Inmunofluorescencia

Técnica que se utiliza para la detección de estructuras 
subcelulares que nos permiten estudiarlas con la utilización de 
anticuerpos acoplados a fluoróforos.

¿Conocen alguna otra técnica para marcar de manera 
fluorescente una proteína?

Lic. Micaela Daiana Garcia
 ¿Por qué estudiar la localización 
subcelular de una proteína?
La expresión de proteínas de una célula es dinámica. Esto depende de los estímulos
que reciban, los requerimientos energéticos y como ésta interprete los mismos
manifestará cambios en la expresión y distribución de las proteínas de su repertorio
genético.

Localización 
Ejemplo:
subcelular

Escalas 
temporales

Sin estímulo
Función 
Interacciones de una 
proteína

Endocitosis y 
señalización
Con estímulo
Migración celular
La inmunofluorescencia es un conjunto de técnicas en donde se emplean
anticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y/o
tejidos.

Inmunodetección Transfección
Tubulina Núcleo Paxilina Mitocondrias Núcleo Actina

Fibroblastos de ratón. Inmunodetección
con anti beta tubulina (citoesqueleto), y  Células BHK‐21 fueron transfectadas con el 
con anti paxilina (adhesiones focales). El  plásmido DsRed‐Mitocondria. Luego la 
núcleo se tiñó con DAPI un intercalante del  detección de actina se hizo con faloidina
ADN.  acoplada a Alexa Fluor 488 (citoesqueleto).

No confundir inmunodetección con Transfección ! 
Proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos 
ó físicos.
Pasos claves de una inmunofluorescencia

Fijación
1

2
Permeabilización

3
Bloqueo

4 Inmunodetección:
‐ Inmunofluorescencia directa
‐ Inmunofluorescencia indirecta
 Fijación: 
1
Preservar la localización, composición y estructura del material biológico a
analizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que existe in
vivo.
Existen distintos métodos de fijación de material biológico. Esto dependerá de
distintos factores como: el tipo de microscopia a utilizar, la estructura
subcelular que se quiera detectar, entre otras.

Glutaraldehído Paraformaldehído Metanol/Acetona

Modo de  Por puentes entre grupos  Por puentes entre grupos  Por precipitación de 
acción aminos de las proteínas aminos de las proteínas proteínas y carbohidratos
Microscopía electrónica y Estudios de fluorescencia e  Gran variedad de estudios
Uso más 
algunos estudios de  inmunocitoquímicos
frecuente
fluorescencia
‐ Provee la mayor  ‐ Produce menos  ‐ La fijación es más rápida 
preservación de estructura  autofluorescencia que el  que con los aldehídos.
fina. glutaraldehído. ‐ Puede alterar el patrón de 
‐ Es el más severo de los  ‐ Genera menor cantidad de  localización de los 
Ventajas / 
fijadores. puentes que el  antígenos.
Desvantajas
‐ Altera los epitopes. glutaraldehído. ‐ Fija y permeabiliza al 
Provoca fluorescencia  ‐ Penetra más rápidamente  mismo tiempo.
inespecífica. dentro de la célula. ‐ Puede generar contracción 
en la muestra.
 2 Permeabilización:
Existen distintos métodos de permeabilización que son mas “suaves” o mas 
“fuertes”. Esto dependerá de la naturaleza del compuesto permeabilizante a 
utilizar. Produce poros en las membranas celulares. Lo que permite el ingreso 
de los anticuerpos a la célula si queremos detectar estructuras internas de la 
célula.

Anticuerpo 
específico
Célula positiva
Célula fijada Permeabilización

Inmunodetección

Célula negativa
Isotipo

Se utilizan generalmente detergentes no iónicos que solubilizan los lípidos de la membrana 
produciendo de manera irreversible o reversible poros en la membrana (por ejemplo Tritón X‐
100, NP40).
3
Bloqueo

• Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con el

material biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica.

• En general se utilizan soluciones protéicas concentradas (Generalmente

Albúmina bovina sérica o gelatina de pescado).

• El anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirse

a su epitope y así detectar la estructura de interés.

• Se reduce la unión inespecífica del anticuerpo por epitopes no específicos.

4 Inmunodetección:

• Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer

específicamente y unirse con alta afinidad a otras moléculas
(antígenos).

• La molécula que es reconocida por los anticuerpos se denomina

antígeno. Cada antígeno tiene al menos un epitope o región
reconocida por un anticuerpo.
 Anticuerpos
Se trata de moléculas sintetizadas por 
linfocitos B y capaces de reconocer y 
unirse con alta afinidad a otras 
moléculas 

Lic. Eliana Fernandez
 ¿Cómo están compuestos?
Las inmunoglobulinas se encuentran formadas por 4 cadenas polipeptídicas: 
2 cadenas pesadas (H, en verde) (55 000 dalton) y 2 cadenas livianas (L, en 
amarillo) (25 000 dalton)

Cada cadena posee regiones variables que permiten 
el reconocimiento específico de antígenos y otra región 
Constante.
 El antígeno es reconocido por la región variable del anticuerpo.
La parte del antígeno reconocida se denomina epitope.

Paratope
Epitope
Epítopes antigénicos
Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.
Anticuerpos policlonales
Anticuerpos producidos por diferentes clones de 
linfocitos

Mezcla heterogénea de anticuerpos que reconocen 
distintos epitopes de un mismo antígeno

Anticuerpos monoclonales
Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos

Población de anticuerpos homogéneos que reconocen 
el mismo epitope de un antígeno
¿Cómo se obtienen los anticuerpos policlonales?
 ¿Cómo se obtienen los anticuerpos monoclonales?
Se obtienen inmortalizando 
linfocitos B, por fusión con 
células de mieloma de ratón.

Las células fusionadas 
(hibridomas) producirán
inmunoglobulinas idénticas a las 
que producía el linfocito B normal 
parental y son inmortales como el 
mieloma que le dio origen.

César Milstein
Premio Nobel de Química 1984
¿Cómo debe ser el anticuerpo 
secundario?
¿Cómo se obtienen los anticuerpos secundarios?

IgG anti‐IgG de 

conejo hecha 
en ratón

IgG purificadas 
de conejo
Gracias!