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“Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento de la Educación”

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

CURSO: MICROBIOLOGIA PESQUERA

TEMA: CULTIVOS Y SIEMBRAS DE LOS MICROORGANISMOS

CICLO: 2015 – I FACULTAD: PESQUERÍA

FECHA DE REALIZACION: MARTES 07 DE ABRIL DEL 2015


FECHA DE ENTREGA: MIERCOLES 22 DE ABRIL DEL 2015

PROFESOR DE PRACTICA: MARTINEZ ORDINOLA, NANCY

ALUMNO:

LIMA - PERÚ

2015
CULTIVOS Y SIEMBRAS DE LOS MICROORGANISMOS 2

INTRODUCCION

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas con otros tipos
de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo,
el conocimiento de los microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas,
cultivadas en el laboratorio en cultivos puros (o axénicos). En ocasiones el estudio
molecular conduce a la caracterización de los microorganismos, aún en poblaciones mixtas. Sin
embargo la identificación bacteriana y la caracterización completa solo es posible tras el
aislamiento de la bacteria y la obtención de cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar
una bacteria es su aislamiento del resto de los microorganismos presentes (enuna muestra
patológica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el aislamiento es
posible obtener la bacteria de interés en cultivo puro.

REVISION BIBLIOGRAFICA

CRECIMIENTO MICROBIANO

Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganismos a lo largo


del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un único microorganismo que
denominaremos ciclo celular, sino al demográfico de una población. En este tema nos
centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir también para
entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de
otra forma diferente y será tratada al final de este capítulo. Denominamos ciclo celular al proceso
de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicación del
material genético, la síntesis de componentes celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar
un tamaño doble del inicial y su división por bipartición para dar lugar a dos células hijas. La
duración del ciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los
mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una población resulta de la suma de
los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población. Los cultivos de microorganismos de
los que hemos hablado son asincrónicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra
en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un
cultivo se encuentran células que acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN, otras
que están creciendo, otras que están iniciando la división celular, etc. En un cultivo sincrónico
todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los
cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente
ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias
del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que
se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las
poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas.
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Microbiología General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. 2 Las poblaciones de bacterias crecen
de forma explosiva acumulando grandes números en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto
que el efecto de los microorganismos es en la mayoría de los casos depende de su número,
entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir
sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y


nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos
distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos
discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

MEDIOS DE CULTIVO

Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos
para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan,
los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO2 atmosférico (microorganismos
que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono orgánico. La fórmula elemental de un
microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las
células son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno
(14%), fósforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran
Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn. La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los
elementos antes citados en una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de
carbono orgánico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en forma de NH4, de
NO3 - o de NO2 - o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe
estar en forma de PO4 3-, el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO4 2-, etc. Además, en
ciertos casos, es necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que
determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. El conocimiento de la fórmula
elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más
adecuado para el mismo.

Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición química se conoce
totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos
de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.). Por otra parte, los medios
de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún agente solidificante que no sea
consumible por los microorganismos (normalmente agar). En función de los microorganismos que
pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el
crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS
para clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias
de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de
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microorganismos hemolíticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos características


anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de
enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una
mezcla una población mixta de gran tamaño.

MÉTODOS DE AISLAMIENTO

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos,


mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El crecimiento explosivo de las
bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma
que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una
colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin
embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables
(microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrínsecas en el cultivo
(microorganismos parásitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos específicos de
cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para
poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo). Se estima que en sólo en torno al 1% de las
bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables. Existen procedimientos
de enriquecimiento del número de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento.
Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el número
de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su
aislamiento.

CONCEPTO DE CULTIVO PURO

Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganismos. Los cultivos
puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan
la misma composición genética. Los cultivos puros son esenciales para poder estudiar las
características de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad. Sin embargo,
cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe
hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales
y que, por consiguiente, la fisiología de los microorganismos en ambientes naturales puede ser
diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros.

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO

Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se producen en
cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres.
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la
evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano:

1.- Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las
nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la
fase de crecimiento exponencial.
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2.- Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de


generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los
nutrientes del medio. La evolución del número de células durante esta fase se explica con los
modelos matemáticos que describiremos a continuación.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros
parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al
de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos
secundarios que pueden tener importancia industrial.

Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del
medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que
el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia
porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los
microorganismos en los ambientes naturales.

4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo.

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SÓLIDO

Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos líquidos se
presentan también en cultivos sólidos. La cinética de crecimiento, en este caso, se puede estudiar
siguiendo la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de
masa. Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina
unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en
condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un
breve lapso de tiempo. Si el número inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la
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confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un césped cuando se realizan los cultivos en
placas de laboratorio. En el caso de microorganismos móviles (deslizantes) o en el de los hongos
filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias aisladas sino formaciones
más difusas o miceliares.

CONCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMO

Desde el punto de vista microbiológico, un microorganismo muere cuando pierde de forma


irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta pérdida, no se produce aumento
en el número de microorganismos y, por tanto, no hay crecimiento. Sin embargo, un
microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiológico y continuar
desarrollando una actividad metabólica que se traduzca, por ejemplo, en liberación de toxinas. Por
otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento) de un
microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones físicas o
químicas del entorno. En estos casos, podríamos considerar como muertos microorganismos que
pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS Existen diferentes


sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Los principales, se enumeran a
continuación:

1.- Recuento directo: consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy pequeños de


suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cámaras de
Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de células sea del
orden de 105 por ml.

2.- Medida de la masa de células: el sistema se basa en que las células en suspensión dispersan la
luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en suspensión y, por tanto,
midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parámetro de medida más fácil de usar en los
cultivos de laboratorio. La densidad de células debe ser del orden de 105 por ml.

3.- Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre
el medio de cultivo sólido adecuado para estimar el número de viables contando el número de
colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una célula aislada. Para que la
medida sea correcta desde el punto de vista estadístico, es necesario contar más de 300 UFC. En
ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, éstos se pueden
recolectar por filtración a través de una membrana (de 0.2 µm de tama- ño de poro) y posterior
colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias.

4.- Medida del número de partículas usando contadores electrónicos de partículas. Estos sistemas
no nos indican si las partículas corresponden a células vivas o muertas; pero nos pueden dar una
idea del tamaño de las partículas.
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5.- Medida de parámetros bioquímicos tales como la cantidad de ADN, ARN, proteínas,
peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo.

6.- Medida de actividad metabólica de las bacterias como que respiran producen una disminución
del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxígeno
(utilización de colorantes sensibles a oxidación-reducción tales como el azul de metileno).
CRECIMIENTO MICROBIANO EQUILIBRADO

Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que todos los parámetros del cultivo (biomasa,
número de células, cantidad de proteínas, de ADN, etc.) evolucionan en paralelo. El crecimiento
equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales. Por
tanto, es principalmente un concepto de aplicación en el laboratorio (o en microbiología
industrial). Sin embargo, es útil porque permite estudiar el crecimiento microorganismos.
(Universidad Pública de Navarra , s.f)

MATERIALES Y METODOS

 Materiales en general
 Baño María
 Estufa
 Mechero

 Materiales para trasplante, resiembra o repique

 Tubos con agar nutritivo en posición vertical


 Tubos con agar nutritivo en posición inclinada
 Tubos con agar TSI (triple azúcar hierro) en posición semiinclinada
 Tubos con agar para el caldo
 Tubos con cepas 90 y 93
 Asa y aguja de kolle, espátulas driglasky, plumón

 Materiales para cultivo por aislamiento- agotamiento de superficie con aguja de


kolle

 Placas con agar XLD


 Cepas 90 y 93
 Asa de Kolle

 Materiales para aislamiento por dilución-por agotamiento en superficie

 Placas con PCA.


 Tubos con diluciones de pescado
 Pipetas de 1Ml
 Espátulas drigalsky
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 Materiales para aislamiento por dilución-por derrame o vertido en placa

 Medio PCA
 Placas petris estériles
 Diluciones a partir del musculo de pescado
 Pipetas estériles

METODOS

Trasplante, resiembra o repique

Introducir la aguja de kolle en el tubo de contiene la


cepa y taparlo inmediatamente.

Destapar el otro tubo de igual forma que el anterior e


introducirlo rapidamente en el medio virgen,
haciendolo de la manera que corresponda segun el
medio.

Flamear la boca del tubo y taponar, esterilizar la aguja


y finalmente colocar en estufa por 24hrs.
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Cultivo por aislamiento

 Aislamiento por agotamiento de superficie con aguja de kolle

Tomar el inoculo, y con la mano izquierda abrir la placa

Trazar 4 lineas paralelas con la aguja, esterilizar la


aguja y trazar otras cuatro paralelas partiendo del
extremo de las primeras lineas, y repetir este
procedimiento una vez mas.

Finalmente cerrar la placa e incubarla , invertica a 37°C


por 24 hrs.

 Aislamiento por dilución

Tomar 3 placas y señalarlas cada una con 10-1,10-2,10-3

Con una pipeta de 1mL, tomar 0.1mL de la dilucion 10-3,


y colocarla en la placa respectiva, y hacer lo mismo con
las demas placas, cada una con su dilucion
correspondiente.

Mover las placas en 8 , 5 veces a la izquierda, 5 veces a


la derecha . Finalmente incubar a 37°C X 24hrs.
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 Por derrame o vertido en placa

Señalar 3 placas esteries identificando cada una con sus


diluciones, Tomar 1mL de la dilucion 10-3 y añadirlo a la
placa correspondiente

Con la misma pipeta hacer lo mismo con las otras


diluciones, colocar PCA que debe estar a 45°C (paso por
baño maria) aprox 15ml en las placas, mezclar bien con
moviemientos suaves (en 8 )

Esperar a que el medio solidifique, y colocar en la estufa


invertidas a 37°C por 24 hrs.,

RESULTADOS Y DISCUSION

 Trasplante resiembra o repique


Cepa 93 Cepa90
TUBO RECTO
Solo en la línea Solo en la línea

TUBO INCLINADO
Cantidad Moderado Moderado
Borde de
Irregular Irregular
crecimiento
Consistencia Fibroso Viscoso
Pigmentación Lechosos Lechosos
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CALDO
Cantidad Moderado Abundante
Distribución Todo el medio Todo el medio

AGAR SEMIINCLINADO
Ingreso de Oxigeno, cambio de color a Fondo, parecido al patrón, y en la parte
amarillo, de consistencia fibrosa inclinada naranja, cepa expandida de forma
irregular y de consistencia fibrosa

 Aislamiento por agotamiento de superficie con aguja de kolle.


Expandido en casi toda la superficie de la placa
Color rojizo
De aproximadamente 8 colonias
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 Agotamiento en superficie
 Placa 10-1
Colonias grandes y pequeñas, expandidas en toda la placa, de color blanco lechoso. Las
colonias pequeñas tienen una distribución más regular, en comparación a las grandes
que son más irregulares. Con un color rojo arcilla.

 Placa 10-2
En la parte superficial de la placa se depositan más formaciones irregulares grandes.
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Color; blanco lechoso y blanco lechoso más claro, está más dispersado. Mayor cantidad
de m.o que en la primera placa. Puntos de m.o más homogéneos.

 Placa 10-3
Menor cantidad de m.o.Concentracion de m.o en la parte media de la placa más no en
los bordes. Colonias más pequeñas y abundantes en comparación con las anteriores, y
la mayoría regulares.

 Por derrame o vertido en placa


 Placa 10-1
Microorganismos color rojo arcilla en poca cantidad, aproximadamente unas 5
colonias. Menor cantidad de m.o en comparación a la que se dio por agotamiento (10-
1). Colonias de tamaño mucho menos, dispersadas en toda la placa. Los m.o de formas

irregulares. Dos colores identificados: Blanco lechoso y rojo arcilla.


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 Placa 10-2
Microorganismos de color rojo arcilla en poca cantidad aproximadamente unos 5.
Dispersión de m.o es regular y la de las colonias en forma irregular. Colores
apreciados blanco lechoso, menor cantidad de m.o en comparación a la primera placa
(10-1, por derrame).

 Placa 10-3
Menor formación de colonias y de forma irregular.
Menor cantidad de m.o y con menos tamaño.
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 Con respecto a las siembras por trasplante, resiembra, o repique podemos observar
que la cepa 93 y la 90 tienen un desarrollo muy similar, sin notamos que la cepa 93 es
la que mejor se ha transferido a estos medios de cultivos nuevos.
 Con respecto al aislamiento por agotamiento de superficie notamos que hubo
desarrollo y se nos permitió contar las colonias, cumpliendo el fin de este tipo de
cultivo.
 En el aislamiento por dilución, por agotamiento de superficie, notamos que mientras
más diluido menor cantidad de m.o se desarrollan.
 En el aislamiento por derrame o vertido en placa, notamos que hay más desarrollo de
colonias mientras este mas diluido, sin embargo los m.o son menores en comparación a
las mismas diluciones pero dadas por agotamiento.

CONCLUSIONES

 Se conocieron las diferentes siembras para los cultivos teniendo en cuenta el fin que
cada uno posee, como son los de aislamiento, dirigidos para algún m.o en particular.
 Se tuvieron en cuenta las medidas necesarias para el trato de cultivos puros.

RECOMENDACIONES

 Trabajar con los materiales totalmente esterilizados, de tal manera que las cepas no se
vean afectadas.
 Trabajar en un radio de 30cm alrededor del mechero.
 Marcar cada tubo para evitar confusiones.
 Esterilizar con la llama del mechero cada material.
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BIBLIOGRAFIA

Universidad pública de Navarra. S.f. Microbiología general. Cultivo de microorganismos. Pp1-


19.Consultado el 21 abril del 2015.En línea. Disponible en
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-
%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf