FUNDAMENTOS TEÓRICOS

A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma

mistura, realizada através da distribuição desses componentes em duas fases, que estão em
contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária, enquanto outra se move através
dela. Durante a passagem da fase móvel sobre a estacionária, os componentes da mistura
são distribuídos pelas duas fases de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela
fase estacionária, o que resulta em migrações diferenciais desses componentes.

Toda cromatografia funciona, em grande parte, com base no mesmo princípio que a
extração de solventes. Basicamente, os métodos dependem das solubilidades ou
capacidades de adsorção diferenciais das substâncias a serem separadas com relação às
duas fases entre as quais elas têm de ser particionadas.

São vários os critérios usados para a classificação das diferentes modalidades de

cromatografia, sendo comuns aqueles relacionados à técnica empregada, ao mecanismo de
separação envolvido e os diferentes tipos de fases utilizadas. A forma física do sistema de
cromatografia define a técnica geral: os métodos cromatográficos sólido-líquido (em papel,
em camada delgada, e em colunas), líquido-líquido (líquido de alto desempenho) e gás-
líquido (na fase de vapor) são comuns.

Figura 1: Tipos de Cromatografia (Fonte:

http://qnint.sbq.org.br/sbq_uploads/layers/imagem2126.png )

Uma classificação baseia-se na polaridade relativa das fases. Em cromatografia

gasosa, a fase móvel é inerte e a separação ocorre devido às interações das moléculas da
amostra com a fase estacionária, enquanto na cromatografia líquida, tanto planar como em
coluna, a polaridade de ambas as fases é importante. Chama-se “cromatografia líquida com
fase normal” quando a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel, e “cromatografia
com fase reversa” quando se tem o inverso.

Considera-se que a classificação mais importante em cromatografia baseia-se no

mecanismo de separação, que pode dar-se por processos físicos, químicos ou mecânicos.
Os processos físicos são de adsorção ou absorção, baseados principalmente em atrações
dipolares (forças de Van der Waals), ou coulômbicas, incluindo a formação de ligações de
hidrogênio.

Quando se trata de um sólido, como sílica ou alumina, como fase estacionária, a

adsorção do soluto ocorre na interface entre o sólido e a fase móvel, devido à presença de
grupos ativos em sua superfície. Muitos tipos de forças intermoleculares fazem com que
moléculas orgânicas sejam ligadas à alumina ou sílica-gel, e essas forças variam em
intensidade, de acordo com seu tipo. Compostos apolares se ligam à alumina utilizando
somente as forças de Van der Waals, que são consideradas fracas, e as moléculas apolares
não se ligam fortemente, a menos que tenham massas moleculares extremamente altas. As
interações mais importantes são aquelas típicas de compostos polares orgânicos. Essas
forças são do tipo dipolo-dipolo ou envolvem alguma interação direta (coordenação,
ligação de hidrogênio ou formação de sal). As forças de tais interações variam na seguinte
ordem aproximada, onde quanto mais polar for o grupo funcional, mais forte será a ligação
com a alumina ou sílica-gel:

 Formação de sal > coordenação > ligação de hidrogênio > dipolo-dipolo >
forças de Van der Waals

A intensidade da interação varia entre compostos. O ponto até o qual qualquer

solvente pode lavar um composto adsorvido da alumina depende quase diretamente da
polaridade relativa do solvente. Para qualquer material adsorvido, pode-se imaginar um
tipo de equilíbrio de distribuição entre o material adsorvente e o solvente. O equilíbrio de
distribuição é dinâmico, com moléculas sendo constantemente adsorvidas a partir da
solução e simultaneamente sendo dessorvidas de volta à solução. O número médio de
moléculas restantes adsorvidas nas partículas sólidas em equilíbrio depende da molécula
específica envolvida e do poder de dissolução do solvente com o qual o adsorvente deve
competir.
 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

A CLAE é o tipo mais versátil e mais amplamente empregado de cromatografia por

eluição. Nesta, a fase móvel é um solvente líquido, o qual contém a amostra na forma de
uma mistura de solutos. Um instrumento moderno de CLAE é equipado com um ou mais
reservatórios de vidro, cada um deles tendo 500 mL ou mais de um solvente.
Freqüentemente são tomadas medidas para a remoção de gases dissolvidos e de partículas
presentes nos líquidos. Os primeiros produzem bolhas na coluna causando, assim, um
alargamento de banda; além disso, as bolhas e os particulados interferem no desempenho
da maioria dos detectores.

Os desgaseificadores podem ser constituídos por sistemas de aplicação de vácuo,

sistemas de destilação, um dispositivo de aquecimento e agitação ou um sistema de
sparging, no qual os gases dissolvidos são arrastados para fora da solução por pequenas
bolhas de um gás inerte que não é solúvel na fase móvel.

Uma eluição com um único solvente ou com uma mistura de solventes de

composição constante é isocrática. Na eluição por gradiente, dois (e às vezes mais)
sistemas solventes que diferem significativamente em polaridade são empregados. A razão
entre os dois solventes varia em uma forma pré-programada durante a separação, algumas
vezes de forma contínua e por vezes em etapas. A eluição por gradiente geralmente
melhora a eficiência da separação.

O tipo mais comum de recheio para a cromatografia líquida é preparado a partir de

partículas de sílica, as quais são sintetizadas aglomerando-se partículas de sílica de
tamanho submicrométrico sob condições que levam à formação de partículas maiores com
diâmetros altamente uniformes. As partículas resultantes são geralmente recobertas com
filmes orgânicos, os quais são quimicamente ou fisicamente ligados à superfície. Outros
materiais de recheio incluem as partículas de alumina, de polímeros porosos e resinas de
troca iônica.
Com freqüência, uma coluna curta de proteção é posicionada à frente da coluna
analítica com a finalidade de aumentar a vida útil desta última, removendo o material
particulado e os contaminantes dos solventes.
 Além disso, em cromatografia líquida, a coluna de proteção serve para saturar a fase
móvel com a fase estacionária de forma que as perdas de fase estacionária na coluna
analítica sejam minimizadas. A composição da coluna de proteção deve ser similar àquela
da coluna analítica; o tamanho de partícula, contudo, é normalmente maior para minimizar
a queda de pressão.

Os detectores em CLAE devem apresentar um volume morto pequeno de forma a

minimizar o alargamento de banda extra coluna. O detector deve ser pequeno e compatível
com a vazão de líquido. Nenhum sistema de detecção universal de alta sensibilidade, como
aqueles encontrados para a cromatografia gasosa, está disponível para a cromatografia
líquida de alta eficiência. Assim, o detector a ser empregado vai depender da natureza da
amostra.

Os detectores mais amplamente empregados em cromatografia líquida são baseados

na absorção da radiação ultravioleta ou visível. Os fotômetros e os espectrofotômetros
projetados especificamente para uso com colunas cromatográficas estão disponíveis
comercialmente. O primeiro geralmente faz uso das linhas a 254 nm e 280 nm de uma
fonte de mercúrio, porque muitos grupos funcionais orgânicos absorvem nessa região. As
fontes de deutério ou de filamento de tungstênio com filtros de interferência fornecem um
meio simples de detectar as espécies absorventes. Alguns dos instrumentos modernos são
equipados com discos que contêm vários filtros de interferência, os quais podem ser
rapidamente trocados. Os detectores espectrofotométricos são consideravelmente mais
versáteis que os fotômetros e são amplamente empregados nos instrumentos de alto
desempenho. Os instrumentos modernos usam arranjos lineares de fotodiodos que podem
adquirir um espectro completo à medida que o analito deixa a coluna. O uso de uma
combinação de CLAE com detector de espectrometria de massas está atualmente tornando-
se bastante popular.

O tipo de CLAE mais utilizado é a cromatografia por partição, na qual a fase

estacionária é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel. A
cromatografia por partição pode ser subdividida em cromatografia líquido-líquido e
cromatografia líquida com fase ligada. A diferença entre as duas está na forma com a qual
a fase estacionária é imobilizada nas partículas de suporte do recheio. O líquido é
imobilizado por adsorção física em cromatografia líquido-líquido, enquanto é retido por
meio de ligações químicas na cromatografia líquida com fase ligada. Inicialmente a
cromatografia por partição era exclusivamente do tipo líquido-líquido; atualmente,
contudo, os métodos de fase ligada predominam por causa de sua maior estabilidade. Os
recheios do tipo líquido- líquido estão hoje em dia relegados a certas aplicações especiais.

A maioria dos recheios com fase ligada são preparados pela reação de um
organoclorosilano com os grupos —OH formados na superfície das partículas de sílica por
hidrólise a quente em ácido clorídrico diluído. O produto é um organosiloxano. A reação
para um sítio SiOH sobre a superfície de uma partícula pode ser escrita como:

Figura 2: Reação organosilano (Fonte: SKOOG et al. Fundamentos de Química Analítica)

Em que R é geralmente um grupo octil ou octadecil de cadeia aberta. Outros grupos

funcionais orgânicos que têm sido ligados às superfícies de sílica incluem as aminas
alifáticas, éteres e nitrilas, bem como hidrocarbonetos aromáticos. Assim, as fases
estacionárias estão disponíveis com muitas polaridades diferentes.
Os recheios com fases ligadas apresentam como vantagem uma estabilidade muito
maior que as fases estacionárias imobilizadas fisicamente. Com essas últimas, o
recobrimento periódico das superfícies do sólido é necessária porque a fase estacionária é
dissolvida gradualmente pela passagem da fase móvel. Além disso, a eluição por gradiente
não é viável com recheios tipo líquido-líquido, novamente por causa das perdas por
solubilização na fase móvel. A maior desvantagem dos recheios com fase ligada está na
sua capacidade de amostra limitada (somente pequenas quantidades de amostra podem ser
admitidas na coluna).

O sucesso da cromatografia por partição requer um equilíbrio adequado entre as

forças intermoleculares existentes entre os três participantes no processo de separação – o
analito e as fases móvel e estacionária.
 Essas forças intermoleculares são descritas qualitativamente em termos da polaridade
relativa de cada um dos três componentes. Em geral, as polaridades dos grupos funcionais
orgânicos na ordem crescente são: hidrocarbonetos alifáticos < olefinas < hidrocarbonetos
aromáticos < haletos < sulfetos < éteres < compostos nitro < ésteres < aldeídos <
cetonas < alcoóis ≈ aminas < sulfonas < sulfóxidos< amidas < ácidos carboxílicos <
água.

Como regra, a maioria das separações cromatográficas é realizada igualando-se a

polaridade do analito com aquela da fase estacionária; uma fase móvel de polaridade
consideravelmente diferente é então empregada. Esse procedimento é mais bem-sucedido
que outro no qual as polaridades do analito e da fase móvel são igualadas, sendo diferentes
daquela da fase estacionária. Nesse caso, a fase estacionária geralmente não consegue
competir com sucesso pelos componentes da amostra; os tempos de retenção tornam-se
muito curtos para permitir sua aplicação prática. No outro extremo está a situação na qual
as polaridades do analito e da fase estacionária são muito parecidas; assim, os tempos de
retenção tornam-se indesejavelmente longos.

REFERENCIAL TEÓRICO

1. SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de Química Analítica,

Tradução da 8ª Edição norte-americana, Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.