APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS

DE BIOLOGIA MOLECULAR

curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

UTFPR –T.D. 5° PERÍODO

Prof. Thiago Cintra Maniglia

Toledo, PR
2017
 Sumário

Aula Prática 01: Preparação e Transformação de E. Coli 03

Aula Prática 02: Extração de DNA Plasmidial 05

Aula Prática 03: Extração de DNA Humano 06

Aula Prática 04: Digestão de DNA por Enzimas de Restrição 08

Aula Prática 05: Reação de PCR 09

Aula Prática 06: Eletroforese em Gel de Agarose 10

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 Aula Prática 01: Preparação e
Transformação de E. coli
Sambrook et al. (1989).

Preparação do meio de Cultura LB (Luria Bertani):

Para 100 ml de meio:

Pesar 1 g de triptona

Pesar 0,5 g de Extrato de Levedura

Pesar 1,0 g de NaCL

Adicionar 100 ml de água destilada e autoclavar.

OBS: Para o meio sólido, adicionar 1,5g de ágar antes de autoclavar.

Preparação de E. Coli (Competência)

1. As células de E. coli foram cultivadas a 37 ⁰C em 50 ml meio LB
líquido a uma agitação orbital de 120 rpm por aproximadamente 3
horas.

2. Transferir para micro tubos e centrifugar por 10 min.

3. Descartar o sobrenadante

4. Ressuspender o sedimento em 10 ml da solução A (10 mM CaCl2,

10 mM de Tris pH = 7,5) a 4 ⁰C.

5. Centrifugar por 10 min e posteriormente descartar o sobrenadante.

6. Ressuspender o sedimento em 10 ml da solução B (30 mM CaCl2,

10 mM de Tris pH = 7,5) a uma temperatura de 4 ⁰C;

7. Manter em gelo por 10 min.

8. Centrifugar por 10 mim. e descartar o sobrenadante

9. Ressuspender o sedimento final em 5 ml da solução B.

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 Transformação de E. Coli Competentes
1. Transferir 200l de células competentes em um tubo eppendorf estéril;

2. Adicionar 5 μl do plasmídio;

3. Incubar no gelo por 10min.;

4. Fazer um heat shock incubando as células em 42ºC por 2min.;

5. Transferir para o gelo por 30segundos;

6. Adicionar 1ml de meio LB e agitar a 37ºC por 30 minutos;

7. Centrifugar por 5 min.;

8. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em uma pequena

quantidade de meio restante no tubo;

9. Semear no meio contendo ampicilina (LA). (50 ug/m de ampicilina)

10. Obs: Solução de Ampicilina 50 mg/mL (esterilizada por ultrafiltração)

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 Aula Prática 02: Extração de DNA Plasmidial
(Kit Miniprep Quiagen©)

Preparação de Reagentes
Opcional: Adicionar 1/1000 de lise blue no tampão P1
Adicionar a RNAse A no tampão P1
Adicionar 24 ml etanol 96 no tampão PE

Protocolo:
Passo 1: Centrifugar de 1 a 5 ml de cultura de bactéria a 8.000 rpm por 3 min.
Passo 2: Descartar sobrenadante
Passo 3: Ressuspender pellet em 250 uL do tampão P1.
Passo 4: Adicionar 250uL do Tampão P2 (inverter de 4 a 6 vezes). (Solução Azul)
Passo 5: Adicionar 350 uL de Tampão N3 – Inverter de 4 a 6 X (Solução incolor)
Passo 6: Centrifugar por 10 min. A 13.000 rpm
Passo 7: Transferir o Sobrenadante para a coluna de Centrifugação
Passo: 8 Centrifugar por 1 min. e descartar o líquido que passou pela coluna
Passo 9: Lavar a coluna de centrifugação com 500 uL de Tampão PB e centrifugar por 1
min. e descartar o líquido que passou pela coluna
Passo 10: Lavar a Coluna com 750 uL de tampão PE. Centrifugar por 1 min. e descartar
o líquido que passou pela coluna
Passo 11: Centrifugar 1 min. Para retirar resíduos do filtro
Passo 12: Transferir a coluna para um tubo eppendorf 1,5 ml
Passo 13: Adicionar 50 uL de tampão EB, no centro do filtro e centrifugar por 1 min.
Guardar a amostra em freezer -20 C

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Aula Prática 03: Extração de DNA Humano
PROTOCOLO BÁSICO: Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega®

1. Adicionar 600μl de Nuclei Lysis Solution gelado em um tubo

de centrifugação 1,5 ml. Mantenha no gelo.
2. Adicione de 10-20mg de tecido e homogenize por 10
segundos em Vortex.
3. Adicione 5 ul de proteinase K 20mg/ul
4. Incubar a 65̊ C por 15-30 min.
5. Adicione 3μl de solução de RNase e misture a solução por
inversão do tubo de 2–5 vezes. Incubar a mistura por 15-30
minutos a 37°C. Deixar a solução em temperatura ambiente
por 5 min.
6. Adicione 200μl de Protein Precipitation Solution e Vortex
vigorosamente a alta velocidade por 20 segundos. Mantenha
a amostra em gelo por 5 minutos.
7. Centrifugue for 5 minutos a 13.000 – 16,000 × g. O precipitado
proteico irá formar uma massa branca no fundo do tubo
(pellet).
8. Cuidadosamente aspire o sobrenadante contendo o DNA
(deixando o precipitado de proteina para trás). Deixe um resto
de solução no tubo para evitar de aspirar sujeira.
9. Transfira para um tubo de centrifugação contendo 600μl de
Isopropanol a temperatura ambiente.
10. Gentilmente misture a solução por inversão até aparecer as
fitas brancas de DNA e formar uma massa visível de DNA.
11. Centrifugue por 5 minutos a 13.000–16.000 × g. O DNA irá
formar um pellet branco.
12. Cuidadosamente descarte o sobrenadante.

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13. Adicione 600μl de etanol 70% a temperatura ambiente e
gentilmente inverta o tubo várias vezes para lavar o DNA.
14. Centrifugue por 5 minutos a 13.000–16.000 × g a
temperatura ambiente.
15. Cuidadosamente aspire o etanol utilizando uma micropipeta.
16. Inverta o tubo em papel absorvente e deixe secar o pellet por
10–15 minutos.
17. Adicione 100μl de DNA Rehydration Solution, e incube o
DNA a 65°C por 1 hora ou 4°C durante 12 horas).
18. Guarde o DNA a 2–8°C.

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 Aula Prática 04: Digestão com enzima
de Restrição
NEB - Protocolo Padrão
Otimizando Reações com Enzimas de Restrição
Para obter uma digestão ótima, recomenda-se utilizar quantidades ideais de
DNA, enzima e tampão (buffer) em um determinado volume de reação.

Protocolo:
Enzima de Restrição BAM HI: 1μl (10 unidades de enzima)
DNA: 1 μg
10X NEBuffer (tampão): 5 μl (1X)
Volume Total da Reação: 50 μl
Tempo de Incubação 15 minutos
Temperatura de Incubação 37 °C

Enzima
* Manter a enzima no gelo quando esta não estiver no congelador.
* Deve ser o último componente a ser adicionado na reação.
* Misturar os demais componentes com a pipeta antes de adicionar a enzima
(não utilizar vortex).

DNA
* O DNA deve estar livre de contaminantes (fenol, clorofórmio, álcool, EDTA,
detergentes ou excesso de sais).
* DNA metilado pode inibir a digestão com certas enzimas.

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 Aula Prática 05: Reação de PCR

Mix de reação de PCR (15,0ul)

H2O – 7,65 ul

Tampão 10x (Tris-HCl 20 mM pH 8,4 e KCl 50 mM), MgCl2 1,5 mM) – 1,5 ul

Primer 1 (10mM) – 1,5 ul

Primer 2 (10 mM) – 1,5 ul

dNTP,(10mM) – 0,5 ul

Taq DNA polimerase – 0,35ul

DNA genômico (10 ng\ul) – 2,0 ul

As amplificações do fragmento de interesse foram realizadas em termociclador

programado para realizar uma etapa inicial de 5 min a 94 C, seguido de 35
ciclos de 1 min a 94 C, 1 min a 51,5 C ou 59,5 C (dependendo do primer
usado) e 1 min a 72 C, e um último passo de 5 min a 72 C.

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 Aula Prática 06: Eletroforese em Gel de
Agarose
Preparação do Gel 1%:

Pesar 1 g de agarose para cada 100 ml de gel

Adicionar 100 ml de Tampão TE 1X

Aquecer até solubilizar a agarose

Montar a cuba com o pente e

Esperar esfriar e aplicar 10 ul de Sybr safe 10.000 x antes de solidificar o

gel

Despejar o gel de agarose ainda quente

Esperar solidificar e Retirar o pente

Colocar o gel na cuba de eletroforese com tampão TE 1X com

quantidade suficiente para que o gel fique submerso

Aplicar as amostras de DNA contendo tampão de corrida Loading buffer

Ligar a fonte elétrica a 85 Volts e corrente de 30 mA

Esperar uma hora e retirar o gel

Visualizar o gel no transiluminador e fotografar

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