CROMATOGRAFÍA

SEGÚN IUPAC:

La Cromatografía es un método usado permanentemente para la separación

de los componentes de una muestra en la cual los componentes se
distribuyen en dos fases una de las cuales es estacionaria, mientras que la
otra se mueve.

La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido

o un gel. Puede estar extendida como una capa o distribuida como una
película, etc. La fase móvil puede ser líquida, un fluido supercrítico o gaseosa.

La cromatografía es una técnica de separación ( fraccionamiento o purificación) cuyo

propósito es separar y cuantificar analitos en mezclas (por lo general en
matrices complejas).
CROMATOGRAMA DE UNA TLC
 ¿CÓMO ES QUE OCURRE LA
SEPARACIÓN EN CROMATOGRAFÍA?
 Ocurre por migración de los analitos en mezcla, a diferentes
velocidades.
 La velocidad de migración está gobernada por diferentes interacciones
entre un soluto (conducido por una fase móvil en movimiento) y un
sólido o líquido (fase estacionaria). El componente más afín a la fase
estacionaria se retiene más y tarda en eluir.
 La fase estacionaria por lo general es un sólido poroso, con un tamaño
de partícula muy pequeño, de superficie inerte. Este sólido está
recubierto por una pequeña capa o película de un líquido.
 La fase móvil es un solvente de alto grado de pureza o una mezcla de
ellos.
FUERZAS INTERMOLECULARES INVOLUCRADAS EN LOS
PROCESOS CROMATOGRÁFICOS

Fuerza intermolecular Grupos típicos Fuerza relativa

en la molécula de los enlaces
Interacciones de Cadenas de Débiles
van der Waals hidrocarburos

Dipolares y atracciones Enlaces dobles C = C, Débil

Inducidas por dipolos halógenos nitrógeno

Enlaces hidrógeno Grupos –OH Fuerza

y –NH2 moderada

Atracciones iónicas Grupos ionizables Fuerte

o con carga
PROCESOS FÍSICO QUÍMICOS QUE OCURREN
EN LA CROMATOGRAFÍA
ADSORCIÓN

Es un fenómeno físico de superficie , las moléculas de una sustancia (adsorbato) se adhieren

en la superficie de un sólido finamente dividido (adsorbente).
El desplazamiento de la sustancia depende del equilibrio adsorción – desorción de la
sustancia contenida en un disolvente móvil sobre un sólido estacionario y ocurre en la
superficie de contacto durante la adsorción.
ADSORCIÓN
El coeficiente de adsorción disminuye cuando aumenta la temperatura,
menos sustancia es adsorbida cuando la temperatura se incrementa.
El tiempo de retención (tR ) disminuirá y los valores de Rf aumentarán.
La desorción es la separación de las moléculas adsorbidas por el
adsorbente.
DISTRIBUCIÓN O REPARTO
Ocurre un reparto múltiple de la muestra entre dos líquidos o fluidos no
miscibles por la diferencia de solubilidad de los componentes en esas fases.
(Ley de distribución de Nernst)
La fase estacionaria es siempre un líquido inmovilizado de algún modo y la
fase móvil puede ser un líquido, un fluido supercrítico o un gas, que la
atraviesa con un gran área de interfase.

C1 C2 : Conc. en fase 2 Ce Ce: Conc. en fase estacionaria

 = k  =k k : coeficiente de reparto
C2 C1 : Conc. en fase 1 Cm Cm: Concentración en fase móvil
 INTERCAMBIO IÓNICO
La FE es una matriz porosa, llamada resina, es un polímero con
grupos portadores de carga eléctrica positiva o negativa a la cual están
enlazados los ligandos y a través de la cual pasa la fase móvil, la FE
retiene el soluto iónico pero de signo opuesto, se intercambia por un
proceso irreversible con iones de la FM.

Se denomina intercambio aniónico si el analito tiene carga negativa y

catiónica si tiene carga positiva.

R+X- + A-  R+A- + X-
Resina intercambiadora
aniónica
R-X+ + C+  R-C+ + X+
Resina intercambiadora
catiónica
 FILTRACIÓN EN GEL

Es llamada también Cromatografía de filtración en gel y se basa en la diferencia de tamaño

molecular, se usa para compuestos de PM > 2000.

La FE consiste de un fluido contenido dentro de una matriz polimérica tridimensional y porosa

(gel) , cuyos poros no son mayores que un determinado tamaño.
Los poros resultan de la formación de enlaces cruzados formados por una reacción
química entre la cadena del polímero y un reactivo puente, el tamaño de los poros puede
disminuirse , incrementando el número de enlaces cruzados.

La FM es el fluído que está fuera de la matriz del gel. Las moléculas más grandes de las
sustancias son incapaces de ingresar a los poros y son eluidas primero y las más
pequeñas son retenidas dentro de los poros del gel, requiriendo más tiempo y solvente
para ser eluidas .

El límite de exclusión es el tamaño máximo de una molécula ( peso molecular), que puede ser
retenida en los poros del gel .
FILTRACIÓN EN GEL
AFINIDAD
AFINIDAD O BIOAFINIDAD
 MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA
CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL

La fase estacionaria es de naturaleza fuertemente polar o hidrofílica: sílice,

alúmina y la fase móvil es apolar ( hexano, cloroformo, etc )
Las muestras polares quedan retenidas más tiempo que las menos polares; es un
método apropiado para solutos de alta y mediana polaridad o para separar
isómeros de posición.

CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA

La FE es de naturaleza apolar (hidrocarburos C8, C18), mientras la FM es un líquido

polar, agua, MeOH, AcN, THF, el agua actúa como carrier. La FM es un solvente polar y
un modificador orgánico y se puede agregar aditivos, sales o buffers. La selectividad
del sistema depende del modificador en función y su capacidad de aceptar y donar
protones.
 FASE LIGADA
La fase ligada está formada por un material de base: sílicagel, alúmina, agarosa
copolímero de estireno, que se une químicamente a un compuesto con un
grupo funcional determinado.
La unión más frecuente es un enlace covalente tipo siloxano (Si - O - R). Hay
también uniones tipo amino (SiNR2), tipo carbono (Si – CR3)
Químicamente la sílicagel es un óxido de silicio hidratado (SiO2.H2O), sus
átomos internos están ligados por oxígeno y los superficiales por –OH, es
fuertemente higroscópica, el agua es responsable de su inactividad, es
insoluble en solventes no polares y muy soluble en solventes alcalinos.
 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Cromatografía Planar
Se presenta cuando la fase estacionaria está colocada en una superficie plana
tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, se considera que es
bidimensional.
Puede ser:
Cromatografía de Capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC)
Cromatografía de Alta Performance en Capa Fina ( High Performance Thin Layer
Chromatography, HPTLC)
Cromatografía en Papel, CP

El flujo de la fase móvil puede ser por capilaridad ( C. horizontal y ascendente) o por
capilaridad y Gravedad (C. descendente).
 Cromatografía en Papel y Capa Fina (TLC)

Sembrado:

Puntiforme Banda

Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)

Cualitativa

x x x x x x

Identificación Pureza Ausencia

Cuantitativa Preparativa

x x x x
TLC o CCD
TLC
TLC (Cromatofolios)
HPTLC
 DIFERENCIAS MÁS SIGNIFICATIVAS ENTRE TLC Y
HPTLC

TLC HPTLC

Espesor de la capa 0,22 mm 0,10 mm

Tamaño de partícula 20 -50 µm 4 µm

Volumen de la muestra (1 – 20 µl) (100 – 500 nL)

Distancias de desarrollo 10 – 15 cm 4 – 5 cm

Nºmuestras/desarrollo(20 x 20 cm) 12 72 aplicaciones

h (altura equiv. plato teórico) 0,050 mm 0,012 mm

Límites detección µg – ng ng - pg
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
EMPAQUETADO APLICACIÓN
COLUMNA ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
MUESTRA

RESERVORIO
f. móvil
LECHO
CROMATOGRÁFICO
f. estacionaria

COLUMNA MUESTRA

EMPAQUETADO
COLUMNA
FLUJO
gravedad

DIFUSIÓN
llave

SEPARACIÓN
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

PERFIL DE ELUCIÓN

FRACCIONES Moléc. distribuida

en f.móvil
Moléc. distribuida
en f.estacionaria

respuesta del detector

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ANÁLISIS DEL
CONTENIDO DE LAS
FRACCIONES

Espectrofotométrico

Abs 280nm – Proteínas

Otras Abs - Colorantes 1 2 3 4 5 6 7 8 9

fracción
TERMINOLOGÍA Y PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Eluyente : Así se denomina a la fase móvil portadora de la muestra

Eluato: es el término con el que se define la salida del eluyente

ELUYENTE ELUATO
(entra) columna (sale)
(proceso de ELUCIÓN

Flujo: mide la velocidad de la fase móvil, se expresa como gasto

en volumen ( ml disolvente/minuto de recorrido de la columna)
o gasto lineal (cm de recorrido/minuto)

CROMATOGRAMA: Gráfica que expresa la respuesta del detector

en función del tiempo de elución
INSTRUMENTACIÓN DE HPLC
DIFERENCIAS MÁS SIGNIFICATIVAS ENTRE CL A
PRESIÓN Y CL POR GRAVEDAD

Técnica Tamaño MP Pº Tiempo

partículas (Bar) (min)
(µm)
Cromatografía 63 - 200 g 0 64
en Columna

CC Flash 40 – 63 40 mg – 2,5 g 0,75 09

CLBP 50 - 120 10 mg – 1 g 1 - 10 15 - 20

CLMP 25 - 40 100 mg - g 12 12

HPLC prep 12 – 15 500 mg – g 150 -

HPLC 10 1 – 50 mg 400 -
semiprep
HPLC anal 5 µg a 1 mg  20 10

HPLC ultra 1,5 - 3 µg 1000 -

alta presión