima diferenciación
LMA sin maduración
LMA con maduración
Leucemia mielomonocítica aguda
Leucemia monoblástica / monocítica aguda
Leucemia eritroide pura
Leucemia megacarioblástica aguda
Leucemia aguda basofílica
Panmielosis aguda con mielofibrosis
- SARCOMA MIELOIDE
- PROLIFERACIONES MIELOIDES RELACIONADAS CON SÍNDROME DOWN:
Mielopoyesis anormal transitoria (TAM)
Leucemia mieloide asociada al Síndrome de Down
LEUCEMIAS AGUDAS DE LINAJE AMBIGUO
- Leucemia aguda indiferenciada
- Leucemia aguda de fenotipo mixto (MPAL) con t (9; 22) (q34.1; q11.2); BCR-ABL1
- MPAL con t (v; 11q23.3); KMT2A reordenado
- MPAL, B / mieloide, NOS
- MPAL, T / mieloide, NOS
10
Introducción
LEUCEMIA/LINFOMA LINFOBLÁSTICO B
- Leucemia/linfoma linfoblástico B, NOS
- Leucemia/linfoma linfoblástico B con anomalías genéticas recurrentes
- Leucemia/linfoma linfoblástico B con t (9; 22) (q34.1; q11.2), BCR-ABL1
- Leucemia/linfoma linfoblástico B con t (v; 11q23.3), KMT2A reordenado
- Leucemia/linfoma linfoblástico B con t (12; 21) (p13.2; q22.1); ETV6-RUNX1
- Leucemia/linfoma linfoblástico B con hiperdiploidia
- Leucemia/linfoma linfoblástico B con hipodiploidia
- Leucemia/linfoma linfoblástico B con t (5; 14) (q31.1; q32.3) IL3-IGH
- Leucemia/linfoma linfoblástico B con t (1; 19) (q23; p13.3); TCF3-PBX1
- Entidad provisional: leucemia/linfoma linfoblástico B, tipo BCR-ABL1
- Entidad provisional: leucemia/linfoma linfoblástico B con iAMP21
LEUCEMIA/LINFOMA LINFOBLÁSTICO T
Entidad provisional: Leucemia linfoblástica temprana de células T precursoras
Entidad provisional: Leucemia/linfoma linfoblástico de células asesinas naturales (NK)
Modificado de (Arber y cols., 2016)
Figura 1. Modelo de diferenciación linfocitaria basado en los estados de maduración y
desarrollo, por la presencia de antígenos en la superficie celular identificados por
anticuerpos monoclonales y por la expresión de inmunoglobulinas (Ig) en el citoplasma o
en la superficie. LAL: leucemia aguda linfoblástica.
Modificado de (Lassaletta y Madero, 2004)
11
Introducción
2.2.4. ETIOPATOGENIA: BASES GENÉTICAS DE LA LEUCEMOGÉNESIS
Determinadas alteraciones genéticas contribuyen a la patogénesis y recaída en pacientes
con LAL. Algunas de ellas incluyen aneuploidia (cambios en el número de cromosomas),
reordenamientos cromosómicos que desregulan la expresión génica o dan como resultado
la expresión de proteínas de fusión quiméricas, deleciones y ganancias de ADN y
mutaciones en la secuencia del mismo (Harrison, 2009).Los pacientes presentan sólo 10-
20 mutaciones codificadoras no silentes en el momento del diagnóstico y
aproximadamente el doble en el momento de la recaída (Ma y cols., 2015). Muchas
mutaciones perturban los procesos celulares clave, incluidos la regulación transcripcional
del desarrollo y la diferenciación linfoide; la regulación del ciclo celular; la vía supresora de
tumores de proteína TP53-retinoblastoma; el receptor del factor de crecimiento, Ras,
fosfatidilinositol 3-quinasa y señalización JAK-STAT; el metabolismo de los nucleósidos; y
la modificación epigenética. La perturbación de alguno de los dos últimos procesos es
común en la recaída (Ma y cols., 2015, Zhang y cols., 2011).
La LAL puede ser de precursor de células B o de linaje de células T. En el 25-30% de los
niños con LAL de células B, las células leucémicas presentan hiperdiploidía alta (> 50
cromosomas) debido a ganancias de cromosomas no aleatorias. Este subtipo se asocia
con un excelente pronóstico. La hipodiploidía (<44 cromosomas) ocurre en el 2-3% de los
niños con LAL de células B y es un fuerte factor pronóstico negativo (Nachman y cols.,
2007).Una hipodiploidía baja (30-39 cromosomas), que se asocia con la presencia de
mutaciones TP53 y que con frecuencia se hereda, es una manifestación del síndrome de
Li-Fraumeni (Holmfeldt y cols., 2013).
Las translocaciones cromosómicas y los reordenamientos intracromosómicos suelen
aparecer de manera precoz, llegando incluso a detectarse en muestras de sangre neonatal
años antes de que se produzcan manifestaciones clínicas de leucemia (Wiemels y cols.,
1999).
12
Introducción
Hay dos clases funcionales de translocaciones. La primera clase reubica oncogenes en
regiones reguladoras de genes transcritos activamente, causando la expresión
desregulada de una proteína intacta. Los ejemplos incluyen translocaciones que llevan al
C-MYC bajo el control de los potenciadores del gen de la cadena pesada (IGH) o de la
cadena ligera (IGK e IGL) de la inmunoglobulina en el linfoma y la leucemia de Burkitt, la
reordenación del factor 2 similar al receptor de citoquinas (CRLF2) y eritropoyetina
receptor (EPOR) a IGH e IGK en la LAL de células B (Russell y cols., 2009a, Russell y
cols., 2009b) y yuxtaposición de los factores de transcripción TLX1 y TLX3 a los loci del
receptor de células T (TCR) en la célula T de LAL (Aifantis y cols., 2008). El segundo tipo
de translocaciones yuxtapone dos genes para codificar una proteína quimérica que tiene
funciones distintas de las proteínas de las que deriva. Un ejemplo importante es la fusión
ETV6-RUNX1, que une dos factores de transcripción hematopoyéticos. Otro ejemplo se da
con la translocación t(9;22) (q34; q11.2) que conlleva la fusión de dos genes (BCR-ABL1)
codificando para una tirosina quinasa activada. Por último los reordenamientos
cromosómicos que involucran al cromosoma 11q23 del gen de leucemia de linaje mixto
(MLL). MLL (KMT2A) codifica una histona metiltransferasa que está involucrada en la
regulación epigenética del desarrollo de células sanguíneas. Más de 70 translocaciones
diferentes se dirigen a MLL, creando proteínas de fusión que median la autorenovación
aberrante de progenitores hematopoyéticos (C. Meyer y cols., 2013a). Las translocaciones
MLL son particularmente comunes en la LAL que se desarrolla en pacientes antes del año
de edad (75% de los casos). Las leucemias reorganizadas por MLL tienen muy pocas
mutaciones somáticas adicionales, particularmente en bebés (Andersson y cols., 2015).
Los estudios de secuenciación y perfiles genómicos han identificado subtipos adicionales
de LAL. Estos incluyen casos con desregulación del gen del factor de transcripción ERG
(Clappier y cols., 2014, Mullighan y cols., 2007) y casos con amplificación
intracromosómica compleja del cromosoma (Heerema y cols., 2013, Russell y cols.,
2009b).
13
Introducción
En varios subtipos de LAL no se produce una única alteración cromosómica definitoria. Por
ejemplo, la LAL precursora de las células T tempranas es una leucemia de células madre
progenitoras agresivas que presenta un inmunofenotipo y alteraciones genéticas
específicas dirigidas a factores de transcripción, vías de señalización y regulación
epigenética (Coustan-Smith y cols., 2009, Zhang y cols., 2012). Los pacientes con LAL Ph-
like tienen un perfil de expresión genética en células leucémicas similar al de los pacientes
con LAL Ph-positiva, pero no presentan BCR-ABL1, albergando una amplia gama de
alteraciones genéticas que activan la señalización de la tirosina quinasa (Roberts y cols.,
2014) Las más comunes de estas alteraciones son las fusiones que involucran quinasas
"ABL-class" (ABL1, ABL2, CSF1R y PDGFRB), que pueden ser tratadas con inhibidores de
la tirosinkinasa como imatinib y dasatinib, y fusiones, mutaciones o supresiones que
activan la señalización JAK-STAT (incluyendo reordenamientos de JAK2, CRLF2, EPOR y
mutaciones de JAK1, JAK2 y JAK3 y el receptor de interleucina-7).
Con la excepción de la leucemia reordenada por MLL en bebés, cada uno de estos
subtipos tiene típicamente múltiples alteraciones genéticas adicionales, que comúnmente
se dirigen a los genes que codifican proteínas implicadas en la señalización celular, las
funciones supresoras de tumores y la diferenciación linfoide. Los dos genes diana más
comunes que gobiernan el desarrollo linfoide B son PAX5 (mutado en el 35% de los casos
de LAL en niños) e IKZF1 (mutado en 15%) (Mullighan y cols., 2007).
2.2.5. PRONÓSTICO
Los factores pronósticos dependen de las características del paciente, de las
características de la leucemia y sobre todo de la respuesta al tratamiento, por este motivo
pueden variar entre protocolos terapéuticos. En la Tabla 3 se resumen los principales
factores pronósticos reconocidos en la mayoría de los estudios.
14
Introducción
Tabla 3. Factores pronósticos en Leucemia aguda linfoblástica
FACTOR FAVORABLE DESFAVORABLE
Niños 1-9 años Niños<1 año>9 años

EDAD
Adultos 15-30 años Adultos>30 años
3
>30000/mm3 LAL-B
LEUCOCITOS <25-30000/mm
>100000/mm3 LAL-T
INFILTRACION SNS No Sí
Hipoploidía, t(9;22), cariotipo
Hiperploidia>50
CITOGENÉTICA complejo, t(4;11), MLL,
T(12;21) del 9p
t(1;19),-7/+8
RESPUESTA AL
TRATAMIENTO EN EL DÍA Rápida (blastos<5-10%) Lenta (blastos>10%)
+14 INDUCCION
Negativa después de la
ENFERMEDAD RESIDUAL Positiva tras la inducción o en
inducción y
MÍNIMA cualquier punto posterior
consolidación
Modificado de (F. Carretero y cols., 2014).
2.2.6. MANIFESTACIONES CLÍNICAS
La presentación clínica refleja la infiltración de los linfoblastos en la médula ósea y la
extensión extramedular de la enfermedad. Los síntomas frecuentes al diagnóstico son
aquellos relacionados con la insuficiencia medular: anemia (palidez, astenia), trombopenia
(equimosis, petequias) y neutropenia (fiebre). El 65% de los pacientes presentan algún
grado de hepatomegalia, que suele ser asintomática (Arber y cols., 2016). La anorexia es
frecuente, pero no la pérdida de peso significativa. A veces, como consecuencia de la
infiltración de la médula ósea, estos pacientes presentan dolores en huesos largos e
incluso artralgias (Kara y Kelly, 2002).
El 25% de los pacientes, y especialmente los niños más pequeños, suelen negarse a
caminar debido al dolor que les ocasiona la infiltración de linfoblastos en la medula ósea.
15
Introducción
El hígado, el bazo y los ganglios linfáticos son los sitios extramedulares más afectados, y
el grado de organomegalia es más importante en niños que en adultos: en el 17% se
encuentra hepatomegalia; en el 44% esplenomegalia y en el 15% linfadenopatía.
La leucemia linfoblástica de fenotipo T se suele dar en pacientes mayores de 9 años y está
asociada a leucocitosis, coagulopatías y afectación del sistema nervioso central (SNC).
Hasta el 55% de los pacientes con LAL-T debutan con una masa “bulky” en el mediastino
anterior, pudiendo dar complicaciones como el síndrome de vena cava superior (Hoffman y
cols., 2013).
2.2.7. TRATAMIENTO
Hace 50 años, la quimioterapia combinada dio lugar a la remisión del 80-90% de los niños
con LAL. Sin embargo, en la mayoría se produjeron recidivas, sobre todo en el SNC, con
tasas de supervivencia del 10-20% (George y cols., 1968). La supervivencia aumentó
considerablemente con la aplicación de irradiación craneoespinal o craneal y quimioterapia
intratecal (Aur y cols., 1971). Un hito importante en la terapia fue el desarrollo de un
régimen intensivo de inducción y consolidación de 8 fármacos y 8 semanas, tal y como lo
describió Riehm (Riehm, 1980) en los denominados protocolos BFM. Este régimen, que
ahora se llama protocolo I, es la base de la mayoría de las terapias contemporáneas para
la LAL. Los componentes básicos de las mismas son similares y presentan varias fases.
La terapia de inducción dura de 4 a 6 semanas e incluye un glucocorticoide (prednisona o
dexametasona), vincristina, una preparación de asparaginasa, uso opcional de antraciclina
y quimioterapia intratecal. Casi todos los pacientes obtienen remisión, pero esto no es una
cura como tal, ya que la recaída ocurrirá irremediablemente sin una terapia adicional.
Después de la remisión, el tratamiento incluye de 6 a 8 meses de quimioterapia intensiva
que está diseñada para consolidar la remisión y prevenir el desarrollo de la leucemia en el
SNC. A continuación, se administra el tratamiento en una fase de 8 semanas de
16
Introducción
intensificación retardada (protocolo II). Los ciclos repetidos de metotrexato, administrados
mediante infusión intravenosa o en dosis elevadas durante las 24 horas seguidas de la
administración de ácido folínico para "rescatar" los tejidos de posibles efectos tóxicos, son
un componente crítico de estos regímenes.
Los pacientes reciben posteriormente terapia de mantenimiento a base de un
"antimetabolito" de baja intensidad durante 18 a 30 meses. Esta terapia consiste en la
administración de mercaptopurina oral diaria o tioguanina y metotrexato oral semanal.
Algunos regímenes también incluyen ciclos periódicos de 5 a 7 días de glucocorticoides y
vincristina. Se desconocen las razones exactas por las cuales se requiere una terapia de
mantenimiento y la composición y duración más efectivas de esta quimioterapia. Debido a
que la terapia de mantenimiento es prolongada y requiere administración diaria de
medicamentos por vía oral, la adherencia puede ser problemática; el 20% de los pacientes
tienen menos del 90% de adherencia y la disminución de la adherencia se asocia con un
riesgo de recaída 4 veces mayor que el riesgo entre los pacientes cuya tasa de adherencia
es del 90% o más (Bhatia y cols., 2014). Los polimorfismos del paciente pueden influir
tanto en la eficacia como en la toxicidad de mercaptopurina, que es la base de la terapia
de mantenimiento (Moriyama y cols., 2015).
En cuanto a la irradiación dirigida al SNC, actualmente, al menos el 80% de los niños
diagnosticados de LAL son tratados sin el uso de irradiación craneal.
La recaída se produce en el 15-20% de los niños, siendo las tasas de curación mucho más
bajas después de la misma (Nguyen y cols., 2008). Los factores pronósticos incluyen el
tiempo de recaída (un tiempo más breve se asocia con un peor pronóstico), el
inmunofenotipo (inmunofenotipo de células T es asociado a un peor pronóstico) y el sitio
de recaída (la enfermedad en la médula ósea se asocia con un peor pronóstico que la
enfermedad extramedular) (Raetz y Bhatla, 2012). Los pacientes en los que se desarrolla
una recaída temprana, con frecuencia presentan mutaciones que disminuyen la
sensibilidad a los fármacos utilizados en la quimioterapia (J. A. Meyer y cols., 2013b,
17
Introducción
Mullighan y cols., 2011). Si la recaída ocurre después de completar el tratamiento primario,
la mayoría de los niños entrarán en una segunda remisión, y la posibilidad de curación es
de aproximadamente el 50%. Si ocurre una recaída durante la terapia, la probabilidad de
lograr una segunda remisión es de sólo el 50-70%, y sólo del 20 al 30% de los pacientes
se curan.
El trasplante alogénico de células hematopoyéticas se usa mucho más comúnmente
después de la recaída (en ≥50% de los pacientes) que durante la terapia primaria (5-10%
de los pacientes). La evaluación de la respuesta residual mínima de la enfermedad puede
ser útil para determinar qué pacientes deben someterse a un trasplante durante una
segunda remisión y cuáles no deberían hacerlo (Peters y cols., 2015).
El tratamiento con inhibidores de la tirosina quinasa (imatinib y agentes relacionados) ha
transformado a la leucemia mieloide crónica de una enfermedad que requería terapia
intensiva que a menudo incluía transplante de células madre hematopoyéticas a una
enfermedad crónica que en la mayoría de los casos se puede manejar exitosamente
durante décadas con inhibidores orales de la tirosina quinasa, con el potencial de
suspender el tratamiento en algunos pacientes (Ross y cols., 2013). Esta “terapia dirigida”
se ha aplicado en los últimos años a algunos pacientes con LAL.
La identificación de lesiones moleculares específicas en pacientes con LAL ha permitido
identificar subtipos con un comportamiento clínico-biológico particular y con posibilidad de
aplicar tratamientos específicos. El caso más paradigmático es el de la LAL con
reordenamiento BCR-ABL o LAL con cromosoma Filadelfia (LALPh+). La combinación de
inhibidores de tirosina cinasa (TKI), como imatinib, dasatinib, nilotinib y, recientemente,
ponatinib (Chiaretti y Foa, 2015, Jabbour y cols., 2015), con quimioterapia de intensidad
variable constituye el tratamiento de elección de esta enfermedad.
18
Introducción
La proteína BCR-ABL1 se presenta en el 25% de los adultos y en el 3-5% de los niños con
LAL (LAL Ph-positiva), Aquí, a diferencia de la leucemia mieloide crónica, esta traslocación
se asocia con alteraciones genéticas secundarias, en particular alteraciones en IKZF1
(Mullighan y cols., 2008). Antes del uso de inhibidores de la tirosina quinasa, sobrevivían
menos de la mitad de los niños con LAL Ph-positiva(Arico y cols., 2010). La combinación
de imatinib con quimioterapia citotóxica ha demostrado ser altamente efectiva en niños con
LAL positiva para Ph y ha minimizado la necesidad de trasplante de células
hematopoyéticas en la primera remisión (Biondi y cols., 2012, Schultz y cols., 2009,
Schultz y cols., 2014).
La LAL Ph-like presenta un perfil de expresión genética similar a la LAL Ph-positiva,
aunque no para BCR-ABL1, y está asociada con un mal pronóstico, suponiendo un buen
candidato para la terapia de inhibición de la enzima tirosina quinasa (Den Boer y cols.,
2009, Mullighan y cols., 2009, Roberts y cols., 2014).
Uno de los avances más espectaculares en el tratamiento de la LAL lo constituye la
inmunoterapia. Hasta el momento esta nueva estrategia de tratamiento se ha empleado
únicamente en la LAL de línea B. Existen 2 modalidades fundamentales de inmunoterapia:
la basada en anticuerpos monoclonales (AcMo) o la que emplea los linfocitos T como
agentes citolíticos (Aldoss y cols., 2017, Maino y cols., 2016). Los AcMo empleados hasta
el momento en el tratamiento de la LAL son de 3 tipos: los no conjugados, los
inmunoconjugados y los biespecíficos.
El blinatumomab, un anticuerpo biespecífico genéticamente modificado que contiene
fragmentos capaces de reconocer tanto CD19 (un antígeno de superficie celular que está
presente en la mayoría de los linfoblastos B) como CD3 (que está presente en todas las
células T) pone en contacto las células T del paciente con las células leucémicas,
facilitando la lisis de los linfoblastos por las células T citotóxicas (Topp y cols., 2015).
19
Introducción
Una estrategia diferente para aprovechar la respuesta inmune de las células T contra las
células leucémicas es proporcionada por las denominadas células CAR-T (CAR T cells o
chimeric antigen receptor T cells en la bibliografía anglosajona) que son linfocitos T
genéticamente modificados para que reconozcan antígenos presentes en linfoblastos,
como el CD19 (y más recientemente el CD22). Se han desarrollado estrategias para
transducir células T autólogas con un fragmento de anticuerpo anti-CD19 acoplado a los
dominios de señalización intracelular del receptor de células T, redirigiendo así los
linfocitos T citotóxicos para reconocer y eliminar las células de la LAL. Al reconocer a los
linfoblastos que expresen CD19, se activa la maquinaria de lisis por citotoxicidad directa a
la par que ocurre una proliferación activa de estos linfocitos. El empleo de las células CAR-
T en pacientes con LAL en recaída ha permitido lograr unas elevadas tasas de RC tanto
morfológica (80%) como molecular (70-80%), algo impensable hace solo unos años
(Ribera, 2017).
Aproximadamente el 1-2% de los niños con LAL mueren antes de alcanzar la remisión y un
1-2% adicional muere por efectos tóxicos durante la remisión (Blanco y cols., 2012). Los
pacientes con síndrome de Down, bebés, adolescentes mayores y aquellos que reciben
terapia más intensiva tienen un mayor riesgo de muerte por efectos tóxicos, principalmente
debido a infecciones. Estos riesgos pueden mitigarse mediante modificaciones de la
terapia.
Uno de los problemas más invalidantes asociados con la terapia de la LAL es la
osteonecrosis, que desarrollan el 5-10% de los pacientes (Te Winkel y cols., 2014). El
riesgo es mucho mayor entre los adolescentes (15 a 20%) que entre los niños pequeños, y
las niñas se ven más afectadas que los niños. La osteonecrosis afecta con mayor
frecuencia a las articulaciones principales, en particular las caderas, las rodillas, los
hombros y los tobillos, y con frecuencia requiere tratamiento quirúrgico, incluido el
reemplazo articular. Las modificaciones de los programas de administración de
glucocorticoides pueden disminuir el riesgo de esta complicación (Mattano y cols., 2012).
20
Introducción
Los efectos adicionales relacionados con el tratamiento incluyen el síndrome metabólico y
la obesidad, el deterioro cardiovascular y del SNC y los efectos tóxicos sobre el sistema
nervioso periférico. Cada uno es causado por agentes antileucémicos altamente efectivos,
y el riesgo de efectos tóxicos de una persona está influenciado por factores genéticos que
influyen en el metabolismo y la actividad de los medicamentos.
2.2.7.1. TRATAMIENTO SEHOP PETHEMA LAL (2013)
Con el objeto de unificar el tratamiento de los pacientes pediátricos en España, en el año
2013 la Sociedad Española de Hematología y Oncología Pediátrica (Grupo SHOP) y la
Sociedad Española de Hematología (Grupo PETHEMA), que hasta ese momento
utilizaban protocolos distintos, consensuaron unas recomendaciones terapéuticas para
tratar a todos los niños del país (protocolo LAL/SEHOP-PETHEMA 2013), basadas en los
protocolos BFM.
Entre los cambios más importantes que supuso esta unificación destaca la introducción del
protocolo I en la inducción, la creación de una red nacional de centros de referencia para el
seguimiento de la enfermedad mínima residual, la introducción del concepto de respuesta
a la prednisona, la eliminación de la irradiación craneal, la restricción en las indicaciones
del trasplante de progenitores hematopoyéticos y la adaptación del tratamiento para
pacientes con Síndrome de Down.
Este tratamiento (ver esquema en Figura 2) se basa en un esquema que incluye tres
fases:
1) Quimioterapia de inducción.
2) Quimioterapia de intensificación (consolidación ± reinducción).
3) Fase de mantenimiento con una duración total del tratamiento de 2 años.
21
Introducción
Los grupos de riesgo en SEHOP-PETHEMA y las dosis intratecales para leucemias y
linfomas linfoblásticos se resumen en las Tablas 4 y 5.
Tabla 4. Grupos de riesgo
El paciente debe reunir todos y cada uno de los siguientes criterios:

- Edad >1 y <10 años.
9
- Leucocitos <20x10 /l al diagnóstico.
- Inmunofenotipo no T.
- Ausencia de infiltración del SNS y/o testes.
- Citogenética (uno de los dos criterios es suficiente):
-Alta hiperdiploidia (51-67 cromososmas), índice de DNA 1,10-1,44
RIESGO
(siempre confirmado por otras técnicas citogenéticas).
ESTÁNDAR
-t(12;21) positiva.
- No t(1,19).
- No reordenamiento MLL.
3
- Presencia <1000 blastos/mm en día +8 de inducción, en sangre
periférica.
- Presencia de < 5% de blastos y < 0,1% de ERM en médula ósea
(MO) en día +15 de la Inducción y al final de la inducción I’A.
RIESGO Aquellos pacientes que no reúnen los criterios de los otros grupos de
INTERMEDIO riesgo.
La existencia de cualquiera de los siguientes criterios determina la
inclusión del paciente en este grupo:
- t(4;11) (MLL/AF4).
- Hipodiploidia <44 cromosomas o índica DNA <0,81 (se requiere
confirmación por otras técnicas).
- >1000 blastos en día +8 de inducción, en sangre periférica.
RIESGO ALTO - > 25% de blastos y >10% de ERM en el día +15 de la Inducción,
en médula ósea.
- EMR>1% en el día +33 de Inducción, en médula ósea.
- EMR>0,1% antes de la Consolidación, en médula ósea.
- Se incluirán en este grupo, de forma transitoria, los pacientes
afectados por LAL Ph+, hasta disponer del protocolo internacional
COG/EsPhALLPh+ ALL.
Modificado de (SEHOP, 2014)
22
Introducción
Tabla 5. Dosis de quimioterapia intratecal en Leucemias y Linfomas Linfoblásticos
Edad (meses) 12 a 23 24 a 35 Mayor de 35

Metotrexato (mg) 8 10 12
Citarabina (mg) 16 20 30
Hidrocortisona (mg) 10 15 20
Figura 2. Esquema de tratamiento de la LAL SEHOP/PETHEMA2013
2.2.7.2. Descripción general del tratamiento
RIESGO ESTANDAR (RE)
- Inducción I’A de RE (2 dosis de Daunorrubicina) + Inducción IB + Consolidación +
Reinducción de RE + Mantenimiento hasta completar 2 años.
- Tratamiento profilaxis SNC: 15 dosis triple it (+4 si al diagnóstico SNC-2).
23
Introducción
RIESGO INTERMEDIO (RI)
- Inducción IA de RI (4 dosis de Daunorrubicina) + Inducción IB + Consolidación +
Reinducción de RI + Mantenimiento hasta completar 2 años.
- Tratamiento SNC: 17 dosis TIT (+4 si al diagnóstico SNC-2 o si LAL T + leucocitos
>100.000/mm3).
- Si el paciente presenta SNC-3 al diagnóstico, recibirá durante la inducción 5 dosis
de TIT semanal, los días +1, +8, +15, +22 y +29, siguiendo posteriormente el
mismo protocolo del paciente con SNC-2, si ha alcanzado la remisión (21 dosis en
total).
ALTO RIESGO (AR)
- Pacientes que no van a TPH: Inducción IA de AR (4 dosis de Daunorrubicina) +/-
Ciclofosfamida en pacientes con LAL T con mala respuesta a Prednisona +
Inducción IB + Intensificación de AR en 3 bloques (Bloque AR-1, AR-2, AR-3) +
Reinducción de AR en 3 bloques (R-1, R-2 y R-3) + Mantenimiento hasta completar
2 años. (ver aclaración en pacientes con SNC-3 que no van a TPH).
Tratamiento SNC: recibirán 26 dosis triple it (21 dosis si pertenecen al grupo de AR sólo
por tener una LAL de precursores B con mala respuesta a Prednisona)
- Pacientes que van a TPH: Inducción IA de AR (4 dosis de Daunorrubicina) +/-
Ciclofosfamida en pacientes con LAL T con mala respuesta a Prednisona +
Inducción IB + Intensificación de AR en 3 bloques (Bloque AR-1, AR-2, AR-3) +/-
bloque de Reinducción R-1 si la EMR es <0,1%. Si la EMR es >0,1% rescate pre-
TPH con Clofarabina + VP-16 + Ciclofosfamida.
Tratamiento SNC: recibirán un total de 11 a 14 dosis de TIT, según se realice antes o
después de la fase de Reinducción-1.
Si el paciente presenta SNC-3 al diagnóstico, recibirá durante la inducción 5 dosis de TIT
semanal, los días +1, +8, +15, +22 y +29, siguiendo posteriormente el mismo protocolo de
24
Introducción
TIT del resto de pacientes del grupo de AR al que pertenecen. Si el paciente no va a TPH,
se sustituye el Bloque de Reinducción 1 por repetición de los Bloques AR-1 y AR-2, para
que reciban un total de 4 dosis de MTX de 5 g/m2.
Figura 3. Fármacos administrados en cada etapa
PRED, prednisona/prednisolona; DEXA, dexametasona; VCR, vincristina; DOX,

doxorrubicina; DNR, daunorrubicina; TG, 6-tiogunina; ASP, L-asparraginasa nativa de E.
coli; MTX, metotrexato; CFM, ciclofosfamida; VDS, vindesina; 6MP, 6 mercaptopurina;
ARA-C, citabarina; VP-16, etopósido; LCV, leucovorín Ca; AD MTX, metotrexato a altas
dosis; PRG-ASP, L-asparraginasa pegilada de E.coli; TIT, triple intratecal (metotrexato,
citabarina, hidrocortisona)
25
Introducción
2.3. METOTREXATO
El metotrexato (MTX) es un inhibidor de folato ampliamente empleado en la quimioterapia
de neoplasias hematológicas y diversos tumores sólidos. Además, sus propiedades
antiinflamatorias e inmunosupresoras hacen que este fármaco constituya la piedra angular
en el tratamiento de la artritis reumatoide (AR), también es adecuado su uso en psoriasis y
en la prevención de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) en el trasplante de
células hematopoyéticas.
Los pacientes muestran una gran variabilidad de respuestas al MTX. Por ejemplo, se ha
demostrado que entre el 20 y el 55% de pacientes con AR y LAL no responden a la
terapia. La toxicidad inducida por MTX es también un motivo de preocupación y puede ser
causa de interrupción del tratamiento. Entre los síntomas que pueden aparecer se
encuentran los gastrointestinales (GI) (Schmeling y cols., 2005), mucositis oral (Gemmati y
cols., 2007, Robien y cols., 2004a), elevación de enzimas hepáticas (Schmeling y cols.,
2005, van Ede y cols., 2001), neurotoxicidad (Weisman y cols., 2006), toxicidad
hematológica (Gemmati y cols., 2007, Ulrich y cols., 2001), e incluso la muerte.
2.3.1. VÍAS DE ADMINISTRACIÓN E INDICACIONES
Vía oral o parenteral a dosis bajas:
 Quimioterapia antineoplásica: leucemias agudas, linfomas no Hodgkin (incluida la
micosis fungoide), neoplasia trofoblástica gestacional (vía oral).
 Artritis reumatoide y artritis crónica juvenil.
 Psoriasis y artritis psoriásica, cuando otros tratamientos son ineficaces. En general
se considera el tratamiento sistémico de elección (guía NICE 2012).
 Síndrome de Reiter.
26
Introducción
Vía parenteral a dosis altas (uso hospitalario):
 Quimioterapia antineoplásica: leucemias agudas, linfomas no Hodgkin (incluida la
micosis fungoide), neoplasia trofoblástica gestacional (coriocarcinoma),
osteosarcoma, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga.
 Profilaxis de la enfermedad injerto contra huésped (EICH) en el trasplante
alogénico de médula ósea.
Figura 4. Vías de administración del MTX
Modificado de (Ortega Castro y cols., 2013)
27
Introducción
2.3.2. FARMACOCINÉTICA
La farmacocinética, es decir, la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME),
describe la disposición de un xenobiótico dentro de un organismo. Los cuatro procesos
influyen en la exposición del fármaco a los tejidos y, por tanto, condicionan la eficacia y
seguridad del mismo.
Absorción
El MTX se puede administrar por vía oral, subcutánea, intramuscular o intravenosa. La
biodisponibilidad por vía oral a dosis bajas es alta (un 70%), aunque variable entre
individuos; a dosis superiores a unos 15 mg/semana disminuye hasta un 30%, ya que la
absorción por el tracto gastrointestinal viene determinada por un transportador saturable, el
transportador de folato reducido (RFC, del inglés Reduced Folate Carrier) (Tian y
Cronstein, 2007). Por este motivo, y por su mayor tolerabilidad gastrointestinal, se tiende a
preferir la vía parenteral en estos casos (Hamilton y Kremer, 1997), aunque la
administración oral en dosis separadas puede mejorar la biodisponibilidad (Hoekstra y
cols., 2006).
La absorción oral de MTX, que se produce fundamentalmente en el yeyuno proximal, no se
ve reducida por la ingesta de alimentos, pero sí en el contexto de malabsorción o
enfermedad inflamatoria intestinal. La biodisponibilidad del fármaco administrado por vía
parenteral es similar, independientemente de la vía.
Distribución
Un 35-50% del MTX circulante se une a la albúmina (frente a un 91-95% del 7-
hidroximetotrexato), y alcanza sus máximas concentraciones en el riñón, el hígado, la
28
Introducción
vesícula biliar, el bazo, la piel y los hematíes; la concentración en estos últimos puede
reflejar la posible toxicidad hematológica y la acumulación hepática del fármaco. El MTX
tiende a acumularse en el compartimiento extravascular, por lo que debe extremarse la
precaución cuando se administra a pacientes con derrame pleural, ascitis o edema masivo,
por el riesgo de toxicidad al reabsorberse el fluido extravascular (Puig, 2012).
Metabolismo
Tras la absorción, un 10% es objeto de conversión hepática en un metabolito parcialmente
inactivo, el 7-hidroximetotrexato, lo que reduce las concentraciones plasmáticas de MTX.
La capacidad de catabolización de MTX a 7-hidroximetotrexato a través de la aldehído
oxidasa (AO) es muy variable, con una distribución bimodal entre la población. Los
catabolizadores rápidos tienen una menor respuesta terapéutica a MTX; por otra parte, el
ácido fólico (a diferencia del folínico) inhibe esta catabolización, y podría contribuir a
aumentar los niveles de MTX en los catabolizadores rápidos (Baggott y Morgan, 2009). El
7-hidroximetotrexato compite por la captación celular del MTX a través de RFC, que
también internalizan los folatos reducidos y el ácido fólico, aunque con baja afinidad. Las
alteraciones cuantitativas o cualitativas de los RFC, al igual que los niveles elevados de
folato exógeno compitiendo por el receptor, pueden determinar una resistencia mediada
por transporte a la acción terapéutica del fármaco.
El MTX, al igual que el 7-hidroximetotrexato, es objeto de metabolización intracelular a
mono y poliglutamatos, que son los principales responsables de la inhibición de las
enzimas comentadas en la sección del mecanismo del fármaco, por lo que sus niveles
intracelulares se correlacionan con la actividad terapéutica del MTX (que en realidad es un
profármaco) (Hoekstra y cols., 2006). La vía de administración determina en parte tanto su
biodisponibilidad como su conjugación intracelular: la sustitución de la vía oral de
administración por la vía parenteral determina un incremento de un 37% en la
29
Introducción
concentración de poliglutamatos de cadena muy larga y una disminución del 31% en la
actividad de la enfermedad en pacientes con AR (Dervieux y cols., 2010). Los
poliglutamatos se liberan lentamente del interior de la célula por la acción de
transportadores de eflujo, lo que puede contribuir a prolongar la eliminación del fármaco
(Hider y cols., 2007).
Excreción
En cuanto al aclaramiento del MTX, el 65-80% del fármaco se excreta por los riñones sin
metabolizar (en su mayor parte en las primeras 12 horas después de la administración) y
un 20-35% es objeto de secreción biliar y se metaboliza o transfiere a otros
compartimentos.
La filtración glomerular es la principal responsable de la excreción renal, siendo menos
importantes la secreción y reabsorción tubulares; por lo que respecta a la secreción biliar
adquiere importancia en pacientes con insuficiencia renal,en los que disminuye el
aclaramiento del fármaco y aumenta el riesgo de toxicidad. La hemodiálisis y la diálisis
peritoneal determinan disminuciones limitadas y transitorias en las concentraciones séricas
del fármaco, debido a su baja-media unión a proteínas y su elevada distribución tisular. La
semivida terminal en suero es aproximadamente de 7-10 horas, pero puede prolongarse
hasta 26 horas en algunos pacientes; las concentraciones intraeritrocitarias permanecen
estables durante 9 días, mientras que las séricas se vuelven indetectables al cabo de 52
horas (Kremer y cols., 1986).
2.3.3. MECANISMO DE ACCIÓN
El metotrexato (C20H22N8O5) es un antimetabolito análogo del ácido fólico (ácido 4-
amino-10-metilfólico), derivado por metilación en N10 de la ametopterina, su precursor. Es
30
Introducción
un inhibidor competitivo de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) que cataliza la
reducción del ácido dihidrofólico (FH2) en tetrahidrofólico (FH4). Posee una triple acción
antiinflamatoria, antiproliferativa e inmunosupresora (G. Carretero y cols., 2010).
Las acciones del MTX en el metabolismo del folato siguen un patrón complejo que incluye
varios transportadores y enzimas metabolizadoras. El MTX se introduce en la célula a
través del transportador RFC (Moscow y cols., 1995). Una vez en ella, se metaboliza a
MTX poliglutamatos activos (MTX-PGs) por la enzima folipoli-γ-glutamato sintetasa
(FPGS), mientras que γ-glutamil hidrolasa (GGH) cataliza la reacción inversa.
Los MTX-PGs interrumpen la vía metabólica del folato mediante la inhibición de las
enzimas que son esenciales para la síntesis de ADN, la reparación del ADN y la
replicación celular (Chabner y cols., 1985). Estas enzimas son la timidilato sintasa (TS)
(Szeto y cols., 1979) que desempeña un papel clave en la síntesis de novo de las
pirimidinas, y la DHFR, que cataliza la reducción de dihidrofolato (DHF) a tetrahidrofolato
(THF) (Galivan, 1980). Un tercer objetivo para la inhibición de MTX-PG es la
aminoimidazol ribonucleótido carboxamida (AICAR) transformilasa (ATIC) (Allegra y cols.,
1985), que constituye un paso limitante en la síntesis de purinas.
Los MTX-PGs de cadena larga tienen mayor afinidad que el MTX por las enzimas
implicadas en la síntesis de novo de purinas, por lo que se refuerza la inhibición del
mismo. La formación intracelular de MTX-PGs aumenta el efecto citotóxico y antileucémico
del MTX (de Beaumais y Jacqz-Aigrain, 2012).
Los efectos del MTX sobre el metabolismo del folato intracelular también influyen en la
actividad de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR), que está implicada en la
regeneración de 5-metil-THF a partir de 5,10-metilen-THF. Este último es un intermediario
importante en todas estas reacciones y se sintetiza en una reacción reversible por una
enzima fundamental, la serina hidroximetiltransferasa (SHMT1). A su vez, la formación de
5-metil-THF es necesaria para la síntesis de metionina a partir de homocisteína, una
31
Introducción
biotransformación en la que la metionina sintasa (MS) y la metionina sintasa reductasa
(MTRR) juegan papeles importantes.
Figura 5. Fórmulas químicas del MTX y del ácido fólico
Muchas proteínas implicadas en la vía metabólica del folato (MTHFR, RFC, TS) pueden
contribuir a la citotoxicidad del MTX y a su eliminación clínica (Xue y cols., 2015).
Concentraciones altas de MTX pueden llegar incluso a inhibir directamente la síntesis de
proteínas. Utilizado a dosis altas parece claro que su principal efecto es la acción
antifolato; sin embargo, su mecanismo a dosis bajas no está aclarado, y se sugiere que
pueda guardar más relación con la capacidad de formar poliglutamatos intracelulares
(poliglutamación) y aumentar la formación de adenosina, que es un potente mediador
antiiinflamatorio (G. Carretero y cols., 2010).
32
Introducción
Figura 6. Esquema de las vías metabólicas en las que está implicado el ácido fólico y
enzimas sobre las que actúa el metotrexato.
5,10-CH2-THF, Metilen tetrahidrofolato; 5-CH3-THF, Metil tetrahidrofolato; ABCB1, ATP-

binding cassette subfamilia B miembro 1; ADA, Adenosina desaminasa; ADP, Difosfato de
adenosina; AMP, Monofosfato de adenosina; ATIC, Aminoimidazol ribonucleótido
carboxamida transformilasa; ATP, Trifosfato de adenosina; DHF, Dihidrofolato; DHFR,
Dihidrofolato reductasa; dTMP, Desoxitimidina trifosfato; dUMP, Desoxiuridina
monofosfato; FPGS, Folipoli-γ-glutamato sintetasa; GGH, γ-glutamil hidrolasa; IMP,
Inosina monofosfato; MTHFD1, Metilentetrahidrofolato deshidrogenasa; MTHFR,
Metilentetrahidrofolato reductasa; MTR; Metionina sintasa (MS); MTX, Metotrexato; MTX-
PGs, MTX poliglutamatos activos; RFC, Transportador de folato reducido; SAM, S-adenosil
metionina; THF, Tetrahidrofolato; TYMS; Timidilato sintetasa;
Modificado de (Sala-Icardo y cols., 2017)
33
Introducción
2.4. FARMACOGENÉTICA
El MTX se conoce desde hace más de 60 años, ya que fue la primera molécula diseñada
contra el cáncer (Farber y Diamond, 1948). A pesar de la mejora en los regímenes de
dosificación, todavía hay variabilidad en las respuestas terapéuticas al fármaco.
Determinados pacientes son más propensos al desarrollo de RAM, mientras que en otros,
la resistencia al fármaco sigue siendo un problema importante ya que reduce la eficacia de
la terapia. Dicha resistencia puede surgir por la adaptación de células cancerosas
expuestas al fármaco, pero también por predisposiciones genéticas que involucran
principalmente a genes del metabolismo del ácido fólico, enzimas dependientes del folato y
sistemas de transporte.
El florecimiento de la farmacogenética en los últimos 20 años ha hecho posible identificar
los factores genéticos que pueden contribuir a la aparición de la toxicidad inducida por
fármacos o a la alteración de su eficacia. Se han publicado muchos estudios que muestran
que tanto la toxicidad como la eficacia del MTX pueden verse modificadas por la presencia
de polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) en genes implicados en el metabolismo, el
transporte, y la función de los folatos y el MTX (Gervasini, 2009).
Las alteraciones en los genes que participan en la síntesis o metilación del ADN podrían
constituir un primer paso para la producción de células hematopoyéticas (linfoides)
malignas. Es necesario mantener una concentración adecuada de folato (tetrahidrofolato-
THF) ya que éste proporciona un grupo metilo para la síntesis adecuada del ADN, y para
la homocisteína en el ciclo de la metionina, lo cual es importante en el proceso de
metilación del ADN. Las variaciones genéticas en estos genes podrían influir en la cantidad
de folato disponible en las células y, por tanto, alterar la susceptibilidad a padecer LAL y la
respuesta a la terapia con MTX (Lautner-Csorba y cols., 2013).
El establecimiento de un tratamiento pediátrico individualizado en oncología y hematología
se propuso durante el 3erCongreso de The European Society of Pharmacogenomics and
34
Introducción
Personalised Therapy (ESPT) (Budapest, Hungría, 7-9 de octubre de 2015) con el objetivo
de facilitar la transferencia y armonización de las pruebas farmacogenéticas en los niños,
reunir la investigación básica y traslacional, educar a los profesionales de la salud en toda
Europa y establecer asociaciones para la industria y los organismos reguladores (Mlakar y
cols., 2016).
Se han conseguido altos índices de curación con los actuales protocolos de tratamiento en
pacientes con LAL, sin embargo el riesgo de recaída es de aproximadamente el 20%, lo
que se asocia con un mal pronóstico. Esto es en gran parte atribuible a los fenómenos de
resistencia a fármacos de las células leucémicas y podría mejorarse con la personalización
de las terapias basada en la farmacogenética (Wojtuszkiewicz y cols., 2015).
2.4.1. POLIMORFISMOS EN EL GEN METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA
(MTHFR)
De todos los genes implicados en las rutas metabólicas del MTX, las variantes más
estudiadas han sido las del MTHFR (De Mattia y Toffoli, 2009).
Esta enzima es clave para la homeostasis y metabolismo de los folatos implicados en la
remetilación de la homocisteína, que a su vez es esencial para la metilación del ADN.Si la
actividad de la enzima se encuentra disminuida, podría dar lugar a alteraciones en la
reducción de folatos e hiperhomocisteinemia, por lo que se podría ver afectada la actividad
y toxicidad de fármacos como el MTX.
Se han identificado al menos 15 polimorfismos en este gen, aunque la mayoría de estudios
se centran en dos de ellos: C677T y A1298C.
Como veremos, hay numerosos estudios que apuntan la posibilidad de que estas
alteraciones genéticas estuvieran relacionadas con la toxicidad hematológica, la
supervivencia y la dosis de exposición en niños con LAL (Mlakar y cols., 2016).
35
Introducción
Los genotipos con menor actividad enzimática (677TT y 1298CC) favorecen la
disponibilidad de la forma no metilada de folato (5,10-MeTHF) para la síntesis de ADN y
disminución de los niveles de 5-MeTHF para la metilación del ADN. La disminución de la
actividad de MTHFR altera la distribución intracelular normal de sustratos de folato a favor
de precursores para la síntesis de nucleótidos. Por lo tanto, niveles adecuados de folato,
incluso si la actividad de la enzima es baja, darían lugar a una conversión suficiente de 5-
MeTHF para la metilación del ADN, mientras se derivaría 5,10-MeTHF hacía la síntesis de
dTMP a partir de dUMP, evitando así la incorporación de uracilo y el daño cromosómico.
Lo que sugiere que las diferencias en la disponibilidad de folato pueden influir en los
efectos funcionales de los polimorfismos en MTHFR (Lightfoot y cols., 2010).
El cambio de la base C a T en la posición 677 localizada en el exón 4 y la consiguiente
sustitución de alanina por valina en el codón 222 (Ala222Val) produce, según un estudio
de Bratsstrom y Zhang, una disminución del 40% de la actividad de la enzima en
portadores heterocigotos, y la disminución del 70% de la actividad en portadores
homocigotos, un genotipo que está presente en el 10% de los caucásicos (Brattstrom y
cols., 1998).
En cuanto a la eficacia, estudios realizados en cánceres hematológicos indican que el alelo
667T podría tener un valor pronóstico negativo. En ocasiones se ha asociado la presencia
de este SNP con mayor riesgo de recidiva en pacientes pediátricos con LAL (Krajinovic y
cols., 2004), otros lo han asociado con una menor probabilidad de superviviencia en
adultos con LAL en terapia de mantenimiento con MTX (Chiusolo y cols., 2007), y otros
con una menor supervivencia en pacientes con la enfermedad injerto contra huésped
(EICH) después de un transplante hematopoyético (Kim y cols., 2007). Sin embargo,
también hay datos que apuntan a un aumento de la eficacia del MTX (Robien y cols., 2006,
Sugimoto y cols., 2008).
36
Introducción
La inconsistenciade los resultados mostrados puede deberse al uso de diferentes
protocolos de tratamiento, la inclusión en los estudios de diferentes etnias, y en especial a
la heterogenicidad de los parámetros de eficacia.
Algunos han señalado una posible asociación entre la variante alélica 666T y mayor
toxicidad inducida por MTX en pacientes con enfermedades tan diversas como LAL
(Chiusolo y cols., 2002, Pietrzyk y cols., 2009), cáncer de pecho (Toffoli y cols., 2000) y
ovario (Toffoli y cols., 2003), AR (Urano y cols., 2002, van Ede y cols., 2001, Weisman y
cols., 2006), artritis idiopática juvenil (Schmeling y cols., 2005), LNH (Gemmati y cols.,
2007) y en pacientes sometidos a transplantes (Kim y cols., 2007, Robien y cols., 2004b,
Ulrich y cols., 2001).
Los signos clínicos observados en estos pacientes fueron muy variados, desde alopecia
hasta efectos secundarios gastrointestinales, neurotoxicidad, toxicidad hematológica, e
incluso la muerte.
En cuanto al impacto que este polimorfismo tiene sobre el riesgo de padecer LAL infantil,
existen estudios contradictorios. Jiang y cols. han indicado que el genotipo 677TT
disminuye el riesgo de LAL en pacientes caucásicos. Sin embargo, no se encontró una
asociación significativa entre el polimorfismo C677T y la LAL en asiáticos. En otro trabajo,
Yan y cols. asociaron la variante 677T con la reducción del riesgo de padecer LAL infantil.
Por otro lado, Atashrazm y cols. no encontraron ninguna asociación entre C677T y el
riesgo de presentar la enfermedad. Otros estudios no han observado evidencia de
asociación entre este polimorfismo y el riesgo de padecer LAL o LMA, en niños ni en sus
madres (Lightfoot y cols., 2010).
El riesgo reducido asociado con los polimorfismos MTHFR 677C> T y TS 2R / 3R puede
ser el resultado de la redistribución intracelular de folato (de Jonge y cols., 2009).
37
Introducción
La segunda variante importante en el gen MTHFR, el cambio de A a C en la posición 1298
del exón 7 (Glu429Ala) también parece disminuir la actividad enzimática aunque en un
grado menor que C677T (Weisberg y cols., 1998).
En cuanto a la eficacia del tratamiento, el alelo 1298C se ha asociado con una mejor
respuesta a MTX para la prevención de EICH (Robien y cols., 2004b) y entre pacientes
con artritis idiopática juvenil (Schmeling y cols., 2005), mientras que, por otro lado, el
mismo alelo se ha relacionado con una mala respuesta al MTX en pacientes con AR
(Kurzawski y cols., 2007, Taniguchi y cols., 2007, Urano y cols., 2002).
Al igual que en el caso del SNP C677T, el uso de diferentes parámetros para medir la
eficacia del MTX hace que los resultados de estos estudios sean difícilmente comparables.
Por otro lado, el impacto de esta variante en la toxicidad relacionada con el fármaco
presenta resultados incluso más dispares que los de C677T.
Tres trabajos han establecido que los pacientes con LNH (Gemmati y cols., 2007), los que
presentan enfermedad inflamatoria intestinal (Herrlinger y cols., 2005), y los receptores
hematopoyéticos de células madre (Goekkurt y cols., 2007), portadores del genotipo
1298CC son más propensos a desarrollar efectos adversos inducidos por MTX. Del mismo
modo, el alelo mutante 1298C también se ha asociado con un aumento de efectos
adversos al MTX en pacientes con AR (Wessels y cols., 2006). Los resultados en sentido
contrario se centran en tres estudios llevados a cabo en pacientes con LAL (Huang y cols.,
2008) y AR (Berkun y cols., 2004, Hughes y cols., 2006), con una reducción de los efectos
adversos al MTX observados en portadores de la variante 1298C. El gran metaanálisis
realizado por Fisher y cols. dirigido a poner fin a esta controversia en los pacientes con
AR, concluyó que el SNP A1298C no está asociado con una mayor toxicidad inducida por
MTX (Fisher y Cronstein, 2009).
En cuanto al impacto que este polimorfismo tiene sobre el riesgo de padecer LAL infantil,
existen estudios contradictorios. Dong y cols. han realizado un meta-análisis mostrando
que el genotipo 1298 CC aumenta significativamente el riesgo de leucemia mieloide en
38
Introducción
poblaciones asiáticas (Dong y cols., 2014). En otro estudio, Yan y cols. no encontraron
ninguna asociación significativa entre el polimorfismo A1298C y la enfermedad (Yan y
cols., 2012). Igualmente, Atashrazm y cols. investigaron el impacto de este SNP en
pacientes de Irán, y tampoco encontraron ninguna asociación entre la variante y el riesgo
de presentar la enfermedad (Atashrazm, 2011). Por otro lado, Bahari y cols. mostraron que
el polimorfismo A1298C disminuyó el riesgo de LAL en una muestra de población infantil
iraní.
Los resultados son inconsistentes, pudiendo influir los factores étnicos, genéticos y/o
ambientales, así como la interacción de la genética con la alimentación, disminuyendo o
aumentando el riesgo de LAL infantil en diferentes áreas geográficas (Bahari y cols.,
2016).
PIRIMIDINAS Y HOMEOSTASIS DEL FOLATO
2.4.2.1. Polimorfismos en el gen timidilato sintasa (TS)
Uno de los mecanismos de acción del MTX es la inhibición de la enzima TS, lo que
provoca un agotamiento de la desoxitimidina trifosfato (dTMP), interrumpiendo así la
síntesis de novo de pirimidinas y conduciendo a roturas cromosómicas y muerte celular
(Welsh y cols., 2000).
Se ha identificado en la región promotora del gen TS un área polimórfica que contiene 2 o
3 repeticiones de 28 pb asociadas con un aumento de la expresión de la enzima, lo que se
cree que está ligado a una menor eficacia inhibidora del MTX (Horie y cols., 1995).
El genotipo TS 3R/3R (homocigoto para tres repeticiones) se ha asociado con un aumento
de la actividad transcripcional en ensayos in vitro. Sin embargo, en células tumorales no se
encontró ninguna relación con la actividad enzimática, en contraste con las células
39
Introducción
normales en las que 3R/3R se asoció con una actividad mayor que 2R/2R (de Jonge y
cols., 2009).
Krajinovic y cols. (Krajinovic y cols., 2002) estudiaron por primera vez el efecto de este
polimorfismo en niños con LAL tratados con MTX. Los pacientes homocigotos para la triple
repetición (genotipo 3R/3R) mostraron tener una mayor probabilidad de recaída o muerte
relacionada con la enfermedad. Después de este primer estudio, el mismo grupo de
investigación analizó los efectos combinados de este SNP con otros polimorfismos de la
ruta de los folatos en la misma cohorte de pacientes. Uno de ellos aparece en la ciclina D1
(CCND1), y su producto modula los niveles de TS (Li y cols., 1995).Se trata de una
transición silente A870G que resulta en una transcripción alternativa que codifica una
proteína CCND1 con una semivida aumentada. Los autores observaron que la
combinación de 3R/3R y el genotipo 870AA tenía un impacto más importante sobre el
resultado del tratamiento con MTX que el genotipo 3R/3R solo. Los portadores
homocigotos mutantes de los dos polimorfismos mostraron un 66% más de probabilidad de
supervivencia libre de eventos en 5 años en comparación con un 86% en otros grupos de
genotipos (Costea y cols., 2003). Por otra parte, la misma población fue reevaluada para
incluir en el análisis la presencia de polimorfismos en el gen DHFR, que pertenece a la
misma ruta relacionada con la TS y la CCND1. Los resultados revelaron que el riesgo de
un evento se incrementó aún más en presencia de ciertas combinaciones de mutaciones
en DHFR (Dulucq y cols., 2008).
El genotipo heterocigoto TS 2R/3R se ha asociado también con la eficacia del MTX en
enfermedades distintas a la LAL. Así, Robien y cols. evaluaron el riesgo de EICH aguda
asociado con la variación genética en receptores y donantes de genotipos en MTHFR y TS
en pacientes que recibieron MTX después de un trasplante de células hematopoyéticas en
casos de leucemia mielógena crónica. Además, se observó un aumento en la EICH aguda
entre los receptores cuyos donantes tenían el genotipo TS 2R/3R (Robien y cols., 2006).
40
Introducción
Por otra parte, también se ha identificado una deleción de 6 pb en el nucleótido 1494 en la
región 3' no traducida del gen TS (Ulrich y cols., 2000), que puede ser clínicamente
relevante.
Los individuos homocigotos para el alelo de la deleción han mostrado una mejor respuesta
terapéutica (Kumagai y cols., 2003). Esto podría ser explicado por la disminución de los
niveles de la enzima TS, ya que la mutación conlleva una menor expresión de ARNm en
las células tumorales (Ulrich y cols., 2000).
2.4.2.2. Polimorfismos en el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR)
El mecanismo principal del MTX implica la inhibición competitiva de DHFR, dando lugar a
un defecto en la regeneración de THF desde DHF, y que conduce a la falta de las
coenzimas de folato y el deterioro de la síntesis de purina y pirimidina. Un aumento en la
expresión de DHFR puede conferir un fenotipo resistente a MTX (Matherly y cols., 1995,
Patino-Garcia y cols., 2009); lo que sugiere que los polimorfismos genéticos, y en
particular los de las regiones reguladoras que afectan a la expresión de DHFR pueden
modular la respuesta farmacológica al fármaco.
Además, tanto en entornos experimentales como clínicos, los niveles alterados de esta
enzima se encuentran en pacientes que han sufrido recidiva y en células con fenotipo
resistente a MTX, lo que parece corroborar la hipótesis de que la DHFR puede
desempeñar un papel importante en el desarrollo de la resistencia al fármaco (Al-Shakfa y
cols., 2009).
En el estudio de asociación genética más importante de este gen, Dulucq y cols. (Dulucq y
cols., 2008) analizaron en niños con LAL la presencia de 15 SNPs en la región promotora
del gen DHFR y una mutación que consiste en una inserción/deleción de 19 bp en el intrón
1.
41
Introducción
Los pacientes con el genotipo317AA presentaron menor supervivencia libre de eventos.
Por el contrario, el alelo T del polimorfismo C-1610G/T se asoció con supervivencias
superiores. El estudio de haplotipos reveló 5 combinaciones alélicas. De éstas, el haplotipo
*1, conferiría una mayor actividad transcripcional y estaba asociada con SSC menores
(supervivencia sin complicaciones). El haplotipo *4 se relacionó con una reducción en la
aparición de eventos (recaída, fracaso de la inducción o muerte) y el haplotipo *5b se
asoció con una mayor frecuencia de aparición de eventos (Dulucq y cols., 2008). El mismo
grupo de investigación reevaluó estos resultados en más pacientes y confirmaron que el
haplotipo *1 seguía asociado a menor supervivencia y mayores niveles de expresión del
ARNm (Al-Shakfa y cols., 2009).
En la misma línea, Kodidela y cols. mostraron que el genotipo GG de la variante -317A >G
se asoció con un mayor riesgo de recaída en LAL y menor supervivencia global en
pacientes indios. Tanto la variante -317AA como la -680CA se asociaron también con la
aparición de leucopenia grave causada por MTX (Kodidela y cols., 2015).
En comparación con otros genes implicados en la ruta del folato, tales como TS y MTHFR,
los SNPs en el gen DHFR han atraído relativamente poca atención. Uno de estos SNPs, el
C829T, se ha demostrado que aumenta la expresión de DHFR (Goto y cols., 2001), y por
lo tanto podría estar implicado en la resistencia a MTX. Sin embargo, las implicaciones
clínicas de este polimorfismo no han sido todavía evaluadas.
El estudio de Dulucq y cols. ha demostrado que el efecto de los SNPs en DHFR
probablemente esté modulado por la presencia de SNPs en otros genes implicados en la
misma ruta, tales como TS o CCDN1 (Dulucq y cols., 2008).
42
Introducción
2.4.2.3. Polimorfismos en el gen de la serina hidroximetiltransferasa (SHMT1)
El gen SHMT1 codifica una enzima dependiente de la vitamina B6 que cataliza la
conversión reversible de serina a glicina y de THF a 5,10-metilen-THF(Girgis y cols.,
1997). Este último es un intermediario fundamental para la formación de las purinas por
ATIC, de pirimidinas por TS, y de 5-metil-THF por MTHFR. Las alteraciones genéticas que
afectan a la concentración intracelular de este compuesto podrían por tanto tener
consecuencias significativas para la homeostasis del folato, así como para los efectos de
los fármacos antifolatos tales como el MTX.
Los estudios iniciales han demostrado que el SNP SHMT1C1420T reduce los niveles de
folato en plasma en los portadores del alelo 1420C (Heil y cols., 2001), y podría conferir un
riesgo mayor de desarrollar LAL en adultos (Skibola y cols., 2002).
Sin embargo, un estudio retrospectivo en niños con LAL (Huang y cols., 2008) no halló
asociaciones clínicamente significativas.
Por otro lado, el genotipo 1420TC se ha asociado también con una menor tasa de
supervivencia al compararlo con el genotipo TT. El alelo menor en heterocigotos se
relacionó con una tasa de supervivencia reducida en niños con LAL, y con una posible
disminución de la respuesta a MTX (Lautner-Csorba y cols., 2013).
Dervieux y cols. observaron un hallazgo interesante respecto a la eficacia del MTX. El
genotipo 1420CC se relacionó con menores niveles de poliglutamatos en glóbulos rojos,
confiriendo por tanto una mayor probabilidad de respuesta terapéutica. La hipótesis de los
autores fue que el aumento de 5,10-metilen-THF por la variante 1420T también podría
aumentar la actividad ATIC y por lo tanto el nivel de MTX-PG necesario para lograr una
inhibición satisfactoria y la acumulación de AICAR que promueve la liberación de
adenosina antiinflamatoria. Estos resultados coinciden con los obtenidos previamente en
43
Introducción
pacientes con LAL portadores de 1420TT que presentaban una mayor resistencia al MTX
(de Jonge y cols., 2005).
Se han realizado pocos estudios dirigidos a determinar la utilidad clínica del polimorfismo
C1420T sobre los efectos del MTX, y los resultados son contradictorios. Una hipótesis es
que este polimorfismo fuera significativo sólo en asociación con SNPs en otras enzimas,
tales como TS, ATIC, o MTHFR que utilizan como sustratos unidades de carbono
generadas por SHMT1. De hecho, se ha publicado la existencia de una interacción entre
las variantes TS 3R y SHMT1 1420T respecto a la disminución del riesgo de LAL (Skibola
y cols., 2002).
Por otro lado, el alelo 1420G/A se ha encontrado asociado con una disminución de la
sensibilidad a MTX en pacientes pediátricos con LAL (Lautner-Csorba y cols., 2013).
Además, el alelo SHMT1 1420T y la variante TS 3R han demostrado tener un riesgo
menor de padecer LAL. Igualmente se han observado efectos protectores de la variante
SHMT1 1420CT y los portadores del alelo T (de Jonge y cols., 2009).
METIONINA
2.4.3.1. Polimorfismos en la metionina sintasa (MS)
El gen MS codifica una enzima dependiente de la vitamina B12 que cataliza la remetilación
de la homocisteína en metionina. La variación genética de esta enzima podría medir el
riesgo de padecer leucemia infantil, ya sea a través de los efectos sobre la metilación del
ADN o bien a través de los efectos sobre el crecimiento fetal y el desarrollo (Lightfoot y
cols., 2010).
44
Introducción
Se ha descrito una transición A2756G (Asp919Gly) (Leclerc y cols., 1996) cuyo efecto
funcional no se ha establecido, aunque algunos datos apuntan a una asociación con la
disminución de los niveles de homocisteína en plasma (Harmon y cols., 1999), sin que
falten tampoco otros datos discrepantes (Berkun y cols., 2007). La mayoría de los estudios
dirigidos a establecer una asociación entre este SNP y los efectos del MTX en pacientes
con LAL (de Jonge y cols., 2005, Huang y cols., 2008, Krajinovic y cols., 2005) no han
podido establecer un efecto relevante del mismo, aunque hay algunas excepciones. Por
ejemplo, un estudio mostró que los niños con genotipo GG tienen mayor riesgo de padecer
LAL y LMA (Lightfoot y cols., 2010). Asimismo, De Jonge y cols. (de Jonge y cols., 2009)
también señalaron que MS 2756G constituye un alelo de riesgo para la LAL en sí mismo.
Además, la relevancia de este SNP podría incrementarse cuando apareciera
simultáneamente con otros. Así, en combinación con SHMT1 1420CT/TT, los pacientes
con la variante MS 2756AG mostraron una reducción de 5,6 veces en el riesgo de LAL
(Skibola y cols., 2002). Mientras que la variante 2756G en combinación con el alelo
MTHFR 677T incrementaría el riesgo de LAL en adultos (de Jonge y cols., 2009).
2.4.3.2. Polimorfismos en metionina sintasa reductasa (MTRR)
La MTRR mantiene niveles adecuados de vitamina necesaria para la función de la enzima
MS. Wilson y cols. (Wilson y cols., 1999) describieron por primera vez el SNP más
relevante del gen, que consiste en una sustitución A>G en la posición 66. Como en el caso
anterior, el efecto funcional de esta mutación es controvertido (Gaughan y cols., 2001,
Jacques y cols., 2003). Así, Jonge y cols. Mostraron (de Jonge y cols., 2005) que este
SNP producía menor sensibilidad al MTX in vitro. Sin embargo, el mismo grupo holandés,
en aparente contradicción, observó más tarde que en un conjunto de 81 niños con LAL
tratados con altas dosis de MTX, el alelo 66G fue significativamente más frecuente en los
pacientes que experimentaban mucositis oral (Huang y cols., 2008).
45
Introducción
No parece haber relación sin embargo con la neurotoxicidad inducida por el fármaco,
según lo publicado en un estudio con pacientes pediátricos con LAL (Krajinovic y cols.,
2005).
Teniendo en cuenta todos estos trabajos contradictorios, con resultados negativos en su
mayoría, lo más probable es que el impacto clínico de los SNPs MS A2756G y
MTRRA66G sean más significativos en asociación con otros polimorfismos.
2.4.4. POLIMORFISMOS EN GENES IMPLICADOS EN EL TRANSPORTE DE MTX
No solo son importantes las alteraciones en los genes que codifican enzimas clave del
ciclo de los folatos, también lo son aquellas que afectan a los transportadores que
determinan las concentraciones intracelulares de MTX y sus metabolitos activos.
2.4.4.1. Transporte de captación
El transportador RFC, codificado por el gen SLC19A1 (Solute Carrier Family 19 Member 1)
juega un papel principal en la captación del MTX por la célula.
Moscow y cols. demostraron que RFC se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer,
principalmente en cáncer de mama y leucemia. Esta sobreexpresión produce una
citotoxicidad invitro incrementada debido a la mayor entrada de MTX en la célula, lo que
puede explicar la afinidad de estos receptores por los antifolatos (Moscow y cols., 1995).
Chango y cols. identificaron por primera vez en personas sanas un SNP común en la
secuencia del genSLC19A1 (G80A, Arg27His) y observaron que el alelo G está
relacionado con menores niveles de folato en plasma y niveles más altos de homocisteína
(Chango y cols., 2000). Esto indicaría presumiblemente un incremento en la capacidad de
absorción de MTX por el transportador SLC19A1 en los portadores del alelo 80G en
46
Introducción
comparación con portadores de la variante 80A. Por lo que, niveles altos de MTX
intracelular interrumpirían la homeostasis del folato, disminuyendo los niveles de 5-metil-
THF necesario para la remetilación de la homocisteína.
Debido a que la homeostasis del folato y la homocisteína se ven afectados por la acción
del MTX, es posible que este SNP también pueda modular el resultado en pacientes
tratados con el fármaco. De hecho, en niños con LAL, la variante 80A se ha relacionado
con un peor pronóstico (Laverdiere y cols., 2002).
Por el contrario, Dawidowska y cols. mostraron recientemente que el alelo 80A está
asociado con una mejor respuesta al tratamiento con MTX y un mejor resultado en LAL
Pacientes con genotipo AA presentaron mayores niveles plasmáticos de MTX que
pacientes con otros genotipos, especulándose sobre la posibilidad de que la absorción
intracelular alterada pueda deberse a la menor afinidad de la variante resultante de la
proteína RFC con MTX (Dawidowska y cols., 2016).
Los pacientes portadores del alelo polimórfico SLC19A180A mostraron un mayor
porcentaje de folato extracelular en relación con el folato intracelular (Yates y Lucock,
2005). De manera similar, el folato plasmático medio fue ligeramente mayor en sujetos
sanos que portaban la variante 80AA. Los portadores del 80A podrían tener menor
captación de folato o metotrexato (MTX), lo que podría aumentar el riesgo de LAL y
disminuir la eficacia del fármaco. Además, se ha asociado con toxicidad antifolato en niños
con LAL (Kishi y cols., 2007), aunque no se ha podido demostrar una alteración de la
sensibilidad (de Jonge y cols., 2005) al fármaco o toxicidad (Huang y cols., 2008) asociada
con este polimorfismo.
Con respecto a la toxicidad inducida por MTX, algunos estudios apuntan al alelo 80A como
un marcador del aumento de la incidencia de eventos adversos. Por ejemplo, se observó
hepatotoxicidad asociada al alelo 80A en un pequeño grupo de 26 niños japoneses con
LAL y linfoma maligno tratados con altas dosis de MTX (Imanishi y cols., 2007).
47
Introducción
Otros dan a la variante 80A un papel opuesto. Así, Shimashaki y cols. encontraron que en
niños con neoplasias hematológicas tratados con MTX a dosis altas, el vómito fue menos
pronunciado en los pacientes que tenían más alelos A (Shimasaki y cols., 2006). Sin
embargo, este estudio sólo analizó 15 sujetos japoneses. Los mismos autores no pudieron
reproducir estos resultados en quimioterapia de mantenimiento con MTX semanal y
mercaptopurina diaria (Shimasaki y cols., 2008).
Otros trabajos no han sido capaces de mostrar relación entre el polimorfismo RFC1 80G>A
y el riesgo de linfoma no Hodgkin, defectos del tubo neural y cáncer de colon (de Jonge y
cols., 2009).
Además del polimorfismo G80A, existen otros SNPs en el gen SLC19A1 que podrían ser
evaluados en futuros estudios. De especial interés son T2582G y C2617T, localizados en
la región no traducida 3´, identificados en pacientes con osteosarcoma (R. Yang y cols.,
2008), y T43C, ubicado en la región flanqueante 5´del gen e identificado en el ADN
genómico de pacientes con AR (Chatzikyriakidou y cols., 2007). Los tres han demostrado
reducir la expresión de SLC19A1 y por lo tanto tener el potencial de alterar la absorción de
MTX y modificar su toxicidad o eficacia.
Otros transportadores de interés son el SLC01A2 y el SLC01B1. Las variantes genéticas
del primero pueden afectar al transporte de MTX (Badagnani y cols., 2006). Por ejemplo, el
SNP Glu172Asp produce una pérdida significativa de la expresión SLC01A2, mostrando un
40% de reducción de la absorción del fármaco en ovocitos. En contraste, el polimorfismo
Ile13Thr ha demostrado duplicar la capacidad de transporte (W. Lee y cols., 2005). Estos
SNP podrían producir una modulación in vivo de la reabsorción de MTX con implicaciones
clínicas (Badagnani y cols., 2006). El segundo ha demostrado ser capaz de transportar
MTX in vitro (Abe y cols., 2001) en ratones transgénicos (van de Steeg y cols., 2009). Se
han identificado algunas variantes genéticas y funcionales en el SLC01B1 que podrían
48
Introducción
afectar a la farmacocinética del MTX y por lo tanto modular la respuesta a determinados
fármacos (Tirona y cols., 2001). Este gen se ha asociado con el aclaramiento de MTX a
alta dosis y con su toxicidad. El SNP rs4149056 demostró haber reducido la capacidad de
afluencia del fármaco (Mlakar y cols., 2016)}.
2.4.4.2. Transporte de eflujo
El MTX se expulsa de la célula por una serie de transportadores de membrana que son
miembros de la familia ABC (ATP-binding cassette). Por lo tanto, los polimorfismos
funcionales capaces de obstaculizar la capacidad de transporte de estas proteínas podrían
modificar las concentraciones intracelulares de MTX y consiguientemente influir en la
toxicidad y la eficacia relacionada con el fármaco.
Para el gen ABCC1 no hay información del efecto de su variabilidad en pacientes con LAL.
Si que existen datos, sin embargo, para otras enfermedades. Así, se ha afirmado que la
expresión y la función de ABCC1 están inhibidas en pacientes con AR tratados con MTX
(Assaraf y cols., 2003, Hider y cols., 2006). Sobre la base de esta observación,
Ranganathan y cols. evaluaron el impacto de los polimorfismos ABCC1 conocidos sobre la
toxicidad relacionada con el fármaco en pacientes con AR. Se analizaron los polimorfismos
G4002A, IVS 14115 C> T y IVS 18-30 C> T, pero ninguno de ellos mostró un efecto
considerable (Ranganathan y cols., 2008). Los datos obtenidos in vitro también han
demostrado que el polimorfismo C218T reduce la resistencia a MTX, aunque no parece
tener ningún efecto sobre el tráfico y la expresión de ABCC1.
Un amplio estudio ha evaluado conjuntamente la influencia de las variaciones genéticas en
el gen sobre el resultado del tratamiento con MTX en psoriasis. Con respecto a la eficacia,
3 de los 40 SNPs estudiados (rs28364006, rs2238476, y rs35592) se asociaron con la
respuesta al fármaco. El más significativo fue el rs35592, cuyos portadores homocigotos
49
Introducción
del alelo wild-type mostraron 2,2 veces más probabilidad de tener una mejor respuesta a
MTX. En cuanto a la toxicidad, 6 SNPs (rs11075291, rs1967120, rs3784862, rs246240,
rs3784864, y rs2238476) tuvieron una asociación significativa con la aparición de eventos
adversos (Warren y cols., 2008).
En relación al gen ABCC2, Rau y cols. (Rau y cols., 2006) estudiaron la presencia de
SNPs en voluntarios sanos, y después analizaron la asociación de los mismos con las
concentraciones plasmáticas de MTX en pacientes pediátricos con LAL en un régimen de
dosis altas. Los autores describieron 5 nuevos polimorfismos, de los cuales el C24T se
asoció en niñas con un área bajo la curva dos veces más alta 36-48 horas tras la infusión
del fármaco. Además, el riesgo de tener dos o más ciclos que exigen una intensificación
del rescate con folinato (ácido folínico) fue mucho mayor en mujeres portadoras de al
menos un alelo 24T. Sin embargo, este estudio sólo incluyó a 15 pacientes de sexo
femenino, lo que puede ser una de las razones por las que un estudio posterior no apoyó
el mencionado efecto de la sustitución C24T (Ranganathan y cols., 2008), si bien éste se
realizó en pacientes de artritis reumatoide y no de leucemia. Este estudio identificó 3 SNPs
relacionados con la toxicidad inducida por MTX: un cambio de base de T a C en el intrón
IVS 23+56, C1249A y G1058A.
Además, se ha publicado un caso clínico que pone en relieve la importancia del ABCC2
para la excreción de MTX en los seres humanos. El paciente, que presentaba linfoma de
células B y estaba siendo tratado con altas dosis de MTX, mostró una reducción de 3
veces en la tasa de eliminación del fármaco, que se asoció con toxicidad grave. El sujeto
era heterocigoto para el SNP A1271G (Arg412Gly). Esta mutación producía la síntesis de
una proteína afuncional (Hulot y cols., 2005).
Estos datos parecen indicar que los SNPs del gen ABCC2 deberían ser considerados junto
con los del gen ABCC1 a la hora de evaluar los efectos clínicos de los mismos en las
terapias con MTX en leucemia.
50
Introducción
El efecto de los fármacos depende, entre otros factores, de la actividad y expresión de
proteínas relacionadas con la resistencia a múltiples drogas (MRP).
ABCC4 presenta una gran capacidad para transportar fármacos y sustratos fisiológicos. Se
expresa altamente en células hematopoyéticas, afectando a la disposición de folatos y
también de MTX y 6-MP, utilizados en el tratamiento de la LAL. Además, protege a las
células de la toxicidad inducida por tiopurinas.
Los individuos con genotipo T1393C han demostrado teneruna mayor supervivencia libre
de eventos (EFS).
El alelo 1393C se ha asociado con una mayor EFS y con menores niveles plasmáticos de
MTX después de ser administrado a altas dosis. La elevada actividad de ABCC4 en el
riñón asociada al alelo 1393C podría explicar no solo los niveles inferiores de MTX sino la
ausencia de toxicidad.
Por otro lado, y en relación al genotipo CA934, se ha asociado a una EFS reducida y
también a un aumento en la frecuencia de trombocitopenia de alto grado (Ansari y cols.,
2009).
El transportador ABCG2 está involucrado en el transporte de MTX-PG (Volk y Schneider,
2003). Estudios in vitro han demostrado que un cambio de aminoácido en la secuencia de
la proteína (Arg482Gly/Thr) inhibe totalmente el transporte de MTX por ABCG2 en las
células cancerosas (Mitomo y cols., 2003). Hay que resaltar que el efecto sobre el
transporte de los poliglutamatos del MTX no se ha analizado todavía. De la misma manera
no hay resultados en pacientes con leucemia, solo un estudio en psoriasis reveló que la
capacidad de expulsión del transportador se puede ver reducida por la presencia de SNPs
en la secuencia del ADN, dando lugar a la acumulación intracelular de metabolitos activos
(Warren y cols., 2008).
51
Introducción
Otro miembro de la familia de transportadores ABC es el ABCB1, que codifica la
glicoproteína P (Pgp). Todavía no está claro si el MTX es o no un sustrato de la Pgp. A
este respecto, un estudio inicial observó que las células leucémicas mostraban un
aumento de expresión de Pgp, produciendo de este modo resistencia a MTX mediante la
limitación de la acumulación intracelular del fármaco, apoyando la idea de que el MTX es
transportado por Pgp (Hooijberg y cols., 1999).
Se han identificado numerosos polimorfismos que afectan a la actividad de este
transportador (Marzolini y cols., 2004). De ellos, el C3435T se ha relacionado con una
mala respuesta a MTX en pacientes con AR (Sharma y cols., 2008, Takatori y cols., 2006),
lo que sugiere que la Glicoproteína P (Pgp) mutada tendría una mayor capacidad
transportadora en portadores homocigotos mutantes. Estos resultados contradicen otros 3
estudios realizados en pacientes con la misma enfermedad. En primer lugar, Pawlik y cols.
(Pawlik y cols., 2004) describieron cómo los portadores del genotipo 3435TT mostraban
una mejor respuesta al fármaco. Esta misma hipótesis fue apoyada por Drozdzik y cols.
quienes observaron una mayor probabilidad de remisión de los síntomas en los portadores
del genotipo TT (Drozdzik y cols., 2006). Sin embargo, Bohanec Grabar y cols. no lograron
encontrar ninguna asociación para este SNP (Bohanec Grabar y cols., 2008). Este último
trabajo relacionó como la aparición de efectos adversos asociados al MTX fue más
frecuente en portadores del genotipo 3435TT.
El ABCB1-3435C> T se asoció con mayor riesgo de neutropenia en niños libaneses que
padecían LAL y con anemia y trombocitopenia en una población danesa (Mlakar y cols.,
2016).
Recientemente se ha observado en niños mexicanos que este SNP aumenta el riesgo de
LAL en sujetos que presentan el genotipo TT (Zaruma-Torres y cols., 2016).
El polimorfismo ABCB1 más estudiado en relación con el MTX, el C3435T, no produce
cambios de aminoácidos en la secuencia de la proteína. Si bien esto no descarta por
52
Introducción
completo un efecto funcional, no debe descartarse tampoco que las asociaciones
relacionadas con la toxicidad del MTX puedan ser debida a otros SNPs no sinónimos que
coexisten en desequilibrio de ligamiento (por ejemplo G2677T /A).
El cambio C1236T en el exón 12 del gen ABCB1 también se ha asociado con una mayor
toxicidad global en pacientes con AR (incluyendo efectos GI, efectos secundarios
pulmonares, alopecia, hepatotoxicidad, leucopenia, estomatitis, dolor de cabeza y erupción
cutánea) (Ranganathan y cols., 2008).
Finalmente, las variantes 2677GG, 3435CC y 2677G-3435C han mostrado una reducción
significativa de la EFS (superviviencia libre de eventos) en pacientes orientales (Y. L. Yang
y cols., 2010).
53
3. OBJETIVOS
54
Objetivos
3. OBJETIVOS
En las últimas décadas, la quimioterapia ha alcanzado tasas de éxito de hasta un 90% en
los países occidentales (Eden, 2002). A ello ha contribuido, entre otros factores, la
implementación de la terapia de mantenimiento con 6-mercaptopurina diaria (6MP) y
metotrexato semanal (MTX) durante varios años después de la remisión (Holland y
Glidewell, 1972, Rivera y cols., 1993, Simone, 1980). Sin embargo, este tratamiento tiene
varios inconvenientes. Uno de ellos es la amplia variabilidad interindividual observada en la
biodisponibilidad de los fármacos, lo que conduce a ajustes continuos de la dosis y
también a interrupciones del tratamiento debido a la toxicidad. Además, no hay consenso
internacional sobre qué dosis iniciales deben usarse, cómo modificarlas con el fin de
obtener la mielosupresión dirigidao cuál es el método más adecuado para evaluar la
intensidad de la terapia (Schmiegelow y cols., 2016).
Un factor que tiene el potencial de ser útil para adaptar el tratamiento, y la dosificación de
MTX en particular, es la variabilidad genética (Gervasini, 2009, Gervasini y Vagace, 2012,
Pui, 2015).
La presencia de variantes genéticas en la ruta del metabolismo del folato puede jugar un
papel importante en relación a los ajustes de dosis de metotrexato y la toxicidad inducida
por algunos fármacos utilizados en la terapia de mantenimiento en población infantil con
leucemia aguda linfoblástica.
Los objetivos específicos de esta tesis son:
1. Selección y purificación de ADN genómico de pacientes con leucemia aguda
linfoblástica.
2. Caracterización de los pacientes mediante la extracción de datos clínicos de sus
historias clínicas.
3. Análisis de las variantes genéticas recogidas en la Tabla 7.
55
Objetivos
4. Estudio comparativo de las frecuencias alélicas, genotípicas y haplotípicas.
5. Estudio del impacto de las variantes consideradas sobre la dosificación, eficacia
y toxicidad de la terapia de mantenimiento en pacientes pediátricos con leucemia
linfoblástica aguda.
56
4. PACIENTES, MATERIALES Y
MÉTODOS
57
Pacientes, Materiales y Métodos
4. PACIENTES, MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. SELECCIÓN DE PACIENTES Y DISEÑO DEL ESTUDIO
Los participantes en el estudio fueron 41 pacientes diagnosticados de LAL-B y LAL-T en el
Hospital Materno Infantil (Badajoz), 17 hombres y 24 mujeres, con edades comprendidas
entre 1 y 14 años, y tratados con los protocolos SHOP05y SEHOP / PETHEMA 2013,entre
2004 y 2016. Los pacientes fueron asignados a grupos de riesgo estándar (RE), intermedio
(RI) o alto riesgo (RA), según edad, recuento de glóbulos blancos, resultados
citogenéticos, inmunofenotipo de leucemia y respuesta al tratamiento.
Según los protocolos, el tratamiento incluye fases de inducción, consolidación,
intensificación y mantenimiento, dependiendo del grupo de riesgo al que pertenezca el
paciente (Figura 2).
Durante la etapa de mantenimiento se administraron 60 mg/m2diarios de 6-MP y 20
mg/m2semanales de MTX. Las dosis de 6-MP sólo se modificaron cuando los niveles de
aminotransferasas superaron las 500 UI/L, y las de MTX se ajustaron hasta obtener un
recuento de leucocitos entre 2,0-3,0 109 / L.
La terapia de mantenimiento se inició en la semana 14 en el grupo de riesgo estándar, en
la semana 20 en el grupo de riesgo intermedio y en la semana 32 en el grupo de alto
riesgo y se prolongó en todos los casos hasta los dos años del diagnóstico.
Se realizaron controles clínicos y analíticos en todos los pacientes cada 15 días o con
frecuencia semanal en caso de toxicidad. El estudio fue aprobado por el Comité de
Bioética de la Universidad de Extremadura. Además, se obtuvo el consentimiento
informado por escrito de todos los representantes legales de los pacientes pediátricos.
El trabajo realizado se divide en dos partes. Por un lado se han estudiado polimorfismos
en genes involucrados en las vías metabólicas en las que está implicado el ácido fólico y
58
enzimas sobre las que actúa el MTX (Tabla 7). Obteniéndose resultados estadísticamente
significativos en regiones reguladoras del gen dihidrofolato reductasa (DHFR), objetivo
prioritario del MTX una vez dentro de la célula. El mecanismo principal del fármaco implica
la inhibición competitiva de la enzima DHFR. Se han analizado tres SNPs en la región
promotora de este gen (C-1610G, C-680G/T y A-317G) y una mutación consistente en una
inserción/deleción de 19 bp en el intrón 1. Los genotipos se han examinado en relación
con la dosis y la toxicidad del MTX.
Por otro lado, y teniendo en cuenta que no sólo son relevantes las alteraciones en los
genes que codifican enzimas del ciclo de los folatos, sino también aquellas que afectan a
los transportadores que determinan las concentraciones intracelulares del fármaco, se han
evaluado diez SNPs en el transportador de captación RFC (codificado por el gen
SLC19A1) y en los transportadores de eflujo ABCB1, ABCC2, ABCC4 y ABCG2 (SLC19A1
G80A; ABCB1 C3435T, G2677 T/A y C1236T; ABCC2 C-24T, G1249A y IVS 23+56 T>C;
ABCC4 T-1393C y C934A y ABCG2 C421A), con el objetivo de determinar si los
polimorfismos en los genes que codifican las proteínas encargadas del transporte de
fármacos pueden influir en la dosificación, la eficacia y la toxicidad de la terapia de
mantenimiento con MTX y 6-mercaptopurina(6MP) en pacientes con leucemia aguda
linfoblástica (LAL) infantil.
Los resultados obtenidos se han plasmado en dos artículos consecutivos que pueden
consultarse en el Anexo III.
4.2. EVALUACIÓN CLÍNICA DE LOS PACIENTES
Todos los pacientes fueron diagnosticados siguiendo el mismo protocolo diagnóstico
(Anexo II).
59
Durante el mantenimiento, en cada una de las consultas quincenales se registraron los
principales datos clínicos, analíticos y de toxicidad del paciente en una base de datos
Excell. Estos registros se revisaron retrospectivamente una vez finalizado el tratamiento,
con el objetivo de recuperar datos de dosificación de MTX y parámetros de toxicidad, así
como analizar su asociación con los distintos genotipos estudiados.
Entre los datos analizados en la etapa de tratamiento de mantenimiento en los pacientes
con LAL, destacan:
a. Al inicio del diagnóstico: % de blastos, hepatoesplenomegalia y masa
mediastínica.
b. Número de controles realizados a los pacientes en rango terapéutico (WBC
= 2,0-3,0 109 / L).
c. Número de controles realizados a los pacientes fuera de rango
terapéuticoValores medios: leucocitos, neutrófilos, linfocitos y hemoglobina.
d. Dosis teórica y dosis realmente prescrita de MTX y 6-MP encontrándose
los pacientes en rango terapéutico.
e. Dosis teórica y dosis realmente prescrita total de MTX y 6-MP.
f. Complicaciones presentadas: hematológicas, infecciosas, respiratorias,
digestivas, metabólicas, hematológicas y hepáticas.
g. Eventos relacionados con la toxicidad (identificados y clasificados usando
los Criterios Terminológicos Comunes para Eventos Adversos - CTCAE
versión 4.0.): hematológicos [leucopenia, neutropenia, trombopenia,
anemia], hepáticos [enzimas hepáticas, bilirrubina], metabólicos [glucemia,
LDH, creatinina, urea] y PCR>5.
4.3. ESTUDIO DE LABORATORIO
60
4.3.1. REACTIVOS
 Proteinasa K (Roche).
 SDS (Panreac).
 Fenol (Merck).
 Cloroformo (Merck).
 Isoamilalcohol(Merck).
 Isopropanol(Merck).
 Solución TE (Sigma Aldrich).
 Tris (Merck).
 Taq Polimerasa (Bioline, Ecogen).
 dNTP master mix (Ecogen).
 Oligonucleótidos (Thermo Fisher).
 Enzimas de restricción (Fermentas).
 Agarosa (Pronadisa).
 Bromuro de etidio 10 mg/ml (Sigma Aldrich).
 Cloruro de Magnesio (Sigma Aldrich).
 Ácido Bórico (Sigma Aldrich).
 8-hidroxiquinoleína (Sigma Aldrich).
 Tampón de Hemólisis 10x (1 litro).
o 82,9 g NH4Cl (Merck).
o 10 gKHCO3 (Merck).
o 2 ml EDTA 0.5 M (SIGMA).
 Tampón S.E. (pH 8).
o NaCl 75 mM (Merck).
o EDTA 25 Mm (Sigma Aldrich).
61
4.3.2. MATERIALES
 Termociclador de 96 pocillos con gradiente G-storm (Gene technologies).
 Baño con termostato Precisterm (P-selecta).
 Centrífugas: Megafuge 1.0R(Heraeus instrumenTS) y 5804 (Eppendorf).
 Tubos de centrífuga Falcon de 15 y 50 ml de capacidad.
 Campana de flujo laminar.
 Multiagitador magnético A-07 (SBS).
 Agitador y calentador Agimatic-E (P-selecta).
 Vórtex (VWR).
 pHmetro Crison Meterbasic 20+.
 Balanza Precisa 1000C-3000D.
 Estufa Heraeus b-5050 (Heraeus instrumenTS).
 Autoclave Presoclave 75 (P-selecta).
 Sistema de purificación de agua Ecomatic y Ultramatic (Wasserlab).
 Mechero Bunsen.
 Máquina de hielo Savoid IS-ZBJ.
 Trituradora de hielo Princess 2986TE.
 Agitador Heidolph Reax-2.
 Cámaras de electroforesis (Laboratorios Ecogen).
 Fuente de alimentación Apelex PS-304 para cámaras de electroforesis.
 Aparato de fotodocumentación Transiluminator Quantum ST4.
 Pipetas Eppendorf (1-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 100-1000 μl).
 Material de vidrio diverso (VWR).
4.3.3. MÉTODOS ANALÍTICOS
62
4.3.3.1. Protocolo para la purificación de ADN genómico a partir de sangre entera
Para el estudio de genotipación se extrajeron muestras de sangre (10 ml) de cada
individuo en tubos de vidrio estériles con EDTA (Venoject, TerumoEurope N.V. 3001
Leuven, Bélgica) y se congelaron a -80ºC hasta su utilización. El ADN genómico se obtuvo
de los leucocitos de la sangre extraída (Neitzel, 1986)tal y como se describe a
continuación:
1. Descongelar la sangre a temperatura ambiente durante 45 minutos.
2. Depositar 10 ml de sangre en tubos de centrífuga de 50 ml sin faldón y añadir 3
volúmenes de tampón de hemólisis. Agitar los tubos a 5 rpm durante 20 minutos.
3. Centrifugar la sangre a 3.000 rpm durante 10minutos a 4ºC con el fin de que los
leucocitos sedimenten. En el sobrenadante quedan proteínas y restos de eritrocitos
que se descartan mediante decantación.
4. Añadir 15 ml más de tampón de hemólisis al sedimento leucocitario. Volver a agitar
durante otros 20 minutos y centrifugar a 3.000 rpm durante 10 minutos. Una vez
finalizada la centrifugación, eliminar mediante decantación el sobrenadante.
5. Añadir 3 ml de solución S.E. al sedimento de leucocitos.
6. Añadir a esta suspensión 200μl de Proteinasa K (10 mg/ml) y 200μl de S.D.S. al 20
%.
7. Agitar los tubos a temperatura ambiente durante 8-24 horas a 5 rpm.
8. Añadir 5ml de fenol (pH>7.8) y, suavemente, agitar los tubos durante 20 minutos.
Posteriormente centrifugar a 3.000rpm durante 10 minutos.
9. Después de la centrifugación se observarán dos fases claramente diferenciadas.
Extraer la fase acuosa (superior) y depositar en otro tubo estéril.
10. En la fase acuosa añadir 5 ml de una mezcla de fenol/cloroformo (1:1). Agitar
durante 10 minutos y centrifugar en las mismas condiciones del paso anterior. La
63
fase acuosa que vuelve a quedar en la parte superior se pasa de nuevo a otro tubo
estéril.
11. Añadir a esta fase acuosa otros 5 ml de cloroformo/isoamilalcohol (24:1). Mezclar
en el agitador y centrifugar a 3.000 rpm durante 10 minutos. Extraer la fase
superior o acuosa y pasar a un nuevo tubo estéril.
12. Añadir 5ml de isopropanol a temperatura ambiente para que precipite el ADN.
13. Mezclar bien ambas fases, sin movimientos bruscos, hasta la formación de un
flóculo que será el ADN genómico. Extraer dicho flóculo con una pipeta Pasteur y
lavar con etanol 70% a -20ºC.
14. Los restos de etanol que quedan en el ADN se evaporan en una campana de vacío
durante 30 minutos.
15. Añadir 500 μl desolución T.E. y almacenar el ADN a 4ºC hasta su procesamiento.
La concentración de ADN y su pureza se determina midiendo la absorbancia en el
espectrofotómetro según el siguiente procedimiento:
 Añadir 700 μl de solución T.E. en una cubeta de cuarzo de 1 ml.
 Medir la absorbancia a 260 nm y a 280 nm.
 Añadir 5 μl de ADN y volver a medir la absorbancia a las longitudes de onda
señaladas.
 Añadir otros 5 μl de ADN a la cubeta y repetir las mediciones.
 Calcular la relación A260/A280. Un valor situado entre 1.82-2 indica que el ADN es
puro. Si los valores quedan por debajo de este rango hay que volver a purificar el
ADN.
El factor de dilución empleado es de 705/5 (=141) y 710/10 (=71), por lo tanto se multiplica
la densidad óptica A260 por 141 o por 71 y el resultado se multiplica por 50 (una A260 de
1000 equivale a 50 μg/ml de ADN genómico) para obtener la concentración de ADN en
μg/ml.
64
4.3.3.2. Protocolo para la precipitación de productos de PCR
En algunas digestiones enzimáticas es necesario precipitar el amplicón resultante de la
PCR para eliminar restos de buffer de la reacción de amplificación que pueden interferir
con la actividad endonucleasa de la enzima. Se realiza de la siguiente manera:
 Añadir a cada muestra de 20 μl de producto de PCR 60,46 μl de mezcla de
precipitado (15,5 μl MgCl2 2 Mm + 44,96 μl etanol 100%).
 Agitar brevemente en el vórtex.
 Dejar 10 minutos en hielo.
 Centrifugar 10 minutos a 13.000 rpm.
 Aspirar el sobrenadante.
 Dejar secar en campana de vacío durante 15 minutos.
 Añadir 5 μl de agua purificada.
 Agitar en el vórtex durante 30 segundos.
4.3.3.3. Análisis genéticos
Inicialmente, para analizar la presencia de las variantes genéticas de estudio en los sujetos
participantes se realizaron amplificaciones por PCR (Reacción en Cadena de la
Polimerasa). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μl y la mezcla
de reacción fue igual para todos los polimorfismos estudiados, a excepción de la adición
de DMSO (diluido 1:10) en las determinaciones de los polimorfismos DHFRA317G y TS
2R/3R, y la adición de Mg2+ a una concentración de 35 mM en la determinación del
polimorfismo ABCC4 T1393C.
Dicha mezcla estaba compuesta por:
- 2 μl de cada oligonucleótido (Fw y Rv).
65
- 5 μl de tampón de amplificación 5x.
- 0,25 μl de Taq polimerasa.
- 200-400 ng de ADN.
- agua estéril hasta completar 25 μl.
Los oligonucleótidos utilizados y el tamaño de banda resultante se detallan en la Tabla 6.
Asimismo, las condiciones de las diferentes PCR una vez se optimiza la amplificación
utilizando gradiente de temperaturas fueron las que quedan recogidas en las Figuras 7 a
27. En los casos en los que se necesitó realizar una digestión enzimática para determinar
el polimorfismo, los productos de PCR obtenidos se sometieron a un proceso de
purificación con etanol que eliminó los oligonucleótidos no incorporados y los componentes
del tampón de amplificación. Tras esto, los amplicones se incubaron con sus
correspondientes enzimas de restricción y los fragmentos resultantes se migraron
mediante electroforesis en gel de agarosa entre el 1,2% y el 4%. Las condiciones de las
digestiones enzimáticas se resumen en las Figuras 7 a 27.
Tabla 6. Resumen de oligonucleótidos utilizados en los análisis genéticos
AMPLICÓN
POLIMORFISMO OLIGONUCLEÓTIDO (5'-3')
(bp)
TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA

MTHFR C677T 198bp
AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG
CAA GGA GGA GCT GCT GAA GA
MTHFR A1298C 128bp
CCA CTC CAG CAT CAC TCA CT
GTG GCT CCT GCG TTT CCC CC
*2=220bp
TS*3R CCA AGC TTG GCT CCG AGC CGG CCA CAG
*3=250bp
GCA TGG CGC GG
ATT ACA ACA GGT CGT ACA ATT ATG GC
TS 1494del6 CTT TAT TAT AGC AAC ATA TAA AAC AAC TAT 673bp
AAC T
DHFR 19 bp ins/del ATG GGA CCC AAA CGG GCG CA ins=137bp
66
AAA AGG GGA ATC CAG TCG G del=118bp
GCA GCT TTC TTC TAG TCA CCC

DHFR A317G 400bp
GTA GGT TCT GTC TGG GAC TGG
CAT ACA TAA GTC CTT CAC CAG C
DHFR C680A 464bp
GCA GTC ATA TTG TGC AGT TCC
AGA GTT CAA GGA GAG ACT GGC AG
SHMT1 C1420T 217bp
GTC AAC AGT TCC CTT TGG AGC
TGT TCC CAG CTG TTA GAT GAA AAT C
MS A2756G 211bp
GAT CCA AAG CCT TTT ACA CTC CTC
GCA AAG GCC ATC GCA GAA GAC AT
MTRR A66G 182bp
TGG TGG TAT TAG TGT CCT TTT G
GTG AAG TTC ATT TCC AAT CCG C
CCND1 A870G 167bp
GGG ACA TCA CCC TCA CTT AC
AGT GTC ACC TTC GTC CCC CTC
RFC1 G80A 230bp
CTC CCG CGT GAA GTT CTT
TCT CAG GCA AAT AGA ACT TTT GAA
ABCC2 C24T 663bp
TGT AAT TTC TCA CCC AAA AAG TAG A
ABCC2 IVS 23+56 CTG CTG AAC AAT ATC CTT CGA GC
117bp
T/C CTT CTT CAC TAG ATG CTG AGC
TGA GCT TCC TCT TCT ACT CCC T
ABCC2 G1249A 417bp
CCC AAA CTC CCA TTA AGA ATT AGA
CCT TGT TAA GGT AGC CAC AG
ABCC4 T1393C 312bp
ACG CCC GAC CAA TTA TCT CA
GTG GTG AAG GTC ACA AAC AC
ABCC4 CA934 268bp
CAC CTC TCA CCT TTG CAC TT
GGC TTT GCA GAC ATC TAT GGA G
ABCG2 C421A 596bp
GCA TAA GGA AAG GCC AGG TG
TGT TTT CAG CTG CTT GAT GG
ABCB1 C3435T 250bp
CAT GCT CCC AGG CTG TTT AT
TCC TGT GTC TGT GAA TTG CCT TG
ABCB1 C1236T 225bp
GCT GAT CAC CGC AGT CTA GCT CGC
GCA GGC TAT AGG TTC CAG GCT
ABCB1 2677GG 320bp
TGA GGA ATG GTT ATA AAC ACA T
67
Tabla 7. Polimorfismos genéticos estudiados
GEN SNPs Rs Cambio aa
C677T rs1801133 Ala222Val

MTHFR
A1298C rs1801131 Glu429Ala
2R/3R rs34743033 -
TS
1494del6pb rs34489327 -
19 bp ins/del rs70991108 -
A-317G rs408626 -
DHFR
C-680A rs442767 -
C-1610M rs1650694 -
SHMT1 C1420T rs1979277 Leu474Phe
MS MTR A2756G rs1805087 Asp919Gly
MTRR A66G rs1801394 Ile22Me
CCND1 A870G -
SLC19A1 RFC1 G80A rs1051266 Arg27His
C-24T -
ABCC2 MRP2 IVS 23+56 T>C -
G1249A -
T-1393C -
ABCC4 MRP4
C934A -
ABCG2 BCRP C421A rs2231142 Arg482Gly/Thr
C3435T rs1045642 -
ABCB1 MDR1 C1236T rs1128503 -
G2677T/A rs2032582 Ala893Ser/Thr
4.3.3.3.1. Esquemas de determinación de polimorfismos estudiados
En las siguientes figuras se detallan las condiciones de las reacciones de amplificación, así
como los patrones resultantes tras las digestiones enzimáticas, en su caso.
68
Figura 7. Detección del polimorfismo MTHFR C677T
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN MTHFR C677T
94o 94o EXTENSIÓN RETENCIÓN
CC CT TT
3´ 30´´ 72o 72o
ANNEALING
30´´ 7´ -198 -198
60o
30´´ -175 -175
30x -23 -23

Hinf I (Fast Digest)
Figura 8. Detección del polimorfismo MTHFR A1298C
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
MTHFR A1298C
3´ 30´´ 72o 72o AA AC CC

ANNEALING
30´´ 7´
61o -100 -100
20´´
-72 -72
30x -28 -28 -28
MbO II (Fast Digest)
Figura 9. Detección del polimorfismo TS 2R/3R
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
5´ 1´ 72o 72o
ANNEALING
2´ 5´
60o
1´
30x
69
Figura 10. Detección del polimorfismo TS1494del6
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 7´
60o
45´´
35x
Figura 11. Detección del polimorfismo DHFR A317G
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
DHFR A317G
AA AG GG
5´ 45´´ 72o 72o
ANNEALING
45´´ 7´ -266 -266 -266
53o
45´´ -134 -134
40x -83 -83
-51 -51
Figura 12. Detección del polimorfismo DHFR C680A
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
DHFR C680A
3´ 30´´ 72o 72o CC CA AA

ANNEALING
30´´ 7´
64o -378 -378
30´´
-250 -250
35x
-128 -128
-86 -86 -86
70
Figura 13. Detección del polimorfismo SHMT1 C1420T
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
SHMT1 C1420T
CC CT TT
3´ 30´´ 72o 72o
ANNEALING
30´´ 7´
-217 -217
64o
-131 -131
30´´
-86 -86
35x
Eam 1104I
Figura 14. Detección del polimorfismo MS A2756G
MS A2756G
PRECALENTAMIENTO AA AG GG
DESNATURALIZACIÓN

-211 -211
2´ 30´´ 72o 72o -131 -131
ANNEALING
30´´ 5´
60o -80 -80
30´´
Hae III+ BSA
40x
71
Figura 15. Detección del polimorfismo MTRR A66G
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
MTRR A66G
3´ 30´´ 72o 72o AA AG GG

ANNEALING
30´´ 7´
58o -182 -182
30´´
-160 -160
35x
-22 -22
Nde I (Fast Digest)
Figura 16. Detección del polimorfismo RFC1 G-80A
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
95o 95o EXTENSIÓN RETENCIÓN RFC1 G80A

3´ 30´´ 72o 72o
ANNEALING GG GA AA
20´´ 7´
62o
-162 -162
20´´
-125 -125
30x
-68 -68 -68
-37 -37
Hha I (CfO I)
Figura 17. Detección del polimorfismo CCND1 A870G
PRECALENTAMIENTO
CCND1 A80G
DESNATURALIZACIÓN
AA AG GG
10´ 30´´ 72o 72o -167 -167

ANNEALING
1´ 7´
55o -146 -146
30´´
-22 -22
35x
Scr FI
72
Figura 18. Detección del polimorfismo DHFR 19 bp ins/del
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 45´´ 72o 72o

ANNEALING
45´´ 7´
60o
45´´
40x
Figura 19. Detección del polimorfismo ABCC2 G1249A
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 7´
57o
30´´
35x
Figura 20. Detección del polimorfismo ABCC2 C-24T
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 7´
56o
30´´
35x
73
Figura 21. Detección del polimorfismo ABCC4 T1393C
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 7´
55o
30´´
35x
Figura 22. Detección del polimorfismo ABCC2 IVS 23+56 T>C
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 7´
59o
30´´
35x
Figura 23. Detección del polimorfismo ABCC4 C934A
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 45´´ 72o 72o

ANNEALING
45´´ 7´
62o
45´´
40x
74
Figura 24. Detección del polimorfismo ABCG2 C421A
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
5´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 5´
58o
30´´
35x
Figura 25. Detección del polimorfismo ABCB1 C1236T
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 7´
56o
15´´
30x
Figura 26. Detección del polimorfismo ABCB1 C3435T
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 7´
57o
30´´
40x
75
Figura 27. Detección del polimorfismo ABCB1 G2677T/A
PRECALENTAMIENTO
DESNATURALIZACIÓN
3´ 30´´ 72o 72o

ANNEALING
30´´ 7´
59o
30´´
35x
4.4. MÉTODOS ESTADÍSTICOS
La realización de la estadística descriptiva, el contraste del supuesto de normalidad
(prueba de Kolmogorov-Smirnov) o del supuesto de igualdad de varianzas(prueba de
Levene) se realizó con el paquete de software SPSS 22.0 para Windows. La comparación
de las frecuencias alélicas y genotípicas se llevó a cabo con el test exacto de Fisher o de
Chi cuadrado (X2) según hubiera dos o más grupos de comparación respectivamente. La
distribución de las variables cuantitativas entre los diferentes genotipos se comparó con los
test de la t de Student o Mann-Whitney, ANOVA o Kruskal-Wallis, según el ajuste de la
muestra a la normalidad y el número de grupos a comparar. El nivel de significación se
estableció en el 5% bilateral en todas las pruebas estadísticas y se ajustó posteriormente
por el número de SNPs estudiados según el método de Bonferroni. El paquete SNPassoc
R se utilizó para evaluar el modelo de herencia apropiado (codominante, dominante o
recesivo) en el análisis genético (Gonzalez y cols., 2007).Las asociaciones de haplotipos y
el desequilibrio de ligamento (LD) fueron obtenidos gracias al paquete haplo.staTS,
también en el entorno R. El umbral de frecuencia para los haplotipos raros se fijó en 0,05.
76
5. RESULTADOS
77
Resultados
5. RESULTADOS
Las características clínicas de los pacientes que participaron en este estudio se describen
en la Tabla 8.
La mediana de la duración (rango intercuartílico, RIQ) de la terapia de mantenimiento fue
de 81 (16) semanas. En el momento del diagnóstico, 24 (58,5%) pacientes presentaron
linfoadenopatía, 21 (51,2%) hepatoesplenomegalia y 7 (17,1%) masa mediastínica.
Durante este tiempo se realizaron un total de 1771 análisis sanguíneos [mediana y rango
intercuartílico de 44 (11) por paciente]. De ellos, 1217 (68%) mostraron mielosupressión
(WBC <3,0 109/L) y 689 (38,9) se encontraron dentro del intervalo terapéutico de WBC (2,0
- 3,0 109/L).
Se observó elevación de aminotransferasas en una mediana de 75,6 (27,83) de las
pruebas realizadas.
El tratamiento se interrumpió, debido a procesos infecciosos o a la aparición de toxicidad,
en una mediana de 16 (30) días por paciente.
A lo largo de la terapia de mantenimiento, los pacientes recibieron un promedio 49,9
mg/m2 de 6MP (83,8% de la dosis inicial recomendada según protocolo) y 13,28 mg/m2 de
MTX (65,3% de la dosis inicial recomendada según protocolo). Cuando los recuentos
sanguíneos se encontraron dentro del rango terapéutico de WBC, las dosis promedio de
MTX y 6MP fueron de 14,6 mg/m2 (73,04% de la dosis inicial) y 51,18 mg/m2 (85,3%),
respectivamente.
Los 41 pacientes tratados tuvieron un seguimiento medio de 128 (rango 7-145) meses, y
de ellos cuatro (9,8%) sufrieron recaídas y tres (7,3%) fallecieron.
78
Resultados
Tabla 8. Características clínicas de los pacientes con LAL
PARÁMETROS CASOS
EDAD DE DIAGNÓSTICO (años) 5.0 (6.0)
SEXO
Mujeres 24 (58.5%)
Hombres 17 (41.5%)
RIESGO
Bajo 9 (22.0%)
Intermedio 29 (70.7%)
Alto 3 (7.3%)
EN EL MOMENTO DEL DIAGNÓSTICO
WBC (109/L) 6.7 (19)
Hb (g/dL) 8.9 (4.8)
9
Plaquetas(10 /L) 69 (127)
Linfoadenopatías 24 (58,5%)
Hepatoesplenomegalia 21 (51.2 %)
Masa mediastínica 7 (17.1 %)
% blastos en sangre periférica 19 (78)
DURANTE EL MANTENIMIENTO
WBC (109/L) 2.7 (0.6)
Hb (g/dL) 12 (0.5)
9
Neutrófilos (10 /L) 2.7 (0.9)
9
Linfocitos (10 /L) 0.7 (0.4)
LINAJE
LAL-B 37 (90.2)
LAL-T 4 (9.8)
5.1. ESTUDIO EN DIHIDROFOLATO REDUCTASA
En la primera parte del estudio se analizaron tres SNPs en la región promotora del gen
DHFR (C-1610G, C-680G/T y A-317G) y una mutación consistente en una
inserción/deleción de 19 bp en el intrón 1.
79
Resultados
La Tabla 9 muestra la distribución de las frecuencias alélicas y genotípicas en la población
de estudio, que no resultaron ser diferentes de las observadas en poblaciones
relacionadas descritas en Hadmap.
Tabla 9. Distribución de genotipos y frecuencias alélicas en la población de estudio
POLIMORFISMO GENOTIPO N % MAF MAFʃ P-valor§
DHFR19bp ins/del I/I 16 39.02 0.378 0.476a 0.844

I/D 19 46.34
D/D 6 14.63
DHFRA-317G (rs408626) A/A 16 39.02 0.378 0.450 0.885
A/G 19 46.34
G/G 6 14.63
DHFRC-680A (rs442767) C/C 26 63.41 0.243 0.319 0.870
C/A 10 24.39
A/A 5 12.20
*
DHFRC-1610M (rs1650694) C/C 15 36.59 0.451 0.360 0.850
C/M 15 36.59
M/M 11 26.83
MAF, frecuencias alélicas menores; HWE, Equilibrio Hardy-Weinberg
ʃ
Frecuencias alélicas menores en población HapMap-CEU (Caucásica)
§
P-valor para las diferencias entre frecuencias alélicas en nuestra serie y en población
HapMap
*
M representa cualquiera de las variantes alélicas (G/T)
a
No hay datos en HapMap; frecuencia obtenida en los sujetos caucásicos portugueses
Los polimorfismos 19 pb ins/del y A-317G se encuentran en desequilibrio de ligamento
(DL) (D’= 0.947, r2=0.898). Los cuatro haplotipos identificados, así como la información
completa sobre el DL se pueden consultar en la Figura 28.
80
Resultados
Figura 28. Haplotipos identificados en la serie de pacientes e información completa de
desequilibrio de ligamiento
C-680A A-317G 19bp ins/del

C-1610M
C-680A
A-317G
Haplotype C-1610M C-680A A-317G ins/del Frequency

*1 M C A I 0.317
*2 C C A I 0.293
*3 C A G D 0.244
*4 M C G D 0.122
5.1.1. Estudio del efecto de las variantes DHFR sobre la dosificación de MTX
El porcentaje de dosis de MTX administrado (respecto a valores estándar del protocolo) se
vio afectado por los polimorfismos del gen DHFR, recibiendo dosis más bajas los
portadores de variantes homocigotas (Figura 29). Se observó una fuerte correlación en el
polimorfismo C-680A, en el cual a los portadores del genotipo AA se les administró una
mediana (RIQ) de tan sólo el 44,08 (34,69)% de la dosis inicial de MTX, comparado con un
77,98(33,90)% recibido en los portadores de CC y CA (Figura 29C).La asociación siguió
siendo significativa después de realizar la corrección por análisis múltiple.
81
Resultados
polimorfismos de DHFR. A, 19 pb ins / del; B, A - 317G; C, C - 680G; D, C1610M (M
representa cualquiera de las variantes alélicas, G o T)
A B
120 120
p = 0.06 p = 0.06
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
ins/ins-ins/del del/del AA-AG GG
C D
p = 0.94
120 p = 0.01 120
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
CC-CA AA CC-CM MM
La Tabla 10 muestra porcentajes de las dosis de MTX recomendadas por protocolo que en
realidad se administraron a los pacientes portadores de los tres genotipos posibles en los
cuatro SNPs estudiados. Se muestran valores medios con error estándar.
82
Resultados
Tabla 10. Porcentaje de dosis administradas de MTX según protocolo
19bp I/D A-317G C-680A C-1610M*

I/D D/D AA AG I/D D/D AA AG I/D D/D AA MM
M SE M SE M SE M SE M SE M SE M SE M SE M SE M SE M SE M SE
%
78.5 5.7 69.7 5.5 50.5 9.2 78.5 5.4 68.6 5.6 50.5 9.2 78.9 4.1 64.5 9.1 44.1 7.9 62.1 6.9 80.6 6.6 69.4 5.7
MTX
M: media
SE: error estándar
*M: cualquiera de los alelos variantes
83
Resultados
La imagen fue bastante similar cuando el análisis se limitó a las dosis administradas a
pacientes en rango terapéutico de WBC (Figura 30). En este caso, los porcentajes de
dosis iniciales administradas a los portadores de 680AA and -680 CC/CA fueron
respectivamente 51.26 (32.61) y 73.83 (32.70) % (p = 0.03; Figura 30C), aunque la
significación estadística desapareció después de realizar la corrección Bonferroni.
polimorfismos de DHFR. Se consideran sólo las dosis administradas cuando el paciente
estaba en el intervalo terapéutico WBC. A, 19 pb ins / del; B, A - 317G; C, C - 680G; D,
C1610M (M representa cualquiera de las variantes alélicas, G o T)
A B
150 150
p = 0.06 p = 0.06
100 100
50 50
ins/ins-ins/del del/del AA-AG GG
C D
150
p = 0.46
150 p = 0.03
100
100
50
50
CC-CA AA CC-CM MM
El número de recuentos sanguíneos realizados dentro del rango WBC difirió entre los
distintos SNPs del gen DHFR (Tabla 11). El polimorfismo C-680A se asoció fuertemente
con el número de recuentos dentro del rango WBC [la mediana para portadores AA fue de
84
Resultados
23 (6) frente a 16,5 (7,8) para los portadores de CC/CA; p < 0.003]. El mismo genotipo
también se relacionó con el número de recuentos por debajo de 3.0 109/L [43 (11) frente a
31 (14.25) para el mismo genotipo; p < 0.001] y con aquellos en rango tóxico (p = 0.03;
Tabla 11).
Tabla 11. Influencia de los polimorfismos genéticos en regiones no codificantes del gen
DHFR sobre el número de recuentos sanguíneos dentro del rango de glóbulos blancos
indicado. Se muestran los valores medianos (y el rango intercuartílico)
Polimorfismo Genotipo Menor 3.0 Dentro del rango Menor 2.0

9 9
10 /L (2.0-3.0 10 /L) 109/L
19bp I/D II/ID 26 (12) 17 (6.5) 9 (10)
DD 40 (16.50)* 23 (6)* 17 (9.5)
A-317G AA/AG 26 (12) 17 (6.5) 9 (10)
GG 40 (16.50)* 23 (6)* 17 (9.5)
C-680ª CC/CA 26 (12) 16.5 (7.8) 9 (10)
AA 43 (11)** 23 (6)** 17 (9.5)*
C-1610M CC/CM 31 (14.25) 17 (7.5) 12 (12)
MM 24 (11.5) 19 (13.8) 6.5 (7.5)
*p < 0.05
**p < 0.005
Además, aunque en menor medida, los genotipos 19-bp DD y 317GG se asociaron a
mayor número de controles sanguíneos en rango terapéutico de leucocitos y de controles
con leucocitos < 3.0 109/L (p=0.03 y p=0.02, respectivamente). La Tabla siguiente muestra
las cifras correspondientes a los tres genotipos en cada polimorfismo.
85
Resultados
Tabla 12. Número de recuentos sanguíneos dentro del rango en portadores de los tres genotipos en los cuatro polimorfismos estudiados. Se
muestran valores medios con error estándar
19bp I/D A-317G C-680A C-1610M*

I/I I/D D/D AA AG GG CC CA AA CC CM MM
Dentro
del 15.5 1.9 17.0 1.3 22.5 2.4 15.0 1.9 19.0 1.2 22.5 2.4 16.0 1.4 17.0 1.3 23.0 1.4 19 1.5 15 1.7 15 2.3
rango
<2000
109
12.5 2.4 7.0 1.2 15.5 2.9 11.0 2.3 7.0 1.6 15.5 2.9 9.5 1.7 8.0 1.9 17.0 2.3 14 1.8 9 2.1 7 2.9
<3000
109
31.0 3.2 24.0 2.0 40.0 4.9 30.5 3.1 25.0 2.3 40.0 4.9 27.0 2.3 24.5 2.6 43.0 2.6 33 2.8 24 3.3 26 3.2
M: media
SE: error estándar
86
Resultados
5.1.2. Asociación de genotipos de DHFR con la toxicidad
En cuanto a la toxicidad asociada a los distintos genotipos de este gen, la mediana (y RIQ)
de días en los cuales se interrumpió el tratamiento fue de 16 (30). Los portadores del
genotipo -680AA mostraron una mayor número de interrupciones que los portadores de
CC o CG [Mediana (RIQ): 30 (51) frente a 11,5 (29) días, respectivamente; p = 0,03]. Sin
embargo, la asociación perdió significación estadística después del ajuste por pruebas
múltiples. Ninguno de los otros SNPs afectó a este parámetro.
En relación a la toxicidad hematológica, los portadores homocigotos -680AA
experimentaron episodios de neutropenia más severos (grado 3-4) que los portadores de
CC/CA [mediana (RIQ): 19 (14) frente a 11,5 (11), respectivamente; p=0,04]. Otras
toxicidades hematológicas en grados 3 o 4 no fueron suficientemente frecuentes para
realizar el análisis de asociación con los distintos genotipos. Respecto a los datos
bioquímicos, el genotipo homocigótico -680AA se relacionó con un mayor número de
controles con niveles muy elevados (> 400mg/dL) de LDH [41 (5) frente a 33 (28) para
portadores de CC / CA; p <0,04]. No se observaron asociaciones para ningún SNP en
relación con la incidencia de hipoglucemia, niveles elevados de urea (> 18 mg/dl) o valores
de PCR> 5.
La Tabla13 muestra valores para estos parámetros de toxicidad estratificados según los
tres genotipos de los cuatro SNPs considerados.
87
Resultados
Tabla 13. Parámetros de toxicidad según el genotipo DHFR. Se muestran valores medios con error estándar
19bp I/D A-317G C-680A C-1610M*

I/I I/D D/D AA I/I I/D D/D AA I/I I/D D/D AA
Días de
tratamiento 7 9 19 6 25 14 3 7 19 7 25 14 11 6 16 9 30 14 18 8 7 11 19 4
interrumpido
Neutropenia
15 2 11 1 19 4 15 2 11 2 19 4 12 2 11 2 19 4 13 2 11 2 12 2
grado ¾
LDH <400
33.0 3.6 37.0 3.2 40.5 6.5 31.0 3.9 38.0 2.9 40.5 6.5 35.0 3.0 32.5 4.2 41.0 1.2 39.0 3.3 32.0 3.5 33.0 5.2
mg/dL
M: media
SE: error estándar
88
Resultados
5.1.3. Estudio de haplotipos
La frecuencia de los cuatro haplotipos identificados y su efecto sobre el porcentaje de
dosis de MTX administrado (tanto de manera general como en pacientes que se
encontraban dentro del rango terapéutico) se muestra en la Tabla 14.
Ninguno de ellos mostró un efecto relevante en la reducción de dosis de MTX. Igualmente,
no se encontró asociación entre la toxicidad observada y los haplotipos analizados.
Tabla 14. Frecuencias de los cuatro haplotipos del gen DHFR identificados (umbral de
frecuencia mínima = 0,05) y su efecto sobre el porcentaje de dosis inicial de metotrexato
administrado, tanto en general como en los pacientes dentro del rango terapéutico de
glóbulos blancos (2,0-3,0 109 / L). Se muestra la diferencia de medias (MD) con intervalos
de confianza del 95% (IC). El orden de los SNPs en los haplotipos es el siguiente: C-
1610M / C-680A / A-317G / 19bp ins / del
Haplotipo Frecuencia MD CI P
General *MCAI 0.3171 66.85 Ref.

CAGD 0.2439 -9.19 (-21.92 - 3.54 ) 0.157
MCGD 0.1219 4.52 (-13.34-22.39 ) 0.620
CCAI 0.2926 7.44 (-5.60-20.47) 0.263
Dentro de MCAI 0.3171 110.01 Ref. 0.659
rango CAGD 0.2439 -12.77 (-69.38-43.85) 0.991
MCGD 0.1219 0.48 (-78.97-79.93 ) 0.396
CCAI 0.2926 -25.09 (-83.06-32.89 ) 0.396
*M indica cualquiera de las variantes alélicas (G o T)
89
Resultados
5.2. ESTUDIO EN TRANSPORTADORES DE FÁRMACOS
La segunda parte del trabajo ha consistido en el estudio de las alteraciones en
transportadores que determinan las concentraciones intracelulares de MTX. Se han
evaluado diez SNPs en el transportador de captación RFC (codificado por el gen
SLC19A1) y en los transportadores de eflujo ABCB1, ABCC2, ABCC4 y ABCG2 (SLC19A1
G80A; ABCB1 C3435T, G2677 T/A y C1236T; ABCC2 C-24T, G1249A y IVS 23+56 T>C;
ABCC4 T-1393C y C934A y ABCG2 C421A), con el objetivo de determinar si los
polimorfismos en los genes que codifican las proteínas encargadas del transporte de
fármacos pueden influir en la dosificación, la eficacia y la toxicidad de la terapia de
mantenimiento con MTX y 6-mercaptopurina (6MP) en pacientes con leucemia aguda
linfoblástica (LAL) infantil.
Los genotipos y frecuencias alélicas observadas en la población de estudio se muestran
en la Tabla 15. La distribución de los SNPs no difirió significativamente del equilibrio de
Hardy-Weinberg, ni las frecuencias observadas fueron diferentes a las de otras
poblaciones caucásicas consultadas en HapMap (p > 0.05 en todos los casos).
90
Resultados
Tabla 15. Frecuencias genotípicas y alélicas observadas y comparación con las
encontradas en individuos caucásicos en HapMap
Polimorfismo Genotipo N % MAF HapMapa
GG 9 22.0
SLC19A1 G80A GA 27 65.8 0.451 0.437
AA 5 12.2
CC 11 26.8
ABCB1 C1236T CT 20 48.8 0.488 0.451
TT 10 24.4
GG 12 29.3
ABCB1 G2677 T/A GT 21 51.2 0.451 0.469
TT 8 19.5
CC 11 26.8
ABCB1 C3435T CT 22 53.7 0.463 0.534
TT 8 19.5
CC 22 53.7
ABCC2 C-24 T CT 16 39 0.268 0.225
TT 3 7.3
GG 29 70.8
ABCC2 G1249A GA 11 26.8 0.158 0.233
AA 1 2.4
TT 12 29.2
ABCC2
TC 20 48.8 0.463 0.387
IVS 23+ 56 T>C
CC 9 22.0
CC 32 78.0
ABCG2 C421A CA 8 19.5 0.122 0.111
AA 1 2.5
TT 35 85.4
ABCC4 T-1393C 0.073 0.06b
TC 6 14.6
CC 31 75.6
ABCC4 C934A 0.122 0.081
CA 10 14.4
MAF, frecuencias alélicas menores; HWE, Equilibrio Hardy-Weinberg
a
Frecuencias alélicas menores en población HapMap-CEU(Caucásica)
91
Resultados
b
No hay datos en HapMap; frecuencia obtenida en el estudio de Ansari y cols. En niños
caucásicos con LAL (Ansari y cols., 2009)
5.2.1. Efecto de polimorfismos en transportadores sobre la dosificación y la eficacia
del tratamiento
En relación a los efectos de los polimorfismos genéticos sobre los requerimientos de dosis
administradas de MTX y 6-MP, la Figura 31A muestra que los portadores de la variante
ABCC4 934A recibieron un porcentaje de dosis inicial de MTX mayor de la recomendada
[81.28% (RIQ =19.92)] en comparación con aquellos pacientes que no presentaron esta
variante [62.12% (RIQ = 37.51); p= 0.001]. De igual manera, los portadores del genotipo
homocigoto ABCB1 1236TT recibieron el 73.09% (RIQ= 31.59) de la dosis estándar de 6-
MP, en comparación con el 87,72% (RIQ = 24,76) que se les administró a los pacientes
con los genotipos CC y CT (p = 0.026; Figura 8C). Al comparar las dosis administradas en
pacientes que se encontraban en rango terapéutico de leucocitos, las diferencias en la
dosificación de 6MP de acuerdo al genotipo ABCB1 C1236T se incrementaron [69.88%
(IQR=30.61) frente a 90.27% (IQR=18.35) para TT y CC/CT respectivamente (p = 0.017;
Figure 31B).
Sin embargo, los efectos de la dosis de MTX sobre el polimorfismo ABCC4 fueron menor
que en el análisis anterior (p = 0.021; Figura 31 D). Las asociaciones mostradas en las
Figuras 31 B a D, perdieron significación estadística después de ser corregidas por
pruebasmúltiples.
92
Resultados
Figura 31. Impacto de los polimorfismos ABCC4 C934A y ABCB1 C1236T sobre los
requerimientos de dosis de metotrexato (MTX) (paneles A y B) y 6-mercaptopurina (6-MP)
(paneles C y D). Los paneles A y C muestran el porcentaje de dosis administrada en
relación con la dosis inicial recomendada por el protocolo. Los paneles B y D muestran
estos porcentajes, pero se limitan a las dosis administradas cuando el paciente estaba
dentro del rango de mielosupresión deseada (leucocitos entre 2,0 y 3,0 109/L). Nota: Con
el fin de mejorar la claridad del gráfico, dos pacientes con porcentajes de 354,4% y 629,0%
(uno dentro de cada grupo de genotipo) fueron eliminados del panel B (estos pacientes sí
fueron incluidos en el análisis estadístico)
Para evaluar la eficacia de la terapia de mantenimiento, observamos el porcentaje de
análisis sanguíneos con leucocitos por debajo de 3 109/L. Se observó un efecto gen-dosis
dependiente para el SNP ABCB1 C1236T (Figura 32), ya que el porcentaje de controles
sanguíneos con mielosupresión eficaz se incrementaba significativamente con cada alelo T.
93
Resultados
Las mediana (y RIQ) evaluadas para los genotipos CC, CT y TT fueron 22 (13), 30.5
(11.75) y 33 (17.25), respectivamente (p=0.0044). La asociación se mantuvo
estadísticamente significativa una vez realizada la corrección de Bonferroni.
Figura 32. Efecto del polimorfismo ABCB1 C1236T en el porcentaje de análisis de sangre
que muestran una mielosupresión eficaz (concentraciones de leucocitos inferiores a 3,0
109/L)
5.2.2. Estudio sobre el efecto de polimorfismos en transportadores en la toxicidad
del tratamiento
En cuanto a los efectos de los polimorfismos genéticos sobre la toxicidad en la fase de
mantenimiento, y en concreto la toxicidad hematológica, se registraron 3598 eventos de
los grados 1 al 4. El polimorfismo ABCB1 C1236T se relacionó notablemente con la
aparición de estos eventos (p = 0.002). Otro polimorfismo que mostró un impacto sobre la
94
Resultados
dosis de mantenimiento y la mielosupresión, el ABCC4 C934A, también mostró asociación
con la toxicidad hematológica (p = 0.041), aunque la significación estadística se perdió
cuando se corrigió por pruebas múltiples (Figura 33).
Figura 33. Influencia de los polimorfismos ABCB1 C1236T (A) y ABCC4 C934A (B) sobre
el número total de eventos adversos hematológicos observados en nuestros pacientes
durante el tratamiento de mantenimiento
Al analizar la toxicidad hematológica por separado (Tabla 16), el polimorfismo ABCB1
C1236T se relacionó con la aparición de neutropenia leve (p = 0,004). Su asociación con
trombocitopenia (0,023) y la del SNP ABCC4 C934A con anemia leve (p = 0,018) no fue
significativa tras la corrección por Bonferroni. Los niveles elevados de aminotransferasas
estaban presentes en una mediana de 75,6 (RIQ = 27,83), no difiriendo significativamente
entre los distintos genotipos. Finalmente, los análisis bioquímicos revelaron que el
polimorfismo ABCC4 C934A se encontraba significativamente relacionado con el número
95
Resultados
de episodios con niveles elevados de LDH (> 400 mg / dL): 39 (RIQ = 16) para los
portadores de CC frente a 21 (RIQ = 26) para los portadores de CA (p = 0,004). Ningún
otro parámetro bioquímico mostró una asociación con los SNP analizados.
Tabla 16. Impacto del genotipo ABCB1 C1236T en el número de eventos tóxicos
hematológicas en niños en terapia de mantenimiento con leucemia aguda linfoblástica. Se
muestran valores medianos (y rangos intercuartiles)
GENOTIPO LEUCOPENIAa NEUTROPENIA TROMBOPENIA ANEMIAb
Grado 1-2 Grado 1-2 Grado 3-4 Grado 1-2 Grado 3-4 Grado 1-2
ABCB1 11 (11) 14 (11)** 10.5 (17) 0.5 (2) 0 (1) 42.5 (16)
1236CC
ABCB1 10.5 (12) 23 (7) 12 (9) 1 (4) 0 (1) 41 (13)
1236CT
ABCB1 12.5 (22) 21.5 (11) 14 (17) 1 (15)* 0 (1) 46.5 (12)
1236TT
ABCC4 9 (13) 22 (10) 12 (11) 1 (4) 0 (0) 43 (12)
934CC
ABCC4 12 (13) 15 (13) 10.5 (15) 1.5 (3) 0 (1) 38***(16)
934CA
a
No se documentaron episodios de leucopenia de grado 3-4 en nuestra serie
b
Sólo se observaron cinco episodios de anemia de grado 3-4 en cuatro pacientes y, por lo
tanto, no se realizaron análisis de asociación genética
* p = 0.023 frente al los genotipos CT/CC
** p= 0.004 frente a los genotipos CT/TT
*** p =0.018
96
Resultados
5.3. ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN OTROS GENES RELACIONADOS CON EL
CICLO DEL FOLATO
Además de estudiar los polimorfismos del gen DHFR, en este trabajo se han analizado
genes que codifican enzimas relacionadas con el ciclo del folato pero cuyos polimorfismos
no han generado ninguna asociación significativa. El tratamiento estadístico ha sido el
mismo que el descrito para las otras dos partes del estudio (DHFR y transportadores). Al
no haber obtenido resultados significativos, no se han incluido en las publicaciones
mencionadas (Anexo III).
97
Resultados
Tabla 17. Distribución de genotipos con porcentajes observados
Recuento % del N de columna

CC 14 34,1%
MTHFRC677T CT 19 46,3%
TT 8 19,5%
AA 22 53,7%
MTHFRA1298C AC 15 36,6%
CC 4 9,8%
2/2 7 17,1%
TS23 2/3 21 51,2%
3/3 13 31,7%
ins/ins 20 48,8%
TS6bpins/del ins/del 20 48,8%
del/del 1 2,4%
CC 21 51,2%
SHMT1C1420T CT 16 39,0%
TT 4 9,8%
AA 28 68,3%
MSA2756G AG 13 31,7%
GG 0 0,0%
AA 5 12,2%
MTRRA66G AG 21 51,2%
GG 15 36,6%
AA 11 26,8%
CCND1A870G AG 20 48,8%
GG 10 24,4%
98
Resultados
Tabla 18. Asociación de SNPs con porcentaje de MTX administrado
PORCENTAJE DOSIS MTX

Media Desviación estándar
CC 76,98 26,13
MTHFRC677T CT 63,10 22,80
TT 60,53 22,60
AA 69,93 17,46
MTHFRA1298C AC 61,04 28,56
CC 76,71 40,44
2/2 68,41 19,46
TS23 2/3 72,30 26,01
3/3 58,75 23,34
ins/ins 71,73 21,53
TS6bpins/del ins/del 63,91 27,17
del/del 48,08 .
CC 71,50 27,38
SHMT1C1420T CT 60,96 21,49
TT 71,00 16,70
AA 64,56 22,99
MSA2756G AG 73,32 27,19
GG . .
AA 72,19 15,70
MTRRA66G AG 66,14 25,41
GG 67,41 26,43
AA 63,38 23,63
CCND1A870G AG 75,52 25,42
GG 55,32 18,27
99
Resultados
Tabla 19. Influencia de los polimorfismos estudiados sobre los recuentos de leucocitos
Número de controles Controles por debajo Controles por debajo

Número de controles
en rango de2000 de3000
Desviación Desviación Desviación Desviación
Media Media Media Media
estándar estándar estándar estándar
CC 39 12 15,1 5,5 8,1 4,9 23,21 8,63
MTHFRC677T CT 43 15 17,2 8,0 11,1 8,4 28,26 12,61
TT 50 10 18,9 4,9 16,9 9,3 35,75 10,26
AA 44 14 18,0 6,7 12,0 8,4 30,00 12,31
MTHFRA1298C AC 44 13 15,2 7,1 11,3 8,2 26,53 11,73
CC 39 11 16,3 5,1 6,3 3,6 22,50 2,65
2/2 42 17 15,6 5,7 9,0 8,4 24,57 11,50
TS23 2/3 41 13 16,0 7,1 11,2 8,2 27,14 11,28
3/3 47 12 18,8 6,6 12,4 7,9 31,23 12,24
ins/ins 43 15 15,2 7,1 10,9 8,8 26,10 12,53
TS6bpins/del ins/del 44 12 18,5 6,2 10,9 7,0 29,35 10,66
del/del 44 . 15,0 . 24,0 . 39,00 .
CC 43 13 16,9 6,1 10,8 8,1 27,67 11,92
SHMT1C1420T
CT 45 12 17,0 7,4 11,8 7,8 28,81 10,93
100
Resultados
TT 36 19 15,8 8,8 10,8 10,6 26,50 15,46

AA 45 11 17,4 6,4 12,3 7,9 29,64 11,47
MSA2756G AG 39 17 15,6 7,4 8,8 8,2 24,46 11,48
GG . . . . . . . .
AA 37 17 14,8 7,2 12,6 9,7 27,40 14,43
MTRRA66G AG 42 14 16,3 7,3 11,8 8,6 28,10 13,33
GG 47 11 18,2 5,9 9,9 7,0 28,07 8,38
AA 43 10 16,4 6,3 13,4 7,8 29,73 8,47
CCND1A870G AG 42 14 16,1 6,5 9,1 7,9 25,25 12,14
GG 45 17 18,7 7,9 12,9 8,4 31,60 13,07
101
Resultados
Tabla 20. Asociación de polimorfismos con días de tratamiento interrumpidos y toxicidad hematológica
Días de
tratamiento Leucopenia1_2 Neutropenia1_2 Neutropenia3_5 Trombopenia1_2 Trombopenia3_5 Anemia1_2
interrumpido
Desviación Desviación Desviación Desviación Desviación Desviación Desviación
Media Media Media Media Media Media Media
estándar estándar estándar estándar estándar estándar estándar
CC 12 10 8 5 17 7 11 7 2 4 1 2 37 11
MTHFRC677T CT 28 36 11 8 19 7 12 8 3 7 0 1 41 14
TT 36 41 17 9 22 7 19 10 3 4 0 0 50 10
AA 24 32 12 8 20 7 13 9 3 3 0 1 42 14
MTHFRA1298C AC 27 35 11 8 17 7 14 7 3 8 0 0 41 13
CC 16 12 6 4 16 8 11 8 4 8 2 3 37 9
2/2 35 43 9 8 18 9 13 7 2 2 1 1 42 17
TS23 2/3 13 13 11 8 18 7 13 8 2 3 0 1 39 12
3/3 36 41 12 8 19 6 14 9 5 9 1 2 44 12
ins/ins 19 30 11 9 18 7 12 8 2 3 0 1 41 15
TS6bpins/del ins/del 29 34 11 7 19 8 14 8 4 7 1 1 42 11
del/del 10 . 24 . 20 . 21 . 0 . 0 . 43 .
CC 23 36 11 8 19 7 13 9 2 4 1 1 42 13
SHMT1C1420T CT 28 29 12 8 19 6 14 7 3 7 0 0 42 12
TT 11 16 11 11 17 9 15 9 4 6 1 1 35 19
102
Resultados
AA 25 31 12 8 18 7 15 8 3 6 0 1 43 11
MSA2756G AG 21 34 9 8 20 8 10 7 2 4 1 2 38 16
GG . . . . . . . . . . . . . .
AA 12 13 13 10 15 8 14 9 1 1 0 0 36 17
MTRRA66G AG 18 24 12 9 18 7 14 10 3 7 0 1 41 14
GG 36 42 9 7 22 6 12 5 3 5 1 2 44 10
AA 23 27 13 8 18 5 14 6 3 5 1 2 40 6
CCND1A870G AG 17 23 9 8 19 8 11 8 2 3 0 0 41 14
GG 39 47 13 9 19 7 17 10 5 9 1 1 43 17
103
Resultados
Tabla 21. Asociación de polimorfismos con parámetros bioquímicos
% controles con
LDH1_2 LDH3_5 Urea PCR transaminasas
alteradas
Desviación Desviación Desviación Desviación Desviación
Media Media Media Media Media
estándar estándar estándar estándar estándar
CC 11 9 25,79 14,26 26 13 4 3 68,79 26,82
MTHFRC677T CT 6 7 32,21 15,07 30 16 3 3 79,00 11,44
TT 9 7 36,00 10,45 29 12 3 5 60,41 28,59
AA 7 8 32,73 13,85 30 13 3 3 71,84 23,24
MTHFRA1298C AC 10 8 28,67 14,86 29 15 5 4 69,05 22,79
CC 8 11 27,75 16,30 19 14 4 2 82,76 11,10
2/2 7 4 33,71 14,77 32 16 3 3 60,46 28,01
TS23 2/3 9 9 28,24 15,42 26 15 3 4 74,79 20,46
3/3 7 8 33,23 12,13 30 13 3 3 73,34 21,17
ins/ins 8 8 29,90 14,42 27 14 4 4 69,87 24,92
TS6bpins/del ins/del 8 8 31,50 14,73 29 14 3 3 73,74 20,03
del/del 8 . 33,00 . 32 . 2 . 75,00 .
SHMT1C1420T CC 8 8 30,33 14,54 26 14 3 3 73,37 22,31
104
Resultados
CT 8 9 32,13 13,60 32 14 4 4 71,91 19,32

TT 6 4 27,50 18,48 27 16 3 2 64,00 35,26
AA 8 8 32,29 13,45 31 12 4 3 71,14 22,23
MSA2756G AG 9 8 27,46 15,85 23 16 3 4 73,48 22,71
GG . . . . . . . . . .
AA 3 3 32,80 16,22 25 14 3 2 69,26 24,16
MTRRA66G AG 7 8 29,81 15,16 27 14 3 3 72,36 23,21
GG 11 8 31,40 13,11 31 15 5 4 72,09 21,43
AA 2 3 36,27 9,07 34 12 4 2 79,53 9,14
CCND1A870G AG 10 8 28,65 15,79 26 14 3 3 67,57 21,48
GG 11 9 28,90 15,23 28 16 5 5 72,11 31,55
105
Resultados
Tabla 22.Asociación con el número de complicaciones durante el tratamiento
Nº eventos Nº eventos Nº eventos Nº eventos Nº eventos Nº eventos Nº eventos Otras

hematológicos infecciosos respiratorios digestivos metabólicos neurológicos hepáticos complicaciones
M DE M DE M DE M DE M DE M DE M DE M DE
CC 76 22 2 2 1 2 1 1 64 23 0 0 45 24 2 1
MTHFRC677T CT 87 30 4 3 2 2 2 2 69 28 0 0 50 20 2 3
TT 110 26 5 5 2 2 1 2 75 16 0 0 44 22 3 4
AA 91 30 3 3 2 2 1 2 70 24 0 0 46 21 2 3
MTHFRA1298C AC 87 30 4 3 2 2 2 2 68 26 0 0 47 21 2 1
CC 76 8 4 4 2 2 1 1 58 25 0 0 58 28 1 1
2/2 85 33 4 5 1 1 3 3 73 29 0 0 42 25 3 4
TS23 2/3 84 28 3 2 2 2 1 1 66 26 0 0 46 22 1 1
3/3 96 28 4 4 2 2 1 1 70 18 0 0 53 19 3 3
ins/ins 85 32 3 2 2 2 2 2 66 26 0 0 43 19 2 2
TS6bpins/del ins/del 90 26 4 4 2 2 1 1 71 23 0 0 52 23 3 3
del/del 108 . 6 . 0 . 1 . 73 . 0 . 44 . 1 .
CC 87 30 3 4 2 2 2 2 65 23 0 0 47 21 2 3
SHMT1C1420T CT 90 24 4 3 2 1 1 2 74 24 0 0 50 21 2 3
TT 82 47 4 2 1 1 1 1 62 33 0 0 41 27 1 0
MSA2756G AA 92 28 4 3 2 2 1 1 72 20 0 0 52 22 2 3
106
Resultados
AG 80 31 3 4 1 1 2 3 60 30 0 0 38 18 2 3
GG . . . . . . . . . . . . . . . .
AA 79 37 4 3 1 1 1 1 63 30 0 0 44 33 1 1
MTRRA66G AG 88 35 3 3 2 2 1 1 66 24 0 0 46 20 2 2
GG 90 15 4 4 1 1 2 2 74 22 0 0 50 19 3 3
AA 90 14 3 2 2 1 1 1 73 19 0 0 54 15 2 3
CCND1A870G AG 81 30 4 4 2 2 1 2 66 26 0 0 44 23 3 3
GG 98 37 4 3 2 1 1 2 69 27 0 0 47 23 1 1
M: media
DE: desviación estándar
107
6. DISCUSIÓN
108
Discusión
6. DISCUSIÓN
El MTX es considerado la piedra angular de los protocolos para el tratamiento de la LAL
infantil. Su principal mecanismo de acción implica la inhibición de la enzima DHFR, lo que
conlleva una falta de folato y un deterioro en la síntesis de purina y pirimidina. Algunos
estudios han indicado que determinados cambios en la expresión de esta enzima pueden
afectar al éxito de la quimioterapia en niños tratados con MTX (Al-Shakfa y cols., 2009,
Dulucq y cols., 2008, Matherly y cols., 1995, Mishra y cols., 2007). En particular, dos
estudios del mismo grupo de investigación canadiense han mostrado que hay
combinaciones de mutaciones en la zona reguladora del gen DHFR que están asociadas
con menor superviviencia libre de eventos (Dulucq y cols., 2008), especialmente en
pacientes de alto riesgo (Al-Shakfa y cols., 2009). Además, niveles altos de proteína
DHFR se han relacionado también con resistencia al MTX en LAL infantil (Matherly y cols.,
1995, Mishra y cols., 2007).
A este respecto, los resultados de la primera parte de nuestro trabajo indican que, durante
la terapia de mantenimiento, a los pacientes portadores del genotipo AA en el polimorfismo
C-680A del gen DHFR, se les administró menor porcentaje de la dosis inicial recomendada
de MTX (20 mg/m2) que a los portadores de los genotipos CC/CA (una diferencia de más
del 30%). Este hallazgo podría deberse a la disminución de la expresión de DHFR
causada por la mutación, que daría lugar a una mayor sensibilidad a los efectos del
fármaco, y por lo tanto disminuiría los requerimientos en cuanto a la dosis. Sin embargo,
los efectos precisos del SNP C-680A sobre la expresión de la enzima DHFR se
desconocen, ya que son muy escasos los estudios in vitro llevados a cabo para analizar el
impacto de los polimorfismos en este gen. Un grupo de investigación canadiense examinó
éste y otros SNPs en relación a cambios en la expresión del ARNm, no encontrando
resultados relevantes para el C-680A (Dulucq y cols., 2008) (Al-Shakfa y cols., 2009). La
109
Discusión
razón por la cual los portadores del -680AA serían más sensibles a los efectos
farmacológicos del MTX queda por dilucidar, por lo que se necesitan estudios in vitro
adicionales para determinar el efecto de éste y otros SNPs en la expresión de la DHFR.
Un inconveniente común en los protocolos de tratamiento de la LAL es que los niveles de
leucocitos utilizados para ajustar la dosis de MTX reflejan no sólo la intensidad del
tratamiento, sino también los valores basales de leucocitos del niño, la adhesión del
paciente a la terapia y la habilidad del médico para ajustar las dosis, que puede variar
ampliamente (Schmiegelow y cols., 2014). Es por este motivo que decidimos repetir el
análisis de asociación genotipo/dosis usando para los cálculos solamente las dosis
administradas cuando los pacientes se encontraban dentro del rango de mielosupresión
deseada. A pesar de que la significación se redujo, aun se apreciaba un efecto notable del
genotipo -680AA sobre el porcentaje de dosis administrada con respecto a la dosis
estándar.
La mayor sensibilidad conferida por este genotipo (el único SNP cuyo efecto seguía siendo
significativo después de la corrección por análisis múltiple) fue confirmada por análisis
posteriores que revelaron que, a pesar de recibir dosis más bajas, los pacientes portadores
se mantuvieron más fácilmente dentro de los niveles de mielosupresión adecuados. Esto
es muy importante en los resultados de la quimioterapia en niños con LAL, ya que hay
estudios que han demostrado que niveles bajos de leucocitos durante la terapia de
mantenimiento se asocian con las concentraciones de metabolitos tóxicos 6MP/MTX en los
glóbulos rojos y una tasa más reducida de recaídas (Dolan y cols., 1989, Gobrecht y cols.,
1992, Schmiegelow y cols., 1988). El número de pacientes de nuestra serie es obviamente
limitado para analizar tasas de recaída o supervivencia, pero los portadores del genotipo -
680AA, que se encontraron más frecuentemente en rango terapéutico de leucocitos, están
actualmente todos en remisión completa.
110
Discusión
Es importante resaltar que los pacientes de nuestra serie recibieron de media menos del
66% de la dosis inicial estándar de MTX (20 mg/m 2). Además de los factores genéticos,
deben existir otros que contribuyan a esta relevante reducción de la dosis recomendada en
los protocolos. Por ejemplo, el uso de trimetoprim/sulfametoxazol durante la fase de
inducción para prevenir las infecciones ha sido relacionado con leucopenia (Levinsen y
cols., 2012), lo que se traduciría en menos requerimientos de dosis. En cualquier caso, el
hecho de que el efecto del genotipo sólo fuera notable cuando se consideraron las dosis
administradas en rango terapéutico de leucocitos, indica la importancia relativa del SNP en
el gen DHFR. Por todo ello, se podría especular con la idea de que la dosis inicial de 20
mg/m2 puede ser demasiado alta en nuestra población, siendo 15 mg/m2 una cifra más
realista. Obviamente harían falta ensayos clínicos diseñados al efecto para poder
confirmar esta hipótesis.
Otro objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de los SNPs del gen DHFR sobre la
toxicidad inducida por MTX. Nuestros resultados mostraron que los portadores de la
variante -680AA habían presentado más días de interrupción del tratamiento, una más alta
incidencia de neutropenia grave y mayores niveles de LDH. Este incremento de efectos
adversos podría deberse a la mayor sensibilidad al fármaco observada en estos pacientes.
Al igual que ocurría con la situación descrita para la dosificación del MTX, los datos
existentes sobre la toxicidad inducida por la terapia de mantenimiento en niños con LAL en
relación a las variantes del DHFR son muy escasos. Nuestros hallazgos están en
consonancia con los de Kodidela y cols., quienes publicaron que existía un aumento de la
toxicidad hematológica en pacientes pediátricos con LAL portadores de la variante -680A
tratados con dosis bajas de MTX (Kodidela y cols., 2015). Otros SNPs del gen DHFR,
como el 19-bp ins/del, han sido relacionados con la aparición de toxicidad hepática en
pacientes adultos con LAL (Ongaro y cols., 2009). En nuestra serie no se observó una
111
Discusión
relación directa entre ninguno de los polimorfismos estudiados y el número de recuentos
sanguíneos que presentaron niveles elevados de aminotransferasas. La explicación más
probable es que estos niveles estaban elevados en la mayoría de los análisis y, por lo
tanto, las diferencias entre genotipos podrían haber sido difíciles de detectar. Por otro lado,
observamos mayores niveles de LDH en portadores de este genotipo. No hubo evidencia
de hemólisis o daño muscular en los pacientes, por lo tanto el aumento de LDH debe
obedecer a la aparición de toxicidad hepática (Vernetti y 2016); lo que indicaría también
una mayor sensibilidad a los efectos del MTX conferida por este genotipo.
Los haplotipos estudiados en esta primera parte del trabajo no relevaron ninguna
asociación significativa con la dosis de los fármacos ni con la toxicidad. Dulucq y cols., han
utilizado previamente los mismos SNPs para definir varios haplotipos que resultaron estar
relacionados con peor supervivencia libre de eventos en pacientes pediátricos con LAL.
Sin embargo los autores no realizaron análisis con respecto a la dosis administrada ni a los
parámetros de toxicidad (Dulucq y cols., 2008).
En la segunda parte del trabajo nos centramos en los transportadores de fármacos. Debido
a la ausencia de protocolos específicos que determinen cómo ajustar las dosis de MTX y
6MPen la terapia de mantenimiento de la LAL (Schmiegelow y cols., 2016), es importante
analizar factores como los genéticos que pudieran usarse para optimizar la terapia (Dulucq
y cols., 2014, Gervasini y Vagace, 2012, Lopez-Lopez y cols., 2014, Pui, 2015). A este
respecto, los transportadores han sido considerablemente menos estudiados que enzimas
metabolizadoras como MTHFR o TMPT, aunque sin embargo, dado el papel crítico de los
mismos en la biodisponibilidad del MTX, 6MP y sus metabolitos activos, parece más que
probable que la variabilidad en los genes que codifican para estas proteínas
transportadoras pueda tener relevancia clínica.
112
Discusión
Los resultados de nuestro estudio muestran que, tanto el SNP ABCB4 C934A como
ABCB1 C1236T modificaron las dosis administradas de MTX y 6MP, respectivamente.
Mientras que el 934A se asoció con la administración de dosis más altas de MTX, el
genotipo 1236TT se relacionó con la administración de dosis más bajas de 6MP (en
relación a las recomendadas según protocolo inicialmente). Es importante señalar que
estas diferencias se mantuvieron (aunque en menor medida) cuando analizamos las dosis
administradas sólo en pacientes que se encontraban dentro del rango de mielosupresión
deseado.
En nuestro estudio fueron los mismos SNPs que afectaban a la dosificación de MTX y 6-
MP los que se mostraron también relacionados con el grado de mielosupresión obtenido y
la incidencia de toxicidad hematológica. Especialmente notable es el papel del
polimorfismo ABCB1C1236T, que no sólo se presentaba preferentemente en pacientes
que necesitaban dosis más bajas de 6-MP, sino que además confirió mayor sensibilidad a
los niños, ya que lograban más fácilmente un nivel superior de mielosupresión y sufrían
más eventos hematológicos que los pacientes que no portaban el polimorfismo.
No hay muchos datos sobre la función del ABCB1 en el transporte de 6-MP, de hecho no
hay datos de pacientes con LAL. En otras patologías, un estudio reciente realizado en
pacientes pediátricos con enfermedad inflamatoria intestinal que recibieron azatioprina (un
precursor de 6-MP) demostró que la variabilidad genética de ABCB1 puede ser importante
para tratamientos con tiopurinas, ya que se asoció con la producción de nucleótidos
activos de 6-tioguanina (M.N. Lee, Kang, B., Choi, S.Y., Kim, M.J., Woo, S.Y., Kim, J.W., y
cols., 2015). Además, un metaanálisis reciente realizado en pacientes con diversas
neoplasias malignas demostró que los individuos portadores de la variante ABCB1 1236T
o el genotipo 1236TT fueron más propensos a tener una buena respuesta a la
quimioterapia (Zhou, 2015), afirmación que está en línea con nuestros hallazgos en
113
Discusión
pacientes con LAL. Los autores sugirieron, y estamos de acuerdo, que el gen ABCB1
podría funcionar como un marcador molecular de quimiosensibilidad. Sin embargo, a pesar
de estas informaciones, no hay todavía pruebas directas sobre la participación de ABCB1
en el transporte de MTX y 6-MP, lo que implica que deben de formularse también hipótesis
alternativas para la asociación del alelo 1236T con la toxicidad. Por ejemplo, podría ser
que la disminución del transporte de otros fármacos por ABCB1 en precursores
hematopoyéticos causada por la variante alélica condujera a una disminución de la reserva
en la médula y, por tanto, a una mayor sensibilidad a los antimetabolitos utilizados.
El otro SNP que mostró un impacto clínico en nuestra serie de pacientes fue el ABCC4
C934A. El alelo C (wild type) se asoció con menores requerimientos de dosis de MTX y
una mayor incidencia de efectos adversos hematológicos (su efecto sobre el grado de
mielosupresión no fue significativo). El transportador ABCC4 afecta a la disposición de
MTX y desempeña un papel importante en la resistencia a este fármaco (Chen y cols.,
2002). No se conocen estudios previos que evalúen el efecto de SNPs en este gen en
relación a la dosis de MTX o al nivel de mielosupresión, aunque algunos trabajos han
evaluado su impacto en la toxicidad inducida por el fármaco. Así, López-López y cols.
(Lopez-Lopez y cols., 2013) detectaron dos polimorfismos, rs1678392 y rs2619312, que se
asociaron con toxicidad renal, apoyando la idea de que una disminución en el transporte
podría conducir a un aumento de los niveles del fármaco y, por tanto, a la toxicidad
inducida por el mismo. Igualmente, Ansari y cols. observaron que el genotipo ABCB4
934CA estaba relacionado con un mayor riesgo de trombocitopenia (Ansari y cols., 2009).
En nuestro estudio fue el genotipo wild type el que se asoció con un mayor riesgo
hematológico. Nuestros resultados podrían indicar que la mutación causa una mayor
expresión/función del transportador, lo que conduce a un flujo de salida adicional, menores
niveles intracelulares, y por lo tanto, menos toxicidad. En cualquier caso, el efecto
funcional del SNP C934A es controvertido (Abla y cols., 2008, Gradhand y Kim, 2008,
114
Discusión
Janke, 2008), siendo necesaria la realización de más estudios in vitro para explicar los
estudios con resultados contradictorios.
Con respecto a la toxicidad hepática, el número de pruebas realizadas con
aminotransferasas elevadas no se correlacionó con ninguno de los SNPs (probablemente
por la misma razón que en el estudio anterior: las aminotransferasas estaban elevadas en
la gran mayoría de las pruebas y por lo tanto, las diferencias entre los genotipos eran más
difíciles de identificar). El genotipo wild type 934CC se asoció con niveles altos de LDH sin
que hubiera evidencia de hemólisis o daño muscular en los pacientes (Vernetti y 2016); lo
que podría indicar la mayor sensibilidad conferida por este polimorfismo. Por último, no
podemos subestimar la influencia de muchas otras variantes genéticas sobre la toxicidad
inducida por MTX y/o 6-MP y que interactúan con los polimorfismos de los transportadores
de fármacos. Por ejemplo, un estudio muy reciente ha demostrado que la interacción entre
las variantes NUDT15, que desfosforila los metabolitos activos de la tiopurina, y ABCC4 se
asocia con un aumento de la intolerancia a 6-MP en niños con LAL (Tanaka y cols., 2017).
Entre las limitaciones de nuestro trabajo destaca obviamente el tamaño reducido de la
serie de pacientes, que por ejemplo evitó que pudiéramos reclutar sujetos con genotipos
poco comunes, ej. ABCC4 934AA. Sin embargo, el hecho de que el estudio se realizara en
el hospital de referencia de nuestro distrito de salud, permitió que todos los pacientes
fueran diagnosticados y tratados por los mismos clínicos y bajo criterios unificados,
reduciendo así la posibilidad de la aparición de sesgos por la estructura de la población.
Otra limitación es que no se midieron los niveles eritrocíticos de MTX o sus metabolitos
tóxicos. No obstante, consideramos que la intensidad del tratamiento fue adecuada, dado
el estrecho seguimiento y el elevado porcentaje de niveles altos de aminotransferasa
(signo de la elevada adherencia), lo que indica que la utilización de dosis más bajas de
MTX no comprometió la eficiencia del tratamiento.
115
Discusión
Hasta donde sabemos, no existen estudios previos dirigidos a determinar los efectos de
los SNPs del gen DHFR sobre el ajuste de dosis de MTX en el tratamiento de la LAL
infantil. La escasa información disponible se centra en el resultado de la terapia (Al-Shakfa
y cols., 2009, Dulucq y cols., 2008, Kodidela y cols., 2015) o bien evalúa el impacto en la
terapia con MTX a dosis altas (Koomdee y cols., 2012). Nuestros hallazgos, aun siendo
preliminares debido a las limitaciones descritas, sugieren que la identificación de
polimorfismos en la región promotora del gen DHFR puede ser útil para adaptar la dosis de
MTX en la terapia de mantenimiento de pacientes pediátricos con LAL.
En cuanto a los transportadores, la información disponible en relación a su efecto sobre la
eficacia, toxicidad y, en particular, la dosificación de fármacos en la terapia de
mantenimiento en niños con LAL es muy escasa en comparación con el gran número de
estudios realizados en enzimas metabolizadoras. Nuestros resultados, a pesar de la
limitaciones mencionadas, indican que la variabilidad genética en los genes ABCB1 y
ABCC4 pueden conferir mayor sensibilidad a los pacientes, y por lo tanto su determinación
podría ser útil para adaptar el tratamiento en la terapia de mantenimiento
116
7. CONCLUSIONES
117
Conclusiones
7. CONCLUSIONES
1. El genotipo DHFR -680AA se encontró asociado con un porcentaje menor de MTX
administrado respecto a la dosis estándar y con un mayor número de controles
sanguíneos dentro del rango terapéutico de leucocitos y con aquellos en rango tóxico.
2. Aunque en menor medida, los genotipos DHFR 19-bp DD y -317GG se asociaron
también con un mayor número de controles sanguíneos en rango terapéutico de
leucocitos y de controles con leucocitos < 3.0 109/L.
3. Los portadores homocigotos DHFR -680AA experimentaron más episodios de
neutropenia severos y más número de controles con niveles elevados de LDH que los
portadores de los genotipos -680CC o CA.
4. Los portadores del alelo ABCC4 -934A recibieron un porcentaje de dosis inicial de
MTX mayor de la recomendada en comparación con aquellos pacientes que no
presentaron esta variante.
5. Los portadores del genotipo homocigoto ABCB1 1236TT recibieron un porcentaje
menor de dosis de 6-MP que los pacientes con los genotipos CC y CT.
6. Se observó un efecto gen-dependiente para el SNP ABCB1 C1236T en cuanto al
porcentaje de controles sanguíneos con mielosupresión eficaz, que se incrementaba
significativamente con cada alelo T.
7. El polimorfismo ABCB1 C1236T se asoció con la aparición de eventos hematológicos,
especialmente neutropenia, mientras que el ABCC4 C934A se encontró relacionado
con el número de episodios con niveles elevados de LDH.
118
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143
Anexos
ANEXO I. CLASIFICACIÓN INTERNACIONAL PARA CÁNCER INFANTIL (ICCC-3)
I Leucemias, enfermedades mieloproliferativas y mielodisplásicas
h. Ia Leucemias linfoides:
i. Ia1 Leucemias de células precursoras.
ii. Ia2 Leucemias de células B maduras.
iii. Ia3 Leucemias de células T maduras y células NK.
iv. Ia4 Leucemias linfoides NOS.
i. Ib Leucemias mieloides agudas.
j. Ic Enfermedades crónicas mieloproliferativas.
k. Id Sindrome mielodisplásico y otras enfermedades mieloproliferativas.
l. Ie No especificadas y otras.
II Linfomas y neoplasias reticuloendoteliales:
m. IIa Linfomas de Hodgkin.
n. IIb Linfomas no Hodgkin (excepto Burkitt):
i. IIb1 Linfomas de células precursoras.
ii. IIb2 Linfomas de células B maduras (excepto Burkitt).
iii. IIb3 Linfomas de células T maduras y células NK.
iv. IIb4 Linfomas no Hodgkin NOS.
o. IIc Linfoma de Burkitt.
p. IId Miscelánea de neoplasias linforeticulares.
q. IIe Linfomas no especificados.
144
Anexos
ANEXO II. DIAGNÓSTICO DE LAL
El diagnóstico de la LAL se basa en la observación morfológica de ≥25% de blastos de
línea linfoide en médula ósea. El diagnóstico inicial incluye:
1. Historia completa.
2. Examen físico incluyendo exploración neurológica completa y de sitios afectados o
sospechosos, ganglios, hígado, bazo y testículos.
3. Hemograma con recuento diferencial.
4. Estudios de hemostasia básica: tiempo de protrombina (TP), tiempo de cefalina
(TTPa), fibrinógeno, dímero-D.
5. Estudios de trombofilia (altamente recomendables): proteína S, proteína C, niveles
de antitrombina III (ATIII), mutación FV Leiden, mutación G20210A del gen de la
protrombina.
6. Bioquímica completa: sodio, potasio, creatinina, AST, ALT, GGT, bilirrubina,
fosfatasa alcalina, LDH, colesterol, triglicéridos, ácido úrico, urea, calcio, fósforo.
7. Serologías víricas de hepatitis (B, C), CMV, VEB y HIV.
8. Análisis de orina (tira reactiva).
9. Test de embarazo en adolescentes con menarquia.
10. Cultivo de localizaciones infecciosas si existe fiebre o sospecha de infección.
11. Aspirado de médula ósea.
12. Punción lumbar antes de iniciar la prefase citorreductiva.
13. Radiografía de tórax.
14. TC y/o RM craneal/abdominal en caso de observarse masas y según criterio clínico.
15. Ecografía de abdomen (y en otros territorios, testículos, cuello, etc…según clínica).
16. ECG y Ecocardiografía.
17. Valorar fondo de ojo según clínica.
Se pueden realizar otros exámenes adicionales de acuerdo a las necesidades
individuales.
145
Anexos
ANEXO III. CERTIFICADO DEL COMITÉ DE BIOÉTICA DE LA UNIVERSIDAD DE
EXTREMADURA PARA LA REALIZACIÓN DE ESTE TRABAJO
146
Anexos
ANEXO IV. ARTÍCULOS CIENTÍFICOS
PUBLICADOS
ORIGINAL ARTICLE
Dihydrofolate Reductase Genetic Polymorphisms Affect

Methotrexate Dose Requirements in Pediatric Patients With
Acute Lymphoblastic Leukemia on Maintenance Therapy
Guillermo Gervasini, PharmD, PhD,* Silvia G. de Murillo, PharmD,*
Mercedes Jimeńez, BSc,* Marıá D. de la Maya, MD,w
and Jose M. Vagace, MD, PhDw
implementation of maintenance therapy with daily 6-

Summary: We have aimed to determine the effect of poly- mercaptopurine (6MP) and weekly methotrexate (MTX)
morphisms in regulatory regions of the DHFR gene in relation to for several years after remission has greatly contributed to
methotrexate (MTX) dose adjustments and drug-induced toxicity this improvement.2–4 However, this treatment is not with-
in children on maintenance therapy for acute lymphoblastic leu-
kemia (ALL). In total, 41 children diagnosed with ALL were
out drawbacks. One of them is the wide interindividual
screened for 3 tag-single nucleotide polymorphisms in the DHFR variability observed in the bioavailability of MTX and
promoter (C-1610G, C-680G/T, A-317G) and an intronic 19-bp 6MP, which leads to continuous dose adjustments and also
insertion/deletion. Genotypes were analyzed in relation to dose treatment interruptions because of toxicity.5 Furthermore,
requirements and toxicity. The percentage of MTX dose adminis- there is no international consensus on what starting doses
tered (with respect to protocol-recommended values) was affected should be used, how to correct them to obtain the targeted
by DHFR polymorphisms. Carriers of the 680AA genotype myelosuppression or which is the right method to evaluate
displayed a median percentage of 44.08 (interquartile range = the intensity of the therapy.6
34.69), compared with 77.98 (interquartile range = 33.90) for CC One factor that holds the potential to be useful for
and CA carriers (P = 0.01). The number of counts within white
blood cell therapeutic range (2.0 to 3.0 109/L) was higher for
tailoring chemotherapy in ALL, and MTX dosing in par-
680AA carriers than for CC/CA carriers (P = 0.003). With ticular, is genetic variability. Polymorphisms in genes
regard to toxicity, carriers of the 680AA genotype displayed affecting the bioavailability of MTX have been shown to
more treatment interruptions than CC/CG carriers (P = 0.03), as impact the outcome of childhood ALL.7–9 In particular, the
well as more episodes of severe neutropenia (P = 0.04) and higher dihydrofolate reductase (DHFR) gene, coding for the major
number of blood counts with elevated levels (> 400 mg/dL) of target of MTX in the cell, has been pointed out as an
lactate dehidrogenase (P = 0.04). Overall, our findings suggest that important locus in this regard. Variants in the DHFR
the identification of DHFR polymorphisms in the promoter region promoter region have been shown to increase transcrip-
of the gene may be helpful in tailoring MTX doses for ALL tional activity, which results in decreased event-free survival
pediatric patients on maintenance therapy.
(EFS).10 Later studies have confirmed the importance of the
Key Words: methotrexate, dihydrofolate reductase, acute lympho- 50 -UTR DHFR region for the outcome of ALL ther-
blastic leukemia, polymorphism, maintenance apy.11–13 However, to our knowledge, the effect of these
genetic variants on MTX dosing in maintenance therapy
(J Pediatr Hematol Oncol 2017;39:589–595) has not been studied.
We have aimed to determine the effect of poly-
morphisms in the DHFR noncoding region in relation to
I n the last decades, the chemotherapy of pediatric acute

lymphoblastic leukemia (ALL), the most common
malignancy in children, has reached success rates of up to
the extent of reduction from protocol-recommended start-
ing doses and drug-induced toxicity in children on main-
tenance therapy for ALL.
90% in western countries.1 Among other factors, the
Received for publication February 24, 2017; accepted June 7, 2017.

METHODS
From the *Department of Medical and Surgical Therapeutics, Division
of Pharmacology, Medical School, University of Extremadura; and Participants
wService of Pediatric Hematology, Materno Infantil Hospital, The study participants were 41 children diagnosed
Badajoz, Spain. with T and B-ALL at Hospital Materno Infantil (Badajoz,
Supported in part by grant PI15/00804 from Instituto de Salud Carlos
III, Madrid, Spain and grant GR15012 from Junta de Extrem-
Spain) who were treated with the SHOP/ALL 99 and 05
adura, Consejeria de Economia, Comercio e Innovacion, Merida, protocols between 2004 and 2016. Patients were assigned to
Spain. standard (SR), intermediate (IR) or high-risk (HR) groups
The authors declare no conflict of interest. according to age, white blood cell (WBC) count, cytoge-
Reprints: Guillermo Gervasini, PharmD, PhD, Department of Medical
and Surgical Therapeutics, Division of Pharmacology, Medical
netics results, leukemia immunophenotype, and treatment
School, University of Extremadura, 06071, Badajoz, Spain (e-mail: response.14,15
ggervasi@unex.es). In brief, the SHOP/ALL protocols (which have pre-
Supplemental Digital Content is available for this article. Direct URL viously been thoroughly described14,15) included an induc-
citations appear in the printed text and are provided in the HTML
and PDF versions of this article on the journal’s Website,
tion phase for all patients with daunorubicin, vincristine,
www.jpho-online.com. prednisone, cyclophosphamide, asparaginase, and triple
Copyright r 2017 Wolters Kluwer Health, Inc. All rights reserved. intrathecal therapy (MTX, hydrocortisone, and cytarabine).
J Pediatr Hematol Oncol Volume 39, Number 8, November 2017 www.jpho-online.com | 589
Copyright r 2017 Wolters Kluwer Health, Inc. All rights reserved.
Gervasini et al J Pediatr Hematol Oncol Volume 39, Number 8, November 2017
The consolidation phase, also for all patients, consisted of also determined by simple CRP amplification as described
high-dose MTX, 6MP, cytarabine, and triple intrathecal elsewhere.10
therapy. IR patients were also subjected to intensification It should be noted that blood samples were not always
therapy with dexamethasone, vincristine, 40 -epi-adriamycin, collected at remission, and therefore there is the chance that
asparaginase, cyclophosphamide, cytarabine, high-dose some genotyping results could have been altered by the
MTX, and triple intrathecal therapy. In the HR patients, presence of tumor cells.
consolidation consisted of 3 to 5 treatment blocks depend-
ing whether or not they were scheduled for allogeneic Statistical Analyses
hematopoietic transplant. The Fisher exact or the Pearson w2 test were used for
Finally, the maintenance phase for SR and IR patients the univariate analysis of the associations between catego-
included 60 mg/m2 daily of 6MP and 20 mg/m2 weekly of rical data. The ANOVA/t student’s or Mann-Whitney/
MTX. Our series also included 3 HR patients who received Kruskal-Wallis tests were used to compare quantitative
maintenance therapy with the same doses because they were variables between groups, as appropriate, and were per-
considered unsuitable for the transplant. Being a study formed by IBM SPSS statistics 22 (Chicago, IL). The
carried out in a single center with homogenous clinical SNPassoc R package was utilized to evaluate the appro-
criteria, all the dose adjustments were performed in the priate model of inheritance (codominant, dominant, or
same manner. Thus, MTX doses were corrected until tar- recessive) in the genetic analyses.16 Haplotype associations
geted myelosuppression (WBC = 2.0 to 3.0 109/L) was and linkage disequilibrium (LD) information were obtained
reached. In total, 6MP doses were not modified unless with the haplo.stats package, also in the R environment.
aminotransferases levels were > 500 IU/L. Of note, 6MP Frequency threshold for rare haplotypes was set at 0.05.
dosing was not affected by DFHR genetic variability (data A P-value of 0.05 was set as the statistical significance
not shown). Maintenance therapy was initiated at treat- threshold (0.0125 after Bonferroni correction for multiple
ment weeks 14 (SR), 20 (IR risk), and 32 (HR), and con- testing).
tinued until 2 years from diagnosis. Clinical and analytical
controls in all patients were carried out every 15 days or RESULTS
weekly (in case of toxicity). Clinical characteristics of the ALL patients that par-
None of the patients were carriers of any TPMT ticipated in the study are described in Table 1. Results are
clinically relevant variant and hence no analyses in this shown as median and interquartile range (IQR) unless
regard were performed. otherwise stated. Duration of the maintenance therapy was
The study was approved by the University of 81 (IQR = 16) weeks. During this time a total of 1771
Extremadura Bioethics Committee. Written informed con- blood counts and biochemistry analyses were performed (44
sent was obtained from all the legally accepted repre- [IQR = 11] per patient). Of the 1771 analyses, 1217 (68%)
sentatives of the pediatric patients. showed sufficient myelosupression (WBC < 3.0 109/L)
Clinical Variables
Clinical records were retrospectively reviewed after TABLE 1. Clinical Characteristics of ALL Patients Included in the
Study
completion of the treatment to retrieve MTX dosing data
and toxicity parameters and analyze their putative associ- Parameters Cases (n [%])
ation with genotypic data. Variables analyzed were number Age at diagnosis (y) 5.0 (6.0)
of blood counts within WBC therapeutic range (2.0 to Sex
3.0 109/L), percentage of starting MTX dose administered Females 24 (58.5)
and percentage of starting MTX dose administered when Males 17 (41.5)
the patient was within WBC therapeutic range. Risk
Hematopoietic, hepatic, and renal toxicity was docu- Low 9 (22.0)
mented and graded retrospectively using the Common Intermediate 29 (70.7)
High 3 (7.3)
Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) version
At diagnosis
4.0. Parameters registered were the number of episodes of WBC (109/L) 6.7 (19)
leukopenia, neutropenia, thrombocytopenia, and anemia; Hb (g/dL) 8.9 (4.8)
the number of blood counts with raised levels of amino- Platelets (109/L) 69 (127)
transferases; urea concentrations; and the number of blood Lymphoadenopathy 24 (58.5)
counts with elevated lactate dehidrogenase (LDH), hypo- Hepatosplenomegaly 21 (51.2)
glucemia, or C-reactive protein (CRP) values >5. Mediastinal mass 7 (17.1)
% Blasts in peripheral blood 19 (78)
Genotyping Throughout maintenance
WBC (109/L) 2.7 (0.6)
Genomic DNA was isolated by using a QIAamp DNA
Hb (g/dL) 12 (0.5)
Blood Kit (Qiagen, Hilden, Germany) from 5-mL whole Neutrophiles (109/L) 2.7 (0.9)
blood samples. Three single nucleotide polymorphism Lymphocytes (109/L) 0.7 (0.4)
(SNPs) in the DHFR promoter, namely C-1610G, C-680G/ Lineage
T, A-317G, which have been shown to capture the varia- B-ALL 37 (90.2)
bility of this regulatory region,10 were identified by real- T-ALL 4 (9.8)
time CRP using TaqMan SNP Genotype Assays from
Number of cases and percentage or median (and interquartile range)
Life Technologies (Rockville, MD) according to the man- values are shown.
ufacturer instructions. An additional 19-bp insertion/del- ALL indicates acute lymphoblastic leukemia; Hb, hemoglobin; WBC,
etion polymorphism in intron 1, which was shown to white blood cell.
interact with promoter variants to affect ALL outcome, was
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J Pediatr Hematol Oncol Volume 39, Number 8, November 2017 DHFR SNPs in Acute Lymphoblastic Leukemia
TABLE 2. Genotypic and Allelic Frequencies Observed and Comparison With Those Found for White Individuals in HapMap
Polymorphism Genotype N % MAF MAF* Pw
DHFR 19 bp ins/del I/I 16 39.02 0.378 0.476z 0.844
I/D 19 46.34 — — —
D/D 6 14.63 — — —
DHFR A-317G (rs408626) A/A 16 39.02 0.378 0.450 0.885
A/G 19 46.34 — — —
G/G 6 14.63 — — —
DHFR C-680A (rs442767) C/C 26 63.41 0.243 0.319 0.870
C/A 10 24.39 — — —
A/A 5 12.20 — — —
DHFR C-1610My (rs1650694) C/C 15 36.59 0.451 0.360 0.850
C/M 15 36.59 — — —
M/M 11 26.83 — — —
*Minor allele frequencies in HapMap-CEU population (whites).
wP-value for the differences between allele frequencies in our series and in HapMap populations.
zNo data in HapMap; frequency retrieved from Portuguese white subjects.17
yM stands for any of the variant alleles (G/T).
DHFR indicates dihydrofolate reductase; MAF, minor allele frequency.
and 689 (38.9) were within WBC therapeutic range (2.0 to 680 CC/CA carriers were 51.26 (IQR = 32.61) and
3.0 109/L). Elevated levels of aminotransferases were 73.83 (IQR = 32.70), respectively (P = 0.03; Fig. 2C),
present in a median of 75.6 (IQR = 27.83) tests. Treatment although statistical significance was lost after Bonferroni
was interrupted because of infection or toxicity a median of correction.
16 (30) days per patient. The number of blood counts according to WBC range
Throughout the whole maintenance therapy, patients differed across DHFR SNPs (Table 3). Again, the C-680A
were given on average 49.9 mg/m2 of 6MP (83.8% of SNP was strongly associated with the number of counts
starting dose) and 13.28 mg/m2 of MTX (65.3% of starting within WBC range (23 [IQR = 6] for AA carriers vs. 16.5
dose). When only blood counts within therapeutic WBC [IQR = 7.8] for CC/CA carriers; P = 0.003). The same
range were considered, the average MTX and 6MP doses genotype was also related to the number of counts below
were 14.6 mg/m2 (73.04% of starting dose) and 51.18 mg/m2 3.0 109/L WBC (43 [IQR = 11] vs. 31 [IQR = 14.25] for
(85.3%), respectively. Administered doses did not correlate the same genotypes; P = 0.001) and with those in toxic
with the duration of the treatment nor did they differ range (P = 0.03; Table 3). In addition, although to a lesser
significantly across risk groups. extent, the 19-bp DD and 317GG genotypes were asso-
Of the 41 patients treated, with a median follow-up of ciated with a higher numbers of blood counts within WBC
128 (range, 7 to 145) months, 4 (9.8%) relapsed, and 3 range and below 3.0 109/L (P = 0.03 and 0.02,
(7.3%) died. respectively; Table 3). Supplementary Table S2 (Supple-
mental Digital Content 2, http://links.lww.com/JPHO/
Impact of DHFR Genotypes on MTX Dosing A214) shows the numbers corresponding to the 3 genotypes
Table 2 shows the distribution of the allelic and gen- in each polymorphism.
otypic frequencies observed in the population of study,
which were not different from those observed in related Association Between DHFR Genotypes and
populations (Table 2). The 19 bp ins/del and the A-317G Toxicity
SNPs were found to be in almost complete LD (D’ = 0.947, The median number of days of treatment interruption
r2 = 0.898). The 4 haplotypes identified in the patient series in our series was 16 (IQR = 30). Carriers of the 680AA
and complete LD information can be seen in Supple- genotype displayed a higher number of interruptions than
mentary Figure S1 (Supplemental Digital Content 1, http:// CC or CG carriers (30 [IQR = 51] vs. 11.5 [IQR = 29] d,
links.lww.com/JPHO/A213). respectively; P = 0.03). None of the other SNPs affected
The percentage of MTX dose administered (with this parameter (data not shown).
respect to protocol standard values) was affected by the With regard to hematological toxicity, carriers of the
DHFR polymorphisms, with generally lower doses received homozygous 680AA genotype experienced more severe
by carriers of homozygous variant genotypes (Fig. 1). In (grade 3 to 4) neutropenia episodes than CC/CA carriers
particular, a significant correlation was observed for the C- did (19 [IQR = 14] vs. 11.5 [IQR = 11], respectively;
680A SNP, as carriers of the AA genotype were administered P = 0.04). Other hematological toxicities of grades 3 to 4
a median of 44.08 (IQR = 34.69) % MTX starting dose, were not frequent enough as to perform association anal-
compared with a 77.98 (IQR = 33.90) % received by CC and yses with genotypes. Regarding biochemistry, the 680AA
CA carriers (P = 0.01, Fig. 1C). The association remained homozygous genotype was also related to a higher number
significant after correcting for multiple testing. Supple- of blood counts with highly elevated levels (> 400 mg/dL)
mentary Table S1 (Supplemental Digital Content 2, http:// of LDH (41 [IQR = 5] vs. 33 [IQR = 28] for CC/CA car-
links.lww.com/JPHO/A214) show percentages for all 3 gen- riers; P = 0.04). It should be noted, however, that all
otypes of the 4 SNPs studied. The picture was quite similar associations with toxicity parameters lost significant after
when the analysis was constrained to doses administered to correction for multiple testing. Supplementary Table S3
patients in WBC therapeutic range (Fig. 2). In this case, the (Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/
percentages of starting dose administered to 680AA and JPHO/A214) shows values for these toxicity parameters
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FIGURE 1. Percentage of standard methotrexate starting dose administered according to DHFR polymorphisms. A, 19-bp ins/del.
B, A-317G. C, C-680G. D, C-1610M (M stands for any of the variant alleles, G or T). del indicates deletion; ins, insertion.
stratified according to the 3 genotypes of the DHFR poly- DISCUSSION

morphisms considered. MTX is the cornerstone of childhood ALL protocols.
No associations were observed for any SNP in relation Its major mechanism involves the inhibition of DHFR,
to the incidence of hypoglycemia, raised levels of urea which results in the lack of folate coenzymes and impair-
(> 18 mg/dL) or C-reactive protein values >5. ment of purine and pyrimidine synthesis. There are indi-
Finally, and although it was not among the aims of cations that changes in DHFR expression may affect ALL
this work, we reviewed clinical records of the patients to outcome in children treated with MTX.10,13,18,19 Most
identify putative associations between the 680AA geno- noticeably, 2 studies by the same Canadian group have
type and toxic events occurring after the administration of shown that combinations of SNPs in the DHFR promoter
high-dose or IT MTX. However, only 8 cases of MTX- region were associated with lower EFS,10 especially in HR
induced toxicity were identified, of which just one patient patients.13 In addition, elevated DHFR expression levels
carried the SNP in homozygosity, and therefore no poten- have been related to MTX resistance in childhood
tial associations could be analyzed. ALL.18,19
In this regard, our results indicate that, throughout
maintenance, patients who carried the AA genotype of the
Haplotype Study C-680A SNP were administered a lower percentage of the
The frequency of the 4 DHFR haplotypes identified protocol-recommended MTX starting dose (20 mg/m2)
and their effect of the on the percentage of MTX dose than were carriers of the CC/CA genotypes (a difference of
administered (both overall and in patients within ther- >30%). A possible explanation for this finding would be a
apeutic range) is shown in Supplementary Table S1 (Sup- decreased expression of DHFR caused by the polymorphism,
plemental Digital Content 2, http://links.lww.com/JPHO/ which would in turn result in increased sensitivity to MTX
A214). None of the haplotypes showed a relevant effect on effects and therefore lower dose requirements. However,
MTX dose reductions. In the same manner, no association the precise effect of the C-680A SNP on DFHR enzyme
with toxicity observed was found in the haplotype analysis expression is unknown. In vitro studies analyzing the func-
(data not shown). tional impact of DHFR polymorphisms are very scarce.
FIGURE 2. Percentage of standard methotrexate starting dose administered according to DHFR polymorphisms. Only doses adminis-
tered when the patient was in leukopenic therapeutic range are considered. A, 19-bp ins/del. B, A-317G. C, C-680G. D, C-1610M (M
stands for any of the variant alleles, G or T). del indicates deletion; ins, insertion.
A Canadian research group examine this and other SNPs in unequivocally determine the effect of this and other SNPs on
relation to changes in mRNA expression, but the authors DHFR expression.
failed to find a relevant impact of the C-680A SNP.10,13 A shared drawback in ALL protocols is that the WBC
Therefore, the reason why 680AA carriers would be more levels utilized to adjust MTX doses reflect both treatment
sensitive to MTX pharmacological effects remains to be intensity, the child’s normal WBC, the patient’s adherence
elucidated and further in vitro studies are needed to to therapy and the clinician’s skill to adjust doses, which
TABLE 3. Influence of Genetic Polymorphisms in DHFR Noncoding Regions on the Number of Blood Counts Within the Indicated White
Blood Cell Range
Polymorphism Genotype Below 3.0¾109/L Within Range (2.0-3.0¾109/L) Below 2.0¾109/L
19 bp I/D II/ID 26 (12) 17 (6.5) 9 (10)
DD 40 (16.50)* 23 (6)* 17 (9.5)
A-317G AA/AG 26 (12) 17 (6.5) 9 (10)
GG 40 (16.50)* 23 (6)* 17 (9.5)
C-680A CC/CA 26 (12) 16.5 (7.8) 9 (10)
AA 43 (11)** 23 (6)** 17 (9.5)*
C-1610M CC/CM 31 (14.25) 17 (7.5) 12 (12)
MM 24 (11.50) 19 (13.8) 6.5 (7.5)
Median (and interquartile range) values are shown.
DHFR indicates dihydrofolate reductase.
*P < 0.05.
**P < 0.005.
can vary widely.5 This is why we repeated the genotype/ Finally, the haplotype study did not reveal any rele-
dosing association analyses using for the calculations only vant associations with drug dosing or toxicity. Dulucq
doses administered when the patient was within the tar- et al10 have previously used the same tag SNPs to define
geted myelosuppression range. Although the level of sig- several haplotypes which turned out to be related to worse
nificance was reduced, there was still a noticeable effect of EFS in childhood ALL, but no analyses regarding doses
the 680AA genotype on the percentage of dose admin- administered or toxicity parameters were carried out. Our
istered with respect to standard doses. haplotype analysis was hampered by the main limitation of
The higher sensitivity conferred by the 680AA the present study, which is its relatively small sample size
homozygous genotype (the only SNP whose effect was still and the resulting limited statistical power. However, the
significant after correcting by multiple testing) was con- fact that the study was performed in just 1 hospital of a
firmed by subsequent analyses that revealed that, despite small health district allowed all the patients to be diagnosed
receiving lower doses, patients carrying this genotype were and followed in the same facility with the same clinical
also more easily maintained within adequate myelosup- criteria, which reduced the chance that findings may be due
pression levels. This is key for the outcome of chemo- to population structure. Another limitation is that eryth-
therapy in childhood ALL, as most studies have shown that rocyte levels of MTX or its cytotoxic metabolites were not
low WBC during maintenance therapy is associated with measured. Notwithstanding, we consider that treatment
red blood cell levels of cytotoxic 6MP/MTX metabolites intensity was adequate, given the close follow-up and the
and reduced relapse rate.20–22 The number of patients in high percentage of raised aminotransferases levels (a sign of
our series was too limited to perform outcomes analysis, high adherence), which indicates that the lower MTX doses
but all the 680AA carriers, who were more frequently in utilized in our series did not compromise the efficiency of
WBC therapeutic range, are in complete remission at the the treatment.
present time. To our knowledge, there are no previous studies aimed
It is remarkable that the patients in our series were to determine the effect of DHFR SNPs on MTX dosing in
given on an average <66% of the standard starting MTX the childhood ALL setting. The scarce available informa-
dose of 20 mg/m2. Aside from genetics, there must be other tion is focused on the outcome of therapy10,11,13 or eval-
factors that contribute to this relevant dose reduction from uates the impact on high-dose MTX therapy.26 Our find-
protocol recommendations. For instance, the use of tri- ings, preliminary as they are given the limited sample size,
methoprim/sulphamethoxazole during the induction phase suggest that the identification of DHFR polymorphisms in
to prevent infections has been related to leukopenia,23 the promoter region of the gene may be helpful in tailoring
which would translate into lower dose requirements. In any MTX doses for ALL pediatric patients on maintenance
case, the fact that the impact of the 680AA genotype was therapy. Further studies on larger and, very importantly,
still noticeable when only doses administered in WBC homogenous series of patients, are warranted to corrobo-
therapeutic range were considered, highlights the relative rate these initial results.
importance of the DHFR SNP.
For all the aforementioned reasons, it is tempting to
speculate that, at least in our series, the 20 mg/m2 starting REFERENCES
dose might in fact be too high and that 15 mg/m2 could be a 1. Hunger SP, Mullighan CG. Acute Lymphoblastic Leukemia in
more realistic figure. Children. N Engl J Med. 2015;373:1541–1552.
The second aim of the present work was to evaluate 2. Simone JV. The treatment of acute lymphoblastic leukaemia.
the effect of DHFR SNPs on MTX-induced toxicity. Our Br J Haematol. 1980;45:1–4.
results showed that carriers of the 680AA genotype had 3. Holland JF, Glidewell O. Chemotherapy of acute lymphocytic
more days of treatment interruptions, a higher incidence of leukemia of childhood. Cancer. 1972;30:1480–1487.
4. Rivera GK, Pinkel D, Simone JV, et al. Treatment of acute
severe neutropenia and greater LDH levels. This increment lymphoblastic leukemia. 30 years’ experience at St. Jude Child-
in adverse events is consistent with the higher sensitivity to ren’s Research Hospital. N Engl J Med. 1993;329:1289–1295.
the drug observed in these patients. Mirroring the situation 5. Schmiegelow K, Nielsen SN, Frandsen TL, et al. Mercapto-
formerly described for drug dosing, reports on the impact purine/methotrexate maintenance therapy of childhood acute
of DHFR variants on the toxicity induced by ALL main- lymphoblastic leukemia: clinical facts and fiction. J Pediatr
tenance therapy in children are extremely scarce. Our Hematol Oncol. 2014;36:503–517.
findings are in line with those of Kodidela et al,11 who also 6. Schmiegelow K, Nersting J, Nielsen SN, et al. Maintenance
reported an increased hematological toxicity for ALL therapy of childhood acute lymphoblastic leukemia revisited-
Should drug doses be adjusted by white blood cell, neutrophil,
pediatric patients carrying the 680A variant who were
or lymphocyte counts? Pediatr Blood Cancer. 2016;63:
treated with low doses of MTX. Other DHFR SNPs, for 2104–2111.
example, 19-bp ins/del, have also been related with liver 7. Pui CH. Genomic and pharmacogenetic studies of childhood
toxicity, although in adult ALL patients.24 We did not acute lymphoblastic leukemia. Front Med. 2015;9:1–9.
observe a direct relation between any of the SNPs studied 8. Gervasini G, Vagace JM. Impact of genetic polymorphisms
and the number of blood counts presenting elevation of on chemotherapy toxicity in childhood acute lymphoblastic
aminotransferases. The likely explanation is that amino- leukemia. Front Genet. 2012;3:249.
transferases levels were raised in the vast majority of 9. Gervasini G. Polymorphisms in methotrexate pathways: what
checkouts and hence differences between genotypes would is clinically relevant, what is not, and what is promising. Curr
be more difficult to detect. We did find, however, higher Drug Metab. 2009;10:547–566.
10. Dulucq S, St-Onge G, Gagne V, et al. DNA variants in the
levels of LDH in 680AA carriers. There was no evidence dihydrofolate reductase gene and outcome in childhood ALL.
of hemolysis or muscle damage in the patients, therefore the Blood. 2008;111:3692–3700.
rise of LDH must obey to liver toxicity;25 which would be 11. Kodidela S, Pradhan SC, Dubashi B, et al. Influence
another indication of the higher sensitivity to MTX effects of dihydrofolate reductase gene polymorphisms rs408626
conferred by the 680AA genotype. (-317A > G) and rs442767 (-680C > A) on the outcome of
methotrexate-based maintenance therapy in South Indian reductase gene leads to methotrexate resistance. Proc Natl
patients with acute lymphoblastic leukemia. Eur J Clin Acad Sci U S A. 2007;104:13513–13518.
Pharmacol. 2015;71:1349–1358. 20. Schmiegelow K, Pulczynska MK, Seip M. White cell count
12. Gomez-Gomez Y, Organista-Nava J, Saavedra-Herrera MV, during maintenance chemotherapy for standard-risk childhood
et al. Survival and risk of relapse of acute lymphoblastic acute lymphoblastic leukemia: relation to relapse rate. Pediatr
leukemia in a Mexican population is affected by dihydrofo- Hematol Oncol. 1988;5:259–267.
late reductase gene polymorphisms. Exp Ther Med. 2012;3: 21. Dolan G, Lilleyman JS, Richards SM. Prognostic importance
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13. Al-Shakfa F, Dulucq S, Brukner I, et al. DNA variants in phoblastic leukaemia. Leukaemia in Childhood Working Party
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14. Rives S, Estella J, Camos M, et al. T-cell pediatric acute intensity and therapy-induced leukocytopenia in intensive
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study group SHOP. Med Clin. 2012;139:141–149. Klin Padiatr. 1992;204:230–235.
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consecutive trials in childhood acute lymphoblastic leukaemia jiroveci pneumonia prophylaxis during maintenance therapy
performed by the Spanish Cooperative Group for Childhood influences methotrexate/6-mercaptopurine dosing but not
Acute Lymphoblastic Leukemia Group (SHOP) from 1989 to event-free survival for childhood acute lymphoblastic leuke-
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Gene 628 (2017) 72–77
Contents lists available at ScienceDirect
Gene
journal homepage: www.elsevier.com/locate/gene
Research paper
Effect of polymorphisms in transporter genes on dosing, efficacy and toxicity MARK

of maintenance therapy in children with acute lymphoblastic leukemia
Guillermo Gervasinia,⁎, Silvia G. de Murilloa, Mercedes Jiméneza, María D. de la Mayab,
Jose M. Vagaceb
a
Department of Medical & Surgical Therapeutics, Division of Pharmacology, Medical School, University of Extremadura, Badajoz, Spain
b
Service of Pediatric Hematology, Materno Infantil Hospital, Badajoz, Spain
A R T I C L E I N F O A B S T R A C T
Keywords: The aim of the present work was to assess whether polymorphisms in genes coding for drug transport proteins
Methotrexate may influence dosing, efficacy and toxicity of maintenance therapy with methotrexate (MTX) and 6-mercap-
Mercaptopurine topurine (6MP) in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). A total of 41 children with ALL were screened
Transporters for 10 SNPs in the SLC19A1, ABCB1, ABCC2, ABCC4 and ABCG2 transporter genes by means of direct se-
Acute lymphoblastic leukemia
quencing. Carriers of the ABCC4 934CC and ABCB1 1236TT genotypes received a lower percentage of the
Polymorphism
Maintenance
protocol-recommended starting dose of MTX (62.1 vs. 81.3% for 934CA carriers, p = 0.001) and 6MP (73.1 vs.
87.7% for 1236CC/CT carriers; p = 0.026), respectively. The C1236T SNP also increased the efficiency of
myelosuppression. Median (and interquartile) number of blood tests with leukocytes levels < 3 109/L for the
CC; CT and TT genotypes were 22 (13), 30.5 (11.75) and 33 (17.25), respectively (p = 0.001). In addition, this
SNP also correlated with the number of hematological adverse events (p = 0.004 for the difference between
same genotypes). The event more profoundly affected was neutropenia (p = 0.004). In the same manner, the
ABCC4 934CC genotype was also associated to more frequent hematological toxicity (p = 0.041 vs. CT carriers)
and raised LDH levels (p = 0.004 vs. CT carriers); although only the latter association remained significant after
correction by multiple testing. Overall, our findings indicate that variability in the ABCB1 and ABCC4 genes may
confer higher sensitivity to maintenance chemotherapy of ALL, and therefore its determination may be helpful in
individualizing this treatment.
1. Introduction in this function (Vlaming et al., 2009; Chen et al., 2002; Hooijberg
et al., 2003; Kool et al., 1999; Chen et al., 2003; Volk and Schneider,
In the last decades, the implementation of prolonged oral main- 2003). With regard to another relevant member of the ABC family,
tenance therapy with weekly methotrexate (MTX) and daily mercap- ABCB1 (multi drug resistance, MDR1), there is no direct evidence of its
topurine (6MP) has greatly contributed to the achievement of success implication in MTX transport, although genetic variants in the ABCB1
rates as high as 90% in the treatment of childhood acute lymphoblastic gene locus have been shown to influence MTX sensitivity in clinical
leukemia (ALL) (Hunger and Mullighan, 2015). studies (Takatori et al., 2006).
Methotrexate (MTX) is a folate inhibitor whose actions follow a The transport of 6MP into and out of the cell has been compara-
complex pattern that, as well as several metabolizing enzymes, includes tively much less studied, but some of the aforementioned transporters,
a number of transporters that determine the intracellular drug levels such as ABCB1 or ABCC4 have also been suggested to play a role, since
and those of active MTX-polyglutamates. MTX entry into cell is mainly they are able to transport thioguanine nucleotides (Lee et al., 2015; Ban
mediated by the solute carrier (SLC) 19A1 transporter (RFC1) (Moscow et al., 2010; Cheung et al., 2014).
et al., 1995), whilst the drug is pumped out by a number of membrane The genes encoding all these transporting proteins are known to
efflux transporters of the ATP-binding cassette (ABC) family. Thus, harbor functionally significant single nucleotide polymorphisms
ABCC1-4 (multi-drug resistance associated proteins 1-4, MRP14) and (SNPs). These SNPs can modify the intracellular concentrations of these
ABCG2 (breast cancer resistance protein, BCRP) have been implicated drugs or their active moieties and hence may have clinical
Abbreviation: ALL, Acute Lymphoblastic Leukemia; ABC, ATP-binding cassette; HR, high risk; IR, intermediate risk; MTX, Methotrexate; 6MP, 6-Mercaptopurine; SLC, Solute carrier;
SNP, Single Nucleotide Polymorphism; SR, Standard risk; WBC, white blood count
⁎
Corresponding author at: University of Extremadura, Medical School, Department of Medical and Surgical Therapeutics, Division of Pharmacology, 06071 Badajoz, Spain.
E-mail address: ggervasi@unex.es (G. Gervasini).
http://dx.doi.org/10.1016/j.gene.2017.07.025
Received 23 May 2017; Received in revised form 21 June 2017; Accepted 10 July 2017
Available online 12 July 2017
0378-1119/ © 2017 Elsevier B.V. All rights reserved.
G. Gervasini et al. Gene 628 (2017) 72–77
repercussions (Chen and Shen, 2015; Ranganathan et al., 2008; Ansari 24 T, G1249A and IVS 23 + 56 T > C; ABCC4 T-1393C and C934A
et al., 2009; Liu et al., 2014; Lopez-Lopez et al., 2013; Radtke et al., and ABCG2 C421A. SNPs were selected on the basis of previous reports
2013; Suthandiram et al., 2014). The aim of the present work was showing their impact on the drugs' pharmacokinetics and/or clinical
therefore to analyze putative associations between relevant SNPs in relevance (Ranganathan et al., 2008; Ansari et al., 2009; Liu et al.,
transporting genes and dose requirements, efficacy and toxicity in ALL 2014; Suthandiram et al., 2014; Rau et al., 2006; Shimasaki et al., 2008;
patients on maintenance therapy. Zgheib et al., 2014). The reactions were carried out on a ABI 3130 DNA
Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primers and PCR con-
2. Patients and methods ditions are presented in Supplementary Table S1.
None of the subjects were carriers of any relevant TPMT poly-
2.1. Participants morphism, as revealed by routine screening performed in our center,
and hence no analyses were performed in this regard. It should be
Forty-one pediatric patients with T and B-ALL treated and diagnosed noted, however, that these TPMT determinations are carried out by
at Hospital Materno Infantil (Badajoz, Spain) between 2004 and 2016 PCR-RFLP and therefore the lack of confirmation by sequencing
were included in this study. methods may have underestimated the frequency of these polymorph-
The patients were treated with the SHOP/ALL 99 and 05 protocols isms in our series.
(Rives et al., 2012; Badell et al., 2008). In brief, age, white blood cell
(WBC) count, leukemia immunophenotype, treatment response and
ctyogenetics results were used to assign risk status, namely standard 2.4. Statistical analyses
(SR), intermediate (IR) or high (HR). The protocols included an in-
duction phase for all patients with daunorubicin, vincristine, pre- The comparison of categorical data was carried out by Fisher's exact
dnisone, cyclophosphamide, asparaginase and triple intrathecal therapy or Pearson's ×2 test. Quantitative data were compared by ANOVA/t-
(MTX, hydrocortisone and cytarabine). The consolidation phase, also Student's or Mann-Whitney / Kruskal-Wallis tests, as appropriate.
for all patients, consisted of high-dose MTX, 6MP, cytarabine and triple Statistical tests were performed with IBM SPSS statistics 22 (Chicago,
intrathecal therapy. IR patients were also subjected to intensification IL). The SNPassoc R package (Gonzalez et al., 2007) was utilized to
therapy with dexamethasone, vincristine, 4′-epi-adriamycin, aspar- perform the associations between the ten SNPs and the different out-
aginase, cyclophosphamide, cytarabine, high-dose MTX and triple in- comes by logistic regression models adjusted by sex and risk group.
trathecal therapy. In the HR patients, consolidation consisted of 3–5 Groups of three genotypes were compared with a log-additive model. A
treatment blocks depending whether or not they were scheduled for p-value of < 0.05 was considered statistically significant that was
allogeneic hematopoietic transplant. lowered to 0.005 after Bonferroni correction for the 10 SNPs assayed.
The maintenance phase was initiated at treatment weeks 14 (SR), 20
(IR risk) and 32 (HR), and continued until 2 years from diagnosis. This
therapy consisted of 60 mg/m2 daily of 6MP and 20 mg/m2 weekly of 3. Results
MTX. The three HR patients included in our series also received
maintenance therapy with the same doses because they were con- Details on the clinical features of the 41 patients who participated in
sidered unsuitable for the transplant. Dose adjustments in maintenance the study (17 males and 24 females with ages ranging from 1 to
were performed with the same criteria in all patients. MTX doses were 14 years) are listed in Table 1. Median duration of the maintenance
corrected until targeted myelosuppression (WBC = 2.0–3.0 109/L) was therapy was 81 weeks (interquartile range, IQR = 16). At diagnosis, 24
reached, whilst 6MP doses were not modified unless aminotransferases (58.5%) patients presented with lymphoadenopathy, 21 (51.2%) with
levels were > 500 UI/L. Clinical and analytical controls in all patients hepatosplenomegaly and 7 (17.1%) with mediastinal mass. Out of the
were carried out every 15 days or every week in case of toxicity. 41 children treated, four (9.8%) relapsed and three (7.3%) died.
The study was approved by the University of Extremadura Bioethics Throughout maintenance therapy, each patient was subjected to a
Committee. Written informed consent was obtained from all the legally median of 44 (IQR = 11) blood counts and biochemistry analyses, to-
accepted representatives of the pediatric patients. talizing 1771 lab tests. Approximately 40% of blood counts (689) were
within the targeted WBC range (2.0–3.0 109/L).
2.2. Clinical assessment
Table 1
After completion of the treatment, clinical records were reviewed to Clinical characteristics of ALL patients included in the study. Number of
document MTX and 6MP dose requirements, as well as parameters in- cases (and percentage) or median (and interquartile range) values are
dicative of efficacy and toxicity. Collected data included the percentage shown.
of standard MTX or 6MP dose actually administered and percentage of
Cases
dose administered when the patient was within WBC therapeutic range.
Efficacy was assessed by the number of blood counts with WBC below Lineage
3.0 109/L. Renal, hepatic and hematopoietic toxicities were identified B-ALL 37 (90.2%)
and graded using the Common Terminology Criteria for Adverse Events T-ALL 4 (9.8%)
Risk
(CTCAE) version 4.0. Toxicity parameters registered were the accu-
Low 9 (22.0%)
mulated days of treatment interruptions, the number of episodes of Intermediate 29 (70.7%)
leukopenia, neutropenia, thrombocytopenia and anemia; the number of High 3 (7.3%)
blood counts with raised levels of aminotransferases, elevated LDH, At diagnosis
hypoglucemia or CRP values > 5 and urea concentrations. WBC (109/L) 6.7 (19)
Hb (g/dL) 8.9 (4.8)
Platelets (109/L) 69 (127)
2.3. Genotyping % Blasts in peripheral blood 19 (78)
Throughout maintenance
Genomic DNA was isolated by using a QIAamp DNA Blood Kit WBC (109/L) 2.7 (0.6)
Hb (g/dL) 12 (0.5)
(Qiagen, Hilden, Germany) from 5-ml whole blood samples. The fol-
Neutrophiles (109/L) 2.7 (0.9)
lowing 10 polymorphisms were screened for by direct sequencing: Lymphocytes (109/L) 0.7 (0.4)
SLC19A1 G80A; ABCB1 C3435T, G2677 T/A and C1236T; ABCC2 C-
73
Table 2 (and IQR) values for the CC; CT and TT genotypes were 22 (13), 30.5
Genotypic and allelic frequencies observed and comparison with those found for (11.75) and 33 (17.25), respectively (p = 0.0044). The association re-
Caucasian individuals in HapMap.
tained statistical significance after Bonferroni correction of the data.
Polymorphism Genotype N % MAF HapMapa
3.2. Effect of genetic polymorphisms on toxicity of maintenance phase
SLC19A1 G80A GG 9 22.0 0.451 0.437
GA 27 65.8
Overall, treatment was interrupted because of toxicity or infection a
AA 5 12.2
ABCB1 C1236T CC 11 26.8 0.488 0.451 median of 16 (IQR = 30) days. With regard to hematological toxicity, a
CT 20 48.8 total of 3598 events of grades 1 to 4 were registered for all the patients
TT 10 24.4 during the maintenance phase. Remarkably, the ABCB1 C1236T, also
ABCB1 G2677 T/A GG 12 29.3 0.451 0.469 correlated with the number of these episodes (p-values = 0.002). The
GT 21 51.2
other SNP that had shown an impact on maintenance dosing and effi-
TT 8 19.5
ABCB1 C3435T CC 11 26.8 0.463 0.534 cient myelosuppression, ABCC4 C934A SNP, also showed an association
CT 22 53.7 with hematological toxicity (p = 0.041), although statistical sig-
TT 8 19.5 nificance was lost after correcting by multiple testing (Fig. 3). When the
ABCC2 C-24 T CC 22 53.7 0.268 0.225
hematological toxicities were analyzed by separate (Table 3), the
CT 16 39.0
TT 3 7.3 ABCB1 C1236T SNP was significantly related to the incidence of mild
ABCC2 G1249A GG 29 70.8 0.158 0.233 neutropenia (p = 0.004). Its association with thrombocytopenia
GA 11 26.8 (0.023) and that of the ABCC4 C934A SNP with mild anemia
AA 1 2.4 (p = 0.018) did not survive correction by multiple testing.
ABCC2 IVS 23 + 56 T > C TT 12 29.2 0.463 0.387
Elevated levels of aminotransferases were present in a median of
TC 20 48.8
CC 9 22.0 75.6 (IQR = 27.83) lab tests, but this number did not differ sig-
ABCG2 C421A CC 32 78.0 0.122 0.111 nificantly across the different genotypes. Finally, biochemistry analyses
CA 8 19.5 revealed that the ABCC4 C934A was also significantly related to the
AA 1 2.5
number of episodes with raised LDH levels (> 400 mg/dL): 39
ABCC4 T-1393C TT 35 85.4 0.073 0.06b
TC 6 14.6
(IRQ = 16) episodes for CC carriers vs. 21 (IRQ = 26) for CA carriers
ABCC4 C934A CC 31 75.6 0.122 0.081 (p = 0.004). No other biochemical parameter showed an association
CA 10 24.4 with the analyzed SNPs.
MAF, minor allele frequency; HWE, Hardy-Weinberg Equilibrium.

a
4. 5. Discussion
Minor allele frequencies in HapMap-CEU population (Caucasians).
b
No data available on HapMap, frequency retrieved from the study by Ansari et al. in
Caucasian children with ALL (Ansari et al., 2009). There are no specific guidelines on how to adjust the doses of MTX
and 6MP in the maintenance therapy for ALL (Schmiegelow et al.,
3.1. Effect of genetic polymorphisms on dose requirements and treatment 2016), therefore it is important to assess other factors, such as genetics,
efficacy that could be used to optimize this therapy (Gervasini and Vagace,
2012; Lopez-Lopez et al., 2014; Dulucq et al., 2014; Pui, 2015). In this
Genotype and allelic frequencies observed in the population of regard, drug transporters have been considerably less studied than
study are shown in Table 2. The distribution of the SNPs did not differ metabolizing enzymes such as MTHFR or TMPT. However, given the
significantly from the Hardy-Weinberg equilibrium, nor were their critical role of transporters in the disposition of MTX, 6MP and their
frequencies different from those observed in Caucasians populations active products, it seems likely that variability in the encoding genes
(Table 2; p > 0.05 in all instances). may have clinical relevance.
Patients were administered on average 49.9 mg/m2 of 6MP, which Our results show that both ABCB4 C934A and ABCB1 C1236T SNPs
accounts for 83.8% of protocol-recommended starting dose, and affected the administered doses of MTX and 6MP, respectively. Whilst
13.28 mg/m2 of MTX (65.3% of starting dose) throughout the main- the 934A was associated with higher doses of MTX, the 1236TT geno-
tenance phase. Fig. 1A shows that carriers of the ABCC4 934A variant type was linked to lower doses of 6MP (relative to the standard starting
allele received a significantly higher median percentage of the re- dose). It is remarkable that these differences were still present (al-
commended MTX starting dose [81.28% (IQR = 19.92)] than did those though to a lesser extent) when we only analyzed doses administered
without the variant [62.12% (IQR = 37.51); p = 0.001]. In the same when the patient was within the targeted myelosuppression range. The
manner, patients carrying the homozygous ABCB1 1236TT genotype rationale behind performing this analysis is that the leukocyte levels
were given 73.09% (IQR = 31.59) of the 6MP standard dose, as com- utilized to adjust maintenance doses may obey to the efficacy of the
pared with 87.72% (IQR = 24.76) for patients with the CC or CT therapy, but also to the patient's basal WBC, adherence to therapy and
genotypes, respectively (p = 0.026; Fig. 1C). When the analysis was the clinician's skill to carry out such adjustments, which can vary
constrained to doses administered to patients in WBC therapeutic greatly (Schmiegelow et al., 2014).
range, differences in 6MP dosing according to the ABCB1 C1236T Interestingly, the same SNPs affecting MTX and 6MP dosing were
polymorphism increased [69.88% (IQR = 30.61) vs. 90.27% also related to the degree of myelosuppression obtained and the in-
(IQR = 18.35) for TT and CC/CT genotypes, respectively (p = 0.017; cidence of hematological toxicity. It is especially remarkable the role of
Fig. 1B). However, the effect of the ABCC4 SNP on MTX doses was the C1236T polymorphism, which not only was preferentially carried
lower than in the previous analysis (p = 0.021; Fig. 1D). The associa- by patients who needed lower doses of 6MP, but it also conferred a
tions shown in Fig. 1B to D lost significance after correcting by multiple higher sensitivity to these children, since they achieved more easily a
testing. higher level of myelosuppression and suffered more hematological
To assess the efficacy of the maintenance therapy, we looked at the events than wild type patients.
percentage of blood tests with WBC below 3 109/L. Interestingly en- Information on the role of ABCB1 in 6MP transport is scarce, and
ough, a gene dose effect was observed for the ABCB1 C1236T SNP there actually are no data on ALL patients. A recent study in pediatric
(Fig. 2), as the percentage of blood counts showing efficient myelo- patients with inflammatory bowel disease receiving azathioprine (a
suppression significantly increased with each T variant allele. Median precursor of 6MP) showed that ABCB1 genetic variability may be im-
portant for treatments with thiopurines, as it was associated with the
74
Fig. 1. Impact of the ABCC4 C934A and ABCB1 C1236T polymorphisms on methotrexate (MTX) (panels A and B) and 6-mercaptopurine (6MP) (panels C and D) dose requirements.
Panels A and C show the percentage of dose administered in relation to the protocol-recommended starting dose. Panels B and D show these percentages but limited to doses administered
when the patient was within targeted myelosuppression range (leukocytes between 2.0 and 3.0 109/L). Note: In order to improve the clarity of the chart, two patients with percentages of
354.4% and 629.0% (one within each genotype group) were removed from panel B (the patients were however included in the statistical analyses).
ABCB1 gene may function as candidate molecular markers of chemo-

sensitivity. However, in spite of the aforementioned reports, it should
be noted the lack of direct evidence for the involvement of ABCB1 in
MTX or 6MP transport, which implies that alternative explanations for
the observed association of the 1236 T allele with toxicity must also be
proposed. For instance, it could be that the decreased transport of other
toxic drugs by ABCB1 in hematopoietic precursors caused by the allelic
variant, led to diminished marrow reserve and therefore higher sensi-
tivity to the utilized antimetabolites.
The other SNP that showed a clinical impact in our series was
ABCC4 C934A. In this case it was the wildtype C allele that was asso-
ciated with lower MTX dose requirements and a higher incidence of
hematological adverse events (its effect on the degree of myelosup-
pression was not significant, data not shown). ABCC4 affects the dis-
position of MTX and it is known to play a role in the resistance to this
drug (Chen et al., 2002). There are no previous reports evaluating the
effect of SNPs in this gene on MTX dosing or the level of myelosup-
pression, but some studies have assessed their impact on MTX-induced
toxicity. Thus, Lopez-Lopez et al. (Lopez-Lopez et al., 2013) detected
Fig. 2. Effect of ABCB1 C1236T polymorphism on the percentage of blood tests showing
two SNPs, rs1678392 and rs2619312 that were associated with renal
efficient myelosuppression (leukocyte concentrations below 3.0 109/L).
toxicity, supporting the rationale that a decrease efflux ability would
lead to increased drug levels and hence drug-induced toxicity. Likewise,
production of active 6-thioguanine nucleotides (Lee et al., 2015). In
Ansari et al. showed that the ABCB4 934CA genotype was associated
addition, a recent meta-analysis in patients with various malignancies
with increased risk of thrombocytopenia (Ansari et al., 2009). In con-
showed that individuals carrying the ABCB1 1236 T variant or the
trast, in the present study it was the wildtype genotype that was asso-
1236TT genotype were more likely to have a good response to che-
ciated with elevated hematological risk. Our results would then indicate
motherapy (Zhou et al., 2015), which is in line with our findings in
that the mutation causes an increased expression/function of the
childhood ALL patients. The authors suggested, and we agree, that the
transporter leading to additional efflux, lower intracellular levels and
75
Fig. 3. Influence of the ABCB1 C1236T (A) and ABCC4 C934A (B) polymorphisms on the total number of hematological adverse events observed in our patients during maintenance
therapy.
Table 3
Impact of ABCB1 C1236T genotypes on the number of hematological toxicities in children on maintenance therapy for acute lymphoblastic leukemia. Median values (and interquartile
ranges) are shown.
Genotype Leukopeniaa Neutropenia Thrombopenia Anemiab
Grades 1–2 Grades 1–2 Grades 3–4 Grades 1–2 Grades 3–4 Grades 1–2
ABCB1 1236CC 11 (11) 14 (11)⁎⁎ 10.5 (17) 0.5 (2) 0 (1) 42.5 (16)
ABCB1 1236CT 10.5 (12) 23 (7) 12 (9) 1 (4) 0 (1) 41 (13)
ABCB1 1236TT 12.5 (22) 21.5 (11) 14 (17) 1 (15)⁎ 0 (1) 46.5 (12)
ABCC4 934CC 9 (13) 22 (10) 12 (11) 1 (4) 0 (0) 43 (12)
ABCC4 934CA 12 (13) 15 (13) 10.5 (15) 1.5 (3) 0 (1) 38⁎⁎⁎(16)
a
No episodes of grade 3–4 leukopenia were documented in our series.
b
Only five episodes of grade 3–4 anemia were observed in four patients and hence genetic association analyses were not performed.
⁎
p = 0.023 vs. the CT/CC genotypes.
⁎⁎
p = 0.004 vs. the CT/TT genotypes.
⁎⁎⁎
p = 0.018.
hence less toxicity. In any case, the functional effect of this C934A SNP 5. 6. Conclusions
is still controversial (Janke et al., 2008; Abla et al., 2008; Gradhand and
Kim, 2008) and more in vitro studies are needed to explain these Available information on the effect of drug transporters on the ef-
contradictions. ficacy, toxicity and, particularly, dosing of maintenance therapy in
With regard to liver toxicity, the number of tests with raised ami- childhood ALL is scarce in comparison with the high number of studies
notransferases did not correlate with any of the SNPs (probably because on metabolizing enzymes. Our findings, preliminary as they are given
aminotransferases were raised in the vast majority of tests and hence the aforementioned limitations, indicate that genetic variability in the
differences across genotypes would be difficult to identify). However, ABCB1 and ABCC4 genes may confer higher sensitivity to the patients,
the 934CC wildtype genotype was also associated with high levels of and therefore its determination may be helpful in tailoring maintenance
LDH. Since there was no evidence of hemolysis or muscle damage in the therapy. Additional studies on larger and homogenous series of patients
patients, the rise of LDH must obey to liver toxicity (Vernetti et al., are needed to confirm these initial results.
2016); which would be another indication of the higher sensitivity Supplementary data to this article can be found online at http://dx.
conferred by this SNP. doi.org/10.1016/j.gene.2017.07.025.
Finally, we cannot underestimate the influence of many other gene
variants shown to influence MTX- and/or 6MP-induced toxicity that can Acknowledgements
actually interact with drug transporter polymorphisms. For instance, a
very recent study has shown that the interaction between variants in The authors want to thank the patients that participated in the study
NUDT15, which dephosphorylates thiopurine active metabolites, and and the technical and human support provided by the Facility of
ABCC4 is associated with increased intolerance to 6MP in children with Bioscience Applied Techniques of SAIUEx (financed by UEX, Junta de
ALL (Tanaka et al., 2017). Extremadura, MICINN, FEDER and FSE).
Among the limitations of the study, we have to mention that in-
tracellular levels of MTX- or 6MP-derived active compounds were not Funding
measured. In any case, the close follow-up and the high percentage of
tests with raised aminotransferases, both suggest that treatment in- This work has been supported in part by grant GR15012 from Junta
tensity was sufficient at the administered doses. Another limitation was de Extremadura, Consejeria de Economía, Comercio e Innovación,
the limited sample size available, which, for instance, resulted in the Merida (Spain).
lack of homozygous ABCC4 934AA carriers. However, this study was
carried out in the reference center of our health district, which allowed References
all the patients to be diagnosed and treated by the same clinicians with
unified clinical criteria, also reducing the possibility that the findings Abla, N., Chinn, L.W., Nakamura, T., Liu, L., Huang, C.C., Johns, S.J., et al., 2008. The
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77

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TESIS DOCTORAL

INFLUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS EN LA

PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOMARCADORES DE SALUD Y

Conformidad de los directores:

Fdo: Guillermo Gervasini Rodríguez Fdo: José Manuel Vagace Valero

Departamento de Terapéutica Médico-Quirúrgica de la Universidad de Extremadura, y D.

JOSÉ MANUEL VAGACE VALERO, Profesor Asociado de Hematología en la Universidad

de Extremadura y Facultativo Especialista de Área en el Hospital Materno Infantil de

Que Dª Silvia González de Murillo Godoy, Licenciada en Farmacia, ha realizado

bajo su dirección el presente trabajo titulado “INFLUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS

GENÉTICOS EN LA RESPUESTA TERAPÉUTICA A METOTREXATO DE PACIENTES

CON NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS”.

presentado como Tesis Doctoral.

Badajoz a 23 de Noviembre de 2017.

Fdo. D. Guillermo Gervasini Rodríguez Fdo. José Manuel Vagace Valero

 Dihydrofolate reductase genetic polymorphisms affect methotrexate dose

requirements in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia on

Gervasini G, de Murillo SG, Jiménez M, de la Maya MD, Vagace JM.

J Pediatr Hematol Oncol. 2017 Nov; 39(8):589-595

 Effect of polymorphisms in transporter genes on dosing, efficacy and toxicity of

maintenance therapy in children with acute lymphoblastic leukemia.

Gervasini G, de Murillo SG, Jiménez M, de la Maya MD, Vagace JM.

Gene. 2017 Sep 10; 628:72-77

 Dihydrofolate reductase genetic polymorphisms affect methotrexate dose

requirements in pedatric patients with acute lymphoblastic leukemia in maintenance

Gervasini G, de Murillo SG, Jiménez M, de la Maya MD, Vagace JM.

13th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and

Praga, 24-27 Junio 2017

que, de alguna manera, han formado parte de este apasionante proyecto.

oportunidad, confiar en mi desde el principio, y haber entendido mi ritmo y dificultades.

Ambos me han ofrecido los recursos disponibles, sus conocimientos y su apoyo

inestimable. Gracias por todo.

A Mercedes, mi compañera de laboratorio, su colaboración y ayuda han sido

imprescindibles para la consecución de este trabajo.

llegar a la meta. Y a mi hermana Pilar, un ejemplo para mí de constancia y esfuerzo en el

Al resto de familiares y amigos, por mostrarme su apoyo y reconocimiento sincero.

aportado nuestro pequeño grano de arena a la CIENCIA.

ABCB1 ATP-binding cassette subfamilia B miembro 1

ABCC2 ATP-binding cassette subfamilia C miembro 2

ABCC4 ATP-binding cassette subfamilia C miembro 4

ABCG2 ATP-binding cassette subfamilia G miembro 2

ADME Absorción, distribución, metabolismo y excreción

AICAR Aminoimidazol ribonucleótido carboxamida

ALT Alanina aminotransferasa

AST Aspartato aminotransferasa

ATIC Aminoimidazol ribonucleótido carboxamida transformilasa

CAR Receptor de antígeno quimérico

CIE-O Clasificación Internacional de Enfermedades para Oncología

CTCAE Criterios Terminológicos Comunes para Eventos Adversos

DHFR Dihidrofolato reductasa

dTMP Desoxitimidina trifosfato

EFS Supervivencia libre de eventos

EICH Enfermedad de injerto contra huésped

EMR Enfermedad mínima residual

ESPT European Society of Pharmacogenomics and Personalised Therapy

FH2 Ácido dihidrofólico

GGH γ-glutamil hidrolasa

IARC International Agency for Research on Cancer

ICCC-3 International Classification of Childhood Cancer-3

LDH Lactato deshidrogenasa

LAL Leucemia aguda linfoblástica

LLC Leucemia linfocítica crónica

LMA Leucemia mieloide aguda

LMA Leucemia mieloide aguda