Revista Cubana de Ciencia Agrícola

ISSN: 0034-7485
rcca@ica.co.cu
Instituto de Ciencia Animal
Cuba

Galindo, Juana; González, Niurca; Marrero, Yoandra; Aldama, Ana I.

Cinética de la actividad de las celulasas microbianas en el líquido de rumen
Revista Cubana de Ciencia Agrícola, vol. 39, núm. 4, 2005, pp. 587-592
Instituto de Ciencia Animal
La Habana, Cuba

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Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 39, No. 4, 2005. 587

Cinética de la actividad de las celulasas microbianas

en el líquido de rumen
Juana Galindo, Niurca González, Yoandra Marrero y Ana I. Aldama
Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, La Habana.
Correo electrónico: jgalindo@ica.co.cu

Para determinar la cinética de las enzimas celulasas producidas por el pool de microorganismos celulolíticos
en el líquido de rumen filtrado (LRF), se efectuaron dos experimentos mediante diseño en bloques al azar,
con cinco réplicas y tres repeticiones. Los indicadores cinéticos que se estudiaron fueron: a) velocidad
inicial de la reacción enzimática (a los tiempos 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 y 2.0 h) y concentración de enzimas en
el líquido ruminal puro y diluido (1:2, 1:3, 1:4, 1:5 y 1:6). En el primer estudio, la velocidad inicial mostró
una relación polinomial entre el tiempo y el producto formado, y la ecuación que relaciona ambos factores
es y = -0.0634x2 + 0.2377x - 0.0094, R2 = 0.99. La actividad enzimática y la enzimática específica se
redujeron a partir de las 0.75 h de incubación. En el segundo ensayo se demostró que la mayor actividad
celulolítica específica se encontró a concentraciones de proteína de 1.52, 1.99 y 2.76 mg/mL, equivalentes
a diluir el líquido de rumen, a razón de 1:4, 1:3 y 1:2, respectivamente. El valor más alto de actividad fue de
169.5 U/mg, cuando el líquido ruminal se diluyó a razón de 1:4. El menor valor de actividad específica se
encontró cuando se utilizó el líquido de rumen sin diluir (96.14 U/mg de actividad, a una concentración de
proteína de 5.194 mg/mL). La concentración de enzimas y su actividad mostraron una relación lineal y la
ecuación que la representa es: y = 42.729x + 207.27, R2 = 0.96. Se concluye que 0.25 h de incubación y una
dilución del LRF de 1:4 son los rangos de tiempo y concentración de enzima en los que se produjo una
mayor actividad de las enzimas celulasas.
Palabras clave: rumen, bacterias celulolíticas, actividad celulolítica, celulasas.

El rumen es el sitio principal de degrada-
ción de la celulosa en los rumiantes (Dijkstra y
Tamminga 1995). La conversión de la celulosa
a glucosa requiere de la acción cooperativa
secuencial, llevada a cabo por una familia de
enzimas celulolíticas, constituida, al menos, por
tres complejos enzimáticos básicos:
endoglucanasas (CMCasa, EC 3.2.1.4),
exoglucanasas, nombradas celobiohidrolasas
(EC 3.2.1.91) y glucosidasas (EC 3.2.1.21)
(Leatherwood 1965, Li y Forsberg 1987, Xue et
al. 1992, Awafo et al. 1996, Valiño 1999 y
Galindo 2001).
Este complejo de enzimas se produce por
los microorganismos que habitan en ese
reservorio (Shi- Zhan et al. 2001), entre los que
se incluyen las bacterias, protozoos y hongos
(Hoover y Strokes 1991 y White y Mackie 1993).
Las celulasas que pueden estar unidas a la
superficie celular, o que pueden degradarse en
el medio, son enzimas inducidas, cuya activi-
dad se inhibe por varios factores: el pH, la fuerza
iónica, la temperatura, la concentración del
sustrato y otros. Esto implica una disminución
en la utilización de los alimentos fibrosos por
el rumiante.
Aunque la actividad celulolítica de los
microorganismos del rumen se ha estudiado
en varios trabajos, los resultados son difíciles
de comparar, debido a los diferentes sustratos
y procedimientos utilizados. Sin embargo, la
verdadera actividad celulolítica extracelular en
líquido de rumen no se ha señalado. Dada la
función de estas enzimas en la digestión de los
carbohidratos estructurales, es importante su
determinación para evaluar su potencial real
de acción. El objetivo de este estudio fue de-
terminar, caracterizar y realizar un estudio
cinético de las celulasas presentes en el líqui-
do de rumen filtrado.
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Materiales y Métodos
Procedimiento experimental
Se efectuaron estudios de cinética de las
enzimas celulasas producidas por los
microorganismos del rumen, en un diseño en
bloques al azar con cinco repeticiones en el
tiempo y tres repeticiones para cada uno de
los indicadores cinéticos: velocidad inicial de
la reacción y concentración de enzimas. Los
resultados se analizaron, según el diseño ex-
perimental seleccionado, y se utilizó el sistema
SPS para Windows en la determinación de las
regresiones entre los indicadores cinéticos que
se evaluaron.
El líquido de rumen utilizado para los estu-
dios procedía de un toro Holstein, con cánula
simple en rumen. Este se consideró como ani-
mal donante y consumió forraje fresco de king
grass (Pennisetum purpureum) y 1 kg de torta
de soya. Las muestras de líquido de rumen
utilizadas en los estudios enzimáticos se ex-
trajeron a las tres horas después del consumo
de alimento. Los muestreos se efectuaron me-
diante la cánula y con la ayuda de una bomba
de vacío. El líquido se filtró por muselina. A
esta fracción se le denominó líquido de rumen
filtrado (LRF).
Los experimentos realizados fueron: a) De-
terminación de la velocidad inicial a los tiem-
pos 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 y 2.0 h de incubación de
la enzima con el sustrato y b) Concentración
de enzimas en el líquido ruminal puro y diluido
(1:2, 1:3, 1:4, 1:5 y 1:6).
La actividad celulolítica se determinó por el
método referido por Galindo et al. (2001), mo-
dificado para enzimas celulolíticas, a partir del
estudio realizado por Martínez et al. (1999) y
descrito según el procedimiento que sigue:
A 1 mL de líquido de rumen filtrado, (LRF) de-
bidamente diluido, se adicionó a un tubo de
centrífuga 1 mL de carboximetilcelulosa (CMC)
10 mg mL-1 y 2 mL de buffer fosfato de sodio
0.05 mol/L, pH 5.5 previamente atemperado a
39 ºC, durante 10 min. La reacción se detuvo a
los 15 min, con 2 mL de ácido 3.5- dinitrosalicílico
(3.5 DNS), agitando rápidamente. Pasados 10 min,
se centrifugaron a 8000 r.p.m, durante 15 min. Se
tomaron 3 mL del sobrenadante y se adiciona-
ron a un tubo de ensayo, el cual se colocó en
baño de agua hirviendo, durante 5 min. Des-
pués de enfriar a temperatura ambiente, se aña-
dieron 5 mL de agua destilada y se agitó fuer-
temente. La absorbancia se leyó a 540 nm
La unidad de actividad celulolítica (U mL-1)
se definió como la cantidad de enzima presen-
te en el líquido de rumen (mL), capaz de liberar
un µg de glucosa/h (µg h,1 mL-1). La actividad
específica se expresó como U de actividad
enzimática/mg de proteína (U mg-1).
Proteína. La concentración de proteína en
el líquido de rumen se determinó por el método
de Lowry et al. (1951). Se utilizó albúmina de
suero bovino como proteína patrón.
La carboximetilcelulosa (CMC) se prepa-
ró según describe Halliwell (1962) y el ácido
3.5 dinitrosalicílico (3.5 DNS), según Gascoigne
y Gascoigne (1960).
Determinación de la velocidad inicial. Para
verificar el intervalo de tiempo en el que se
trabajó con velocidades iniciales, la actividad
celulolítica se determinó deteniendo la reac-
ción, por la adición de ácido tricloroacético
(TCA) al 10 %, a las 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5 y 2 h.
El líquido de rumen se utilizó puro; la CMC, a
razón de 10 mg mL-1 en buffer fosfato de sodio
0.05 mol L-1, pH de 5.5 y temperatura de 39 ºC.
Para cada tiempo, se colocaron dos tubos en
baño de incubación, los que contenían el
sustrato y el extracto crudo enzimático.
Concentración de enzima. El líquido de
rumen filtrado (LRF) se utilizó puro, a las di-
luciones 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 y 1:6, para obtener dife-
rentes concentraciones de enzimas (concentra-
ciones de proteína). La reacción se detuvo a una
velocidad inicial de 0.75 h, según se comprobó
en el ensayo anterior. El resto de los indicadores
se señalaron previamente. Para cada concentra-
ción de enzima se colocaron en el baño de
incubación dos tubos.
Resultados y Discusión
En los ensayos enzimáticos es importante
demostrar que la velocidad de la reacción que
se cataliza por una enzima es directamente pro-
Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 39, No. 4, 2005.
porcional a la concentración de la misma, a una
determinada concentración de sustrato (Chávez
et al. 1990). En el presente trabajo se corrobo-
ró la necesidad de determinar el rango de tiem-
po en que se trabaja, con velocidades iniciales
de reacción (V0), fundamentalmente en los ex-
tractos crudos enzimáticos, en los que pueden
ocurrir reacciones colaterales.
El comportamiento de la curva que presenta
la figura 1 es el típico para los ensayos
enzimáticos (Kochetov 1980, Kopecny y Wallace
1982 y Chávez et al. 1990). En la misma se repre-
senta la densidad óptica (DO), determinada a
540 nm, lo que constituye la unidad arbitraria de
la actividad enzimática a diferentes tiempos de
reacción.
Se observa que la velocidad inicial mostró
una relación polinomial entre el tiempo y el pro-
ducto formado. La ecuación que relaciona am-
bos factores es y = -0.0634x2 + 0.2377x - 0.0094;
R2 = 0.99. Esto significa que la velocidad de la
reacción catalizada por la enzima es práctica-
mente lineal hasta las 1.5 h de incubación de
esta con el sustrato, para mantener posterior-
mente una velocidad de reacción constante.
En la tabla 1 se muestran los valores de
actividad enzimática, obtenidos a diferentes
tiempos de incubación. La relación entre el
tiempo de reacción y el producto formado se
mantuvo hasta 0.5 h y se señala en el rango en
que se pueda trabajar con velocidades inicia-
les. Es importante que el tiempo de reacción de
0.25 h es lo suficientemente corto para garanti-
Tabla 1. Influencia del tiempo de incubación en la actividad celulolítica
Tiempo, h Actividad enzimática, U/mL
a
0.25 717.94
a
0.5 656.6
0.75 496.88b
1.0 429.48c
c
1.5 365.03
2.0 282.29d
EE ± 20.98***
abcd
Medias con letras no comunes en la misma columnas difieren
significativamente a P < 0.05 ( Duncan 1955)
*** P < 0.001
589
zar que una pequeña fracción de sustrato se
utilice cuando aumente la concentración de en-
zima en el líquido de rumen. Esto puede indicar
que detener la reacción enzimática a ese período
significa un considerable ahorro de tiempo.
La actividad enzimática y la enzimática es-
pecífica se redujo a partir de las 0.75 h de
incubación (P < 0.001) y no se encontraron
diferencias entre las 0.25 y 0.5 h. Sin embargo,
a tiempos superiores a los señalados disminu-
yó (P < 0.001). Estos resultados corroboran el
comportamiento que se observó en los estu-
dios acerca de la velocidad inicial de la reac-
ción enzimática (figura 1).
Los resultados no coinciden con los tiem-
pos de reacción a los que se determinó la acti-
vidad celulolítica, correspondiente a 1 y 2 h y
encontrada por Krisnamurt y Kitts (1969). No
obstante, confirman lo informado por Galindo
et al. (2004), lo que se verifica por los estudios
cinéticos realizados.
El comportamiento de la actividad
enzimática específica y la concentración de
proteína en el LRF se muestra en la tabla 2.
Como se observa, los mayores valores de ac-
tividad específica de las enzimas celulasas se
encontró a concentraciones de enzima (deter-
minada como proteína) de 1.52, 1.99 y 2.76, lo
que es equivalente a diluir el líquido ruminal
(LRF), a razón de 1:4, 1:3 y 1:2, respectivamen-
te. Quedó demostrado en el trabajo que el lí-
quido ruminal sin diluir presentó la más baja
actividad celulolítica específica (96.14 U/mg
Actividad específica, U/mg
15 7 . 0 9 a
143.6a
10 8 . 7 0 b
93.95c
79.87c
61.76d
4.59***
590 Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 39, No. 4, 2005.

DO, 540 nm Actividad celulolítica

500
0,25
0,2 400

0,15 300
0,1
200
0,05
100
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 0
Tiempo, h 0 2 4 6 8
Proteína, mg/mL
y = -0.0634x2 + 0.2377x - 0.0094 y = 42.729x + 207.27; R2 = 0.96
R2 = 0.99
Figura 1. Determinación de la velocidad inicial de la Figura 2. Efecto de la concentración de proteína en
reacción de las enzimas celulasas LRF en la actividad celulolítica (mg glu-
cosa h-1.mL-1 10-2)

Tabla 2. Comportamiento de la actividad enzimática a diferentes

concentraciones de enzimas (proteína) en LRF
Dilución del LRF Proteína, mg/mL Actividad específica, U/mg
1:6 1.10 131.34b
1:5 1. 2 6 14 3 . 9 b a
1:4 1. 5 2 16 9 . 5 a
1:3 1. 9 9 161.62a
1:2 2.76 15 9 . 6 3 a
Sin diluir 5 . 19 4 9 6 . 14 c
EE ± - 8.30***
abc
Medias con letras no comunes en la misma columna difiere
significativamente P < 0.05 (Duncan 1955)
*** P < 0.001

de proteína, a una concentración de proteína
de 5.194 mg/mL). Esta observación demuestra
que no toda la proteína soluble determinada
en el LRF tiene actividad celulolítica. Martínez
et al. (1999) encontraron similar comportamien-
to cuando estudiaron la actividad proteolítica
en LRF.
No resulta recomendable diluir el líquido
ruminal, a razón de 1:6, para efectuar estudios
de cinética enzimática (valores de actividad
enzimática de 131.34 U/mg de proteína), debido
a que la concentración de enzima es insuficiente
para obtener una adecuada actividad celulolítica.
La determinación de la actividad celulolítica
a diferentes diluciones del LRF permitió estimar
la relación que existe entre dicha actividad y la
concentración de proteína en el líquido ruminal
(figura 2). La relación entre la concentración de
enzima y su actividad fue lineal y se representa
en la siguiente ecuación: y = 42.729x + 207.27;
R2 = 0.96.
En la gráfica se muestra que la velocidad
aumentó proporcionalmente hasta una concen-
tración de proteína en LRF, igual a 2.76 mg/mL,
equivalente a 4.4 x 102 U/mL. Esto implicó que
el líquido de rumen puede utilizarse a una con-
centración de proteína 2.76 mg/mL, lo que hace
posible cuantificar la concentración de enzimas
celulolíticas activas, independientemente de su
pureza (Chávez et al. 1990).
Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 39, No. 4, 2005.
Se concluye que 0.25 h de incubación y una
dilución del LRF de 1:4 son los rangos del tiempo y
concentración de enzimas, en los cuales se produjo
una mayor actividad de las enzimas celulasas.
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592 Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 39, No. 4, 2005.

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