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PCR
Paula Alejandra Díaz Tatis
PhD( c ) Biología, UNAL
padiazta@unal.edu.co
Textos guía, parte Biología molecular
DNA
Scaffold
Proteínas de
andamiaje
El ADN es condensado para formar la cromatina.
El ADN en una célula humana mide 2m de longitud, tasa de
compactacion de 105 (compactar 40 km de hilo en una bola de
tenis)
La cromatina = ADN + proteínas histónicas y no histónicas
– Suelta cuando no en división
– Empaquetada en cromosomas cuando división
NIVELES DE ORGANIZACIÓN
formada por nucleosomas
(1er nivel de organización, empaquetado por 6)
Casi el 20%
Histonas
Más conservadas
Ensamblaje del nucleosoma
• Se une a:
– DNA linker
– Parte central de 146bp
• Estructura más compacta del
nucleosoma
Sin H1
Con H1
Estructuras de orden superior
Fibra de 10 nm
• Las modificaciones de
las colas las hacen
accesibles a proteínas
reguladoras
• La acetilación reduce
la carga positiva
general de la histona:
pierde afinidad por el
ADN
Regiones activas e inactivas de cromatina
Sensibilidad a la DNAsaI
-Amplificación
-Detección
-Caracterización
-Clonación
-Mutación
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Taq polimerasa Brock 1965.
Kary mullis 1987, premio nobel de química 1993, científico?
Posteriormente descubrimiento del
Termociclador. 1976
PCR (Polymerase Chain Reaction)
La técnica de la amplificación in vitro se
basa en la repetición de tres procesos:
La técnica de la amplificación in vitro se
basa en la repetición de tres procesos:
La técnica de la amplificación in vitro se
basa en la repetición de tres procesos:
La taq ADN polimerasa, cataliza la formación de enlaces fosfodiéster.
La técnica de la amplificación in vitro se
basa en la repetición de tres procesos:
Ciclo
1
Ciclo
2
Ciclo
3
• ADN
• Primers
• dNTP
• MgCl2
• Taq polimerasa
• Diseño primers
• Tamaño
• Especificidad
• Contenido de GC
Manual: ej. word
Programas: ej. OligoAnalyzer, primer3,
Condiciones óptimas: Longitud 18-25nt, contenido de GC 50-60%, Tm 52º-65º
http://www.idtdna.com/site
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Comprobación: Electroforesis
Verificar si hay producto
Verificar el tamaño del
producto
Verificar especificidad
del producto
Su Taq DNA polimerasa, es ampliamente utilizada por sus
propiedades de termorresistencia en las reacciones de PCR.
• Análisis de DNA de cualquier organismo
• En busca de especies
• Caracterización de mutaciones
• Mutagénesis dirigida
• Arqueología molecular y ancestralidad genómica
• Clonación
• Ecología y comportamiento
• Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y
C, papiloma virus, HIV, entre otros
• Pruebas de Paternidad
• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener
una cantidad considerable.
• El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y analizar.
• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo.
• Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense,
diagnósticos, análisis prenatales, etc.
• Se pueden reproducir solamente partes del genoma en donde se
conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.
29/05/15
Métodos de arreglos cíclicos
ILLUMINA
• Fragmentación
• Ligación de adaptadores
• PCR en emulsión o se
crean colonias de PCR
por varios métodos
• Se extiende con
nucleótidos marcados o
emisión de luz por
incorporación
• Imagen y repetición
Pirosecuenciación
• Utiliza el pirofosfato liberado en
la polimerización
(h-p://www.pyrosequencing.com/pages/technology.html)
29/05/15
Nanopore Sequencing
h-p://www.pacificbiosciences.com/video_lg.html
Metzker.
Nature
Rev.
Genet.
11:31.
2010
Pac-Bio
• No hay amplificación (single
molecule, real time)
• Secuenciación por síntesis (por
polimerasa) usando nucleótidos
marcados
• Muy largas – cromosomas enteros???
• Muy exactas