MÉTODOS

CROMATOGRÁFICOS

Cromatografia
em Coluna
Prof. Dr. Marcelo Galindo Lahoud 1
 Cromatografia em coluna
• É a técnica de separação cuja fase estacionária acontece
dentro de um tubo.

• Utiliza-se uma coluna de vidro aberta na parte superior e

munida de uma torneira na extremidade inferior, por
onde elui o líquido.

• Dentro da coluna encontra-se a fase estacionária constituída

por um enchimento sólido no caso da cromatografia de
adsorção.

• A fase móvel é líquida.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

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Cromatografia em coluna
Método por adsorção

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 Cromatografia em coluna

As dimensões da coluna dependerão

da quantidade de material a ser
cromatografado.

Na parte superior da coluna, adapta-

se um recipiente como um
reservatório da fase movel,

Em baixo uma torneira, para fazer

coleta em frascos.

A Fase que fica no interior da coluna

(adsorvente) é suportada, na parte
inferior, por um chumaço de lã de
vidro ou uma placa porosa de PTFE.
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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Adsorventes
• Muitos dos adsorventes empregados na CL também são usados na CCD
(Sílica e alumina).

• A diferença reside no tamanho das partículas, da ordem de 63 a 200 μm, na

CL e 5 e 40 μm na CCD.

• Outros adsorventes de uso comum em CL são silicato de magnésio, carvão e

polímeros de estireno.

• O Silicato de magnésio apresenta propriedades intermediarias às da alumina e da

sílica e é usado para separação de esteroides, lipídios, glicosídeos e derivados de
açúcar.
• O óxido de magnésio tem como uso típico na separação de carotenóides e
porfirinas.
• O carvão disponível comercialmente para fins cromatográficos é uma mistura de
carvão grafitinizado, cuja superfície é apolar e o carvão ativo, obtido por oxidação
de material orgânico a baixa temperatura, que contém grupos funcionais polares. 7
 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Adsorventes
• A polimerização de estireno e divinilbenzeno resulta em um
adsorvente com característica apolares ou baixa polaridade.

• Outro adsorvente de baixa polaridade e com propriedades

cromatográficas únicas pode ser obtido a partir de derivados
hidroxipropril de dextrana entrecruzadas (sephadex LH-20).

• Esse adsorvente tem mostrado resultados excelentes na separação

de lipídeos hormônios, vitaminas e outras biomoléculas, bem como
processos de purificação de produtos naturais.

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Cromatografia em coluna
Método por adsorção

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Cromatografia em coluna
Método por adsorção

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Processos de adsorção em coluna
• Para se conhecer a natureza do processo de adsorção, deve-se
considerar a atividade do adsorvente (atividade cromatográfica)
que, de uma maneira geral, se traduz em força de adsorção.

• A atividade de adsorvente pode significar também a área de

superfície ativa do sólido onde ocorre a adsorção.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Processos de adsorção em coluna

• As substancias eluirão da coluna segundo a polaridade .

• Adsorventes polares como a sílica e a alumina irão reter mais substancias

polares.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Preparação dos adsorventes

• Os adsorventes (alumina, sílica gel, silicato de magnésio, carvão
ativo) são aquecidos para dessorção de água (ativação) e de outros
materiais adsorvidos.

• Ativação da alumina: 400 ºC por 4 h.

• Para os outros sólidos: ~200 ºC por 2 h.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Para evitar, usa-se uma alumina neutra.

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A acetona não é usada como FM quando se utiliza alumina.
 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Escolha do eluentes
A função das fases móveis na CL por adsorção tem um sentido amplo.

• PRIMEIRO, ela tem a função de solvente propriamente dito (leva

em relação de solubilidade dos componentes da mistura a ser
cromatografada.

• As FM deve tem baixo ponto de ebulição (35 – 80 ºC) para ser

evaporado facilmente.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Escolha do eluentes
• SEGUNDO, é promover o desenvolvimento dos componentes da
mistura na coluna e remover ou dessorver esse componentes do
adsorvente seletivamente.

• Então, se escolhe primeiro o adsorvente, depois a FM.

• A escolha da FM pode ser feita através de teste com CCD (mesmo

adsorvente).

• FE POLARES, a dessorção é facilitadada quando se usa um

eluente polar, e dificultada quando se usa uma FM de polaridade
menor.

• O inverso também é observado.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Escolha do eluentes
• A tabela mostra os eluentes colocados em ordem crescente de
polaridade (serie elutrópica).

Série de eluentes com ponto de ebulição baixo, em ordem crescente de polaridade.

Hexano
Éter de petróleo
Cicloexano
Tolueno
Diclorometano
Clorofórmio
Éter etílico
Acetato de etila
Piridina
Acetona
Etanol
Metanol 17
Ácido acético
 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Escolha do eluentes
• Pode se fazer uso de eluição por gradiente.

• Ex; éter de petróleo e acetato de etila (1:3 v/v), éter de petróleo e

acetato de etila (1:6 v/v).

• Gradiente: composição da fase móvel varia durante a análise.

• Isocrático: composição da fase móvel permanece constante ao

longo da análise.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Escolha do eluentes

• Pode reter solutos polares tão fortemente que

são adsorvidos de modo irreversível. Ex. água.

• A vazão do eluente pode ser aproximadamente

de uma gota por segundo.

• Não se deve aumentar muito rapidamente a

polaridade do eluiente para se evitar a
sobreposição de bandas.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Enchimento da coluna e aplicação da amostra
• Quanto mais uniforme for o enchimento da coluna, maior será sua
eficiência.

• Durante o enchimento, o ar pode ficar retido entre as partícula, o que

não é conveniente. Devido a formação de canais que prejudicam
(alargamento) das bandas de eluição.

• Para evitar a retenção de ar, o adsorvente

deve ser agitado com FM ate a formar uma
pasta e então ser adicionado a coluna,
contendo um terço já da FM.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Enchimento da coluna e aplicação da amostra
• Nessa operação, espera o assentamento do adsorvente obtendo uma
homogeneidade no enchimento.

• Deve-se evitar deixar a coluna secar durante o enchimento, ou

durante a eluição,

• Porque apareceram rachadura na coluna, prejudicando a corrida

cromatográfica.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Enchimento da coluna e aplicação da amostra

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Fatores que afetam a eficiência da coluna Aberta

• Dimensão da coluna: Eficiência da coluna pode ser melhorada com o
aumento do comprimento / estreitamento do raio da coluna.

• Tamanho das Partículas na coluna.

• Atividade do adsorvente.

• Temperatura da coluna.

• Empacotamento da coluna.

• Qualidade dos solventes: Solvente com baixa viscosidade apresentam

melhores resultados.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Aplicação da amostra
• Uma vez montada a coluna, a amostra deve ser colocada no seu
topo.

• É feito colocando ou a amostra sólida solubilizada num volume

mínimo de solvente ou amostra liquida, por meio de uma pipeta na
superfície do adsorvente.

• Após toda a amostra ter sido colocada no topo da coluna adiciona-

se uma quantidade de FM, cuidadosamente, até que se forme uma
coluna liquida incolor e límpida acima do nível superior da amostra.

• Para manter essa superfície da amostra uniforme, é conveniente

colocar sobre ela, antes de adicionar a FM, uma camada de
adsorvente (1 a 2 cm de espessura), para evitar anormalidades
quando adicionar novamente a FM.
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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção
Aplicação da CL por adsorção
• São varias as áreas de pesquisas nas quais esse tipo de
cromatografia é utilizado, por exemplo:

• Laboratórios de química orgânica, para separar e purificar

reagentes e materiais obtido por síntese;

• Laboratórios de produtos naturais, os quais são normalmente

submetidos a esse método cromatográfico em escala preparativa e
analítica;

• Laboratórios de análise clínicas, para separar esteroides de urina

ou do sangue etc.

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 Cromatografia em coluna
Método por adsorção

Vantagens C.L.
• Pode separar qualquer substancia.

• Qualquer quantidade de mistura pode ser separada.

• Escolha opções de FM.

• Automatização é possível

Desvantagem C.L.

• Pode ter um longo tempo de execução;

• Grande quantidade de amostra demanda maior quantidade de FM;

• Automatização faz a técnica ser complicada e cara.

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Qual a ordem de eluição em uma coluna cromatográfica?

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Como ocorre a separação (quem elui primeiro e depois)
quando usamos alumina básica ou sílica como fase
estacionária na separação por coluna das seguintes
substâncias:

Mais retido
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