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LABORATORIO AVANZADO DE
FISIOLOGÍA
Curso 2006/2007
MÓDULO ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD
Luis E. Hernández
Soledad Sanz
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Módulo de Estrés Oxidativo y Salinidad Laboratorio Avanzado de Fisiología Vegetal 2007/2008
INTRODUCCIÓN
El objeto de esta práctica es la utilización de diversas técnicas
bioquímicas y de biología molecular para estudiar un problema
fisiológico. La salinidad es un importante factor de estrés especialmente
relevante para la agricultura, y en concreto en el área mediterránea. En
la actualidad, más del 20% de los suelos cultivados y aproximadamente el
50% de las tierras irrigadas, están catalogados como potencialmente
salinos. Uno de los cultivos más afectados por este problema es el de
tomate (Lycopersicon esculentum), que se crece intensivamente en
amplias zonas del litoral almeriense y huertas murcianas bajo cubierta. El
uso de aguas freáticas de un modo indiscriminado ha provocado su
salinización, mediante la entrada de agua del mar en dichas aguas
subterráneas.
El efecto más común de la salinidad sobre las plantas es la reducción del
desarrollo debido a la disminución del potencial osmótico del medio y en
consecuencia del potencial hídrico del suelo y a una toxicidad específica
asociada con la absorción excesiva de Na+ y de Cl–. Esto último produce
un desequilibrio nutricional debido a la interferencia de estos iones con
otros nutrientes esenciales. Como consecuencia de estos efectos
primarios, ocurren otros estreses secundarios, como el daño oxidativo.
Entre los síntomas característicos del estrés inducido por salinidad es
común encontrar el aumento de especies reactivas de oxígeno (EROs),
como el ión superóxido (O2–) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Para atenuar
la toxicidad celular de estas sustancias, las plantas disponer de varios
enzimas, entre los que cabe mencionar superóxido dismutasa (SOD) y
ascorbato peroxidasa (APX), de las que existen varios isoenzimas
distribuidos en diferentes compartimentos subcelulares (Fig. 1). Dichos
enzimas forman parte de un complejo mecanismo de detoxificación de
EROS, donde intervienen glutation y ascorbato como compuestos
reductores.
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Fig. 4. Ciclo ascorbato-glutation para la eliminación de especies reactivas de oxígeno.
Bibliografía
Armengaud R, Thiery L, et al. 2004. Transcriptional regulation of
proline biosynthesis in Medicago truncatula reveals developmental
and environmental specific features. Physiologia Plantarum, 120: 442-
450.
Dionisio-Sese ML, Tobita S. 1998. Antioxidant responses of rice
seedlings to salinity stress. Plant Science, 135:1-9
Fujita T, Maggio A, et al. 1998. Comparative analysis of the regulation
of expression and structures of two evolutionarily divergent genes for
1-pyrroline-5-carboxylate synthetase from tomato. Plant Physiology,
118: 661-674.
Mittova V, Theodoulou, et al. 2004. Comparison of mitochondrial
Fig 1. Ciclo ascorbato-glutation para la eliminación de especies reactivas de oxígeno (EROs).
ascorbate peroxidase in the cultivated tomato, Lycopersicon
SOD y APX juegan un papel central en su eliminación.
esculentum, an its wild salt-tolerant relative, L. pennellii – a role for
matrix isoforms in protection against oxidative damage. Plant, Cell
Environment, 27: 237-250
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Procedimiento: Todo el material se manipulará con guantes, para evitar su contaminación con
RNAasas. Para limitar su presencia, ha de prepararse el material para la homogeneización del
tejido: se lavan exhaustivamente los morteros a utilizar y se tratan con una disolución NaOH 1
M durante 30 min. Seguidamente, los morteros se lavan bien con H 2O miliRO y se secan con
papel. Alternativamente, los morteros han de autoclavarse con suficiente antelación utilizando
el ciclo corto de esterilización. Este proceso de esterilización YA HA SIDO REALIZADO
POR LOS PROFESORES, por lo que los alumnos encontrarán el material LISTO para su uso.
Se recolectan las plantas del tratamiento que corresponda, que se han cultivado en tiestos con
perlita. Se va a estudiar exclusivamente la expresión en la parte aérea. Tras lavar
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cuidadosamente con H2O miliRO estéril y se seca el material vegetal ligeramente con toallita
de papel.
Extracción de RNA
Para extraer el RNA del material vegetal a analizar, se va a emplear un kit comercial, SV Total
RNA Isolation System de Promega (EE.UU.), que permite la obtención de suficiente RNA de
calidad para reacciones de RT-PCR. Se procede de la siguiente manera:
1. Se transfiere 250 µL del tampón de homogeneización (SV RNA Lysis Buffer) a un tubo
Eppendorf de 1.5 mL estéril.
2. Escoger 4 o 5 hojas de tomate. Se congelan con N 2(l) y se pulverizan con un mortero
estéril.
3. Se transfiere 100 mg del polvo congelado al tubo Eppendorf que contiene el tampón de
homogeneización. Se emplea una espátula que previamente se ha enfriado en N 2(l), para
evitar la descongelación del material vegetal.
4. Mezclar muy bien por repetidas inversiones. Añadir 450 µL de la disolución de dilución
(SV RNA Dilution Buffer, de color azul), y mezclar por inversión 3-4 veces.
5. Incubar la suspensión a 70ºC durante 3 min. Evitar tiempos prolongados de incubación,
pues se puede degradar el RNA
6. Extraer el montaje de purificación de RNA del kit de su embalaje y situarlo en una
gradilla adecuada. Marcar con el nombre de la muestra tanto el tubo recolector como el
contenedor de la matriz de purificación (de color blanco; y aprx. 1 mm de espesor).
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Para analizar con mayor precisión los resultados que se obtendrán en la RT-PCR, es preciso
visualizar la cantidad de RNA extraído y determinar su calidad. Esto es, si está o no
degradado. Esto se realizará mediante su separación electroforética en gel de agarosa
desnaturalizante y posterior tinción con bromuro de etidio, con objeto de visualizar
adecuadamente las bandas mayoritarias de RNA ribosómico (25S y 18S).
Procedimiento
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Para facilitar la práctica se va a emplear un kit preparado para conseguir en una sola reacción
tanto la síntesis de cDNA como, posteriormente, la amplificación para poder ser analizado en
un gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio (BrEt).
Para poner la cantidad adecuada de RNA para la reacción de RT-PCR hay que diluir una
alícuota 1/5. Esto es: como molde de RNA se prepará una muestra con 10 µL del RNA
extraído al que se añade 40 µL de H2O pura libre de RNAasas.
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Programa deldel
Combinación de componentes termociclador
medio de reacción de RT-PCR
Temperatura (ºC) Tiempo
CEBADOR (10 µM) Muestra de RNA (1/5)
Transcripción reversa 42 30 min
Componente LeAPXF LeAPXR LeP5CSF LeP5CSR Control + NaCl
PCR Cebador + 5 µL
Control APX
Desnaturalización 94 5 min
Cebador
30 -
ciclos a baja 5 µL
Molde de RNA
temperatura 5 µL
Desnaturalización 94 1 min
+ 5 µL
+ NaCl APX
Anillamiento
Cebador 59 1 min
Extensión 68 1 min
Cebador
Extensión- final 5 µL 68 5 min
Final reacción 4 Hasta el siguiente día
Molde de RNA 5 µL
Control P5CS
Cebador + 5 µL
Cebador - 5 µL
Molde de RNA 5 µL
+NaCl P5CS
Cebador + 5 µL
Cebador - 5 µL
Molde de RNA 5 µL
Mezcla Maestra 35 µL 35 µL 35 µL 35 µL 35 µL 35 µL
TOTAL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL
Para cada muestra de RNA se estudiará la expresión de una APX (LeAPX, presumiblemente
citosólica) y de 1-pirrolina-5-carboxilato sintetasa (LeP5CS2), el cual se sobreexpresa como
respuesta de las plantas a exceso de sal, para lo que se han diseñado cebadores específicos.
Como puede observarse en la tabla adjunta, cada par de cebadores tienen un rango de
temperatura de anillamiento recomendada, calculada utilizando el programa Oligos,
desarrollado por el Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finlandia
(http://www.biocenter.helsinki.fi). Para asegurar la amplificación de todos los fragmentos se
puede programar el termociclador para iniciar el anillamiento de la PCR a una temperatura
inicial menor, para subirla en una segunda tanda de ciclos.
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Fig. 3. Estructura del bromuro de etidio. Se forma un aducto con las cadenas de ácidos nucleícos, que fluoresce
cuando se ilumina con luz ultravioleta. Dada la alta energía de esta luz y su posible carácter ionizante, hay que
trabajar con extremo cuidado, protegiéndonos de su exposición.
desnaturalizante de formaldehído/formamida.
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Fundamento
En la práctica se pone de manifiesto los cambios en la actividad de APX en hoja de tomate
entre plantas control y las tratadas con NaCl 200 mM. Se pretende, asimismo, comparar
dichos cambios de actividad con las variaciones en la expresión de los genes que codifican
APX, que se ha estudiado previamente. Para dicho análisis emplearemos un ensayo de
actividad in gel, separando las proteínas mediante una electroforesis de poliacrilamida no
desnaturalizante.
Fig. 4. Visualización de gel de agarosa con cDNA amplificado, empleando BrEt. Se muestran varias
muestras de guisante, y alguno de los amplicones esperados. 1) CuZnSOD citosólica, 2) CuZnSOD
plastidial, 3) APX citosólica y 4) control de carga y amplificación derivado del 18S rRNA (315 pb)
empleando los cebadores de Ambion.
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Reactivos
Tampón de extracción (TE): con este tampón haremos la extracción del material congelado a
-80ºC. Está compuesto por:
MOPS 30 mM, (Pm: 209,3; 3,1395g )* Ácido ascórbico 10mM, (Pm: 176,13; 0,8806g )
EDTA-Na 5mM, (Pm: 372,24; 0,9306 g ) PVP soluble 0,6% (p/v), (3g )**
DTT 10mM, (Pm: 154,2; 0,771g )
*Los pesos en paréntesis son para preparar 500 mL de tampón de extracción.
**El PVP es muy insoluble, tarda bastante en disolverse y es mejor echarlo al final del todo.
Los pesos indicados son los necesarios para el volumen final de 500 mL, este volumen es suficiente para realizar
unas 250 extracciones, ya que cada gramo de material precisa unos dos ml de tampón de extracción.
Una vez que se haya disuelto todo, se ajusta el pH a 7.3 y se conserva en alícuotas de 15 mL a
-20ºC hasta su utilización. Hay que evitar en lo posible la reutilización de tampón
descongelado, dada la labilidad de varios de sus componentes.
Mezcla extractora (ME): Se prepara en fresco justo cuando vayamos a hacer las
extracciones, en un tubo muy limpio de ensayo de 15 mL. Mientras no se use, mantenerlo en
baño de hielo. Con estas cantidades tenemos suficiente para preparar 12 extractos
enzimáticos en total (dos por grupo), utilizando 0.5 g de tejido:
14 mL de TE
10 µL de PMSF 200 mM (preparado en isopropanol)
1 mL de cocktail inhibidor de proteasas (Sigma, cat. P2714; preparado en 10 mL de H2O miliRO)
La función del PMSF y del cóctel de inhibidores es evitar la degradación por proteasas de las
proteínas extraídas, una vez que las muestras empiezan a descongelarse. Esto es fundamental,
pues proteínas degradadas pueden alterar el patrón de bandas a observar.
Gel de poliacrilamida: Hay que emplear todo el tiempo necesario en limpiar perfectamente
los cristales, peines etc., realizando un lavado con agua jabonosa y esponja suave (EVITAR
RAYAR LOS CRISTALES). Se aclara bien todo el material con agua del grifo, a continuación
con agua miliRO, y por ultimo se rociará con etanol al 70%, secándolo perfectamente todo.
Una vez comprobada su estanqueidad del montaje, se preparará la disolución de acrilamida.
En el momento de la carga del gel hay que poner especial atención para que no nos quede
ninguna burbuja y dejamos que se polimerice con los peines puestos. La polimerización del
sobrante de gel que nos quede en el Falcón nos indicará cuando nuestro gel esta listo y se
puede guardar en la nevera con total seguridad.
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Disolución Volumen
Tampón Tris-HCl 0,3 M pH 8,8 6 mL
Acrilamida/bis-acrilamida 30/1 6,6 mL
H2O mili RO 7,2 mL
Mezclar bien
Polimerización:
TEMED 8 µL
Amonio persulfato (APS) 10% (p/v) FRESCO 200 µL
Una vez añadido los componentes mayoritarios, el TEMED y el APS se emplear para
polimerizar la acrilamida. Por tanto, a partir de entonces, deberemos trabajar con presteza y
diligencia a la hora de cargar el gel para evitar que polimerice antes de montar el gel. Para
asegurar una adecuada polimerización, el APS hay que prepararlo fresco en el día.
Tampón de electroforesis (Running Buffer, RB): Está compuesto por Tris, glicina y
ácido ascórbico. Se prepara un litro diez veces concentrado, sin el ácido ascórbico, se tapa con
papel de plata y se guarda a 4º C. Cuando preparemos un gel prepararemos el 1x y justo antes
de correr el gel añadiremos el ácido ascórbico.
Disolución madre 10x Cantidad para 1 L
Tris 25 mM, (Pm: 121,1) 30,28 g
Glicina 190 mM (Pm: 75,07;) 142,26 g
Ajustar pH a 8.3 con HCl, y enrasar a 1 L
Disolución de trabajo 1x
Disolución RB 10x 100 mL
Ácido Ascórbico 2 mM, (Pm: 176,13) 0,3522 g
Enrasar a 1 L
Tampón de carga (TC): Este tampón permite que las muestras adquieran mayor densidad y se
depositen en el fondo de los pocillos del gel. Además, para aquellas muestras incoloras, el
azul de bromofenol nos permite visualizar que la carga se ha realizado correctamente. Por otro
lado, este colorante migra junto al frente de electroforesis permitiendo discriminar cuando se
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Pasada media hora, se lavan bien los pocillos del gel con una jeringuilla, utilizando el RB.
En cada pocillo se cargan 20 μl de muestra preparada anteriormente, cargando un pocillo por
extracto enzimático. Una vez cargadas todas las muestras en cada cubeta, se corren los geles a
30 mA. Cuando las muestras hayan entrado en el gel, y los montajes de electroforesis se
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pueden manipular con seguridad, las cubetas se introducen en un baño de hielo, para
refrigerar el tampón durante la separación de las proteínas. Después de 1,5-2,0 horas de
espera, y cuando el azul de bromofenol nos indique que el frente de electroforesis ha llegado
al final del gel, se desenchufará el montaje de electroforesis, apagando la fuente de
alimentación. Seguidamente, se extraen los geles del montaje, separando los cristales y
separadores. Se parten los geles para que los respectivos grupos puedan analizar sus
resultados, efectuando la tinción de APX.
Fig. 5. Esquema del revelado de actividad de APX “in gel”. Es preciso el equilibrado del tampón de reacción
enzimática que permita la reducción de ascorbato en presencia de H 2O2. El ascorbato no eliminado por la
reacción de APX, reacciona con ANT, reduciéndolo en presencia de TEMED.
Revelado de APX
Fundamento: El ANT es reducido por el ascorbato, actuando el TEMED como catalizador
esta reacción. Se produce azul de formazano, que es insoluble, tiñendo aquellas áreas donde
hay exceso de ascorbato de un color azul muy intenso. En el lugar donde esté la APX se podrá
ver una banda acromática debido a que en ese lugar la APX ha consumido el ascorbato para
reducir el peroxido de hidrógeno durante la fase de incubación
Reactivos:
Tampón fosfato madre 100 mM pH 7.0. Preparar 1 L a partir de dos disoluciones madre de
Na2PO4 1M (57,7 mL) y NaH2PO4 1M (42,3 mL).
Tampón fosfato madre 100 mM pH 7.8. Preparar 1 L a partir de dos disoluciones madre de
Na2PO4 1M (89,6 mL) y NaH2PO4 1M (10,4 mL).
Buffer de equilibrado (BE): se utiliza para equilibrar el gel una vez que ha acabado de
correr. Preparar 50 mL para cada grupo de alumnos, pesando siempre en fresco Está
compuesto por:
Fosfato sódico 50 mM pH 7.0; añadir 25 mL de la madre de 100 mM
Ácido ascórbico 2 mM; añadir 5 mL de la disolución madre 20 mM
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Buffer de incubación (BI): se utiliza para que embeber bien el gel y que la APX comience a
reducir el H2O2, utilizando ascorbato como donador de electrones. Se Preparar 50 mL
para cada grupo de alumnos en fresco y en un tubo Falcon. Está compuesto por:
Fosfato sódico 50mM pH 7.0; añadir 25 mL de la madre de 100 mM
Ascorbato 4mM; añadir 10 mL de la disolución madre 20 mM
H2O miliRO hasta 50 mL (esto es, 15 mL).
H2O2 2 mM (11,5 μl). Se añade justo antes de echar al gel.
Buffer revelador de APX (BRAPX): es el buffer que se utiliza para poder ver las bandas de
APX. Como en el caso anterior, se preparan 50 mL para cada DOS grupos y está
compuesto por:
Fosfato sódico 50mM pH 7,8; añadir 25 mL de la madre de 100 mM.
NBT 0,5 mM (pipetear 20 mL de la disolución 1.25 mM).
H2O miliRO hasta 50 mL (esto es, 5 mL).
TEMED 28 mM (212 μl). Se añade justo antes de echar al gel.
Fundamento
El desajuste del estado redox celular da lugar a la aparición de especies reactivas de oxígeno,
como H2O2, O2·- y diversos radicales orgánicos, que provocan daños irreversibles en
substancias vitales para el funcionamiento celular como son proteínas y ácidos nucleícos.
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MDA, formado de la ruptura de ácidos grasos insaturados, sirve cano un índice adecuado
para determinar el daño oxidativo causado en las células. Para su determinación se hace
reaccionar el material vegetal con ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), definiéndose el índice del
material reactivo con TBA (TBA-rm). Se genera un cromóforo de color rojo que tienen un
máximo de absorbancia a 535nm. La presencia de cofatores hemo y metales de transición
pueden alterar el grado de reactividad al TBA, dado que la incubación que se precisa a alta
temperatura puede generar diversos peróxidos orgánicos. Para limitar este artefacto se incluye
en el reactivo de TBA un reductor, como el butil-hidroxítolueno (BHT), que se añade justo
antes de utilizar el reactivo de TBA. Asimismo, compuestos como el acetaldehído y la
sacarosa también reaccionan con el TBA dando especies químicas que absorben a 535 nm. Si
estos compuestos se encuentran en presentes en concentraciones del rango mmolar, pueden
interferir en la detección del MDA.
Por tanto, aunque se pueden producir artefactos durante el análisis del MDA, el empleo del
reactivo de TBA sigue siendo una herramienta útil para determinar el grado de peroxidación
lipídica, dada su alta sensibilidad y sencillez en procedimiento.
Material y Equipo
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precipitado de 100 mL y con ayuda de un agitador magnético. Una vez conseguida la total
disolución, se enrasa a 100 mL.
Procedimiento
Cálculos
El nivel de TBA-rm se expresa como nmoles MDA·g-1PF, para lo cual se realizan los
siguientes cálculos:
Bibliografía
Buege JA, Aust SD. 1978. Microsomal Lipid Peroxidation. Meth.
Enzymol.. 52:302-310
Lozano-Rodríguez E, Hemández LE, et al. 1997. Distribution of
cadmium in shoot and root tissues of maize and pea plants:
physiological disturbances. J. Exp. Bot. 48:123-128
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Análisis de clorofilas
Fundamento
Se puede extraer fácilmente las clorofilas de hojas de plantas con diversos disolventes
orgánicos, y mediante un espectro de aborbancia determinar la concentración de dichos
pigmentos. La clorofila a (Cla) y clorofila b (Clb) tienen un pico de máxima absorbancia en el
rango del rojo, cuyas longitudes de onda son 663 y 645 nm, respectivamente, cuando se
realiza su extracción con una disolución de acetona al 80% (Arnon, 1949). Los cambios
observados en el contenido de estos pigmentos están muy relacionados con efectos
generalmente deletéreos causados por diversos estreses ambientales.
Reactivos
Procedimiento
Cálculos
La ecuación experimental desarrollada por Arnon para extractos con acetona al 80% es:
µg 10 mL acetona
Cla Clorofila a 12 ,7 A663 2 ,60 A645
gMF 0 ,05 g MF
µg 10 mL acetona
Clb Clorofila b 22 ,9 A645 4 ,68 A663
gMF 0 ,05 g MF
Clorofilas totales Cla Clb
Bibliografía
Arnon DI. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts -
polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology 24:1-15
Fundamento
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La L-prolina se acumula en muchas plantas como respuesta a diversos estreses, siendo los
más ampliamente estudiados la escasez de agua y salinidad. Se piensa que juega un papel
relevante en el ajuste osmótico en plantas de patata y tomate, entre otras especies, aunque esta
función también se piensa que la realizan otras substancias (por ejemplo, polialcoholes del
tipo del sorbitol o el manitol). Asimismo, la acumulación de prolina podría estar asociado a la
protección de proteínas frente a su desnaturalización o, incluso, como substancia reductora de
ROS.
Material y Equipo
Reactivo de ninhidrina
Se prepara disolviendo 2,5 g de ninhidrina en 100 mL de una mezcla formada por ácido
acético glacial:H2O desionizada:ácido ortofosfórico (6:3:1, v/v/v).
Procedimiento
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Como se hace con las muestras problema, se utilizan 0,5 mL que se hacen reaccionar con 0,5
mL del reactivo de ninhidrina. Para el correcto ajuste del equipo de espectrofotometría, HAY
QUE PREPARAR DOS TUBOS BLANCO (Tubos con 0 mM de prolina). Asimismo,
INSITIMOS: todos los tubos se ponen a incubar a 90ºC SIMULTÁNEAMENTE con los de
las muestras problema. Los siguientes pasos analíticos son idénticos a los descritos
anteriormente.
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L-prolina (mM)
CALENDARIO DE LA PRÁCTICA
JUEVES
Electroforesis de RNA
Preparación de geles de proteínas en condiciones nativas
Reacción de RT-PCR
VIERNES MAÑANA
Extracción de proteínas y separación electroforética de proteínas nativas
Electroforesis de DNA: visualización de Resultado de RT-PCR
Medición de peroxidación de lípidos
VIERNES TARDE
Revelado de actividad de APX
Extracción de clorofilas
Determinación del contenido de L-prolina
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