PROCESO DE INMUNIZACIÓN EN ANIMALES DE

EXPERIMENTACION

OBJETIVOS

· Ensayar las técnicas de inmunización con conejos, practicando algunos

de los esquemas de inmunización ya establecidos.

· Efectuar la purificación de sangre lavada al 5% por precipitación de

cloruro de sodio al 9%.

· Conocer distintas maneras de poner en evidencia la reacción que ocurre

cuando un antígeno soluble interacciona con su anticuerpo homólogo.

INTRODUCCIÓN

El sistema inmunológico tiene como función principal proteger al organismo de

agentes extraños, está integrado por diferentes órganos, tejidos, células y
moléculas que funcionan coordinadamente. Sus componentes más importantes
son: la piel y las mucosas, los órganos linfoides como las amígdalas, las
adenoides, el bazo, el timo, los ganglios linfáticos; numerosas células
leucocitarias (linfocitos) y sus productos de secreción como citocinas,
quimiocinas e inmunoglobulinas entre otros. Este sistema tiene tres propiedades
esenciales: primera, tiene la habilidad de reconocer sustancias extrañas
denominadas antígenas principalmente provenientes de patógenos, tales como
bacterias, virus, hongos.

Los anticuerpos, también llamados inmunoglobulinas, son glucoproteínas

producidas por células específicas del sistema inmunitario en respuesta a una
proteina extraña o antígeno. Inmunoglobulinas, término introducido por vez
primera por J. F. Heremans en 1959 para referirse a aquellas globulinas que se
asocian al sistema linforreticular y que a menudo son referidas como
“anticuerpos” que son producidas por las células plasmáticas. El descubrimiento
de los anticuerpos fue el resultado global de un cúmulo de conocimientos
derivados de observaciones científicas recabadas a lo largo de varios siglos,
desde las vacunas rudimentarias de la antigua civilización China (variolización),
hasta la primera estructura resuelta por Edelman y Porter .
En general los anticuerpos, independientemente de su especificidad tienen una
estructura común, consistente de cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas
pesadas idénticas de 55-70 kDa denominadas con la letra H (del inglés heavy),
unidas covalentemente a un oligosacárido, y un par idéntico de cadenas livianas
no glicosiladas de 24 kDa denominadas con la letra L (del inglés light). Un puente
disulfuro y otras uniones no covalentes unen las cadenas pesadas con las
livianas. Las cadenas pesadas también están unidas entre sí por al menos un
puente disulfuro, tal unión está localizada en una región conocida como
“bisagra”, región formada por aproximadamente 12 residuos de aminoácidos que
proporciona una gran flexibilidad a la molécula, éstos residuos están expuestos
a la ruptura química y enzimática.

CLASES O ISOTIPOS

Existen diferentes clases de anticuerpos, las cuales son determinadas por el tipo
de cadena pesada. Hay cinco tipos de cadenas pesadas, denotados por las
letras griegas y para cada una de las inmunoglobulinas IgG,
IgA, IgD, IgE e IgM, respectivamente. En estas clases pueden existir cadenas
livianas ya sea de tipo kappa ) o tipo lambda (). Los genes que codifican para
las distintas variantes isotípicas están presentes en todos los individuos sanos,
es decir, éstos poseen los genes para las cadenas pesadas denominadas 1,
2, 3, 4, , 1, 2 localizados en el brazo largo del cromosoma 14 y para las
cadenas livianas y, en los cromosomas 2 y 22, respectivamente.

FACTORES QUE INTERVIENEN EN LA REACCIÓN ANTÍGENO-

ANTICUERPO

La reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es la piedra angular de la respuesta

inmune y se pone de manifiesto in vitro por la formación de un precipitado o
aglutinación de partículas (eritrocitos). El acoplamiento estructural entre las
macromoléculas está dado por varias fuerzas débiles que disminuyen con la
distancia, como los puentes de hidrógeno, las fuerzas de Van Der Waals, las
interacciones electrostáticas y las hidrofóbicas. El reconocimiento Ag-Ac es una
reacción de complementariedad, por lo que se efectúa a través de múltiples
enlaces no covalentes entre una parte del antígeno y los aminoácidos del sitio
de unión del anticuerpo. La reacción se caracteriza por su específicidad, rápidez,
espontaneidad y reversibilidad:

· Específicidad: capacidad de los anticuerpos para distinguir entre dos

ligandos de estructura similar. La unión dada por la especificidad es muy precisa
y permite distinguir entre grupos químicos con diferencias mínimas.

· Rapidez: la velocidad con que ocurre la primera etapa de la reacción Ag-

Ac es del orden de milésimas de segundo, y está limitada únicamente por la
difusión. La segunda etapa, que es más larga, incluye todas las manifestaciones
que se presentan como consecuencia de la interacción, tales como precipitación,
aglutinación, neutralización, etcétera.

· Espontaneidad: la reacción Ag-Ac no requiere energía adicional para

efectuarse y es factible explicarla en términos de la ley de acción de masas.

· Reversibilidad: dado que la reacción se debe a fuerzas no covalentes, es

reversible y, en consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura,
la proporción de Ag-Ac, el pH y la fuerza iónica.

METODOLOGÍA

OBTENCIÓN DEL ANTÍGENO

 Se extrajo sangre de un niño de sangre tipo ´´A´´ postivia sano en un tubo

con citrato de sodio
 Se centrifugó a 3,500 rpm durante 5 minutos para obtener el suero.
 Tras terminar el anterior proceso se decanto el plasma sanguíneo y se
extrajo 1ml de sangre con una micro pipeta de capacidad de 100-1000
ul.
 En un tubo de ensayo esteril se coloco la sangre y se precipito con cloruro
de sodio al 9%
 Se llevo a la centrifuga a 3000 rpm x 3 min por tres veces.
 Se inoculó en el conejo.

INOCULACIONES DEL CONEJO

Se hizo vía subcutánea:

1. Se le aplico xilocaina al conejo en la oreja.

2. Se introdujo la aguja de 27x 5/8 mm punta naranja en la vena del conejo con
el bisel hacia arriba. Una vez dentro de la piel, se giró 180º y se depositó el
inóculo. En el sitio de la inoculación se observó la formación de una pápula que
días después evolucionó en costra.

El programa de inoculación fue el siguiente:

Programa de inoculación de suero humano en el conejo por vía subcutánea.

Día Fecha Cantidad inoculada Número de

(ml) puntos
1 04-sep-18 0.5 2
3 06-sep-18 1.0 4
5 08-sep-18 1.5 6
7 11-sep-18 2.0 1° SANGRADO
10 13-sep-18 2° SANGRADO
13 15-sep-18 4° SANGRADO
15 17-sep-18 3° SANGRADO
En la tabla 1 Se observa que se administró por vía intravenosa 7 días antes del
sangrado para asegurarse que presentara alta concentración de anticuerpos. El
sangrado se obtuvo de la oreja del conejo en la vena central. Se obtuvieron 5 ml
de sangre.

OBTENCION DEL SANGRADO DEL CONEJO

 Se le froto las oreja para que sus venas puedan dilatarse y así hacer más
fácil este procedimiento de punción en la vena.
 Se le aplico xilocaina para el dolor de la aguja sea menos traumático para
el animal
 Se le extrajo la muestra por goteo en aguja de 25 x 1 ml de colo azul.
 Se colocó la muestra en un vacuteiner pediátrico con gel separador.

CONSERVACION DE LAS MUESTRAS

  Se llevó al laboratorio y policlínico de ´´ESSALUD´´ las muestras y se
centrifugo a 3500 rpm x5 min.
 Se le extrajo el plasma sanguíneo con un micro pipeta de 50 ul.
 Se colocó el plasma del sangrado en un crio vial de tapa rosca y rotulada.
 Se colocó a - 20°C para la conservación del plasma.
 Este procedimiento de realizo en los 4 sangrados que se le hizo al animal.

DILUCIONES SERIADAS DEL PROCESO DE INMUNIZACION

 Se le extrajo la muestra de la madre del niño con sangre tipo A para hacer
la reacción antígeno anticuerpo.
 Se descongelo los micro viales a temperatura ambiente para poder
procesarlas.
 Se lavó la sangre de la madre del niño para extraer glóbulos rojos lavados
al 5%.
 Se colocó 10 tubos seriados en un soporte respectivamente para cada
sangrado.
 Se colocó 100 ul de Cloruro de Sodio en todos los tubos para poder hacer
la dilución
 Se colocó 100 ul de muestra de los 4 plasmas en los 4 primeros tubos
seriados respectivamente
 Se homogenizo las muestras y el cloruro de sodio.
 Se absorbió 100 ul de muestra homogenizada en los tubos y se empezó
a hacer las diluciones.
 Luego se llevó a la centrifuga a 3400 rpm x 15 segundos contados
paulatinamente.
 Se empezó a dar lectura de los botones respectivamente por las
´´cruzes´´.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 REACCION ANTIGENO - ANTICUERPO 1°

3 3

1 1
+/-

cruzes 0 0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

En la figura 1 La reacción antígena – anticuerpo que se da en el primer sangrado

es una curva decreciente en la cual se nota que el punto máximo de titulación
para detectar anticuerpos es1/128.

REACCION ANTIGENO - ANTICUERPO 2°

4 4 4 4 4 4

1
+/-
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

cruzes

En la figura 2 La reacción antígena – anticuerpo que se da en el segundo

sangrado es una curva decreciente en la cual se nota que el punto máximo de
titulación para detectar anticuerpos es1/256 sin embargo hay una reacción
constante de 4+.
 REACCION ANTIGENO - ANTICUERPO 3°

4 4 4

1
+/-
0 0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

cruzes

En la figura 3 La reacción antígena – anticuerpo que se da en el tercer sangrado

es una curva decreciente en la cual se nota que el punto máximo de titulación
para detectar anticuerpos es 1/512 , por otro lado en la curva también se observa
que en los primeros tubos no se forma los botones esto se debe por dos causas:
se presentó el fenómeno de prozona (Exceso de antígeno) o la muestra estaba
concentrada (postzona).

REACCION ANTIGENO - ANTICUERPO 4°

4 4 4 4

1
+/-
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
cruzes

En la figura 4 La reacción antígena – anticuerpo que se da en el cuarto sangrado

es una curva decreciente en la cual se nota que el punto máximo de titulación
para detectar anticuerpos es1/1512 por otro lado en la curva también se observa
que en los primeros tubos no se forma los botones esto se debe por dos causas:
se presentó el fenómeno de prozona (Exceso de antígeno) o la muestra estaba
concentrada (postzona).

DIAS DE INMUNIZACION

1/512 1/512

1/256

1/128

7 10 13 15

DIAS DE INMUNIZACION

Los días máximos de la producción de anticuerpos fueron en el dia 13 y el dia 15

La inmunogenicidad es la medida de antigenicidad de un material y está en
función de la zona de administración y de la especie que es inmunizada .

Las proteínas y carbohidratos al poseer estructuras químicas complejas

presentan un mayor grado de inmunogenicidad (salvo ciertas excepciones) en
comparación con los polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos. Así mismo las
moléculas de composición mixta (por ejemplo: las glicoproteínas,
nucleoproteínas, glicolípidos, lipopolisacáridos y las lipoproteínas) son más
inmunógenas que sus componentes individuales. También si los compuestos
presentan estructura terciara o cuaternaria presentarán mayor inmunogenicidad.

Las moléculas que presentan pesos moleculares superiores a los 100kD son
más inmunogénicas que aquellas con pesos moleculares inferiores a los 20kD.
 MANEJO DE CONEJOS

En primera instancia, se trató el aspecto del manejo adecuado de los animales.

Si un procedimiento produce dolor o estrés en los animales de laboratorio, las
normas internacionales urgen a los usuarios a buscar nuevas alternativas
(Lobato-García, 2009). Tomando en cuenta esta recomendación, se decidió
establecer protocolos de inmunización y prácticas de laboratorio que
disminuyeran el sufrimiento del conejo utilizado. Básicamente, los esfuerzos se
orientaron a disminuir el estrés del animal durante la obtención de la muestra de
sangre y durante su inmunización. Para ello, se utilizó lidocaína en pomada 15
minutos antes de cada punción y una zanahoria para ayudar a reducir el estrés.

INMUNIZACIÓN

Una vez capacitados en el manejo de los conejos, se inició la discusión sobre la

mejor vía de inmunización con los antígenos. La inmunización puede realizarse
a través de la vía oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intracardiaca,
subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, etc. La elección de la vía depende,
entre otras cosas, de la especie animal que se utilice y de las características del
antígeno.

En la vida intravenosa proporciona un contacto inmediato y directo del antígeno

con las células inmunes; sin embargo, la inoculación del antígeno a través de
esta vía requiere de amplia experiencia en la canalización de venas o arterias.
Dado que los protocolos de inmunización establecían inoculaciones periódicas
con los antígenos, el posible fallo de la inoculación por vía intravenosa podría
constituir una limitante para la estimulación de una adecuada respuesta inmune.
En este sentido, la inoculación de los antígenos por vía intravenosa no es muy
adecuada para los fines didácticos que se persiguen con la producción de
anticuerpos. Sin embargo, esta vía podría utilizarse exitosamente si fuera
precedida de un curso sobre toma de muestras en animales de laboratorio.

Pruebas

La formación de un precipitado abundante entre el antígeno y su anticuerpo

depende de que las concentraciones de ambos sean equivalentes (zona de
equivalencia); el exceso de alguno de éstos disminuye e incluso inhibe la
formación del precipitado. Con objeto de determinar la zona de equivalencia del
antisuero se realizó una serie de diluciones dobles del plasma como se indica
en la tabla (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024). En este
caso la concentración del anticuerpo permaneció constante. Como se esperaba,
concentraciones muy bajas o muy altas del antígeno inhibieron la formación del
complejo antígeno-anticuerpo (extremos de la curva). La zona de equivalencia
para el anticuerpo anti-A se presentó entre las diluciones 1:7, 1:8 y 1:9 del
antígeno (zona central de la curva). Este resultado demostró que el protocolo de
inmunización establecido fue adecuado para la producción de anticuerpos.

En la figura 5 se observa la sangre ya lavada y lista para el procesamiento de

reacción asimismo los tubos de diluciones debiadamente rotulados para evitar
confusiones , estos ya constan con 50 ul de cloruro de sodio respectivamente en
los 40 tubos.

En la figura 6 se observa los cuatro tubos respetivos de los sangrados ya

separados en los microviales y congelados a -20°C para mantener viable la
muestra y procesarla.

En la figura 7 observamos la cuarta inoculación de 2ml , debido al caso de la

tuberculina que solo puede cargar 1 ml decidimos hacer la punción con una
 jeringa de mayor proporción y aguja de 23 x1 ml.

En la figura 8 se observa los tubos de diluciones en la centrifugadora ya listos

para centrifugarlos a 3400 rpm x 15 segundos y poder ver el botón hematológico

REACCION ANTIGENO -
ANTICUERPO 1°

3 3

1 1
+/-

cruzes 0 0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

En la realización de esta prueba se observan 2 zonas formadas respecto a la

concentración del antígeno empleado (suero humano): en la primera ocurre un
incremento de la formación del precipitado conforme se va reduciendo la
concentración del antígeno; la otra zona comienza después de la tercera dilución
(1:7) la cantidad de precipitado disminuye hasta llegar a un punto (dilución 1:512)
en donde ya no hay precipitado.

Lo anterior se puede adecuar a la curva de inmunoprecipitación donde ocurre lo

mencionado previamente, además se observa que hay una zona intermedia (en
donde el aumento/descenso del precipitado se da en una proporción menor).

Para la primera etapa como lo menciona al haber mayor cantidad de antígeno

los 2 centros de unión están ocupados, mientras que en el caso de los antígenos
presentes sus epítopos no están totalmente ocupados, por lo que no hay una
formación de complejos grandes, haciendo que solamente hayan complejos
pequeños y que sean solubles. Conforme la concentración del antígeno se va
disminuyendo los epítopos se van combinando con las zonas libres de los
anticuerpos hasta ocupar las 2 zonas de unión de estos, con lo anterior se forman
inmunocomplejos grandes e insolubles formando los precipitados. A esta zona
se le denomina la “zona de equivalencia” . En esta prueba se observa que en la
figura 9 tubo 49/ 1:9 hay mayor precipitado, por lo que correspondería a esta
zona. Para los tubos 1 y 2 si bien hay inmunoprecipitado la cantidad es menor
por lo mencionado anteriormente (formación de pequeños complejos solubles).

Al seguir disminuyendo la concentración del antígeno, estos se van a ir

reduciendo, por lo que varios anticuerpos se unirán en los diferentes epítopos,
formando complejos solubles y de esa manera se reduce la formación del
inmunoprecipitado.
En la figura 10 se observa las reacciones entre una concentración fija de
anticuerpos y concentraciones crecientes de antígeno en la prueba de
inmunoprecipitación.

En la figura 11 se observa la curva de la formación del inmunoprecipitado en

función de la concentración de antígeno.
En la figura 12 se observó que en el primer tubo del plasma del cuarto sangrado
no se formó el botón esto fue por dos causas: se presentó el fenómeno de
prozona (Exceso de antígeno) o la muestra estaba concentrada (postzona).

CONCLUSIONES

 Si hubo presencia de anticuerpos contra anti A sérica humana

como demostró en las diluciones mediantes los ´´botones´´
 La dilución 1:512 fue la que presentó mayor reacción en el día
13 y 15
 Con la reacción de inmunoprecipitación se comprobó que el
anticuerpo producido por el conejo es útil para el antígeno
administrado (suero – albúmina humana).
 En la prueba de diluciones se observó la zona de equivalencia
(relación entre las concentraciones de antígeno y anticuerpo
para formar inmunocomplejos insolubles) en la dilución de
albúmina sérica humana de 1:7 , 1:8 y 1:9
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