Guía práctica (24 y 25 Junio 2013)

Curso Pre-Congreso: Fundamentos de PCR en tiempo real y sus aplicaciones clínicas

Ponentes: Michelle Chirinos-Arias y Lisette Delgado

I.-­‐  Objetivo:  

Identificar  la  presencia  de  M.  tuberculosis  en  muestras  de  Biopsia  por  PCR  en  tiempo  real.  

II.  Equipos  y  reactivos  requeridos  

a. Equipo  
• Termociclador  en  tiempo  real.  Ej:  ECO  qPCR    (ILLUMINA).  
b. Materiales  y  reactivos  
• Placa  Eco  qPCR.  
• AmpliGold  Mix.  
• Agua  Grado  Molecular  
• Control  no  relacionado  
• Control    positivo  
• Blanco  (mix  sin  DNA)  
• Sonda  Msp  y  Mtb.  
• Primers  Mtb  
• Primers  de  Actina  
• Sonda  de  actina

III. Preparación  de  la  PCR  

 

Soluciones  de  Trabajo   Volumen  (µl)  x  Rxn   [  ]  Final  

Super  Mix  (AmpliGold)  o  Sybrgreen   10ul   1X  
 
Sonda  Taqman     01ul   500nM  
Primers  Forward  y  reverse   01ul   250nM  
ADN  Muestra  o  Controles   01ul   100ng  
Agua  grado  Molecular   Csp   -­‐-­‐-­‐  
Volumen  Final   20ul   -­‐*-­‐  
  

• Se   usa   un   control   positivo,   un   control   no   relacionado,   un   control   negativo.   A   parte  

también  se  corren  las  muestras  con  actina  (gen  de  referencia).  

• En   caso   de   no   tener   sonda,   se   puede   usar   Sybgreen,   pero   se   le   agrega   al   protocolo   de  

amplificación   una   curva   de   melting   (análisis   post-­‐PCR   que   ayudará   a   discriminar   entre  
positivo  y  negativo).  

IV. Protocolo  de  amplificación  por  PCR  

V. Resultados  

  (-­‐)  

 
Las  muestras  que  amplifican  son  positivas.  La  tecnología  Taqman  es  más  específica  por  lo  que  es  
solo   necesario   observar   las   curvas   de   amplificación.   Sin   embargo,   el   hecho   de   usar   SYBRgreen  
puede   dificultar   el   análisis,   ya   que   es   más   probable   que   se   amplifique   productos   inespecíficos,   por  
lo   que   es   necesario   la   curva   de   melting   que   ayude   a   discriminar   el   resultado.   Si   el   patrón   de  
melting  se  asemeja  al  control  (+)  la  muestra  es  positiva.  Por  el  contrario  si  se  asemeja  al  patrón  del  
control  (-­‐)  la  muestra  es  negativo.  Esto  solo  se  aplica  para  sondas  reversibles  como  el  SYBRgreen.  

PROBLEMAS  

1.-­‐  Se  hace  una  extracción  de  ADN  utilizando  columnas  de  unión  a  ADN  (Qiagen)  para  el  estudio  
molecular  de  mutaciones  EGFR.  Al  medir  en  el  biofotómetro  se  obtiene  una  concentración  de  850  
ng/ul  en  50  ul  de  volumen  de  elución.  Para  la  PCR  se  debe  trabajar  con  un  mix  de  primers  (Forward  
y   Reverse)   que   están   a   una   concentración   de   50   uM   y   estos   deben   trabajarse   a   250   nM   como  
concentración  final.  

a.  Llevar  el  ADN  a  una  concentración  de  100  ng/ul  

Tengo  850  ng/ul  en  50  ul,  para  llevarlo  a  una  concentración  menor  como  100  ng/ul  debo  diluirlo.  

C1xV1  =  C2xV2  

C1=  850  ng/ul    (concentración  inicial)  

V1=  es  el  volumen  que  debo  tomar  de  mi  concentración  inicial,  es  decir  mi  incógnita.    

C2=  100  ng/ul  (la  concentración  a  la  que  quiero  llevar  el  reactivo,  conc.  Final)  

V2=  el  volumen  final,  por  ejm  500  ul  

Reemplazando  en  la  fórmula:  

C1xV1  =  C2xV2  

850  ng/ul    x  V1  =  100  ng/ul  x  500  ul    

V1=  58.82  ul  

Por  tanto  para  llevar  al  ADN    a  una  concentración  de  100  ng/ul  debo  usar  58.82  ul  de  mi  stock  de  
ADN  y  llevarlo  a  500  ul  con  agua  ultra  pura  (500-­‐58.82=  441.18ul)  

 
b.   Indicar   que   volumen   de   ADN   se   debe   tomar   de   la   concentración   final   para   la   PCR   si   se   desea  
tener  150  ng  de  ADN  en  la  reacción.  

Por   el   enunciado   anterior   ahora   tengo,   mi   ADN   a   una   concentración   de   100   ng/ul   (esta  
concentración  ahora  es  mi  concentración  inicial),  pero  deseo    150  ng  en  mi  mix  de  PCR.  

100  ng_____  1ul  

150  ng_____  xul         X=  150/100=  1.5  ul  

c.  Indicar  el  volumen  final  que  se  debe  tomar  de  los  primers  (50  uM)  para  prepararlos  a  250  nM  
como  concentración  final  en  la  reacción.  

Los  primers  están  a  50  uM  (concentración  inicial)  pero  los  quiero    a  una  concentración  final  (en  el  
mix)  de  250  nM.  Lo  primero  que  debo  recordar  es  que  para  hacer  los  cálculos  las  concentraciones  
deben  estar  EN  LAS  MISMAS  UNIDADES.  

250  nM=  250  x  10-­‐9  =0.25x  10-­‐6  o  sea  uM    

C1xV1  =  C2xV2  

C1=  50  uM  (concentración  inicial  de  primers)  

V1=  es  el  volumen  que  debo  tomar  de  mi  concentración  inicial,  es  decir  mi  incógnita.    

C2=  0.25  uM  (la  concentración  a  la  que  quiero  llevar  el  primer,  conc.  Final)  

V2=  el  volumen  final  del  mix,  por  ejm  20  ul  

Reemplazando  en  la  fórmula:  

50  uM  x  V1=  0.25  uM  x  20ul  

V1=  0.1  ul  

El  volumen  a  usar  sería  de  0.1  ul  por  reacción,  pero  usualmente  se  corre  la  muestra  por  duplicado,  
un  control  no  relacionado,  un  control  negativo  (sin  ADN)  y  un  control  positivo,  es  decir  en  este  
caso  5  reacciones,  por  lo  que  debería  ser  0.1  x  5=  0.5  ul  en  el  mix.  

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