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Programa de Educação

Continuada a Distância

Curso de
Toxicologia Laboratorial

Aluno:

EAD - Educação a Distância


Parceria entre Portal Educação e Sites Associados
Curso de
Toxicologia Laboratorial

MÓDULO I

Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para
este Programa de Educação Continuada. É proibida qualquer forma de comercialização do
mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores
descritos na Bibliografia Consultada.

SUMÁRIO

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MÓDULO I

1 – Introdução

1.1 – Fatores que influem na toxicidade;

1.2 – Características físicas dos agentes tóxicos;

1.3 – Tipos e efeitos de ação tóxica (ou órgão alvo, onde atuam);

1.4 – Tipos de Testes Toxicológicos;

1.4.1 – Informações Preliminares ;

1.4.2 – Estudos de Toxicidade Aguda;

1.4.3 - Estudos de Toxicidade Subcrônica;

1.4.4 - Estudos de Toxicidade Crônica;

1.4.5 - Estudos de Mutagênese e Carcinogênese;

1.4.6 – Testes de Teratogenicidade;

1.4.7 – Estudos de Toxicocinética;

1.4.8 – Efeitos locais sobre a pele e os olhos;

1.4.9 – Estudos de Ecotoxicidade;

1.5 – Classificação dos métodos analíticos;

1.5.1 – Tipos de Métodos;

1.6 – Ferramentas para análises;

1.7 – Métodos Analíticos;

1.8 – Calibração de Métodos Analíticos;

1.9 - Questões para estudo;

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1.10 – Glossário.

Índice de figuras e quadros

Figura 1 – Indicador de dose interna

Figura 2 – Dose/resposta em teste de toxicidade

Figura 3 – Log dose/resposta em teste de toxicidade

Figura 4 – Perfil analítico: cromatografia em camada delgada (CCD)

Figura 5 – Esquema do Teste de Ames

Figura 6 – Curva de Calibração

Quadro 1 – Classes de toxicidade

Quadro 2 – Propriedades físicas e químicas em Métodos Instrumentais

Quadro 3 – Componentes Instrumentais

MÓDULO II

2. Circuitos;
2.1 – Amplificadores Operacionais;
2.2 – Sinais Analógicos e digitais dos instrumentos;
2.3 – Sinais e Ruídos;
2.4 – Métodos espectrométricos;
2.5 – Medidas espectroquímicas e os aspectos quantitativos;
2.6 – Características dos Instrumentos Ópticos;
2.7 – Espectrometria de Absorção Atômica e Fluorescência Atômica;
2.7.1 – Aplicações da espectroscopia de absorção atômica com fontes de plasma;
2.8 – Espectrometria de Massa Atômica;
2.8.1 – Métodos de ionização;

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2.8.2 – Sistemas de detecção e analisadores de massas;
2.9 – Questões para estudo;
2.10 – Glossário;

Índice de Figuras e Quadros

Figura 7 – Exemplos de símbolos e elementos utilizados em circuitos elétricos;


Figura 8 – Entrada e saída de um amplificador operacional;
Figura 9 – Amplificador Operacional seguidor de voltagem;
Figura 10 – Representação de um sistema numérico decimal;
Figura 11 – Áreas da desoxiguanosina (dG) das amostras de fígado de camundongo
tratados com tetraidrofurano (THF);
Figura 12 – Espectro de emissão de uma amostra de dC (desoxicitidina) tratada com THF
com Ph;
Figura 13 – Adutos de desoxiadenosina (dA-THF) e desoxicitidina (dC-THF) THF e suas
tratados com massas;
Figura 14 – Esquema representando o funcionamento de um espectrômetro de massas;
Figura 15 – Exemplo de ionização química do ácido de Bronsted CH5+
Figura 16 – Analisador de massa quadripolar;
Quadro 4 – Caracteres alfanuméricos e seus equivalentes em binário;
Quadro 5 – Métodos espectroscópicos que utilizam radiação Eletromagnética;
Quadro 6 – Categorias principais de métodos espectroquímicos;
Quadro 7 – Métodos de Ionização;

MÓDULO III

3 - Espectrometria de Luminescência Molecular;


3.1 – Aspectos da Fluorescência e Fosforescência;
3.2 – Componentes para a medida de fluorescência e fosforescência;
3.3 – Aplicações da quimiluminescência, fosforescência e fluorescência;

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3.4 - Espectrometria no Infravermelho;
3.4.1 – Equipamentos para medidas de absorção infravermelha;
3.4.2 – A espectrometria no infravermelho e suas aplicações;
3.5 - Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN);
3.5.1 - Ressonância Magnética Nuclear de onda contínua;
3.5.2 - Ressonância Magnética Nuclear por Transformada de Fourier;
3.5.3 – Aplicações de Ressonância Magnética Nuclear;
3.6 - Espectroscopia de Massa Molecular;
3.6.1 – Métodos de ionização em espectrometria de massa molecular;
3.7 - Caracterização por Espectroscopia e Microscopia de superfícies;
3.8 - Questões para estudo;
3.9 – Glossário;

Índice de Figuras e Quadros

Figura 17 – Exemplo de Spins;


Figura 18 – Átomo de oxigênio;
Figura 19 – Diagrama de Pauling;
Figura 20 – Componentes para medida de fluorescência e fosforescência;
Figura 21 – Descrição de componentes de um espectrômetro de massa;
Quadro 8 – Regiões espectrais do Infravermelho;
Quadro 9 – Propriedades magnéticas de quatro núcleos com Spin ½;
Quadro 10 – Deslocamentos químicos aproximados de alguns prótons;
Quadro 11 – Exemplos de métodos espectroscópicos para análises de superfície;

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MÓDULO IV

4 - Métodos de separação cromatográficos;


4.1 - Cromatografia Gasosa;
4.1.1 – Gás de Arraste;
4.1.2 – Detector por ionização de chama;
4.1.3 - Detector fotométrico de chama;
4.1.4 – Outros detectores;
4.1.5 – Colunas para cromatografia gasosa;
4.1.6 – Aplicações da cromatografia gasosa;
4.2 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE);
4.2.1 – Equipamentos importantes na cromatografia líquida de alta eficiência;
4.2.2 – Outros tipos de cromatografia líquida de alta eficiência;
4.3 - Eletroforese Capilar e Eletrocromatografia Capilar;
4.4 - Miscelânea de Métodos;
4.4.1 - Método para extração de DNA de fígado de camundongos da linhagem C57Bl/6J;
4.4.2 - Protocolo de dosagem de proteína pelo método e Bradford;
4.4.3 - Protocolo de extração de microssomos;
4.4.4 – Métodos térmicos;
4.5 - Métodos de Análise Automatizados;
4.6 – Questões para estudo;
4.8 - Anexo A – Soluções e Tampões;

Índice de Figuras e Quadros

Figura 22 – Tipos de cromatografia;


Figura 23 – Esquema de um cromatógrafo a gás;
Figura 24 – Componentes de um equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência;
Quadro 12 – Classificação de métodos cromatográficos;

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Quadro 13 – Variáveis que afetam a eficiência de uma coluna cromatográfica;
Quadro 14 – Símbolos das relações e grandezas utilizadas na cromatografia;
Quadro 15 – Exemplos de fases estacionárias em cromatografia gás-líquido;
Quadro 16 – Exemplos de fase móvel em cromatografia;

MÓDULO I

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Testes Toxicológicos

1 – Introdução

A toxicologia é a ciência que estuda os efeitos nocivos produzidos pelas


substâncias químicas sobre os organismos vivos. Portanto, ao homem, os animais e as
plantas que podem estar expostos a uma grande variedade de substâncias químicas.
Estas podem, por exemplo, serem metais e substâncias inorgânicas, moléculas orgânicas
muito complexas. Ou seja, a toxicologia se ocupa da natureza e dos mecanismos das
lesões tóxicas e da avaliação quantitativa do espectro das alterações biológicas
produzidos pela exposição aos agentes químicos. Estuda o efeito adverso de substâncias
químicas sobre os organismos vivos, com a finalidade principal de prevenir o
aparecimento deste efeito, ou seja, estabelecer o uso seguro destas substâncias
químicas.

Substâncias muito tóxicas acarretarão efeito tóxico em pequenas doses, enquanto


que substâncias de baixa toxicidade precisam ser utilizadas em altas doses para acarretar
um efeito tóxico. É importante saber que a relação entre a concentração e o tempo de
exposição, bem como a intensidade do efeito, depende de variáveis como idade,
condições de saúde do indivíduo ou organismo exposto.

A dose ou concentração do agente químico envolvido na exposição e o tempo de


interação da substância com o organismo serão determinantes para exercer ou não ação
tóxica no plano tecidual e celular.

Um efeito adverso pode ser definido como uma alteração indesejável ou nociva
após exposição a substâncias tóxicas ou potencialmente tóxicas, que podem ser
exemplificadas como: variação no peso corpóreo, alteração anatomopatológicas, entre
outros. Também pode o organismo responder a variação externa mantendo a função
normal (homeostasia), permitindo que o organismo se adapte por meio de modificações

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bioquímicas, mecanismos fisiológicos e outros em caso de exposição sem manifestações
toxicológicas. Porém, saber distinguir entre efeito adverso (efeito patológico) e adaptação
(alteração fisiológica) é muito difícil, então, sempre é realizada a análise de cada caso em
particular. A verificação da dose administrada ou da concentração em que um organismo
vivo é submetido é uma das formas de avaliação de exposição toxicológica.

A curva Gaussiana teórica representa a relação dose/resposta ou


concentração/resposta, estatisticamente é calculada a partir da observação de
mortalidade após a exposição à doses/concentrações da substância em teste. No cálculo
da dose letal 50% (DL50) ou concentração letal 50% (CL50), essa curva é em geral
empregada.

A Comunidade Comum Europeia classificou as substâncias químicas em apenas


3 categorias, como:

• Muito Tóxica: substâncias com DL50 para ratos menores do que 25 mg/kg;

• Tóxicas: substâncias com DL50 para ratos entre 25 e 200 mg/kg;

• Nociva: substâncias com DL50 para ratos entre 200 e 2000 mg/kg;

Podem-se classificar as substâncias químicas, segundo Sterner e Hodge (1949),


em seis classes de toxicidade, de acordo com a provável dose letal para humanos
conforme descrito no quadro 1:

Quadro 1 – Classes de Toxicidade

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Classe Categoria de Toxicidade Provável DL oral/ humanos

1 Praticamente não-tóxica > 16 g/kg

2 Ligeiramente tóxica 5-15 g/kg

3 Moderadamente tóxica 0,5-5 g/kg

4 Muito tóxica 50-500 mg/kg

5 Extremamente tóxica 5-50 mg/kg

6 Super tóxica < 5 mg/kg

Fonte: Sterner e Hodge (1949).

Estas classificações são qualitativas e são utilizadas apenas como orientação, ou


para responder a questões de outra área, que pergunta: “O quanto esta substância é
tóxica?”, por exemplo. Na prática não se deve conhecer apenas a toxicidade das
substâncias, em geral representadas pela DL50, pois conhecer a toxicidade dos agentes
químicos e o risco tóxico é fundamental para uma avaliação fundamentada não apenas na
teoria e sim capaz de prover dados reais.

1.1 - Fatores que influem na Toxicidade

Fatores ligados ao agente químico: propriedade físico-química (coeficiente de


partição óleo/água, estado físico, grau de ionização, pka, solubilidade, tamanho
molecular, entre outros); impurezas e contaminantes; fatores envolvidos na formulação
(veículo, adjuvantes).

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Fatores relacionados com o organismo: espécie, fatores genéticos, linhagem;
fatores imunológicos, dieta; estado nutricional, estado hormonal, estado emocional,
estado patológico, idade, peso corpóreo, sexo.

Fatores relacionados com a exposição: dose ou concentração; via de introdução


(Figura 1).

Fatores relacionados com o ambiente: pressão; radiações; temperatura outros


(calor, luz, umidade, entre outros).

Dose externa

Quantidade absorvida

Quantidade que atinge os tecidos

Quantidade que atinge as células

Dose biológica efetiva

Efeito

Figura 1 – Indicador de dose interna (Adaptado de IPCS, 1993).

1.2 - Características físicas dos agentes tóxicos:

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ƒ Origem Natural: Animal (vitamina A), Vegetal (glicosídeos cianogênicos),
Mineral (Pb, Cd, Ni).

ƒ Artificial: Clembuterol, Fenobarbital (medicamentos).

ƒ Gases: fluidos sem forma, que permanecem no estado gasoso em


condições normais de pressão e temperatura (Ex.: CO, NO e NO2, O3 entre outros).

ƒ Vapores: formas gasosas de substâncias normalmente sólidas ou líquidas


em condições ambientais (Ex: benzeno, tolueno, xileno, vapores resultantes da
volatilização de solventes orgânicos).

ƒ Partículas: com tamanho microscópico, em estado sólido ou líquido (Ex:


poeiras, fumos; neblinas e névoas).

1.3 - Tipos e efeitos de ação tóxica (ou órgão alvo, onde atuam):

ƒ Ação: Hepatotóxico (fígado); Hematopoiético (sangue); Nefrotóxico (rins);


Neurotóxico (sistema nervoso); entre outros.

ƒ Efeitos: Carcinogênico (AS), Mutagênico (Aflatoxina) e Teratogênico


(Isotretinoina). Onde AS, é o produto da contaminação por atividade antropogênica ou
pela presença natural do produto tóxico em solos e águas superficiais.

As substâncias químicas novas devem ser submetidas a uma avaliação de


seguridade antes de sua fabricação e venda. Porém, devido ao grande número de
substâncias químicas é necessário dar prioridade as que são consumidas pelo homem,
como os fármacos, os aditivos alimentares e as que se utilizam amplamente como
praguicidas ou produtos domissanitários.

Os compostos de presumida toxicidade elevada, aguda, crônica ou diferenciada


(como a carcinogenicidade) ou de maior persistência no meio ambiente, são os
priorizados. Bem como, os compostos que inibem a desativação metabólica de

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substâncias químicas, pois podem ser uma via a mais de toxicidade. O conhecimento da
toxicidade das substâncias químicas se obtém por meio de experimentos em laboratório,
utilizando geralmente animais. Os métodos são empregados com todo rigor científico com
a finalidade de fornecer informações relativas aos efeitos tóxicos e principalmente para
avaliar riscos que podem ser extrapolados ao homem.

Portanto os critérios essenciais para determinação da prioridade para seleção das


substâncias químicas serão colocados a partir dos seguintes critérios:

• Indicação ou suspeita de perigo para a saúde humana/ tipo de gravidade


dos efeitos potenciais à saúde;

• Grau provável de produção e emprego;

• Potencial de persistência no meio ambiente;

• Potencial de acumulação no organismo e no meio ambiente, e;

• Tipo e tamanho das populações que estarão expostas.

Para selecionar a substância química prioritária para as provas, a mesma deverá


ser classificada com destaque seguindo todos estes critérios ou a sua maioria.

1.4 - Tipos de Testes Toxicológicos

Para se conhecerem os efeitos tóxicos de uma substância, é preciso além da


curva dose/concentração-resposta, realizar testes toxicológicos. Estes testes são
aplicados em animais de laboratório, sendo possível estabelecer por meio destes os
possíveis efeitos das substâncias em humanos expostos às mesmas. Em relação a
fármacos, os testes de toxicidade ocorrem após as triagens farmacológicas gerais e são
realizados somente com fármacos que mostram efeitos farmacológicos úteis.

No Brasil, a resolução 1/78 (Diário Oficial 17/10/78) do Conselho Nacional de


Saúde, estabelece cinco tipos de ensaios de toxidade aguda, subaguda, crônica,
teratogênica e embriotoxicidade e estudos especiais.

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Estes testes devem ser realizados para cada nova substância a ser utilizada ou
produzida em larga escala, em estudos onde se procura determinar o agente tóxico, entre
outros. Porém, de acordo com o uso da substância, seu efeito tóxico produzido por
estruturas análogas à substância química, bem como do efeito tóxico produzido pela
substância em si, pode ser definido quais testes serão realizados. Os estudos podem
variar de um país para outro, mas inclui geralmente os tópicos a seguir:

• Informações preliminares;

• Toxicidade aguda;

• Toxicidade subcrônica (curta duração);

• Toxicidade crônica (longo prazo);

• Mutagênese e carcinogênese;

• Reprodução e teratogênese;

• Toxicocinética;

• Efeitos locais sobre a pele e olhos;

• Sensibilização cutânea;

• Ecotoxicidade;

Na realização dos testes toxicológicos em animais, dois princípios devem ser


seguidos: os efeitos produzidos pelo composto no animal de laboratório devem ocorrer
também no homem; e a exposição de animais de experimentação a altas doses de um
agente tóxico é um método válido e necessário para a descoberta dos efeitos danosos ao
homem. Pois, os testes toxicológicos são realizados para caracterizar que tipo de efeito
tóxico uma substância química produz em um organismo vivo e assim mostrar como
precaver ou tratar uma intoxicação.

1.4.1 - Informações preliminares

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O objetivo das informações preliminares é conhecer a substância que será
submetida aos estudos de toxicidade. Já que a toxicidade está ligada a sua estrutura
química é necessário que a substância em estudo seja quimicamente caracterizada. Se
houver impurezas, as mesmas devem ser conhecidas quantitativamente e
qualitativamente, pois podem alterar a toxicidade da substância em estudo.
Principalmente, porque o efeito tóxico em muitos casos é ocasionado devido às
impurezas e não à substância em teste.

Para a aplicação dos testes toxicológicos, devem ser definidas as propriedades


físico-químicas, pois delas vai depender o tratamento a ser dado à substância. O
conhecimento do odor, cor, pontos de fusão e ebulição, pressão de vapor, densidade,
viscosidade, solubilidade e volatilidade são fundamentais, pois servirão para orientar que
solventes serão usados para a dissolução da amostra, a via de administração entre
outros.

1.4.2 - Estudos de toxicidade aguda

Neste estudo, a toxicidade aguda é caracterizada pela administração ou


exposição da substância química numa dose única (ou múltipla num espaço de 24 horas),
onde os efeitos adversos ocorridos nesse intervalo de tempo são analisados. A dose
única é utilizada para determinar-se a potência da droga em casos de ingestão ou
envenenamento acidental, e as doses múltiplas são usadas para avaliarem-se os efeitos
cumulativos.

A DL50 (e CL50) é a prova mais comum de toxicidade aguda. Os estudos de


toxicidade aguda têm por objetivo caracterizar a relação dose/resposta que conduz ao
cálculo da DL50. Este parâmetro que representa a probabilidade estatística de uma dose
causar efeito letal em 50% dos animais de uma população é útil para identificar a
toxicidade relativa da substância. A CL50 (concentração letal média) é utilizada para testes
de letalidade no caso de inalação ou para peixes no meio aquático. Na figura 2 os grupos

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receberam baixas doses não se observando mortes, se fossem doses intermediárias
parte do grupo morreria e se em altas doses todos os animais do grupo morreriam. A
curva sigmoide apresentada na figura 3 se torna linear entre 16% e 84%, e então é
possível obter o ponto médio que é a DL50.

Os principais objetivos deste estudo são:

• Avaliar a toxicidade do agente tóxico (xenobiótico) ou substância química;

• Avaliar a suscetibilidade das espécies;

• Identificar órgãos alvo;

• Fornecer informações para o planejamento de quantidades necessárias das


doses para estudos mais prolongados como, no estudo de toxicidade crônica.

Figura 2 Figura 3

Figura 2 – Dose resposta em teste de toxicidade.

Figura 3 – Log dose/resposta em teste de toxicidade.

Fonte: Oga (2003).

De acordo com os resultados obtidos a partir dos estudos de toxicidade aguda o


mecanismo de ação da substância, a identificação de possíveis órgãos ou sistemas

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sensíveis e a determinação dos efeitos serem ou não reversíveis, passam a serem
conhecidos.

É fundamental nessa avaliação verificar não apenas a quantidade de animais


mortos, mas também o início, a natureza e a duração da intoxicação associada à morte.
Além das observações clínicas, os exames anatomopatológicos que auxiliam na
caracterização de tecidos e órgãos alvos, devem estar inclusos.

Diferentes espécies e linhagens de animais de ambos os sexos, devem fazer


parte nos estudos em que as substâncias são testadas, pois as diferenças de resposta
indicam que o efeito tóxico não é sempre o mesmo e que a extrapolação para o homem
deve ser feita considerando-se essas diferenças.

1.4.3 - Estudos de toxicidade subcrônica

Neste estudo o tempo de exposição é de 1 a 3 meses. As doses experimentais


são divididas em três: mínima, intermediária e máxima. Sendo que a dose máxima não
deve produzir um índice de letalidade acima de 10% (para que as avaliações
histopatológicas e bioquímicas não sejam inviabilizadas). Os objetivos principais deste
estudo são:

• Estabelecer os níveis nos quais não se observam os efeitos tóxicos;

• Estudar os órgãos alvos e determinar aqueles com mais suscetibilidade;

• Fornecer dados sobre as doses para os estudos de toxicidade crônica.

Estes testes são realizados para se obterem informações sobre a toxicidade das
substâncias químicas após exposições repetidas. A importância deste teste se dá porque,
às vezes, é o primeiro e o único teste com doses repetidas a ser realizado para
determinadas substâncias químicas. Outro fator importante é o exame dos efeitos após o
período de tratamento e se a determinação deste efeito é devido a um acúmulo da

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substância ou não. Outro aspecto importante é o de estabelecer se os efeitos tóxicos são
reversíveis, determinando-se assim se o período de observação pós-tratamento é
necessário ou não.

Em geral a via de administração é a oral, porém as outras eventuais vias de


exposições humanas devem ser consideradas. Pelo menos duas espécies animais, sendo
uma não-roedora, devem ser estudadas com a utilização de pelo menos três doses.

As manifestações de sinais de toxicidade devem ser verificadas, com exames nos


animais, pelo menos uma vez ao dia durante todo o experimento. Em geral verificam-se
modificações no consumo de ração, de peso, modificações na cor e textura dos pêlos,
alterações circulatórias e respiratórias, anormalidades motoras e de comportamento e
aumentos macroscópicos de massas de tecidos. Sempre deverão incluir um grupo de
controle negativo, que será tratado da mesma maneira que o grupo teste, sem o agente
em teste.

No final do experimento, os animais sobreviventes serão sacrificados e terão seus


órgãos retirados para avaliação anatomopatológica. As avaliações hematológicas e
bioquímicas no sangue (balanço eletrolítico, proteína, ureia, creatinina) costumam ser
realizadas no final, podendo também ser feitas antes do início e no meio do ensaio. Os
exames de urina são também recomendados no início, meio e término do experimento.

Os estudos de toxicidade subcrônica além de caracterizar a relação


dose/resposta após administrações repetidas, também fornecem dados para escolha de
doses nos estudos de exposição crônica.

1.4.4 - Estudos de toxicidade crônica

O estudo da toxicidade subcrônica com dados histopatológicos e estudos


toxicocinéticos precisos podem auxiliar no fornecimento de valiosos subsídios sobre os
efeitos tóxicos de determinadas substâncias químicas, porém existem várias limitações.
Por exemplo, os testes subcrônicos não são testes seguros para prever efeitos
mutagênicos, carcinogênicos ou teratogênicos.

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O período de exposição em um estudo de toxicidade crônica é de 2 anos ou
quase toda a vida do animal (ex.: camundongo vive de 2 a 3 anos). Como no teste
subcrônico, este também não procura letalidade e utiliza 3 níveis de dose pela via de
administração de acordo com a via de uso prescrita.

Para este teste, o protocolo experimental compreende as observações e


alterações especificadas no estudo de toxicidade subcrônica com adição de outros
parâmetros bioquímicos que possibilitam uma melhor avaliação de todos os órgãos e
funções, com um maior enfoque na função renal e hepática. Os principais objetivos deste
estudo são:

• Verificar as concentrações/doses máximas das substâncias que não produzem


efeitos perceptíveis de doença, se administradas durante a maior parte da vida do animal;

• Verificar os efeitos tóxicos que não são relacionados aos estudos de toxicidade
subcrônica;

• Determinação do mecanismo de ação tóxica das substâncias químicas


envolvidas no estudo.

Os estudos de toxicidade crônica são realizados para se determinar o efeito tóxico


após uma exposição prolongada a doses cumulativas da substância em estudo, portanto,
permitem também observar o potencial carcinogênico da substância, desde que a dose
escolhida seja correta.

Em roedores, o teste de toxicidade crônica pode variar por um período de 6


meses a 2 anos e em não roedores o tempo de tratamento é normalmente de um ano. A
determinação do tempo de tratamento depende do uso previsto da substância. Se for por
períodos curtos, 6 meses de tratamento podem ser suficientes. Porém se a substância for
empregada por longo tempo, o que levaria a um contato crônico da população, o tempo
de tratamento adequado, seria o período de vida normal do animal escolhido para o teste.

Em geral realiza-se este tipo de estudo em duas espécies animais (ratos e


camundongos), por um período semelhante ao tempo de vida média destes animais (18
meses a 2 anos para camundongos e 2 a 2,5 anos para ratos). A escolha das doses é o
ponto crítico dos testes de longa duração, para que não haja morte prematura no decorrer

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do tratamento.

Os exames clínicos devem ser realizados duas vezes ao dia, evitando-se assim
perdas por autofagia, após a morte dos animais. Dados como peso corpóreo, consumo de
ração e sinais clínicos precisam ser anotados rigorosamente todas as semanas durante
as 13 primeiras semanas do ensaio para se obter resultados conforme os verificados no
início do tratamento e os da progressão dos efeitos tóxicos.

Os dados hematológicos como hematócrito, hemoglobina, contagem total e


diferencial de leucócitos devem ser medidos no início do estudo e após 6 meses. Quando
o teste for finalizado, os mesmos dados devem ser avaliados em pelo menos 10 animais
por grupo. A análise de urina e dados bioquímicos, também deve ser avaliada, da mesma
maneira que os dados hematológicos, bem como, os exames histopatológicos, igualmente
nos testes de toxicidade subcrônica devem ser realizados.

1.4.5 - Estudos de mutagênese e carcinogênese

Os efeitos mutagênicos de substâncias químicas podem ser avaliados por meio


de ensaios com microorganismos e em organismos superiores, inclusive o homem.
Agente mutagênico é todo agente físico, químico ou biológico que, em exposição às
células, pode causar mutação, ou seja, um dano na molécula de DNA que não é reparado
no momento da replicação celular, e é passado para as gerações seguintes.

De acordo com a célula afetada, as mutações podem acarretar desde a


inviabilidade de desenvolvimento da célula ovo, passando por morte do embrião ou feto
até o desenvolvimento de anormalidades congênitas que podem ser transmitidas
hereditariamente.

Os ensaios com microorganismos, realizados in vitro, são indicados na triagem


rotineira dos agentes tóxicos. Os ensaios com microorganismos avaliam basicamente o
dano provocado ao DNA pela substância química estudada ou seu produto de
biotransformação.

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Vários testes in vitro e in vivo foram desenvolvidos para avaliar-se a capacidade
mutagênica das substâncias químicas. Existe a necessidade de se quantificar o perigo de
indução ao material genético e por consequência a transmissão hereditária destas
mutações.

O teste desenvolvido por Ames em 1975 é um dos mais utilizados, pois neste
teste é possível avaliar-se mutações pontuais em cepas mutantes de SalmoneIa
typhimurium que precisam de uma enzima, a fosforibosil ATP sintetase, necessária para a
síntese de histidina. Como algumas substâncias químicas são mutagênicas somente após
a biotransformação. Este teste foi modificado introduzindo-se no meio de reação,
composto por uma suspensão de microssomo hepático de ratos.

Já os testes in vivo, realizados em animais, incluem a observação de danos a


cromossomos de células de medula óssea em metáfase, o aparecimento de micronúcleos
em linfócitos de sangue periférico e o teste do dominante letal. No teste do dominante
letal é avaliada a capacidade da substância produzir alterações nos espermatozoides de
ratos tratados e a manifestação destas alterações nos descendentes, após acasalamento
com fêmeas não tratadas.

O potencial mutagênico das substâncias é avaliado nestes testes, porém, os


resultados obtidos são de difícil uso para a extrapolação ao homem. Em sua maioria, os
testes de mutagenicidade são utilizados para prever o desenvolvimento de câncer, a partir
de uma das teorias de carcinogênese química que indica o desenvolvimento de uma
mutação como evento inicial deste processo.

Portanto, os testes de mutagênese fazem parte dos testes de triagem para prever
o potencial carcinogênico das substâncias; mas eles apenas avaliam as substâncias que
produzem câncer por mecanismos genotóxicos (interagem diretamente com o material
genético).

Existe um grande número de substâncias que produzem câncer por mecanismos


não genotóxicos. Estas substâncias apresentam os testes de mutagênese negativos, não
interagindo com o DNA. Alguns mecanismos de carcinogênese não genotóxica incluem
citotoxicidade com regeneração acompanhada de aumento na síntese de DNA,
imunossupressores e promotores de expressão de oncogênese.

22
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Deste modo, os testes de mutagênese não são suficientes para indicar o potencial
carcinogênico de uma substância. Pois, as evidências primárias que podem apontar o
potencial carcinogênico das substâncias químicas são de origem epidemiológica ou
experimental em roedores. Sendo que, esses efeitos precisam ser observados em pelo
menos, duas espécies de animais de laboratório, com uma duração máxima de 130
semanas em ratos, 120 semanas em camundongos e 130 semanas em hamsters. No
mínimo, 2 doses da substância são utilizadas e a maior dose é a dose máxima tolerada
(DMT), definida como sendo aquela que não causa uma perda de peso superior a 10% e
não induz mortalidade ou sinais clínicos de toxicidade no animal. Como parâmetro se
utiliza a menor dose correspondendo à metade da DMT.

Testes de carcinogênese devem ser realizados, principalmente nos casos onde


ocorra exposição humana em longo prazo. Mesmo que na maioria dos casos, estas doses
sejam muito superiores às relacionadas à exposição humana, elas são indicadas para
garantir o aparecimento de tumores, se houver.

Para se obter uma avaliação final do risco de carcinogenicidade para o homem, é


necessário além das evidências primárias, obterem dados com a realização de testes de
curta duração. Como os testes que detectam lesão do DNA, incluindo o estudo da
formação de ligações entre o DNA e os produtos ativos formados na biotransformação do
agente tóxico; quebra de fitas e reparo do DNA; que evidenciam alterações dos produtos
gênicos ou das funções celulares e que avaliam alterações cromossômicas. Existe uma
limitação na evidência de carcinogenicidade nas seguintes situações:

• Problemas para diferenciar as neoplasias (malignas e benignas);

• Duração menor do que a necessária do experimento;

• Inadequação de doses e vias de administração;

• Poucos experimentos;

• Uso reduzido de animais no experimento;

• Utilização de uma única espécie animal.

23
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1.4.6 - Testes de Teratogenicidade

Efeitos adversos são estudados na toxicologia do desenvolvimento advindos da


exposição a substâncias químicas antes da concepção (durante o desenvolvimento
perinatal ou pós-natal até a puberdade). Estes estudos englobam a teratologia e a
toxicologia de reprodução. Para tanto, testes de avaliação do efeito teratogênico de um
composto químico, pode ser realizado por meio de métodos experimentais em animais de
laboratório sendo executada em complexos protocolos envolvendo fases distintas.

Na primeira fase o objetivo é a avaliação do potencial tóxico do composto químico


que afeta a fertilidade e o desempenho reprodutivo. O tratamento dos animais (machos e
fêmeas) ocorre durante um período mínimo de 60 dias antes do acasalamento e, depois,
continua para as fêmeas durante a gestação e lactação. Aproximadamente no meio da
gravidez é realizado o sacrifício da metade dos animais do estudo para verificar se
ocorreram anormalidades uterinas. É observado o número, anormalidades externas, sexo,
peso corpóreo em todos os filhotes, no final desta fase experimental.

Na fase seguinte, são administradas doses diárias da substância química na


alimentação, de animais fêmeas grávidas (período da organogênese), para se obter as
informações que vão dar suporte a uma avaliação minuciosa e detalhada da mãe e da
prole.

Na última fase deste teste, são avaliados os efeitos da substância sobre o


desenvolvimento peri e pós-natal dos animais do grupo experimental. É realizada a
administração da substância química no período entre o último terço da gestação até o
desmame, onde o desenvolvimento somático, sensorial, comportamental da prole, é
avaliado. Conceitualmente pode-se dizer que a teratologia estuda as alterações induzidas
durante o desenvolvimento, entre a concepção e o nascimento da prole em estudo,
enquanto que a toxicologia da reprodução tem seu enfoque no estudo dos efeitos
adversos que ocorrem nos sistemas reprodutores, masculino e feminino, após exposição
aos agentes químicos.

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1.4.7 - Estudos de toxicocinética

Nos estudos de toxicocinética são obtidas as informações sobre a absorção,


distribuição, armazenamento, biotransformação e excreção da substância. Estes estudos
permitem a avaliação das diferenças de comportamento das substâncias em diferentes
espécies animais e para antecipar o seu comportamento no homem, quando as
diferenças de metabolismo são conhecidas entre as espécies em estudo. É sabido que
muitas substâncias químicas exercem efeitos tóxicos por meio de seus produtos de
biotransformação, e o estudo de toxicocinética é a ferramenta que vai proporcionar o
conhecimento sobre estes produtos.

As concentrações de substâncias detoxificantes nos tecidos como a glutationa


têm efeitos importantes na toxicidade e são variáveis entre as espécies, as doses e o tipo
de substância. A dose quando em grande quantidade e com aplicação contínua é muito
importante, pois nestas condições, os mecanismos de proteção e as reações enzimáticas
podem estar diminuídas ou inativas, e o metabolismo de catálise pode estar aumentado.

As diferenças e as semelhanças no metabolismo de uma substância química


devem ser consideradas na avaliação de risco quando for realizada a extrapolação de
dados de animais para o homem.

É importante compreender que os modelos de animais experimentais apresentam


limitações e que a correta classificação quantitativa de toxicidade no homem, depende de
algumas condições, como a espécie de animal escolhida para estudo, os tipos de
experimentos e os métodos de extrapolação dos dados dos animais para o homem.

A maior problemática na extrapolação dos dados de animais para o homem é a


conversão de uma espécie a outra, pois na maior parte das substâncias químicas a
ocorrência da intoxicação, é similar no homem e em outros mamíferos, por isso os sinais
de intoxicação são semelhantes. Porém, são mais comuns as diferenças quantitativas na
resposta tóxica do que as qualitativas.

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1.4.8 - Efeitos locais sobre a pele e os olhos

Os dados avaliados vão se referir à irritação que a substância em estudo pode


provocar sobre a pele intacta ou não e sobre os olhos. A pele é uma barreira contra a
penetração de substâncias químicas exógenas. Porém, alguns xenobióticos podem ser
absorvidos pela pele, de acordo com alguns fatores como a anatomia, propriedades
fisiológicas da pele e propriedades físico-químicas dos agentes. Diversos fatores podem
influir na absorção a partir da pele e estes podem ser agrupados em: fatores ligados ao
organismo; ao agente químico; presença de outras substâncias na pele; condições de
trabalho (quando for exposição ocupacional).

Em 1944, Draize propôs o teste que é conhecido por seu nome e é o empregado
até hoje, para avaliação de irritação causada por substâncias química sobre a pele e os
olhos. Os dados avaliados para a pele são: eritema, escara, edema e corrosão. E no caso
dos olhos, observam-se alterações da conjuntiva, córnea, íris e cristalino. São três os
tipos de testes de irritação: irritação local ou aguda, resultante da resposta de uma
aplicação única ou exposição a um agente tóxico; irritação cumulativa (exposição repetida
à substância); e irritação induzida fotoquimicamente (uma irritação primária resultante de
luz induzindo modificações moleculares na pele exposta).

Se uma irritação persistir por mais de 14 dias após a exposição é tida como não
reversível. O fato que uma simples dose de uma substância química poder causar uma
lesão reversível ou permanente é avaliada no teste de irritação primária que tem como
objetivo avaliar o potencial de risco de uma dose da substância em estudo.

1.4.9 - Estudos de ecotoxicidade

O termo ecotoxicidade é utilizado para o estudo dos efeitos químicos no


ecossistema e seus componentes. Enquanto que no meio ambiente, existem várias
substâncias potencialmente tóxicas, e muitas delas em concentrações que por si só não
causam danos, uma interação destas substâncias com outros agentes químicos poderá

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então ser a causa de um dano.

Diversos fatores como as condições climáticas e enchentes podem afetar a


natureza e os efeitos da exposição a substâncias potencialmente tóxicas. Quando ocorre
o aumento da temperatura, também há um aumento de vaporização dos agentes
químicos na atmosfera e estes favorecem a absorção por via respiratória por meio da
inalação. As enchentes auxiliam na disseminação de substâncias potencialmente tóxicas
de áreas contaminadas para terras e poços de água ao redor da área afetada pela
enchente, podendo contaminar a água potável, por exemplo.

Portanto, a monitoração das substâncias químicas quando em contato com o


meio ambiente é muito importante. A análise química de amostras ambientais executadas
conforme os métodos estabelecidos em uma avaliação de risco auxiliam na verificação da
distribuição do agente químico fornecendo informações acerca de qualquer transformação
que esses agentes em maior ou menor toxicidade podem ter.

Nestes estudos se inclui a monitoração biológica que avalia os organismos


expostos para ser possível detectar efeitos adversos que indiquem a exposição em níveis
tóxicos das substâncias no ambiente por meio da monitoração de indicadores de
deficiências enzimáticas ou genéticas.

1.5 - Classificação dos métodos analíticos

Os métodos analíticos têm duas classificações: clássicos ou instrumentais. A


adaptação ou execução de um método conhecido envolve um processo de avaliação que
possibilite a verificação de sua eficiência na rotina de um laboratório. Bem como o
desenvolvimento baseado no estudo da composição química dos constituintes do material
em estudo, da definição do marcador e/ou princípio ativo, bem como sua quantificação
para a utilização nos métodos.

Os métodos clássicos consistem em análises por separação dos componentes


em estudo (analitos) de uma amostra utilizando-se precipitação, extração ou destilação.
Em análises qualitativas, os analitos separados são tratados com reagentes, que

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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
possibilitam seu reconhecimento por suas cores, suas solubilidades, ponto de fusão ou
ebulição em vários solventes, entre outros materiais. No caso de análises quantitativas, as
medidas titulométricas ou gavimétricas são utilizadas para determinar a quantidade do
analito. Estes métodos foram muito utilizados nos primeiros anos da química e são
aplicados até os dias de hoje.

Entretanto, há mais de um século, químicos começaram a estudar outros dados


tais quais as propriedades físicas dos analitos, como a condutividade, emissão ou
absorção da luz, razão massa/carga, fluorescência, potencial do eletrodo na análise
quantitativa. Desde então, técnicas de cromatografia e de eletroforese começaram a
substituir a destilação, extração e precipitação para separar componentes de misturas
complexas, que eram utilizadas na determinação quantitativa e qualitativa das análises, e
essas técnicas são conhecidas como métodos instrumentais.

1.5.1 - Tipos de Métodos

As análises quantitativas e qualitativas são realizadas de acordo com algumas


características físicas e químicas do xenobiótico (analito) em estudo. No quadro 2 estão
listadas algumas propriedades e estas são utilizadas para análise instrumental, pois
dependendo da característica do analito, uma determinada fonte de energia será
necessária para se obter uma resposta que possa ser medida.

Os métodos utilizados nas análises instrumentais são vários, porém os mais


utilizados nos dias de hoje são os cromatográficos, os espectroscópicos (de ressonância
magnética nuclear, fotoacústica, de emissão de UV, por exemplo), como os citados no
quadro 2, entre outros.

O enfoque principal será dado aos métodos instrumentais, pois os clássicos


apesar de ainda serem usados, estão sendo substituídos pelos instrumentais que a cada
dia se renovam trazendo novas metodologias e aparelhos com maior poder de detecção,
mais rapidez no diagnóstico e também uma maior confiabilidade nos resultados obtidos. A
seguir alguns exemplos de métodos e suas aplicações:

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• Imunoensaios ou ELISA:

Teste analítico que utiliza anticorpos. Características: reagem com uma grande
variedade de compostos natural-artificiais, biomoléculas, células e vírus; tem excelente
especificidade que permite detectar quantidades mínimas do analito; ligação não
covalente/covalente forte que resiste aos processos e geração de sinal; alta precisão e
exatidão; permite automatização; permite a execução de testes rápidos; pode ser aplicado
nas áreas de alimento, no ramo farmacêutico, forense, militar, medicina e veterinária. A
geração de sinais pode ocorrer conforme descrito abaixo:

• Colorimétrico – limitado ao limite de leitura do espectrofotômetro.

• Fluorimétrico – composto fluorescente - emissão repetida de radiação em curto


espaço de tempo. Por dois tipos – marcação direta e marcação enzimática e revelação
fluorescente.

Quadro 2 – Propriedades físicas e químicas utilizadas em Métodos


Instrumentais

29
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Propriedades Características Métodos Instrumentais

Emissão da radiação Espectroscopia de emissão (raios X, UV,


visível, elétrons, Auger); fluorescência,
fosforescência e luminescência (raios X, UV
e visível).

Absorção da radiação Espectrofotometria e fotometria (raios X, UV,


visível, IR); espectroscopia fotoacústica;
espectroscopia de ressonância magnética
nuclear e de ressonância de spin eletrônico.

Difração da radiação Métodos de difração de raios X e de


elétrons.

Massa Gravimetria (microbalança de cristal de


quartzo).

Relação massa/carga Espectrometria de massa.

Velocidade da reação Métodos cinéticos.

Características térmicas Gravimetria e titulometria térmica:


calorimetria diferencial exploratória; análise
térmica diferencial e métodos de
condutimetria térmica.

Radioatividade Métodos de ativação e diluição de isótopos.

(Adaptado de: Skoog; Holler e Nieman, 2002).

• Espectrometria de Massas:

30
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A espectrometria de massa é uma técnica analítica muito usada para identificar
compostos desconhecidos, quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades
químicas e estruturais de moléculas e biomoléculas. A detecção de compostos por meio
desta ferramenta é viável para quantidades pequenas como as de 10-15g e também para
um composto de massa de 1000 Dalton. É um método utilizado para fornecer informação
tanto por químicos, como físicos, bioquímicos, toxicologistas e biologistas, entre outros.
Dentre os tipos de espectrometria de massa podemos destacar o de ionização por
electrospray que favorece novas possibilidades na análise de compostos com elevada
massa molecular, incluindo proteínas, nucleotídeos e polímeros sintéticos, sendo,
portanto uma técnica amplamente utilizada em estudos biológicos, bioquímicos,
farmacêuticos e médicos.

• Cromatografia:

Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia é uma das mais


utilizadas devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação
das espécies químicas, por si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais
de análise, como por exemplo, a espectrofotometria por absorção no visível e ultravioleta
ou a espectrometria de massas. Existem alguns tipos de cromatografia como:
cromatografia em papel, em camada delgada, cromatografia em coluna, cromatografia
gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência.

A cromatografia em camada delgada (CCD) é a técnica de referência para muitos


laboratórios brasileiros porque não necessita de equipamentos caros e é confiável. A CCD
permite separação eficaz dos compostos, o que torna este método muito útil na
caracterização e a quantificação de compostos químicos pode ser realizado utilizando
técnica visual sob luz UV ou a densitometria. Este tipo de cromatografia é muito útil para
avaliar casos de intoxicação aguda, principalmente se o toxicante for desconhecido
(Figura 4). A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) de fase normal e
fase reversa em geral, utilizam-se em conjunto com ferramentas de detecção por
absorção ultravioleta (UV), fluorescência e espectrometria de massas, entre outros. É o

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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
tipo de cromatografia mais utilizada atualmente em laboratórios de pesquisas e de
análises por sua versatilidade, sensibilidade, resultados quantitativos, por analisar
espécies não-voláteis e termolábeis, e por sua automatização.

outros
21%
dipirona
30%

antidepressivo
benzodiazepínico
6%
26%

barbitúrico
17%

Figura 4 – Perfil analítico: cromatografia em camada delgada (CCD).

(Adaptado de Oga, 2003).

1.6 - Ferramentas para Análise

Para que uma informação possa ser interpretada, manipulada é necessário que a
conversão da informação contida nas características químicas ou físicas do analito passe
por um instrumento para sua análise. Portanto, este analito deverá receber um impulso na
forma de energia elétrica, eletromagnética, mecânica ou nuclear, e estes impulsos
auxiliam na obtenção de uma resposta do analito em estudo (alguns exemplos no quadro

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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
3). Existem vários dispositivos que podem converter uma informação de uma forma à
outra, em geral os dados gerados são analisados em forma gráfica ou numérica.

Alguns termos apesar de serem utilizados como sinônimos têm diferenças em


seus significados como no caso de detectores, transdutores e sensores. O detector é um
dispositivo mecânico, elétrico ou químico que serve para indicar, identificar ou registrar
uma alteração em uma variável (pressão, temperatura, radiação nuclear, entre outros).

Quadro 3 – Componentes Instrumentais

Instrumento Fonte de Informação Transdutor Domínio de Processador da Dispositivo


Energia de Entrada de Leitura
Analítica Dados da Informação
(impulso) Informação de Saída
vinda do
Transdutor

Fotômetro Lâmpada de Feixe de Luz Fotocélula Corrente Escala Medidor de


tungstênio, atenuado elétrica corrente
filtro de
vidro

Espectrômetro Chama Radiação UV Válvula Potencial Amplificador Registrador


ou visível fotomulti- elétrico gráfico
Demodulador
plicadora
Monocromador
modulador

pHmetro Amostra/ Atividade do Eletrodos Potencial Amplificador Unidade


íon vidro- Elétrico
Eletrodo de digitalizador digital
hidrogênio calomelano
vidro

(Adaptado de: Skoog; Holler e Nieman, 2002).

33
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Os dispositivos que fazem a conversão de informações não elétricas para
elétricas são denominados transdutor (exemplos: fotomultiplicadores, fotodetectores
eletrônicos, entre outros) e o sensor faz parte dos dispositivos utilizados para monitorar
substâncias químicas específicas de modo contínuo e reversível (exemplo: eletrodos íon-
seletivo, sensores de fibra ótica, entre outros).

Os instrumentos analíticos estão em geral conectados com alguns dispositivos


eletrônicos e a conversores de domínios de dados, como circuitos integrados,
conversores analógico-digital e digital-analógico, microprocessadores e computadores.
Portanto, tomando como exemplo conversores analógico-digital, que são usados para
tratar uma informação por meio da análise de uma série de pulsos de energia que são
produzidos pelo declínio dos átomos, sendo que esses pulsos podem ser convertidos em
domínio elétrico, num primeiro momento como pulsos analógicos e depois como pulsos
digitais. Estes são contados com a utilização de um transdutor de entrada específico, para
somente após estes passos serem passíveis de análise. Desse modo, fica clara a
necessidade de conhecer vários dispositivos e ferramentas que integram os instrumentos
analíticos em um laboratório experimental, devido à complexidade dos equipamentos
utilizados para as análises.

1.7 - Métodos Analíticos

A definição por um método analítico requer que alguns itens sejam pensados e
realizados antes, como: levantamento bibliográfico (Há algum método descrito na
literatura? Quais as propriedades físico-químicas do analito? Que conhecimento existe
sobre as substâncias relacionadas?); tempo necessário para realizar as análises;
quantidade de amostra disponível e necessária (sensibilidade do método); intervalos de
concentração do analito (amplitude do método); impurezas que a amostra poderá conter e
causar interferência nas análises (seletividade do método); propriedades física e química
da matriz da amostra e quantas amostras serão analisadas. A quantidade de amostras a
serem analisadas tem peso econômico no desenvolvimento do protocolo de estudo, pois

34
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
se a quantidade de amostras for grande o método requererá que cada amostra tenha um
tempo mínimo de análise. Portanto, tirando os trabalhos preliminares, e se forem poucas
amostras, a opção por um método mais simples, porém que requer mais tempo de análise
para cada amostra, e pouco ou nenhum trabalho preliminar, pode ser a melhor escolha.
Depois de verificar todas as variáveis que fazem parte de uma escolha acertada acerca
do método analítico, verificando as características e eficiência dos vários instrumentos
que estarão inseridos nos trabalhos desenvolvidos neste método, alguns pontos
importantes devem ser analisados tendo em vista uma abordagem adequada à eficiência
e aos resultados esperados do método analítico escolhido.

Os equipamentos que serão utilizados no método analítico deverão ser estudados


verificando sua eficiência no que diz respeito a sua precisão (repetibilidade), tendência
(Bias), sensibilidade, limite de detecção, faixa de concentração e seletividade. Bem como,
saber como são os equipamentos em termos de eficiência qualitativa, na caracterização
da velocidade, facilidade e conveniência, custo e disponibilidade do equipamento, custo
por amostra, treinamento de pessoal, para então definir qual será o método analítico. E
ainda será preciso saber que tipo de aplicação terá esse método analítico, qual matriz
será usada e em que concentração, com que sensibilidade. A robustez de um método
analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações
dos parâmetros analíticos, e durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se
considerar a avaliação da robustez. A seguir os fatores que devem ser considerados na
determinação da robustez de um método analítico.

Preparo das Amostras


Estabilidade das soluções analíticas

35
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Tempo de extração.

Variação do pH da solução
Espectrofotometria
Temperatura

Diferentes fabricantes de solventes

Variação do pH da fase móvel

Variação na composição da fase móvel


Cromatografia Líquida
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

Temperatura

Fluxo da fase móvel

Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

Cromatografia Gasosa Temperatura

Velocidade do gás de arraste

Para iniciar o desenvolvimento do método analítico alguns dados precisam ser


definidos sobre as condições analíticas. Por exemplo, ser for utilizar CLAE (Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência) mais conhecido como HPLC (High Performance Liquid
Chromatography), será necessário saber que coluna será usada? Que fase móvel? Qual
fluxo? Em que temperatura? Qual detector? Somente após a definição desses dados será
possível otimizar o método, ajustando os parâmetros (capacidade, seletividade, eficiência,
reprodutibilidade). E finalmente, verificar o sistema analítico, que é composto por:
instrumentos, computador e método.

A cromatografia líquida de alta eficiência de fase normal e fase reversa são


usadas com detecção por absorção ultravioleta (UV), fluorescência e espectrometria de

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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
massas para detectar vários tipos de substâncias químicas orgânicas e inorgânicas. Por
exemplo, ao desenvolver uma metodologia analítica para identificar lesão em DNA
causada por substâncias mutagênicas, estes equipamentos mostrarão resultados
precisos acerca do objeto de estudo, de acordo com o protocolo de estudo desenvolvido
para a identificação, nesse caso, da lesão em DNA.

No caso da metodologia escolhida for o Teste de Ames, conhecido também como


teste da Salmonella microssoma, ou teste de mutagenicidade com S. typhimurium, que é
uma metodologia de triagem para detecção de substâncias carcinogênicas genotóxicas.
Existem vários protocolos para este ensaio, porém em geral utilizam-se os métodos de
incorporação em placas, de pré-incubação ou de microssuspensão (Kado et al., 1983),
conforme esquema na figura 5.

1.8 - Calibração de Métodos Analíticos

Somente os métodos gravimétricos e coulométricos não requerem calibração por


terem a relação entre quantidade medida e concentração do analito, calculadas por
constantes físicas conhecidas. Em todos os outros métodos analíticos, a calibração que é
um processo onde se relaciona o sinal analítico medido com a concentração do analito, é
necessária. Para tanto, prepara-se a curva de calibração, o método de adição de padrão e
o método de padrão interno.

Para se obter a curva de calibração alguns padrões com concentrações do analito


previamente conhecidas são adicionados em forma de amostras ao equipamento (Por
exemplo: HPLC/detecção eletroquímica) para se ter a resposta registrada, em geral esta
resposta, é corrigida para o valor obtido com uma amostra denominada branco no
equipamento. Essa amostra chamada de branco deverá conter todos os componentes da
amostra original excetuando-se o analito. Depois que as amostras dos padrões e do
branco são adicionadas ao equipamento, os dados obtidos são colocados em um gráfico
linear, de preferência, pois este tipo de gráfico apresenta menos erros do que os não-
lineares.

37
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
+ Salmonella typhimurium
+ +

Várias doses
triplicatas

48h
37ºC

revertentes
revertentes espontâneos
espontâneos +
induzidos

Figura 5 – Esquema do teste de Ames – incorporação em placas

(Adaptado de Ribeiro, Salvador e Marques, 2003).

Na figura 6, temos o exemplo de um gráfico linear, de uma curva de calibração de


uma amostra de DNA, analisando a formação de 8-oxo-dGuo, que auxilia na verificação

38
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
de dano oxidativo em DNA. Para se obter esta curva, quatro amostras de DNA foram
preparadas com concentrações diferentes e quatro amostras de branco (padrão) foram
injetadas no HPLC/detecção eletroquímica. Cada amostra tem um dado numérico
correspondente que é calculado por meio de uma análise estatística denominada como
teste t-student, que compara as amostras (DNA e padrão) para a determinação da
quantificação e determinação da fração molar de 8-oxodGuo presente em cada amostra,
gerando a curva de calibração, onde o R2 preferencialmente, deve ficar entre 0,99 e 1,00
para que a curva esteja dentro dos padrões considerados como excelentes.

É preciso conhecer as concentrações dos padrões e o quanto estes padrões


correspondem à matriz das amostras que serão analisadas. Isto porque, uma amostra
tem vários componentes que podem interferir nos dados apresentados nas curvas de
calibração, sendo assim, é necessário separar o analito antes de analisar uma amostra,
para se obter uma resposta sem interferências.

Portanto, a calibração corresponde à colocação em um gráfico da razão entre o


sinal do analito e o sinal do padrão, em função da concentração do analito nos padrões.
Quando um padrão é adequado sua utilização pode compensar vários tipos de erros
aleatórios e sistemáticos, pois se os sinais do analito e do padrão responderem às
flutuações aleatórias do método e instrumental, a razão entre esses sinais não depende
dessas flutuações. A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média
determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente:

Exatidão = concentração da média experimental = x 100

concentração teórica

O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções


contendo concentrações decrescentes da amostra até o menor nível determinável com
precisão e exatidão aceitáveis. Pode ser expresso pela equação:

LD = DPa x 10

39
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
IC

Onde: DPa é o desvio padrão, de no mínimo, 3 curvas de calibração construídas


contendo concentrações das amostras próximas ao suposto limite de quantificação. Este
desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de calibração proveniente da
análise de um apropriado número de amostras do branco; IC é a inclinação da curva de
calibração.

Curva 8-oxo-dGuo

120000
100000
80000
área

60000
y = 98425x - 1084,4
40000
R2 = 0,9965
20000
0
0,25 0,50 1
pmol

Figura 6 – Curva de Calibração. Fonte: Hermida (2007).

É também necessário avaliar a precisão do método analítico que pode ser


expressa como o desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) de
uma série de medidas. A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR)
ou coeficiente de variação (CV%), segundo a fórmula:

DPR = DP x 100

40
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
CMD

Onde: DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.

1.9 - Questões para estudo:

1 – O que é efeito adverso? Exemplifique.

2 – Quais fatores relacionados ao organismo influem na toxicidade?

3 – Que princípios devem ser seguidos na realização de testes toxicológicos em


animais?

4 – Em quanto tempo o teste de toxicidade crônica pode variar quando aplicado


em roedores?

5 – Qual é a “maior problemática” na extrapolação dos dados de animais para o


homem?

6 – Quais são os métodos analíticos mais utilizados nos dias de hoje?

7 – Que técnica analítica é usada para identificar propriedades químicas e


estruturais de moléculas e biomoléculas? Por quê?

8 – Por que a técnica de CCD é tida como referência em muitos laboratórios?

9 – Que dispositivos fazem à conversão de informações não elétricas para


elétricas?

10 – Por que é necessário conhecer as concentrações dos padrões que serão


usados na curva de calibração?

1.10 - Glossário

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Absorção - diz-se que um material foi absorvido somente quando tenha
alcançado entrada no fluxo sanguíneo e consequentemente poder ser carregado para
todas as partes do corpo. A absorção necessita que a substância passe por meio da pele,
membrana mucosa, ou por meio dos alvéolos pulmonares (sáculos de ar dos pulmões).

Amostra – termo geral que abrange: controles, brancos, amostras processadas e


desconhecidas.

Amostra (branco) – amostra de uma matriz biológica na qual nenhum analito foi
adicionado, utilizada para avaliar a especificidade do método bioanalítico.

Analito – composto químico específico a ser mensurado, podendo ser o fármaco


não-transformado, biomolécula ou seu derivado, metabólito ou produto de degradação em
uma matriz biológica.

Antídoto – agente capaz de antagonizar os efeitos tóxicos de uma substância.

Autofagia – autodestruição pela célula de alguma ou algumas de suas próprias


estruturas (já degeneradas ou não mais funcionais) em pequenos vacúolos, onde são
lançadas as enzimas hidrolisantes dos lisossomos. É uma forma de digestão intracelular
com finalidade de retardar o processo de envelhecimento da célula.

Biotransformação – toda alteração que ocorre na estrutura química da


substância, no organismo.

Congênito – aquilo que acompanha o indivíduo desde o seu nascimento, ou


antes dele, anomalia decorrente de malformação embrionária; patologia adquirida durante
a vida intrauterina por contágio por meio da placenta, como sucede com a sífilis, a
toxoplasmose e a rubéola.

CL50 - concentração letal média.

DL50 - dose letal média.

Droga – toda substância capaz de modificar ou explorar o sistema fisiológico ou


estado patológico, utilizada com ou sem intenção de benefício no organismo receptor.

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Especificidade – habilidade do método bioanalítico de medir e diferenciar o
analito de componentes que possam estar presentes na amostra, tais como metabólitos,
impurezas, compostos de degradação ou componentes da matriz.

Estabilidade – parâmetro que visa determinar se um analito mantém-se


quimicamente inalterado numa dada matriz sob condições específicas, em determinados
intervalos de tempo.

Exatidão – representa o grau de concordância entre os resultados individuais


encontrados e um valor aceito como referência.

Faixa de quantificação – corresponde a uma faixa de concentração, incluindo o


LSQ e o LIQ, que pode ser confiável e reprodutivelmente quantificada com exatidão e
precisão, por meio da relação concentração-resposta.

Fármaco – toda substância de estrutura química definida capaz de modificar ou


explorar o sistema fisiológico ou estado patológico em benefício do organismo receptor.

Histopatológico – estudo de tecidos doentes, no que se refere à origem (sinais e


sintomas).

IN VITRO – expressão usada em técnica experimental para caracterizar toda


experiência laboratorial feita em um dispositivo artificial de mesa, como tubo de ensaio,
proveta, entre outros. Experiência não realizada em organismo vivo.

IN VIVO – atividade experimental praticada em organismo vivo. Diz-se da


experiência procedida em cobaia, interpretando como tal qualquer ser vivo.

Limite de Detecção (LD) – menor concentração de um analito que o


procedimento bioanalítico consegue diferenciar confiavelmente do ruído de fundo.

Limite Inferior de Quantificação (LIQ) – menor quantidade de um analito numa


amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão aceitáveis.

Limite Superior de Quantificação (LSQ) – maior quantidade de um analito numa


amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão.

Linearidade – corresponde à capacidade do método de fornecer resultados


diretamente proporcionais à concentração da substância em exame (analito).

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Matriz biológica – material distinto de origem biológica, que pode ser amostrado
e processado de modo reprodutível.

Método – descrição compreensível de todos os procedimentos usados em


análises de amostras.

Mutagênico – qualquer fator, físico ou químico, que provoque mutação. Dentre os


fatores físicos mutagênicos destacam-se os raios X, ultravioleta, entre outros. Os fatores
químicos mutagênicos são numerosos e os mais conhecidos são os derivados de pireno,
o ácido nitroso, o LSD, o gás de mostarda, entre outros.

Organogênese – fase da embriogênese durante a qual se formam e se


desenvolvem os órgãos, pela harmônica e ordenada distribuição dos tecidos.

Padrão de calibração – matriz biológica a qual foi adicionada uma quantidade


conhecida de analito. Os padrões de calibração são usados para construir a curva de
calibração, com a qual são determinadas as concentrações do analito e nas amostras
desconhecidas em estudo.

Padrão Interno – composto, geralmente com características estruturais similares


ao analito, adicionado aos padrões de calibração e amostras em concentrações
conhecidas e constantes, para facilitar a determinação do analito.

Precisão – representa o grau de repetibilidade entre os resultados de análises


individuais, quando o procedimento é aplicado diversas vezes numa mesma amostra
homogênea, em idênticas condições de ensaio.

Recuperação – eficiência de extração de um método analítico, expressa como a


porcentagem da quantidade conhecida de um analito, obtida da comparação dos
resultados analíticos de amostras de branco acrescidas de padrão e submetidas ao
processo de extração, com os resultados analíticos de soluções padrão não extraídos.

Reprodutibilidade – precisão entre dois laboratórios. Também representa a


precisão do método sob as mesmas condições operacionais, num curto período de
tempo.

Toxicidade – capacidade inerente e potencial do agente tóxico de provocar


efeitos nocivos em organismos vivos.

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Toxicidade Aguda - este termo será empregado no senso médico para significar
“de curta duração”. Quando aplicado para materiais que podem ser inalados ou
absorvidos por meio da pele, será referido como uma simples exposição de duração
medida em segundos, minutos ou horas. Quando aplicado a materiais que são ingeridos,
será referida comumente como uma pequena quantidade ou dose.

Toxicidade Crônica - este termo significa de longa duração. Quando aplicado a


materiais que podem ser inalados ou absorvidos por meio da pele, será referido como
períodos prolongados ou repetitivos de exposição de duração medida em dias, meses ou
anos. Quando aplicado a materiais que são ingeridos, será referido como doses
repetitivas com períodos de dias, meses ou anos. O termo “crônico” não se refere ao grau
(mais severo) dos sintomas, mas com a implicação de exposições ou doses que podem
ser relativamente perigosas, a não ser quando estendidas ou repetidas após longos
períodos de tempo (dias, meses ou anos).

Sistêmico - este termo se refere a um ponto de ação diferente do ponto de


contato e pressupõe que ocorreu absorção. É possível, que agentes tóxicos possam ser
absorvidos por meio de canal (pele, pulmões ou canal gastrintestinal) e produzirem
manifestações posteriores em um daqueles canais que não são um resultado do contato
direto original. Assim, é possível para alguns xenobióticos produzir efeitos perigosos em
um simples órgão ou tecido como o resultado de ambas as ações “local e sistêmica”.

Termolábil – não resistente ao calor. Que se decompõe pelo calor. A vitamina C


é um produto termolábil, por exemplo.

Xenobiótico – substâncias químicas estranhas ao organismo.

---------------FIM DO MÓDULO I-----------

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