TINCIÓN DE FLAGELOS

TÉCNICA KODAKA
Debido a las dimensiones de los flagelos solo puede observarse al microscopio de luz
con tinciones especiales que incrementan su diámetro de deposición de colorantes.
Una variante de esta tinción fue descrita por Heimbrook et al (1989) y consiste
básicamente en hacer suspensión de bacterias como se describió anteriormente, pero
en vez de dejarla secar se le coloca un cubre objetos y se agrega una gota del
colorante en el borde del cubre objetos y se deja en reposo por 10 minutos a
temperatura ambiente. El colorante entrará a la preparación por capilaridad y teñirá los
flagelos, que se evidenciarán fácilmente en la zona donde se observa colorante.
Las bacterias para tinción de flagelos deben cultivarse en medios sin carbohidratos
para evitar efecto nocivo de acidez; además deben utilizarse cultivos jóvenes (ca. 18
horas).
OBJETIVO
Conocer el fundamento, la técnica y aplicación de flagelos
MATERIALES
- Cultivo de Pseudomonas sp. De 18 horas en agar sangre (AS)
- Cultivo de Proteus sp. De 18 horas en AS
- Colorante KODAKA recién preparado
- 1 frasco Koplic
- Cubre objetos

MÉTODO
1. En un porta objetos limpio dibujar 3 círculos (ca. 0,5 cm de diámetro) y en la
cara opuesta colocar sobre cada círculo una pequeña gota de agua destilada
2. Con un asa de siembra (forma de aguja) tocar la superficie de la colonia (no
debe tocar agar). Transferir las bacterias tomadas a las gotas de agua
colocadas en el porta objetos, para ello tocar la primera gota con la punta de la
aguja, dejándola entre 10 y 20 segundos en contacto con el agua. No agitar el
asa ni realizar movimientos bruscos al momento de depositar las bacterias
pues los flagelos son estructuras frágiles muy fácilmente de desprender.
Repetir la operación con las otras dos gotas de láminas sin tocar nuevamente
el cultivo. Las bacterias móviles se desprenderán de la aguja y nadarán en el
agua. Uno de los problemas más frecuentes es el exceso de bacterias en la
preparación; con este procedimiento se tiene 3 opciones, pues se está
diluyendo el inóculo inicial en cada gota.
3. Dejar secar la preparación al aire. No flamear. Es importante secar la
preparación al aire y no calentarla, pues el calor distorsiona los flagelos.
4. Cubrir las preparaciones con el colorante durante 5 a10 minutos. Colocar la
lámina en el frasco Koplic y lavar por 2 o 3 minutos con agua del tubo. Se
requiere un lavado intenso por ambos lados de la lámina para evitar artefactos
que puedan influir la observación. Escurrir y dejar secar al aire.
 5. Obsérvese con el objetivo de inmersión y analizar la preparación de la periferia
hacia el centro. Es recomendable iniciar el análisis en la periferia de la
preparación, pues allí se concentran las células flageladas.

TÉCNICA LEIFSON

OBJETIVO

Demostrar la presencia de flagelos mediante tinción y observar la movilidad que

presentan algunas bacterias diferenciándolas del movimiento browniano.

MATERIALES
- Suspensión bacteriana
- Solución salina o agua destilada estéril
- 1 porta objetos excavado
- 1 porta objetos normal, perfectamente limpio en mezcla crómica y
desengrasado.
- 1 cubre objetos perfectamente limpio y desengrasado
- Pipera Pasteur estéril
- Gradilla
- Asa de siembra
- Lápiz graso
- Mechero
- Vaselina
- Papel absorbente
- Colorante de Leifson
- Mezcla crómica
- Aceite de inmersión
MÉTODO
OBSERVACIÓN AL FRESCO EN GOTA PENDIENTE
1. Depositar en condiciones asépticas tres o cuatro asadas de la suspensión
bacteriana en el centro del cubre objetos limpio y libre de grasas. También se
puede usar una pipeta Pasteur estéril para este fin, procurando que la gota
quede lo suficientemente grande para facilitar la observación.
NOTA:
Los cubre objetos se pueden limpiar frotándolos cuidadosamente entre los
dedos con agua y jabón y enjuagándolos en agua caliente. Luego sumergirlos
en alcohol y secarlos con un trapo limpio sin pelusa. Finalmente, el
calentamiento suave a la flama quitará los últimos restos de grasa.
2. Cuando se trata de un cultivo sólido, colocar una gota de solución salina o
agua destilada estéril en el centro del cubre objetos limpios y emulsionar una
pequeña cantidad de material. Se puede hacer una marca cerca de la gota del
cubre objetos para facilitar la observación.
3. Poner poca vaselina alrededor de la concavidad del portaobjetos utilizando
para ello un aplicador
4. Invertir y colocar el portaobjetos sobre el cubreobjetos que contiene la gota de
suspensión bacteriana cuidando que quede bien centrado para que la
excavación quede directamente encima de la gota. La gota no debe tocar el
portaobjetos.
 5. Presionar suavemente para que se adhiera perfectamente cubre y portaobjetos
6. Invertir rápidamente. La gota que contiene el material pende del cubreobjetos
sobre la excavación del portaobjetos.
7. Observar al microscopio
TINCION DE FLAGELOS
1. Hacer un círculo en un portaobjetos perfectamente limpio para lo cual
previamente fue sumergido en mezcla crómica durante 24 horas, lavado
posteriormente con agua destilada, enjuagado con alcohol y secado con un
trozo de tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias veces.
2. Colocar dentro del círculo con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensión
bacteriana e inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la
muestra.
3. Fijar la preparación al aire ya que si esta operación se hace usando la flama
del mechero se pueden destruir los flagelos.
4. Humedecer la preparación con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a
temperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la
incubadora en tiempo frío.
5. Lavar con agua corriente.
6. Secar y observar con objetivo de inmersión.

TÉCNICA EN FRESCO
OBJETIVO
Observar disposición de flagelos de bacterias móviles
MÉTODO
1. Se cultiva el microorganismo a teñir a temperatura ambiente en agar sangre
durante 16 a24 horas.
2. Se agrega una pequeña gota de agua a un portaobjetos
3. Se sumerge un asa estéril en agua estéril
4. Se toca con suavidad el borde de una colonia con el asa cargada de agua (esto
permite que las células móviles ingresen en la gota de agua)
5. Se toca el asa llena de células móviles la gota depositada en el portaobjetos
6. Se cubre la gota de agua portaobjetos, que ahora estará algo turbia con un
cubreobjetos. Un preparado en fresco adecuado debe tener líquido apenas
suficiente para llenar el espacio que queda debajo del cubreobjetos. Es preferible
que haya algo de aire alrededor del borde.
7. Se examina el portaobjeto de inmediato con objetivo 40x para verificar si hay
células móviles. Si no se observa no se prosigue con la tinción
8. Si se observan células móviles se deja el portaobjetos a temperatura ambiente
durante 5 a 10 minutos. Este tiempo permite que las células bacterianas se
adhieran al portaobjetos o al cubreobjetos.
9. Se aplica con suavidad 2 gotas de colorante RYU para flagelos (Remel, Inc.
Lenexa, Kan) en el borde del cubreobjetos. El colorante fluirá por capilaridad y se
mezclará con la suspensión celular. Pequeñas burbujas de aire alrededor del
borde del preparado fresco son útiles para aumentar capilaridad.
10. Después de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente se examinan las células en
busca de flagelos.
11. Los flagelos pueden observarse con aumento 100x (inmersión de aceite)