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David L. Nelson M ichael M.

C ox

Introduzione alla
biochimica di Lehningher
Quarta edizione
Prefazione
ome tutte le cose umane, anche l’insegnamento va in­ il testo più semplice e più scorrevole, per adattarlo anche a

C contro a una naturale evoluzione per adeguarsi da un


lato al continuo incremento del sapere, dall’altro alle
svariate necessità della società. Siamo ora nella fase “pro­
fessionalizzante” , cioè in un momento in cui gli sforzi di tutti
studenti con una preparazione chimica limitata, senza però
togliere gli argomenti propedeutici che facilitano l’appren­
dimento della biochimica. Qualsiasi corso professionalizzan­
te in campo biomedico, veterinario, agrario o altro non può
sono diretti alla preparazione di professionisti capaci di svol­ fam e a meno.
gere determinate funzioni in modo specialistico. Anche la Questa nuova versione del libro risulta diversa sotto alcuni
biochimica, sebbene scienza di base per lo studio della vita, aspetti rilevanti, anche se nella sua elaborazione si sono se­
deve adattarsi a questo processo, cioè entrare nelle scuole guite le strategie sostanzialmente utilizzate nelle edizioni
e nelle università portandovi le nozioni e la capacità di for­ precedenti, evitando di accorpare e riunire in pochi capito­
mare specialisti. li argomenti biochimici anche tra loro correlati. Piuttosto,
A questo fine diventa necessaria una riorganizzazione del­ un maggiore frazionamento è a nostro avviso importante per
l’insegnamento della disciplina, enucleando le nozioni es­ costruire corsi di biochimica “specifici” , come richiesto dalla
senziali e correlandole a quelle più specificatamente indiriz­ nascita di lauree triennali con un gran numero di indirizzi di­
zate alla professionalizzazione. Non bisogna però dimenti­ versi. In questo modo, lo studente potrà enucleare i capito­
care che la ricerca scientifica fornisce quotidianamente li che gli servono a creare un corso “personalizzato” , adegua­
nuove informazioni, nuove scoperte e nozioni che non pos­ to alle sue necessità.
sono non essere menzionate in un corso moderno e attuale. Si è inoltre cercato di sfruttare le figure inserite nel libro. In
Per rispondere a queste esigenze bisogna disporre degli molti casi esse non solo sono una versione grafica idonea a
strumenti opportuni e per prima cosa di un testo adeguato. definire meglio un concetto, un esperimento, una via meta­
Si poteva risolvere questo problema in due modi: scrivere bolica, ma contengono anche approfondimenti e ulteriori in­
un nuovo libro oppure ridurre e adattare un testo già pron­ formazioni che completano la trattazione e possono soddi­
to. È stata scelta la seconda ipotesi, usando come riferimen­ sfare la curiosità scientifica dello studente che vuole ulte­
to la quinta edizione de I p rin c ip i di biochimica di Leh- riormente addentrarsi nei meandri della biochimica.
ninger. Vorrei soltanto ricordare che dagli anni Settanta a In conclusione questo manuale, pur conservando l’impronta
oggi, molti dei biochimici che operano in Italia e nel mondo di Lehninger, punta a essere più adatto per un apprendi­
si sono formati proprio sui testi di questo autore. mento scorrevole e semplice, ma non semplicistico, della
Come è stato adeguato il manuale, e quali parti sono state biochimica.
tolte? In questa fase, abbiamo seguito più che un disegno E don M elloni
ben preciso studiato a tavolino, l’esperienza didattica di anni Dipartimento di Biochimica
di insegnamento. Il primo obiettivo è stato quello di rendere Università d i Genova
Indice

CAPITOLO 1 L’anatom ia m olecolare rivela le relazioni evolutive 17


Il con fro n to fra i diversi genom i ha un notevole im patto
Fondamenti di biochimica nella biologia um ana e nella m edicina 18
Termini chiave 18
1.1 Fondamenti di biologia cellulare 2 Ulteriori letture 18
Le cellule sono le unità strutturali e funzionali di tu tti Problemi 19
gli organism i viventi 2
Gli organism i viventi p ossono essere raggruppati
in tre distinti dom ini 2 Parte 1
L’Escherìchia coli è il batterio più studiato
Le cellule eucariotiche possiedono vari organelli
3 Struttura e catalisi 21
circondati da una m em brana, che possono
CAPITOLO 2
essere isolati 3
Il citoplasm a viene organizzato dal citoscheletro L’acqua
ed è altam ente dinam ico 3
Le cellule p roducono strutture sopram olecolari 5 2.1 Interazioni deboli nei sistemi acquosi 23

1.2 Fondamenti di chimica 6 I legam i idrogeno conferiscono all’acqua proprietà


insolite 23
Le biom olecole sono co m p o sti del carbonio con vari L’a cq u a fo rm a legam i idrogeno con i soluti polari 24
gruppi funzionali 6 L’entropia aum enta q u a nd o le sostanze cristalline
Le cellule contengono un grande assortim ento si scio lg on o 26
di m olecole 7 I co m p o sti non polari provocano variazioni
La struttura tridim ensionale può essere descritta energeticam ente non favorevoli nella struttura
in term ini di configurazione e conform azione 8 d ell’acq u a 26
Le interazioni tra le biom olecole sono stereospecifiche 10 Le interazioni di van der W aals sono attrazioni
1.3 Fondamenti di fisica ^ 10 interatom iche deboli 27
Le interazioni deboli sono fondam entali p e r la struttura
Gli organism i viventi si trovano in uno stato stazionario e la funzione delle m acrom olecole 27
dinam ico, mai in equilibrio con l’am biente I soluti influenzano le proprietà collìgative delle soluzioni
circostante 10 a cquose 28
Gli organism i trasform ano l’energia e la m ateria
del loro am biente 10 2.2 Ionizzazione dell’acqua, degli acidi deboli
BOX 1.1 Entropia: i vantaggi di essere disorganizzati 10 e delle basi deboli 29
Il flusso degli elettroni fornisce energia agli organism i 11 L’acqua è p o co ionizzata 29
L'accoppiam ento energetico unisce le reazioni La ionizzazione d ell’a cq u a è espressa da una costante
biologiche tra loro 12 di equilibrio 29
La K eq e il AG° indicano la tendenza di una reazione La scala del pH indica le concentrazioni degli ioni H+ e OH” 30
a procedere spontaneam ente 12 Gli acidi e le basi deboli hanno caratteristiche costanti
Gli enzimi prom uovono sequenze di reazioni chim iche 13 di dissociazione 31
1.4 Fondamenti dì genetica 14 2.3 Meccanismi di tamponamento delle variazioni
La continuità genetica dipende da singole m olecole di pH nei sistemi biologici 32
di DN A 14 I tam poni sono m iscele di acidi deboli e delle loro basi
La struttura del DNA consente la sua replicazione coniugate 32
e la sua riparazione con fedeltà quasi assoluta 14 L’equazione di H enderson-H asselbalch m ette
La sequenza lineare del DN A codifica proteine in relazione tra loro il pH, il pK a e
con strutture tridim ensionali 15 la concentrazione della soluzione ta m p o n e 32
Gli acidi o le basi deboli si oppon g o n o nelle cellule
1.5 Fondamenti di biologia dell’evoluzione 15
e nei tessuti alle variazioni di pH 33
Variazioni nelle istruzioni ereditarie sono alla base
dell’evoluzione 15 2.4 L’acqua come reagente 33
Le biom olecole si sono form ate per evoluzione chim ica 15
Le m olecole di RNA o i loro precursori potrebbero 2.5 L’am biente acquoso è adatto alla vita 34
essere stati i prim i geni e i prim icatalizzatori 16 Termini chiave 34
Le cellule eucariotiche si sono evolute da precursori Ulteriori letture 35
più sem plici in diverse ta p p e 17 Problemi 35
La m ioglobina è il prim o esem pio della com plessità
CAPITOLO 3
strutturale delle proteine globulari 60
Amminoacidi, peptidi e proteine Le proteine globulari hanno varie strutture terziarie 61
La struttura quaternaria com prende strutture proteiche
8.1 Gli amminoacidi 37 che vanno dai dim eri a com plessi
Gli am m inoacidi hanno proprietà strutturali com uni 37 m olto più grandi 62
I residui am m inoacidici delle proteine sono 4.4 Denaturazione e ripiegamento
tutti stereoisom eri l 38 delle proteine 63
Gli am m inoacidi possono essere classificati in base
al loro gru p p o R 39 La perdita della struttura provoca la perdita della
Gli am m inoacidi p ossono com portarsi da acidi funzione delle proteine 63
e d a basi 41 La sequenza degli am m inoacidi determ ina la struttura
È possibile predire la carica elettrica degli terziaria 63
am m inoacidi 41 I polipeptidi si ripiegano rapidam ente secondo
Gli am m inoacidi differiscono per le loro proprietà un processo a ta p p e 64
acid o-b ase 41 I difetti neH’a w o lg im e n to delle proteine sono la base
m olecolare di un vasto num ero di m alattie
3.2 I peptidi e le proteine __ _ __ j t 2 genetiche 64
I peptidi so n o catene di am m inoacidi 42 Termini chiave 65
I peptidi biologicam ente attivi e i polipeptidi hanno Ulteriori letture 65
dim ensioni e com posizioni m olto variabili 43 Problemi 65
A lcune proteine co n te n g on o gruppi chim ici diversi
dagli am m inoacidi 43
CAPITOLO 5
3.3 Lavorando con le proteine ___ 44
La funzione delie proteine
Le proteine p ossono essere separate e purificate 44
Le proteine p ossono essere separate e caratterizzate 5.1 Legame reversibile di una proteina
m ediante elettroforesi 46 con un ligando: le proteine che legano
3.4 Struttura delle proteine: struttura primaria _48 l’ossigeno 67
La funzione delle proteine dipende dalla loro struttura L’ossigeno si lega al g ru p p o p rostetico em e 67
prim aria 49 La m ioglobina ha un solo sito d i legam e
l polipeptidi di piccole dim ensioni p ossono essere per l’ossigeno 68
sequenziati con procedim enti autom atizzati 49 Le interazioni proteina-ligando p ossono essere
S trategie per il sequenziam ento della proteina 50 descritte quantitativam ente 69
Le sequenze am m inoacidiche possono essere Il m eccanism o di legam e dei ligandi dipende
determ inate con altri m etodi 51 dalla struttura delle proteine 70
Dalle sequenze am m inoacidiche si possono ricavare L’em oglobina tra sp o rta l’ossigeno nel sangue 71
im portanti inform azioni biochim iche 51 Le subunltà d ell’em oglobina sono strutturalm ente
Termini chiave 52 sìmili alla m ioglobina 71
Ulteriori letture 52 Il legam e d ell’ossigeno provoca una variazione
Problemi 52 strutturale nell’em oglobina 72
L’em oglobina lega l’ossigeno con un m eccanism o
cooperativo 72
i CAPITOLO 4 il legam e cooperativo di un ligando può essere
Struttura tridimensionale descritto quantitativam ente 73
L’em oglobina trasporta anche H + e C 0 2 73
delle proteine Il legam e dell’ossigeno all’em oglobina è regolato
dal 2,3-bisfosfoglicerato 74
4.1 Uno sguardo alla struttura delle proteine _54 L’anem ia a cellule falciform i è una m alattia
Il legam e pep tid ico è rìgido e planare 55 delle m olecole em oglobiniche 75

4.2 Struttura secondaria delle proteine 56 5.2 Interazioni complementari tra proteine
e ligandi: il sistema immunitario
L’a elica è una com une struttura secondaria 56
e le immunoglobuline 76
La sequenza am m inoacidica influenza la stabilità
d e ll’a elica 56 La risposta im m unitaria utilizza una serie di cellule
La conform azione p organizza le catene e proteine specializzate 76
polipeptidiche in foglietti 57 GII anticorpi hanno due siti Identici per il legame
I ripiegam enti p sono frequenti nelle proteine 57 dell'antigene 76
M olte im portanti tecniche analitiche si basano
4.3 Struttura terziaria e quaternaria delle proteine 58 sulle interazioni antigene-anticorpo 77
Le proteine fibrose sono adattate a ruoli strutturali 58 Termini chiave 78
Nelle proteine globulari la diversità strutturale riflette Ulteriori letture 78
la diversità funzionale 60 Problemi 79
© 9 7 8 IB 08-C6413 '! INDICE jvil

CAPITOLO 6 Alcuni polisaccaridi hanno ruoli strutturali 101


I glicosam m inoglicani sono eteropolisaccaridi
Gli enzimi della m atrice extracellulare 101
6.1 Introduzione agli enzimi so 7.3 Glicoconiugati: proteoglicani, glicoproteine
e glicolipidi 103
La m aggior parte degli enzimi so n o proteine 80
Gli enzimi sono classificati in base alle reazioni I proteoglicani sono m acrom olecole della superficie
che catalizzano 81 cellulare e della m atrice extracellulare
contenenti glicosam m inoglicani 103
6.2 Come lavorano gli enzimi 81 Le glicoproteine possiedono oligosaccaridi legati
Gli enzimi m odificano la velocità delle reazioni, covalentem ente 104
non gli equilibri 81 I glicolipidi e i lipopolisaccaridi so n o com ponenti
La velocità e gli equilibri delle reazioni hanno precise delle m em brane 104
definizioni te rm odinam iche 83
7.4 | carboidrati come molecole informazionali:
Il potere catalitico e la sp e cificità degli enzimi
il codice saccaridico 104
d ip e ndono dal legam e del su b stra to 83
Le interazioni deboli tra l’enzim a e il substrato Le lectine sono proteine che leggono il co d ice
diventano ottim ali nello sta to di transizione 83 saccaridico e m ediano m olti processi biologici 104
La catalisi dipende da specifici gruppi funzionali 84 Termini chiave 105
Ulteriori letture 105
6.3 La cinetica enzimatica, un approccio Problemi 106
alla comprensione del meccanismo
di azione degli enzimi 85
CAPITDLD 8
La concentrazione del su b stra to m odifica la velocità
delle reazioni catalizzate dagli enzimi 85 Nucleotidi e acidi nucleici
I param etri cinetici possono essere utilizzati
per confrontare le attività degli enzimi 87 8.1 Alcune nozioni di base 107
M olti enzimi catalizzano reazioni a due o più substrati 87 I nucleotidi e gli acidi nucleici co n te n g on o basi azotate
Gli enzimi possono essere sog g e tti ad inibizione e pentosi 107
reversibile o irreversibile 87 Nelle catene degli acidi nucleici i nucleotidi sono
L'attività enzim atica dipende dal pH 89 uniti da legam i fosfodiestere 108
6.4 Esempi di reazioni enzimatiche 89 Le proprietà delle basi dei nucleotidi determ inano
la struttura tridim ensionale degli acidi nucleici 110
6.5 Enzimi regolatori 90 8.2 Struttura degli acidi nucleici 11 o
Gli enzimi allostericl legano m odulatori 90 II DN A è una do p p ia elica in cui viene conservata
In m olte vie m etaboliche le ta p p e regolate sono l’inform azione genetica 111
catalizzate da enzimi allosterici 91 Il DN A può avere form e tridim ensionali diverse 113
Gli enzimi allosterici non seguono il co m p o rta m e n to Gli RN A m essaggeri co d ificano le catene p o lip ep tid ich e l 14
descritto dalla cinetica di M ichaelis-M enten 91 M olti RN A hanno strutture tridim ensionali com plesse 114
Alcuni enzimi sono regolati da m odificazioni covalenti
reversibili 91 8.3 Chimica degli acidi nucleici 115
Le fosforilazioni m ultiple pe rm etto n o un accurato La d o p p ia elica del D N A e dell’RN A può essere
controllo della regolazione 92 denaturata 115
Alcuni enzimi e altre proteine sono regolati per È possibile determ inare la sequenza di lunghi tratti
scissione proteolitica di un precursore enzim atico 92 di DNA 116
Taratili chiave 94
Ulteriori letture 94 8.4 Altre funzioni dei nucleotidi 118
Problemi 94 I nucleotidi tra sp o rta n o energia chim ica nella cellula 118
I nucleotidi adenilici fanno parte di m olti cofattori
capitolu 7 enzim atici 118
Carboidrati e geobiologia Termini chiave 120
Ulteriori letture 120
7.1 Monosaccaridi e disaccaridi 96 Problemi 120
Le due fam iglie dei m onosaccaridi: gli aldosi e i chetosi 96
I m onosaccaridi hanno centri asim m etrici 97 CAPITOLO 9
I com uni m onosaccaridi hanno strutture cicliche 98 Tecnologie basate suirinformazione
I m onosaccaridi sono agenti riducenti 100
I disaccaridi con te n g on o un legam e glicosidico 100 contenuta nel DNA
7.2 Polisaccaridi 101 3.1 Clonaggio dei DNA: tecniche di base 121
Alcuni om opolisaccaridi sono una fo rm a di riserva Le endonucleasi di restrizione e la DNA ligasi
di com bustibile 101 perm ettono di ottenere il D NA ricom binante 122
I vettori di clonaggio perm ettono l’am plificazione Tutte le m em brane biologiche hanno alcune proprietà
dei segm enti di DNA inseriti 123 fondam entali in com une 143
L’espressione dei geni clonati rende disponibili grandi Il d o p pio strato lipidico è l’elem ento strutturale di base
quantità di proteine norm ali e m odificate 124 delle m em brane 144
Si possono riconoscere tre tipi di proteine,
9.Z Dai geni ai genomi 125
che differiscono tra loro per II m odo con cui
Le librerie di DNA possono essere considerate sono associate alla m em brana 145
raccolte specializzate di inform azioni genetiche 125 Le proteine integrali si m antengono associate
La reazione a ca te n a della pollm erasi am plifica alle m em brane grazie a interazioni idrofobiche
sequenze specifiche del D N A 127 con i lipidi 145
9.3 Dai genomi ai proteomi 127 11.2 Dinamica delle membrane 147
I m odelli di espressione cellulare p ossono rivelare I gruppi acilici all’interno del d o p pio strato possono
la funzione cellulare di un gene 127 disporsi in m odi ordinati diversam ente 147
Gli sfingolipidi e il colesterolo si associano per form are
9.4 Alterazioni del genoma e nuovi prodotti agglom erati detti zattere lipidiche 148
della biotecnologia 127
11.3 Trasporto di soluti attraverso le membrane 148
Un batterio parassita delle piante perm ette
il clonaggio nelle cellule vegetali 129 Il tra sp o rto passivo è facilitato d a proteine
Le nuove te cnologie potranno accelerare lo sviluppo di m em brana 148
di nuovi farm aci 130 I trasportatori p ossono essere raggruppati
Termini chiave 131 in superfam iglie in base alla loro struttura 150
Ulteriori letture 131 II trasportatore del glucosio degli eritrociti prom uove
Problemi 131 un tra sp o rto passivo 150
Il tra sp o rto attivo trasferisce un soluto contro
un gradiente di concentrazione 0 contro
CAPITOL01 0 un gradiente elettrochim ico 152
Le ATPasi di tip o P sono trasportatori attivi e vengono
I lipidi fosforilate durante i loro cicli catalitici 152
I gradienti ionici fo rniscono l’energia per il tra sp o rto
10.1 I lipidi di riserva 133
attivo secondario 153
Gli acidi grassi sono derivati degli idrocarburi 133 Termini chiave 154
I triacilgliceroli so n o esteri degli acidi grassi Ulteriori letture 154
con il glicerolo 135 Problemi 155
I triacilgligeroli sono una riserva energetica
e fungono da isolam ento term ico 135
10.2 I lipidi strutturali delle membrane 136 CAPITOLO 1 2

I glicerofosfollpidi sono derivati d ell’acido fosfatidico 136


Biosegnalazione
Gli sfingolipidi sono derivati della sfingosina 136
12.1 Caratteristiche generali della trasduzione
Gli sfingolipidi sulla superficie cellulare sen/ono .
dei segnali 156
co m e siti p e r il riconoscim ento biologico 138
Gli steroli sono form ati da quattro anelli carboniosi fusi 139
12.2 I recettori accoppiati alle proteine G
10.3 I lipidi come segnali, cofattori e pigmenti 140 e i secondi messaggeri 158
Il fosfatidillnositolo e I derivati della sfingosina agiscono Il sistem a recettoriale p-adrenergico agisce tram ite
da segnali intracellulari 140 un secondo m essaggero, il cA M P 158
Gli eicosanoldi trasferiscono il m essaggero Diversi m eccanism i provocano la term inazione
alle cellule vicine 140 della risposta del recettore p-adrenergico 160
Gli orm oni steroidei trasm ettono m essaggi Il diacllglicerolo, l’inosltolo trisfosfato e il Ca2+
da un te ssuto all’altro 140 svolgono funzioni correlate com e secondi
Termini chiave 140 m essaggeri 161
Ulteriori letture 140
12.3 I recettori con attività tirosina chinasica 163
Problemi 141
La stim olazione del recettore d ell’insulina dà inizio
ad una cascata di reazioni di fosforilazione
CAPITOLO 11 di proteine 163
Il fosfolipide di m em brana PIP3 agisce a livello di una
Membrane biologiche e trasporto biforcazione della via di segnalazione d ell’insulina 165
11.1 La composizione e l’architettura 12.4 I recettori con attività guanilil ciclasica,
delle membrane 142 il cGMP e la proteina chinasi G 165
Ógni tip o di m em brana ha una caratteristica
com posizione In lipidi e proteine 142
12.5 Canali ionici eontrolSati 166
©978-88-08-06413-4 INDICE
I'

I canali ionici delle cellule eccitabili p roducono L’ossidazione del glucosio ad anidride carbonica
un segnale elettrico 166 nelle cellule richiede trasportatori specializzati
I canali ionici controllati dal voltaggio p roducono di elettroni 189
potenziali d ’azione nei neuroni 166 Coenzim i e proteine in num ero m olto lim itato
II recettore d ell’acetilcolina è un canale ionico agiscono d a trasportatori universali di elettroni 189
controllato dal ligando 167 Il NADH e il N ADPH agiscono com e trasportatori
12.6 Regolazione della trascrizione da parte solubili di elettroni 189
di ormoni steroidei 167 Le flavoproteine con te n g on o nucleotidi flavinici
saldam ente legati . 190
Tepmfnl chiava 191
12.7 La trasduzione sensoriale 168
Ulteriori letture 191
Il sistem a visivo utilizza i classici m eccanism i GPCR 168 Problemi 192
La rodopsina eccitata agisce attraverso la proteina G
trasducina riducendo la concentrazione di cG M P 169
I GPCR del sistem i sensoriali hanno m olte CAPITOLO 1 4
caratteristiche In com une 169 Glicolisi, gluconeogenesi
12.8 La regolazione del ciclo cellulare e via del pentosio fosfato
richiede segnali 170
14.1 La glicolisi 194
II ciclo cellulare si svolge in quattro fasi 170
I livelli di proteina chinasi dipendenti dalla dolina Uno sguardo d ’insieme: la glicolisi pu ò essere divisa
oscillano nella cellula 171 in due fasi 195
L'apoptosi è un suicidio cellulare program m ato 171 La fase preparatoria della glicolisi richiede ATP 195
Termini chiave 172 La fase di recupero energetico della glicolisi genera
Ulteriori letture 173 ATP e N ADH 198
Problemi 173 Il bilancio com plessivo co m p o rta un guadagno
netto di ATP 200
La glicolisi è strettam ente regolata 200
Parte 2 14.2 Vie di alimentazione della glicolisi 200
Bioenergetica e metaboiismo I polisaccaridi e i disaccaridi della dieta vengono
idrolizzati a m onosaccaridi 201
CAPITOLO 1 3 II glicogeno e l’am ido endogeni vengono degradati
Bioenergetica e tipi di reazioni p e r fosforolisi 201
biochimiche A ltri m onosaccaridi entrano nella glicolisi in diversi
punti 202
13.1 Bioenergetica e termodinamica 177 14.3 II destino del piruvato in condizioni
Le trasform azioni biologiche dell’energia seguono anaerobiche: la fermentazione 203
le leggi della term odinam ica 178 Il piruvato è l’acce tto re term inale di elettroni
La variazione di energia libera standard è direttam ente nella ferm entazione lattica 203
correlata alla co stan te di equilibrio 178 L’etanolo è il p ro d o tto della ferm entazione alcolica 204
La variazione di energia libera reale dipende dalle
concentrazioni dei reagenti e dei pro d o tti 179 14.4 La gluconeogenesi 204
Le variazioni di energia libera si p ossono som m are 180 La conversione del piruvato in fosfoenolpiruvato
Le reazioni chim iche più com uni 180 richiede due reazioni esoergoniche 205
13.2 Trasferimenti di gruppi fosforici e ATP 181 La se co nd a deviazione è la conversione del
fruttaSio 1 ,6-bisfosfato in fruttaSio 6-fosfato 206
La variazione di energia libera d ell’idrolisi dell’ATP La terza deviazione è la conversione del glucosio
ha un valore m olto negativo 181 6 -fo sfa to in glucosio 206
A ltri co m p o sti fosforilati e tioesteri hanno un’energia La gluconeogenesi è energeticam ente dispendiosa,
libera di idrolisi m olto elevata 182 m a essenziale 206
L’ATP fornisce energia m ediante trasferim enti Gli interm edi del ciclo dell’acido citrico e m olti
di gruppi, non per sem plice idrolisi 184 am m inoacidi sono glucogenici 206
L’ATP d o n a gruppi pirofosforici e adenililici 184 I m am m iferi non p ossono convertire gli acidi grassi
13.3 Le reazioni biologiche di ossidoriduzione 185 in glucosio 206
La glicolisi e la gluconeogenesi so n o reciprocam ente
Il flusso di elettroni può produrre un lavoro biologico 186 regolate 206
Le ossidoriduzioni p ossono essere descritte
co m e sem i-reazioni 186 14.5 L’ossidazione del glucosio attraverso
Le ossidazioni biologiche avvengono spesso la via del pentosio fosfato 207
attraverso deidrogenazioni 186 La fase ossidatlva produce pentosio fosfato e NADPH 207
I potenziali di riduzione sono una m isura d ell’affinità La fase non ossidativa ricicla i pentosi fosfato
per gli elettroni 187 in glucosio 6-fo sfa to 207
X CO978 Hfi-üS-06413 A

Il glucosio 6-fo sfa to è ripartito tra la glicollsi Il ciclo dell’a cido citrico è regolato a livello
e la via del pentosio fosfato 208 delle sue tre ta p p e esoergoniche 233
Tannini chiava 210
16.4 II ciclo del gliossilato 234
Ulteriori letture 210
Problemi 210 Termini e l a f i 234
U lteriori le ttu re 235
CAPITOL01 5 Problemi 235

Principi di regolazione metabolica


m c ap itolo 17
15.1 Regolazione delle vie metaboliche 211
Catabolismo degli acidi grassi
La q uantità di un enzim a e la sua attività catalitica
p ossono essere regolate 211 17.1 Digestione, mobilizzazione e trasporto
I nucleotidi adeninlci hanno un ruolo speciale degli acidi grassi ____ 237
nella regolazione m etabolica 213
I grassi della dieta vengono assorbiti nell’intestino
15.2 Regolazione coordinata della glicolisi tenue 237
e della gluconeogenesi 214 Gli orm oni innescano la m obilizzazione delle riserve
Gli isozimi d ell’esochinasi del m uscolo e del fegato di triaciigliceroli 239
sono regolati differentem ente dal loro prodotto, Gli acidi grassi sono attivati e trasportati nei m itocondri 240
¡I glucosio 6-fosfato 215 17.2 Ossidazione degli acidi grassi 241
Lafosfofruttochinasi-1 e la fru tto s lo 1 ,6-bìsfosfatasl
sono reciprocam ente regolate 216 La p ossidazione degli acidi grassi saturi avviene
II fruttaSio 2,6-bisfosfato è un potente regolatore In qua ttro reazioni 242
allosterico della PFK-1 e della FBPasl-1 217 L’ossidazione degli acidi grassi insaturi richiede
altre due reazioni 243
15.3 II metabolismo del glicogeno negli animali 219 L’ossidazione co m p le ta degli acidi grassi con
La dem olizione del glicogeno (glicogenolisi) num ero dispari di atom i di carbonio richiede
è catalizzata dalla glicogeno fosforilasi 220 altre tre reazioni 243
L’U D P-glucosio, uno zucchero legato ad un L’ossidazione degli acidi grassi è rigidam ente
nucleotlde, dona ¡I glucosio per la sintesi regolata 244
del glicogeno (gllcogenosìntesl) 221 La p ossidazione avviene anche nei perossisom i 244
La glicogeno fosforilasi è regolata allosterlcam ente 17.3 I corpi chetonici 245
e orm onalm ente 222
A nche la glicogeno slntasl è regolata m ediante I corpi chetonici form ati nel fegato sono esportati
fosforllazione e defosforllazione 223 in altri organi com e fonte di energia 245
Termini chiave 223 Termini chiave 246
Ulteriori letture 223 Ulteriori le ttu re 247
Problemi 224 Problemi 247

CAPITOL01 6
( CAPITOLO 1 8
Il ciclo dell’acido citrico
Ossidazione degli amminoacidi
1G.1 Produzione di acetil-CoA (acetato attivato) 225 e produzione dell’urea
Il plruvato viene ossidato ad acetll-C oA e C 0 2
18.1 Destino metabolico dei gruppi amminici 248
dal co m plesso della piruvato deidrogenasi 225
Nel com plesso gli interm edi non abbandonano Le proteine della die ta vengono degradate
m ai la superficie d ell’enzim a 226 enzim aticam ente ad am m inoacidi 248
Il piridossal fosfato partecipa al trasferim ento
16.Z Reazioni del ciclo dell’acido citrico 228 dei gruppi a-am m inici all’a -ch e to g lu ta ra to 249
Il ciclo d e ll’acido citrico com prende o tto ta p p e 228 Il glutam m ato rilascia il suo gru p p o am m inico
L’energia delle ossidazioni che avvengono sotto form a di am m oniaca nel fegato 250
nel ciclo viene efficacem ente conservata 231 La glutam m ina e l’alanina tra sp o rta n o l’am m oniaca
I co m ponenti del ciclo d ell'acido citrico sono nel torrente circolatorio 251
im portanti interm edi biosintetici 231
18.2 Escrezione dell’azoto e ciclo dell’urea 252
Le vie anaplerotlche riforniscono di Intermedi
il ciclo d ell’acido citrico 232 L’urea viene p ro d o tta d all’am m oniaca in quattro
ta p pe enzim atiche 254
16.3 Regolazione del ciclo dell’acido citrico 233 I cicli d ell’acido citrico e d ell’urea possono
La produzione di acetil-C oA da parte del co m plesso essere collegati 254
della piruvato deidrogenasi è regolata sla L’attività del ciclo dell’urea è regolata 255
allostericam ente sia m ediante I collegam enti tra le vie m etaboliche riducono i costi
m eccanism i covalenti 233 energetici della sintesi dell’urea 255
© 978-88-08-06413-4

18.3 Vie di degradazione degli amminoacidi 255 FOTOSINTESI: LA CATTURA DELL’ENERGIA


LUMINOSA 278
Alcuni am m inoacidi sono convertiti in glucosio,
altri in corpi chetonici 255
Sei am m inoacidi vengono degradati a piruvato 256
19.5 Caratteristiche generali
della fotofosforilazione 278
Sette am m inoacidi sono degradati ad a cetil-C oA 257
C inque am m inoacidi sono convertiti La fotosintesi delle piante avviene nei cloroplasti 279
in a -ch e to g lu ta ra to 258
19.6 L’assorbimento della luce 279
Q uattro am m inoacidi so n o convertiti in succinil-C oA 259
Gli am m inoacidi a catena ram ificata non vengono Le clorofille assorbono l’energia della luce
degradati nel fegato 260 p e r la fotosintesi 280
L’asparagina e l'aspartato vengono degradati La clorofilla incanala l’energia assorbita verso
a ossalacetato 260 I centri di reazione tram ite II trasferim ento
Termini chiave 261 di eccitoni 281
Ulterieri letture 262
Problemi 262
19.7 L’evento fotochimico centrale: il flusso
di elettroni indotto dalla luce 281
I batteri possiedono solo uno del due distinti centri
di reazione fo to ch im ica 281
CAPITOLO 1 9
Nelle piante due centri di reazione agiscono
Fosforilazione ossidativa In sequenza 283
e fotofosforilazione II com plesso del cito cro m o b 6f unisce
i fotosistem i II e I 284
LA FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA 263 L’a cq u a viene scissa dal co m plesso che libera
ossigeno 285
19-1 II flusso degli elettroni nei mitocondri 263 L’ATP sintasi nei cloroplasti è slm ile a quella
nel m itocondri 285
Gli elettroni sono incanalati verso accettori universali 264
Termini chiave 286
Gli elettroni passano attraverso una serie
Ulteriori letture 286
di trasportatori legati alla m em brana 265
Problemi 287
I trasportatori di elettroni funzionano sotto.form a
di com plessi m ultienzim atici 267
L’energia associata al tra sp o rto elettronico viene
efficientem ente conservata so tto form a CAPITOLO 2 0
di un gradiente di protoni 270 Biosintesi dei carboidrati
Durante la fosforilazione ossidativa si generano
specie reattive dell'ossigeno (ROS) 270
nelle piante e nei batteri
19.2 La sintesi dell’ATP 271 20.1 Sintesi fotosintetica dei carboidrati 289
L’ATP sintasi possiede due dom ini funzionali, F0 ed Fi 272 I plastidi sono organelli presenti unicam ente
L’ATP viene stabilizzato sulla superficie d ell’enzim a F-i 272 nelle cellule delle piante e delle alghe 290
II gradiente di protoni favorisce il rilascio di ATP L’organicazione d ell’anidride carbonica
dalla superficie d ell’enzim a 272 avviene in tre fasi 290
Ogni subunità p d ell’ATP sintasi può assum ere La sintesi di ciascun triosio fosfato dalla C 0 2
tre diverse conform azioni 272 richiede sei NADPH e nove ATP 293
La catalisi rotazionale è alla base del m eccanism o Q uattro enzimi del ciclo di Calvin sono attivati
di sintesi dell’ATP m ediato dalla variazione indirettam ente dalla luce 294
di legam e 274
L’a cco ppiam ento ch e m iosm otico perm ette 20.2 La fotorespirazione e le vie C4 295
stechiom etrie non unitarie per il consum o La fotorespirazione dipende dall’attività osslgenasica
di ossigeno e la sintesi di ATP 274 della rubisco 295
La forza m otrice protonica fornisce energia Nelle piante C4 la fissazione della C 0 2 e l’attività
al tra sp o rto attivo 274 della rubisco sono fisicam ente separate 295
Sistem i navetta (shuttle) trasferiscono gli equivalenti
riducenti del NADH cltosolico nei m itocondri 275 20.8 Biosintesi dell’amido e del saccarosio 297
L’A D P -glucoslo è II su b stra to per la sintesi dell’am ido
18.8 Regolazione della fosforilazione ossidativa 275
nelle piante e per la sintesi del glicogeno
Le vie di produzione dell'ATP so n o regolate in m odo nel batteri 297
coordinato 276 L’U D P-glucosio è II substrato per la sintesi
19.4 I mitocondri nella termogenesi del saccarosio nel citosol delle cellule vegetali 297
e la loro evoluzione 277 20.4 Integrazione del metabolismo dei carboidrati
Nel tessuto adiposo bruno i m itocondri disaccoppiati nelle cellule vegetali 297
p roducono calore 277 Nei sem i In germ inazione la gluconeogenesi
I m itocondri si sono evoluti da batteri endosim biotici 278 converte grassi e proteine In glucosio 297
liti in I Ì e « 9 7 8 - 8 8 08-06413-4

Termini eiiave 299 CAPITOLO 2 2


Ulteriori ie tta « 299
Problemi 300 Biosintesi degli amminoacidi, dei
nucleotidi e deile molecole correlate

CAPITOLO 21 22.1 Uno sguardo al metabolismo dell’azoto 320


Biosintesi dei lipidi Il ciclo d ell’azoto crea una quantità di azoto
disponibile per i processi biologici 320
21.1 Biosintesi degli acidi grassi L’azoto viene fissato dagli enzimi del com plesso
e degli eicosanoidi 302 della nitrogenasi 321
L’am m oniaca viene incorporata nelle biom olecole
Il nnalonil-CoA si form a dall’acetil-C oA
tram ite il glutam m ato e la glutam m ina 322
e dal b icarbonato 302
La glutam m ina sintetasi è il principale sito
GII acidi grassi vengono sintetizzati m ediante di regolazione del m etabolism o dell’azoto 323
una sequenza di reazioni ripetute 302
L’acido grasso sintasi dei m am m iferi possiede 22.2 Biosintesi degli amminoacidi _ 323
m olteplici siti attivi 302
L a -ch e to g lu ta ra to è il precursore del glutam m ato,
L’acido grasso sintasi lega gruppi acetilici e malonilici 304
della glutam m ina, della prolina e dell’arginina 324
Le reazioni d ell’acido grasso sintasi si ripetono
La serìna, la glìcina e la cisteina derivano
fino alla form azione del palm itato 304
dal 3-fosfogllcerato 324
In m olti organism i la sintesi degli acidi grassi
Tre am m inoacidi non essenziali e sèi am m inoacidi
avviene nel cltosol, m entre nelle piante avviene
essenziali vengono sintetizzati a partire
nei cloroplasti 306 d all’ossalacetato e dal piruvato 324
L’acetato viene tra sp o rta to fuori dai m itocondri Sintesi del triptofano, della fenilalanina e della tirosina 325
sotto form a di citrato 307
La biosintesi d ell’istldina utilizza precursori
La biosintesi degli acidi grassi è strettam ente
della biosintesi della purina 325
regolata 308 La biosintesi degli am m inoacidi è regolata
Gli acidi grassi saturi a catena lunga sono allostericam ente 325
sintetizzati dal palm itato 308
La desaturazione degli acidi grassi richiede 22.3 Molecole derivate dagli amminoacidi^ _ _ 326
una ossidasi a funzione m ista 309
La glìcina è il precursore delle porfirine 326
Gli eicosanoidi si form ano da acidi grassi poliinsaturi L’em e è la sorgente dei pigm enti biliari 326
a venti atom i di carbonio 309 L’arginina è II precursore della sintesi biologica
21.2 Biosintesi dei triacilgliceroli 309 dell’ossido di azoto 327

I triacilgliceroli e i glicerofosfolipidi sono sintetizzati 22.4 Biosintesi e degradazione dei nucleotidi 328
a partire da precursori com uni 309 La sintesi de novo delle purine inizia dal PRPP 328
Negli animali la biosintesi dei triacilgliceroli è regolata La biosintesi dei nucleotidi purinici è regolata
dagli orm oni 309 per inibizione retroattiva 328
21.3 Biosintesi dei fosfolipidi di membrana 310 I nucleotidi pirim idinici sono pro d o tti a partire
da aspartato, PRPP e carbam il fosfato 330
Le cellule m ettono in a tto due strategie I nucleosidi m onofosfato so n o convertiti
per attaccare le te ste polari dei fosfolipidi 311 In nucleosidi trifosfato 331
Le vie di sintesi degli sfingolipidi e I ribonucleotidi so n o i precursori
dei glicerofosfolipidi hanno precursori dei deossiribonucleotidi 332
e alcuni m eccanism i in com une 312 II tim idilato deriva dal dC D P e dal dU M P 332
21.4 Biosintesi del colesterolo, degli steroidi La degradazione delle purine e delle pirim idine
e degli isoprenoidi 312 p roduce rispettivam ente a cid o urico e urea 333
Le basi purinlche e pirim idiniche so n o riciclate
II colesterolo è sintetizzato dall’acetil-C oA m ediante le vie di salvataggio 334
in q u attro ta p p e 312 M olti agenti chem ioterapici co lp isco n o enzimi
Il colesterolo ha diversi destini m etabolici 313 delle vie bloslntetiche dei nucleotidi 334
Il colesterolo e altri lipidi vengono trasportati Termini chiave 335
dalle llpoproteine piasm atiche 314 Ulteriori letture 335
Gli esteri del colesterolo entrano nella cellula Problemi 335
per endocitosl m ediata da un recettore 316
La sintesi del colesterolo è regolata a diversi livelli 316
Gli orm oni steroidei si form ano p e r rottura della CAPITOLO 2 3
catena laterale e ossidazione del colesterolo 316 Regolazione ormonale e integrazione
Gli interm edi della sintesi del colesterolo possono
avere m olti destini m etabolici alternativi 317
del metabolismo nei mammiferi
Termini chiave 318
23.1 Gli ormoni: strutture diverse per funzioni
Ulteriori letture 318
diverse 337
Problemi 318
La sco p erta e la purificazione di un orm one CAPITOLU 2 5
richiedono la m essa a p u n to di un sistem a
di dosaggio 338
Metabolismo del DNA
Gli orm oni agiscono attraverso specifici recettori
25.1 Replicazione del DNA 364
cellulari ad alta affinità 339
Gli orm oni sono chim icam ente diversi 339 La replicazione del DN A è governata da un insieme
23.2 Metabolismi tessuto-specifici: la divisione di regole fondam entali 364 ,
del lavoro 341 Il DN A è d e g radato dalle nucleasi 366
Il DN A viene sintetizzato dalle D N A polim erasi 366
Il fegato m odifica e distribuisce le sostanze nutritive 341 Il processo di replicazione è m olto accurato 367
Il te ssuto adiposo im m agazzina e distribuisce E. coll possiede alm eno cinque DN A polim erasi 368
gli acidi grassi op p ure p roduce calore 344 La replicazione del DNA richiede numerosi
I m uscoli utilizzano l’ATP p e r com piere un lavoro enzim i e fattori proteici 368
m eccanico 344 La replicazione del crom o so m a di £ co li procede
II m uscolo usa l’ATP per la contrazione 345 in fasi successive 369
Il cervello utilizza energia per trasm ettere La replicazione nelle cellule eucarìotiche
im pulsi elettrici 346 è più com plessa 372
23.3 Regolazione ormonale del metabolismo 25.2 Riparazione del DNA 372
energetico 348
Le m utazioni so n o legate alla cancerogenesi 373
L’insulina segnala alti livelli di glucosio nel sangue 348 Tutte le cellule p ossiedono sistem i multipli
Il glucagone segnala bassi livelli di glucosio nel sangue 348 di riparazione del D N A 373
L’adrenalina segnala un pericolo im m inente, Il blocco della forcella di replicazione da D N A
il cortisolo situazioni di stress 349 danneggiato p u ò essere superato
23.4 Obesità e regolazione della massa dalla riparazione sog g e tta ad errori 375
corporea 351 25.3 Ricombinazione del DNA 376
Il te ssuto adiposo svolge Im portanti funzioni La ricom binazione genetica om o lo g a ha num erose
endocrine 351 funzioni 376
Termini chiave 352 La ricom binazlone durante la m eiosi inizia
Ulteriori letture 352 con la ro ttu ra della d o p pia elica 377
Problemi 352 Tutti gli aspetti del m etabolism o del DNA co n corro n o
alla riparazione delle forcelle di replicazione
in stallo 378
La ricom binazione sito-specifica determ ina
Parte 3 riarrangiam enti del DN A in punti precisi 378
Le vie delPinformazione Gli elem enti genetici trasponibili si spostano
da una posizione a ll’altra 378
[ geni delle Im m unoglobuline si assem blano
CAPITOLO 2 4 per ricom binazione 379
Geni e cromosomi Termini chiave 381
Ulteriori letture 381
24.1 Elementi cromosomici 356 Problemi 381

I geni sono segm enti di D NA che codificano RNA


e catene polipeptidiche 356 CAPITOLO 2 6
Le m olecole di DNA so n o m olto più lunghe
degli involucri che le co n te n g on o 357
Metabolismo dell’RNA
I geni e i crom osom i degli eucarioti sono m olto
26.1 Sintesi dell’RNA dipendente dal DNA 383
com plessi 358
L’RNA viene sintetizzato dalle RNA polim erasi 383
24.2 Superawolgimento del DNA 359
La sintesi dell’RN A inizia dai prom otori 385
La m aggior parte del DN A cellulare è parzialm ente La trascrizione è regolata a diversi livelli 386
disavvolto 360 S equenze specifiche segnalano la fine della sintesi
d ell’RNA 386
24.3 Struttura dei cromosomi 360
Le cellule eucarìotiche hanno tre tip i di R N A polim erasi
Gli ¡stoni sono piccole proteine basiche 361 nel nucleo 387
I nucleosom i so n o le unità organizzative La RNA polim erasi II richiede m olti altri fattori proteici
fondam entali della crom atina 361 per la sua attività 387
I nucleosom i sono com p a tta ti in strutture
26.2 Maturazione dell’RNA 389
di ordine via via superiore 362
Termini chiave 362 L’RNA catalizza la rim ozione (splicing) degli introni 389
Ulteriori letture 362 Gli m R N A degli eucarioti hanno strutture particolari
Problemi 363 all’estrem ità 3 ’ 391
Un gene può dare origine a prodotti diversi a seguito In tu tte le cellule la degradazione delle proteine
di m odificazioni differenti dell’RNA 392 è m ediata da sistem i specializzati 412
Gli RNA con funzioni speciali vanno incontro Termini chiave 415
a diversi tipi di m odificazioni 392 Ulteriori letture ( 415
Gli R NA con proprietà enzim atiche catalizzano Problemi ' 415
alcune reazioni del m etabolism o dell’RNA 392
26.3 Sintesi dell’RNA e del DNA dipendente
CAPITOLO 2 8
dall’RNA 394
Regolazione dell’espressione genica
La trascrittasi inversa produce DNA a partire
d a RNA virale 394 28.1 Principi di regolazione genica 417
A lcuni retrovirus causano il cancro e l’AIDS 394
La telom erasi è una trascrittasi inversa specializzata 395 L’RNA polim erasi si lega al D NA in corrispondenza
Termini chiave 395 dei prom otori 417
Ulteriori letture 395 L’inizio della trascrizione è regolato da proteine
Problemi 396 che si legano ai prom otori o vicino ai prom otori 417
M olti geni batterici sono raggruppati e regolati
in o p e ro n i 417
CAPITOLO 2 7 L’operone la c è soggetto a regolazione negativa 418
Le proteine regolatrici hanno dom ini distinti
Metabolismo delle proteine che legano il DNA 419
Le proteine regolatrici possiedono anche dom ini
27.1 II codice genetico 397
di interazione proteina-proteina 421
Il co d ice genetico è stato decifrato utilizzando 28.2 Regolazione dell’espressione genica
stam pi di m RN A artificiali 397 nei batteri 422
L’“oscillazione” perm ette ad alcuni tR N A
dì riconoscere più di un co done 399 L’operone la c è sog g e tto a regolazione positiva 422
M olti geni per gli enzimi della biosintesi
27.2 La sintesi proteica 400 degli am m inoacidi sono regolati per
La sintesi proteica avviene in cinque fasi 400 attenuazione della trascrizione 423
Il ribosom a è una com plessa m acchina 28.3 Regolazione dell’espressione genica
sopram olecolare 400 negli eucarioti 423
Gli RN A transfer hanno caratteristiche
strutturali peculiari 401 La crom atina trascrizionalm ente attiva è
Fase 1 : le am m inoacil-tR N A sintetasi legano strutturalm ente diversa dalla crom atina inattiva 423
il corretto am m inoacido ai tR N A La crom atina viene rim odellata per acetilazione
corrispondenti 403 e per spostam ento/riposizionam ento
Fase 2: uno specifico am m inoacido dà inizio dei nucleosom i 423
alla sintesi proteica 403 Molti prom otori eucariotici sono regolati positivam ente 423
Fase 3: ì legam i peptidicì si form ano durante Gli attivatori e i coattivatori che si legano al D N A
la fase di allungam ento 406 facilitano l’organizzazione dei fattori generali
Fase 4: la term inazione della sintesi proteica di trascrizione 424
necessita di un segnale peculiare 409 L’espressione dei geni eucariotici p u ò essere
Fase 5: le catene polipeptidiche neosintetizzate regolata d a segnali intercellulari e intracellulari 425
vanno incontro a ripiegam enti e m odificazioni 410 Il silenziam ento genico post-trascrizionale
è m ediato d all’interferenza d a RNA 425
27.3 Trasporto a destinazione (targeting)
Termini chiave 426
e degradazione delle proteine 410
Ulteriori letture 426
Le m odificazioni post-traduzionali di m olte proteine Problemi 427
eucariotiche com inciano nel reticolo
e n d oplasm atico 411 Appendice A 428
La glìcosìlazione svolge un ruolo chiave Appendice B Soluzioni abbreviate dei problemi 432
nel tra sp o rto a destinazione delle proteine 411 Crediti 440
Persistenza del sistem a segnale per il tra sp o rto Glossario 443
delle proteine nel nucleo 412 Indice analitico 458
JSf*

Con la cellula, la biologia ha scoperto i suol atomi...


Per caratterizzare la vita è stato essenziale studiare la cellula e / '! (
analizzare la sua struttura, per stabilire quali sono I
denominatori comuni su cui si fonda la vita di ognuna di esse e
per riconoscerne le differenze associate allo svolgimento di
speciali funzioni.
François Jacob, La logique du vivant: une histoire de l ’hérédité (The
Logic ofLife:A History of Heredity), 1970

Fondamenti
di biochimica
1.1 Fondamenti di biologia cellulare 2 • Sistemi capaci di estrarre, trasformare e utilizza­
1.2 Fondamenti di chimica 6 re l’energia dall’ambiente, che consentono agli orga­
nismi viventi di costruire e mantenere le loro comples­
1.3 Fondamenti di fisica 10
se strutture, e di svolgere un lavoro meccanico, chimi­
1.4 Fondamenti di genetica 14 co, osmotico ed elettrico.
1.5 Fondamenti di biologia dell’evoluzione 15 • Funzioni specifiche di ogni componente cellulare
e loro interazioni controllate. L’interazione tra i
irca quindici miliardi di anni fa l'universo ebbe origine componenti chimici degli organismi viventi ha un carat­

C con eruzioni inimmaginabili di calore e di particelle


subatomiche ricche di energia. In pochi secondi si
formarono gli elementi più semplici (idrogeno ed e lio ). Man
mano che l’universo si espandeva e si raffreddava ì materia­
tere dinamico. Tutto l’insieme delle molecole segue un
programma finalizzato a riprodurre il programma stesso
e ad autoperpetuare quello specifico insieme di moleco­
le, cioè la vita.
li si condensarono sotto l’influenza della gravità, generando • Meccanismi per percepire e rispondere alle alte­
le stelle. Alcune di queste diventarono enormi ed esplosero razioni dell’ambiente circostante, che continuamen­
come supernove, rilasciando l’energia necessaria a conden­ te adattano la chimica della cellula alle variazioni am­
sare i nuclei degli elementi semplici in elementi complessi. bientali.
In miliardi di anni si formarono la Terra e gli elementi chimi­ • Capacità di autoriprodursi e di autorganizzarsi.
ci presenti al giorno d’oggi. Circa quattro miliardi di anni fa Una singola cellula batterica, posta in un mezzo nutrien­
comparve la vita: piccoli microrganismi con la capacità di te sterile, può dare origine a circa un miliardo di cellule
estrarre energia dai composti organici o dalla luce solare; “figlie” identiche nel giro di 24 ore.
questa energia fu poi usata per produrre una serie di bio­ • Capacità di cambiare nel tempo attraverso
molecole più complesse a partire dai semplici elementi e un’evoluzione graduale. Gli organismi viventi sono in
composti presenti sulla superficie terrestre. grado di cambiare lentamente le strategie vitali eredita­
La biochimica cerca di spiegare come le eccezionali caratte­ te al fine di sopravvivere al mutare delle condizioni am­
ristiche degli organismi viventi derivino dalle migliaia di dif­ bientali.
ferenti biomolecole. Lo studio della biochimica mostra come
tutte le molecole, di per sé prive di vita, che costituiscono Il risultato di eoni di evoluzione è un numero enorme di
gli organismi viventi interagiscano tra loro per mantenere e forme di vita diverse, che condividono una discendenza evo­
perpetuare la vita utilizzando soltanto quelle leggi fisiche e lutiva comune. Nonostante queste proprietà condivise e la
chimiche che governano l’universo non vivente. fondamentale unitarietà della vita che esse sottendono, è dif­
Gli organismi viventi possiedono però attributi straordinari, ficile fare generalizzazioni sui sistemi viventi. La biodiversità
cioè proprietà che li distinguono da altri tipi di materia. nel nostro pianeta è enorme.
Quali sono queste caratteristiche che distinguono gli orga­ La biochimica descrive in termini molecolari le strutture, i
nismi viventi? meccanismi, e i processi chimici comuni a tutti gli organi­
smi, insieme a una serie di principi organizzativi, validi per
• Un alto grado di complessità chimica e di organiz­ tutte le forme di vita, che vanno sotto il nome di logica mo­
zazione a livello microscopico. Migliaia di molecole di­ lecolare della vita. Anche se la biochimica è in grado di of­
verse formano l’intricata struttura interna delle cellule. frire importanti prospettive e applicazioni pratiche nel
21 CAPITOLO! Fondamenti di biochimica © 978-88-08-0641:3-4:

campo della medicina, dell’agricoltura, della nutrizione ed Nucleo (eucarioti)


anche dell’industria, il suo fine ultimo rimane quello di sco­ o nucleoide Membrana piasmatica
(batteri, archea) Doppio strato lipidico
prire le leggi che governano la materia vivente. Contiene il materiale flessibile e resistente.
genetico: DNA e proteine Selettivamente permeabile
associate. alle sostanze polari.
Il nucleo è circondato Comprende proteine
da una membrana di membrana
1.1 Fondamenti di biologia cellulare che hanno funzioni
di trasporto, di ricezione
L’uniformità e l’eterogeneità degli organismi viventi risultano dei segnali e funzione
evidenti anche a livello cellulare. Gli organismi più piccoli con­ enzimatica
sistono di una singola cellula e non sono visibili a occhio nudo.
Gli organismi più grandi sono costituiti da più tipi di cellule,
diverse per dimensioni, forme e funzioni svolte. Ma, anche se
così diverse, tutte le cellule, da quelle degli organismi più
semplici a quelle degli organismi più complessi, hanno in co­
mune alcune proprietà fondamentali, che possono essere ap­
prezzate soprattutto a livello biochimico.

-» Le cellule sono le unità strutturali e funzionali di tutti Citoplasma


gli organismi viventi Il contenuto acquoso della
cellula, le particelle
Tutti i tipi di cellule hanno alcune caratteristiche struttura­
sospese e gli organelli
li comuni (Figura 1.1). La membrana piasmatica defini­
sce i contorni della cellula e separa il contenuto della cellu­
la dal mezzo esterno. Essa è composta da m olecole lipidi­ FIGURA 1.1 « L e caratteristiche universali delle cellule.
che e proteiche, che formano intorno alla cellula una bar­ Tutte le cellule possiedono un nucleo o un nucleoide, una membrana
plasmática e un citoplasma.
riera sottile, resistente, flessibile e idrofobica. La membra­
na impedisce il passaggio degli ioni inorganici e della mag­
gioranza delle molecole cariche o polari.
Il contenuto cellulare interno, racchiuso dalla membrana pia­ una volta raggruppati come procarioti (dal greco p rò,
smatica, il citoplasma (Figura 1.1), è composto da una so­ “prima”), vengono oggi suddivisi in due gruppi distinti, i
luzione acquosa, il citosol, e da una varietà di particelle in batteri e gli archea, che verranno descritti in seguito.
sospensione, che svolgono funzioni diverse.
Tutte le cellule possiedono, almeno per una parte del loro -> Gli organismi viventi possono essere
ciclo vitale, un nucleo o un nucleoide, dove viene conser­ raggruppati in tre distinti domini
vato e replicato il genoma (il corredo dei geni) costituito da Tutti gli organismi viventi possono essere suddivisi in tre
DNA. Il nucleoide dei batteri e degli archea non è separato grandi gruppi (dom in i), che corrispondono a tre branche
dal citoplasma da una membrana. Il nucleo degli eucarioti evolutive che si dipartono da un progenitore comune (F i­
consiste di materiale racchiuso da una doppia membrana, gura 1.2). Due di questi gruppi sono costituiti da organismi
l’involucro nucleare. I microrganismi sprovvisti di nucleo, unicellulari, distinguibili sulla base delle loro caratteristi-

Eucarioti

FIGURA 1.2 ® Filogenesi dei tre domini degli organismi viventi. Le filogenetico", come quello presentato in questa figura, Minore è II numero delle
relazioni filogenetiche spesso vengono illustrate sotto forma di un “albero ramificazioni tra due organismi, più stretta è la loro relazione evolutiva.
© 978-88-08-C6413-4 GAP3TOL81 Fondamenti di biochimica | :

che biochimiche e genetiche: i batteri e gli archea (ar- non patogeno del tratto intestinale dell’uomo e possiede una
cheobatteri). I batteri vivono nel terreno, sulla superficie membrana esterna protettiva e una membrana piasmatica
dell’acqua e nei tessuti di altri organismi viventi o in decom­ interna che racchiude il citoplasma e il nucleoide.
posizione. Molti archea, riconosciuti come un dominio a sé La maggior parte dei batteri (tra cui VE. coli ) esiste sotto
da Cari Woese negli anni ’80, vivono in condizioni estreme, forma di cellule isolate, ma le cellule di alcune specie batte­
per esempio in acque salate, sorgenti calde, paludi molto riche (per esempio i mixobatteri) tendono ad associarsi, for­
acide e nelle profondità degli oceani. Gli organismi euca- mando aggregati cellulari.
rioti raggruppati nel terzo dominio si sono evoluti dalla
stessa branca da cui sono derivati gli archea. -> Le cellule eucariotiche possiedono vari
A ll’interno dei domini degli archea e dei batteri vi sono dei organelli circondati da una membrana,
sottogruppi distinguibili sulla base dei loro habitat. Negli ha­ che possono essere isolati
bitat aerobici alcuni organismi traggono l’energia dal tra­ Le tipiche cellule eucariotiche sono molto più grandi delle
sferimento degli elettroni dalle molecole combustibili all’os­ cellule batteriche (Figura 1.4). Il loro diametro è general­
sigeno. Negli habitat anaerobici si sono adattati microrga­ mente compreso tra i 5 e i 100 pm, e il loro volume è da mi­
nismi che ottengono energia dal trasferimento degli elettro­ gliaia fino a un milione di volte maggiore rispetto a quello
ni al nitrato (con formazione di N 2), al solfato (formando dei batteri. I caratteri distintivi delle cellule eucariotiche
H2S), o alla C 0 2 (formando CH4). Alcuni di questi organismi sono il nucleo e vari organelli circondati da membrana, con
che si sono evoluti in un ambiente anaerobico sono anaero­ funzioni specializzate: i mitocondri, il reticolo endoplasmati-
bi obbligatori: essi muoiono al contatto con l’ossigeno. Altri co, il complesso di Golgi, i perossisomi e i lisosomi. Oltre a
sono invece anaerobi,facoltativi, capaci di vivere sia in pre­ questi organelli, le cellule vegetali contengono anche i va­
senza che in assenza di ossigeno. cuoli e i cloroplasti (Figura 1.4). N el citoplasma di molte cel­
lule sono presenti anche granuli o gocce di piccole dimen­
-> UEscherichia colie ¡1 batterio più studiato sioni che fungono da deposito di sostanze nutrienti, come i
Le cellule batteriche hanno in comune alcune caratteristi­ grassi e lamido.
che strutturali (Figura 1.3). La cellula dii?, coli è lunga Esistono alcune metodiche per separare gli organelli dal
circa 2 |xm e ha un diametro di meno di 1 |o.m; è un ospite citosol, e i diversi tipi di organelli tra loro. Un tipico frazio­
namento cellulare è mostrato nella Figura 1.5. Le cellule o
i tessuti vengono immersi in una soluzione e disgregati me­
Ribosomi I ribosomi batterici sono più piccoli dei ribosomi
diante una blanda om ogenizzazione. In questo modo si
eucariotici, ma svolgono la stessa funzione: la sintesi
deEe proteine usando le informazioni presenti nell’RNA rompono le m em brane piasmatiche cellulari, m entre la

Nucleoide Contiene una sola,


maggior parte degli organelli rimane intatta. L’omogenato
semplice e lunga molecola di viene quindi centrifugato e gli organelli, come i nuclei, i mi­
DNA circolare tocondri e i lisosomi, che hanno differenti dimensioni, se­
/Pili Sono dimentano a velocità diverse.
/ punti di
/ adesione alla Questa centrifugazione differenziale produce una separazio­
.r ~ i superficie di ne dei componenti citoplasmatici, che possono essere ulte­
"fcU . altre cellule
riormente purificati mediante altre procedure. In questo
modo si è potuto stabilire che i lisosomi contengono enzimi
degradativi, i mitocondri enzimi ossidativi e i cloroplasti pig­
menti fotosintetici. Spesso l’isolamento di un tipo di orga-
nello ricco di un certo enzima costituisce la prima tappa per
la purificazione della proteina.

-> Il citoplasma viene organizzato


dal citoscheletro ed è altamente dinamico
Involucro La microscopia a fluorescenza ha messo in evidenza diversi
cellulare tipi di filamenti proteici che attraversano la cellula eucario-
Struttura che varia
tica, formando una rete tridimensionale di interconnessioni
a seconda del tipo
di batterio chiamata citoscheletro. Esistono tre tipi principali di fila­
menti citoplasmatici: i filamenti di actina, i microtubuli e i
filamenti intermedi (Figura 1.6). Essi differiscono per spes­
sore (da 6 a 22 nm ), composizione e funzione specifica.
Tutti e tre questi filamenti contribuiscono alla struttura e al­
l’organizzazione del citoplasma e alla forma della cellula. I fi­
lamenti di actina e i microtubuli contribuiscono anche al
movimento degli organelli e dell’intera cellula.
Il quadro che emerge da questa breve rassegna sulla struttu­
FIGURA 1.3 • Caratteristiche strutturali comuni delle cellule batteriche. ra della cellula eucariotica descrive la cellula come una rete
Queste strutture sono presenti nell'E colie in molti altri procarioti. di fibre strutturali e un complesso sistema di compartimen-
4 1 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica ©97&-8fi?08-O6413i4S

( a ) C ellu la animale
I ribosomi sono macchinari
di sintesi proteica

I perossisomi ossidano gli acidi grassi

Il citoscheletro fornisce sostegno alla cellula


e assiste il movimento degli organetti

Il iisosuma degrada i detriti intracellulari

Le vescicole di trasporto veicolano


i lipidi e le proteine tra EE,
Golgi e membrana plasmática

Il complesso di Golgi processa,


impacca e marca le proteine
per altri organetti o per l’esportazione

Il reticolo endoplasmatico liscio


(SER) è il sito di sintesi dei lipidi
e del metabolismo dei farmaci

L’involucro nucleare
separa la cromatina
(DNÀ + proteine)
dal citoplasma

La membrana piasmatica separa


la cellula dall’ambiente, regola
il movimento dei materiali all’interno Citoscheletro
e all’esterno della cellula

Complesso
xp di Golgi
Il cloroplasto cattura la radiazione solare
produce ATP e carboidrati

I granuli <i:i. amido immagazzinano


temporaneamente i carboidrati
prodotti dalla fotosintesi

I tilamidi sono i siti di sintesi


di ATP guidata dalla luce

La p; ■ no lini -('conferisce
forma e rigidità; protegge la cellula
dal rigonfiamento osmotico

Il vacuolo
degrada e ricicla
le macromolecole,
immagazzina i metaboliti
La párele cellulare
Il plasmodesma mette
della cellula adiacente
in comunicazione
due cellule vegetali Il g lio s s is o m a contiene enzimi
del ciclo del gliossilato

(b ) C e llu la vegetale

FIGURA 1.4 • Struttura della cellula eucariotica. Illustrazione schematica dei due tipi principali di cellule
eucariotlche: (a) una cellula animale e (b) una cellula vegetale. Le cellule vegetali hanno generalmente un diametro
che varia dal 10 ai 100 p.m, maggiore di quello delle cellule animali che varia da 5 a 30 g,m. Le strutture
contrassegnate in rosso sono tipiche o delle cellule animali o delle cellule vegetali, I microrganismi eucarioticl (come i
pratisti e i funghi) hanno strutture slmili a quelle delle cellule vegetali e animali, ma molti contengono anche organetti
specializzati, qui non riportati.
©978-88-08-06413-4 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica 15

FIGURA 1.5 • Frazionamento subcellulare di un tessuto.


Un tessuto, per esempio il fegato, viene omogenizzato meccanicamente, per rompere le cellule e disperdere II
loro contenuto nella soluzione acquosa tamponata. La soluzione di saccarosio ha una pressione osmotica slmile a
quella degli organelll, in modo da impedire la diffusione dell’acqua all’interno degli organelll, che provocherebbe II
loro rigonfiamento e la loro rottura se per esempio l'osmolarilà fosse più bassa. Le particelle con diverse
dimensioni In sospensione possono essere separate variando la velocità di centrifugazione.
Centrifugazione
differenziale
Omogenizzazione
del tessuto

Centrifugazione
a bassa velocità
(1000 g, 10 min)

Sopranatante sottoposto
a centrifugazione a media velocità
(20000 g, 20 min)

Sopranatante sottoposto
A ï: 4 a centrifugazione
Tessuto j ad alta velocità
omogenizzato I (80 000 g, 1 h)

Sopranatante
sottoposto
W ' a centrifugazione
Sedimento a velocità molto alta
contenente (150000 0, 3h )
cellule intatte,
nuclei,
citoscheletro,
membrane
plasmatiche Sedimento
contenente
mitocondri,
lisosorru, Sopranatante
perossisomi contenente
proteine
Sedimento solubili FIGURA 1.6 * I tipi di filamenti del citoscheletro: i filamenti
contenente di actina e i microtubuli. Le strutture cellulari possono essere
microsorru marcate con un anticorpo (che riconosce una specifica proteina) a
(frammenti cui è covalentemente legato un composto fluorescente. Quando la
diER) *:5SSSK
e piccole
cellula viene osservata al microscopio a fluorescenza le strutture
vescicole Sedimento marcate diventano riconoscibili. Cellule endotellall dell’arteria
contenente polmonare bovina. Fasci di filamenti di actina, chiamati stress
ribosomi (Ibers, sono colorati In rosso; i mlcrotubull, che si dipartono
e grosse dal centro, sono colorati in verde; I cromosomi (nel nucleo) sono
macromolecole colorati in blu.

ti delimitati da membrane (Figura 1.4). Il sistema endo- metro di circa 1000 nm. La differenza tra le semplici biomo­
membranoso segrega specifici processi metabolici e forni­ lecole e le strutture cellulari visibili al microscopio ottico è
sce le superfici su cui avvengono alcune reazioni catalizzate molto grande. La Figura 1.7 illustra la gerarchia strutturale
da enzimi. L’esocitosi e l’endocitosi, meccanismi di tra­ dell’organizzazione cellulare.
sporto (rispettivam ente verso l’esterno e verso l ’interno Le subunità monomeriche delle proteine, degli acidi nucleici
della cellula) che comportano la fusione e la fissione della e dei polisaccaridi sono unite da legami covalenti. Nelle strut­
membrana, costituiscono delle vie di comunicazione tra il ci­ ture sopramolecolari le macromolecole sono però tenute in­
toplasma e il mezzo circostante, e inoltre permettono la se­ sieme da interazioni non covalenti, tutte molto più deboli dei
crezione di sostanze prodotte dalla cellula verso l’esterno, e legami covalenti. Queste interazioni non covalenti compren­
l’assorbimento dall’esterno all’interno di materiale extracel­ dono i legami idrogeno (tra gruppi polari), le interazioni ioni­
lulare. che (tra gruppi carichi), le interazioni idrofobiche (tra grup­
pi non polari in soluzione acquosa) e le forze di van der Waals
-> Le cellule producono strutture sopramolecolari (o forze di London), ognuna delle quali ha un’energia di le­
Le macromolecole e le loro unità costitutive hanno dimen­ game nettamente inferiore a quella del legame covalente.
sioni molto diverse. Una molecola di amminoacido è lunga Una delle sfide della moderna biochimica è quella di capire
circa di 0,5 nm. Le proteine sono molto più piccole dei ribo­ quale sia la reale influenza dell’organizzazione cellulare e
somi (diametro di circa 20 nm), e a loro volta essi sono molto delle associazioni macromolecolari sul comportamento delle
più piccoli di organelli come i mitocondri, che hanno un dia­ biomolecole.
61 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica ©. 978-88-08-06413-4/

Livello 4: Livello 3: Livello 2: Livello 1:


la cellula complessi macromolecole unità
e i suoi organetti sopramolecolari monomeriche

Zuccheri Pio/;
FIGURA 1.7 • La gerarchia strutturale nell’organizzazione molecolare Parete cellulare- '
della cellula. In questa cellula vegetale, il nucleo contiene diversi tipi di
complessi sopramolecolari, tra cui la cromatina. La cromatina è costituita
da due tipi di macromolecole, DNA e molte differenti proteine, ciascuna
formata da semplici unità costitutive.

della cellula. Il carbonio può formare legami singoli con gli


i .2 Fondamenti di chimica
atomi di idrogeno, e un legame singolo o un legame doppio
La biochimica si propone di spiegare le forme biologiche e con l’ossigeno e con l’azoto. (Figura 1.8). Di grande signifi­
le loro funzioni in termini chimici. cato in biologia è la capacità del carbonio di formare legami
Meno di 30 dei più dei 90 elementi chimici che si trovano in stabili con fino a quattro altri atomi di carbonio. Due atomi
natura sono essenziali per gli organismi viventi. La maggior di carbonio possono anche mettere in comune due (o tre)
parte degli elementi che compongono la materia vivente ha coppie di elettroni, formando legami doppi (o tripli).
numeri atomici relativamente bassi. I quattro elementi più Gli atomi di carbonio legati covalentemente nelle biomole­
abbondanti negli organismi viventi espressi come percen­ cole possono formare catene lineari o ramificate e strutture
tuale del numero totale di atomi, sono l’idrogeno, l’ossigeno, cicliche. Nessun altro elemento chimico può formare una
l’azoto e il carbonio, che insieme ammontano al 99% della varietà così vasta di molecole diverse per grandezza, forma e
massa della maggioranza delle cellule. Essi sono elementi in composizione.
grado di formare rispettivamente uno, due, tre e quattro le­ Le biomolecole in gran parte possono essere considerate
gami. Gli elementi presenti in traccia rappresentano solo come derivati degli idrocarburi, in cui atomi di idrogeno
una minuscola frazione in peso del corpo umano, ma sono sono sostituiti da una serie di gruppi funzionali che conferi­
tutti essenziali per la vita, soprattutto perché sono indispen­ scono caratteristiche proprietà alle molecole, formando le
sabili per la funzione di specifiche proteine. diverse famiglie di composti organici. Tipici sono i gruppi
funzionali degli alcoli, che possiedono uno o più gruppi ossi­
-> Le biomolecole sono composti del carbonio drili, delle ammine, caratterizzate dai grappi ammiraci, delle
con vari gruppi funzionali aldeidi e dei chetoni, che possiedono gruppi carbonilici; e
La chimica degli organismi viventi è organizzata intorno al degli acidi, che possiedono gruppi carbossilici (Figura 1.9).
carbonio, che corrisponde a più della metà del peso secco Molte biomolecole sono polifunzionali, poiché contengono

FIGURA 1.8 * Versatilità del


carbonio nel formare
legami. L’atomo di carbonio
può formare legami singoli,
doppi e tripli (tutti evidenziati in
rosso), in particolare con altri
atomi di carbonio. I legami tripli
sono rari nelle biomolecole.
© 978^88-08^6413*4 CAPITOL0 1 Fondamenti di biochimica

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Metile Etere R 1— 0 — R 2 Guanidino R — N — C — N:

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Carbonile i; c—H Anidride r ^ c^ ò '^ g^ r 2 Disolfuro R i s i i l i —R 2
(aldeide) (due acidi
0 Q.
carbossilici)

H .llifl

Carbonile R- -G — R :i Animino R —N ÌlÉ l Tioestere R 1JS0— S - R2


(chetone) II (protonato) 1 ih :® ' Il 38
0 h sili. 0

0 '

Carbossile R — C— O g l Amido

R—C ^ N p *
111 Fosforile
1
R — 0 — P — OH
II
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Il ......
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Itt
I I
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! . 1
Ossidrile li — 0 — H Immina R 1— C— R 2 Fosfoanidride R 1— O - P O — P - O — R2
(alcol) rii il

CT
Rd : I ■
Enolo R —C=G. Immina sostituita wln Anidride mista R — ('■ (>--P — UH
in N (base SÉ; (acido carbossilico Jl ( Jl
di Schifi) i m 2 e acido fosforico;
K ■gG—R
detta anche
adì fosfato)

FIGURA 1.9 • Alcuni gruppi funzionali che si Incontrano frequentemente atomo di idrogeno, ma può essere anche un gruppo contenente molti atomi di
nelle biomolecole. In questa figura, e poi In seguito nel testo, la lettera R è carbonio. Quando una molecola possiede due o più sostituenti, essi vengono
usata per rappresentare “ogni sostituente” , Esso può essere semplice come un Indicati con R1, R2 e così via.

due o più gruppi funzionali, ciascuno con caratteristiche di, i nucleotidi, gli zuccheri e i loro derivati fosforilati e un
specifiche. La “personalità” chimica di un composto deriva certo numero di acidi mono-, di- e tricarbossilici. Le mole­
dalla chimica dei suoi gruppi funzionali e dalla loro disposi­ cole sono polari o cariche, solubili in acqua e presenti in
zione nello spazio, concentrazioni da micromolari a miUimolari. Esse sono in­
trappolate all’interno della cellula poiché la membrana pia­
ri» Le cellule contengono un grande assortimento smatica è impermeabile a queste sostanze. La presenza
di molecole dello stesso gruppo di composti organici in tutte le cellule
La fase acquosa (citosol) di tutte le cellule contiene un mi­ viventi è un indice dell’universalità del disegno metabolico
gliaio di piccole m olecole organiche diverse (M T da 100 a e riflette la conservazione evolutiva dei meccanismi meta­
500), che costituiscono i metaboliti della maggioranza dei bolici che si svilupparono nelle prime cellule.
processi che avvengono in quasi tutte le cellule, metaboliti e L’insieme delle piccole molecole in una data cellula è stato
processi che si sono conservati nel corso di tutta l’evoluzio­ definito come m e ta b o lo m a cellulare, in analogia con il ter­
ne. Questa varietà di molecole include i comuni amminoaci­ mine “genoma” .
8 1 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica © 978-88-08-06413-4

TABELLA 1.1 Componenti molecolari di una cellula


di Escherichia coli
Numero .
Percentuale approssimativo
approssimativa di specie
del peso totale molecolari
della cellula differenti

Acqua 70 1
Proteine ; A U ; 15 3000
Acidi nucleici
(a ) (b ) (c )
DNA 1 1-4
RNA 6 >3000 FIGURA 1.10 • Rappresentazione delle molecole. Tre modi per
Polisaccaridi 3 io: rappresentare la struttura dell’amminoacido alanina (qui mostrata nella forma
Lipidi 2 : 2Ò ionica che si riscontra a pH neutro), (a) Formula di struttura in prospettiva. Il
Subunità simbolo (— ) indica un legame in cui l’atomo all'estremità del simbolo si proietta
al di fuori del piano del foglio, verso il lettore; lo stesso simbolo tratteggiato (»-)
monomeriche
rappresenta un legame che si proietta sotto il piano del foglio, (b) Modello a
e intermedi ■’ 2 ( :-: 500 palle e bastoncini che mostra le lunghezze relative del legami e gli angoli che
Ioni inorganici 1 ■■ U T 20 essi formano. (c) Modello a spazio pieno, In cui ogni atomo ha un raggio di van
der Waals riportato nelle corrette proporzioni.

La cellula contiene anche molte macromolecole, cioè po­ mensionale, cioè la sua stereochimica, è altrettanto impor­
limeri con peso molecolare superiore a 5000 che si formano tante. Un composto contenente carbonio si trova comune­
a partire da precursori relativamente semplici. I polimeri più mente sotto forma di stereoisomeri, molecole con gli stes­
corti sono detti oligomeri (dal greco oligoi, “pochi”) . Le si legami chimici ma diversa stereochimica, cioè una diversa
proteine, gli acidi nucleici e i polisaccaridi sono macromole­ configurazione corrispondente ad una diversa disposizio­
cole composte da monomeri con un peso molecolare pari o ne degli atomi nello spazio. Le interazioni fra le biomolecole
inferiore a 500. La sintesi delle proteine è uno dei processi sono invariabilmente stereospecifiche poiché richiedono
biologici che richiede più energia. Le macromolecole posso­ una stereochimica specifica delle molecole che entrano in
no raggrupparsi, formando complessi sopramolecolari fun­ contatto.
zionali, come i ribosomi. La Tabella 1.1 mostra le principali La Figura 1.10 illustra tre sistemi che si possono utilizzare
classi di biomolecole presenti in urna cellula dii?, coli. per descrivere le strutture stereochimiche delle m olecole
Le proteine, lunghi polimeri di amminoacidi, costituiscono semplici. La rappresentazione in prospettiva mostra in
la parte più rilevante (oltre all’acqua) di una cellula. Alcune, modo non ambiguo la stereochimica, ma gli angoli e la lun­
come gli enzimi, possiedono attività catalitica; altre fungono ghezza di legame tra un centro e l’altro sono meglio rappre­
da elementi strutturali, recettori di segnali, o trasportatori di sentati con i modelli a palle e bastoncini. N ei modelli a spa­
sostanze specifiche dentro e fuori la cellula. Le proteine sono zio pieno, il raggio di ogni “atomo” è proporzionale al suo
forse le biomolecole più versatili. L’insieme di tutte le protei­ raggio di van der Waals e i contorni del modello definiscono
ne funzionanti in una cellula è detto proteoma. Gli acidi lo spazio occupato dalla molecola (il volume precluso agli
nucleici, DNA ed RNA, sono polimeri di nucleotidi. Essi con­ atomi di altre m olecole).
servano e trasmettono l’mformazione genetica. Inoltre alcu­ La configurazione è determinata dalla presenza di (1 ) doppi
ne m olecole di R N A hanno ruoli strutturali e catalitici in legami, attorno ai quali non vi è libertà di rotazione; ( 2) cen­
complessi sopramolecolari. I polisaccaridi, polimeri di zuc­ tri durali intorno ai quali i gruppi sostituenti sono disposti
cheri semplici come il glucosio, hanno tre funzioni principa­ in ima sequenza specifica. Gli isomeri conformazionali non
li: come riserve ricche di energia, come componenti struttu­
rali delle pareti cellulari (nelle piante e nei batteri), e come
elementi extracellulari che si legano a proteine o ad altre cel­
lule. I lipidi, derivati idrocarburici insolubili, servono da
componenti strutturali delle membrane, come riserve ricche
di energia, pigmenti e segnali intracellulari.
Poiché le sequenze di elementi costitutivi sono ricche di in­
formazioni, le proteine e gli acidi nucleici spesso sono detti
anche macromolecole informazionali. Anche alcuni oli­ H, H HOOC^
gosaccaridi, come osservato in precedenza, possono com­ /
C=C
portarsi come molecole informazionali. / \
HOOC COOH H COOH
Acido maleieo (cis) Acido fumarico (trans)
-* La struttura tridimensionale può essere descritta
in termini di configurazione e conformazione FIGURA 1.11 • Configurazione degli isomeri geometrici.
Anche se i legami covalenti e i gruppi funzionali di una bio­ Isomeri come l’acido malelco (maleato a pH 7) e l’acido fumarico (fumarato) non
possono essere convertiti l’uno nell’altro senza rompere i legami covalenti, un
molecola sono essenziali per la sua funzione, la disposizione processo che richiede un apporto energetico ben più elevato rispetto all’energia
degli atomi che costituiscono la molecola nello spazio tridi­ cinetica media delle molecole alla temperatura fisiologica.
© 978-88-08-06413-4 CAPÌTOLO 1 Fondamenti eli biochimica I

FIGURA 1.12 • Due tipi di stereoisomeri. Vi sono quattro differenti forme di permettere al lettore di vedere tutti i gruppi. Due coppie di stereoisomeri sono
2,3-butano disostituito (n= 2 atomi di carbonio asimmetrici, da cui 2" = 4 l'una l’immagine speculare dell’altra, o enantiomeri. Le altre coppie non sono
stereoisomeri). Ogni stereoisomeo è mostrato in un riquadro in una formula immagini speculari e sono diastereoisomeri.
prospettica e in un modello a palle e bastoncini, leggermente ruotato, per

possono a convertirsi l’uno nell’altro senza rompere tempo­ cuni stereoisomeri sono strutturalmente correlati, come la
raneamente uno o più legami. La Figura 1.11 mostra la con­ mano destra lo è con la sinistra). Una molecola con un solo
figurazione dell’acido maleico e del suo isomero acido fuma- atomo di carbonio chirale può avere solo due stereoisome­
rico. Questi composti sono isomeri geometrici, o isomeri ri, ma quando i centri durali sono due o più (ri) possono es­
cis-trans; essi differiscono per la disposizione dei gruppi serci 2™ stereoisomeri. Alcuni stereoisomeri sono immagi­
sostituenti rispetto al doppio legame intorno al quale non è ni speculari l’uno dell’altro; essi sono chiamati enantiome­
possibile alcuna rotazione (dal latino cis, “dalla stessa ri. Le coppie di stereoisomeri che non sono immagini spe­
parte” : i gruppi sono dalla stessa parte rispetto al doppio le­ culari l’uno dell’altro sono chiamate diastereoisomeri (F i­
game; trans, “all’opposto” : i gruppi sono dalla parte oppo­ gura 1.12).
sta rispetto al doppio legam e). L’acido maleico (maleato a Gli enantiomeri hanno proprietà chimiche molto simili, men­
pH neutro) è l’isomero cis e l’acido fumarico (fumarato) è tre differiscono per alcune caratteristiche proprietà fisiche,
l’isomero trans; i due composti sono così stabili che possono come la loro interazione con la luce polarizzata. Due enan­
essere separati l’uno dall’altro, e ciascuno di loro presenta tiomeri posti in soluzioni separate ruotano il piano della luce
specifiche proprietà chimiche. Un sito di legame (di un enzi­ polarizzata in direzioni opposte, mentre soluzioni equimola-
ma, per esempio) che sia complementare a uno di questi ri dei due enantiomeri (miscela racemica) non mostrano
composti non può legare l’altro; ciò spiega come queste mo­ alcuna rotazione ottica. I composti senza centri durali non
lecole svolgano ruoli biologici diversi pur avendo una chimi­ hanno effetto sulla luce polarizzata.
ca molto simile. La conformazione molecolare è diversa dalla configurazio­
Nel secondo tipo di isomero configurazionale, quattro so­ ne. Essa rappresenta la disposizione spaziale che i gruppi
stituenti diversi legati allo stesso atomo di carbonio tetrae­ funzionali sono liberi di assumere grazie alla libertà di rota­
drico possono essere disposti nello spazio in due modi, cioè zione attorno ai legami singoli senza rompere alcun legame.
hanno due configurazioni. Siamo così in presenza di due In un idrocarburo semplice come Tetano, per esempio, vi è
stereoisomeri con proprietà molto simili o identiche, ma una completa libertà di rotazione attorno al legame C— C.
con diverse caratteristiche fisiche e biologiche. Un atomo Sono quindi possibili conformazioni molto diverse, ma inter-
di carbonio con quattro sostituenti diversi è asimmetrico e convertibili, dell’etano a seconda del grado di rotazione (F i­
viene detto centro chirale (dal greco chinos, “mano”; al­ gura 1.13). Due conformazioni sono di particolare interes-

FIGURA 1.13 • Conformazioni. Sono possibili molte conformazioni dell’etano


a causa della libera rotazione attorno al legame C— C, Nel modello a palle e
bastoncini, quando il carbonio più vicino al lettore e i suoi tre atomi di idrogeno
vengono ruotati rispetto al carbonio più lontano, si ha un aumento dell’energia
potenziale quando la molecola è nella conformazione eclissata (angolo di
torsione 0°, 120° ecc); poi l’energia decresce quando la conformazione diventa
completamente sfalsata (angolo di torsione 60°,180° ecc). Poiché le differenze
energetiche sono sufficientemente piccole da consentire una rapida
interconversione delle due conformazioni (milioni di volte per secondo), la
conformazione eclissata e la conformazione sfalsata non possono essere
separate.
io | CAPITOL01 Fondamenti di biochimica 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4

se: quella sfalsata è più stabile delle altre e quindi è la forma -> Gli organismi trasformano l’energia
predominante; quella eclissata è invece meno stabile. Non è e la materia del loro ambiente
possibile isolare queste due conformazioni perché esse sono Possiamo definire una reazione chimica come un sistema
libere di convertirsi l’una nell’altra. costituito dall’insieme di tutti i reagenti e i prodotti, com­
preso il solvente che li contiene, e l’atmosfera circostante;
-> Le interazioni tra le biomolecole cioè tutto quello che è compreso in una data regione dello
sono stereospecifiche spazio. Il sistema e il suo ambiente circostante costituiscono
Quando le biomolecole interagiscono, vi deve essere una l’universo. Se il sistema non scambia né energia, né materia
corrispondenza strutturale complementare corretta. La con il suo ambiente circostante, è definito come isolato. Se
struttura tridimensionale delle biomolecole, piccole o gran­ il sistema scambia energia, ma non materia, è chiuso. Se
di che siano, cioè la combinazione della conformazione e scambia sia energia che materia è aperto.
della configurazione, è della massima importanza per le loro Gli organismi viventi sono sistemi aperti, poiché scambiano
interazioni biologiche. Lo studio della stereochimica biomo­ sia energia che materia con l’ambiente circostante. Essi rica­
lecolare, che utilizza sofisticati metodi fisici, è una parte im­ vano l’energia dall’ambiente circostante in due modi: ( 1) as­
portante della moderna ricerca sulla struttura della cellula sumono combustibili chimici (come il glucosio) dall’ambiente
e sulle sue funzioni biochimiche. esterno e li ossidano assumendo energia (B ox 1.1) oppure
La stereospecificità, cioè la capacità di distinguere tra gli ( 2) assorbono energia dalla luce solare.
stereoisomeri, è una proprietà delle proteine e una caratte­
ristica peculiare della logica molecolare della cellula.

BOX 1.1 Entropia: i vantaggi di essere disorganizzati

Il termine “entropia” , che letteralmente significa “cambia­


1.8 Fondamenti di fisica mento all’interno” , fu utilizzato per la prima volta nel 1851
da Rudolf Clausius, uno degli studiosi che hanno formulato
Le cellule e gli organismi viventi devono compiere un lavoro la seconda legge della termodinamica. Una rigorosa defini­
per rimanere vivi e per riprodursi. Le reazioni di sintesi che zione quantitativa di entropia coinvolge considerazioni stati­
si svolgono nelle cellule, come i processi di sintesi di una stiche e probabilistiche. Tuttavia, la sua natura può essere
fabbrica, richiedono un apporto di energia. È necessaria dimostrata qualitativamente dall’esempio riportato. I con­
cetti chiave dell’entropia sono la casualità e il disordine,
energia per il movimento di un batterio o per la corsa di un
che si manifestano in modi differenti.
atleta olimpionico, per la luce emessa da uria lucciola o per
la scarica elettrica di un’anguilla. Anche la conservazione e L’ossidazione del glucosio
l’espressione dell’informazione richiedono energia, senza la L’entropia non è solo uno stato di energia ma anche di ma­
quale le strutture ricche di informazione inevitabilmente di­ teria. Gli organismi aerobici estraggono energia libera dal
glucosio che ottengono dai loro ambienti circostanti ossi­
venterebbero disorganizzate e prive di senso.
dandolo con l’0 2, anch’esso ricevuto dall’ambiente. I prodot­
N el corso dell’evoluzione le cellule hanno sviluppato m ec­ ti finali di questo metabolismo ossidativo, C 0 2e H2O i vengo­
canismi altamente efficienti per accoppiare l’energia otte­ no restituiti all’ambiente. In questo processo l’ambiente su­
nuta dalla luce solare con molti processi che consumano bisce un aumento di entropia, mentre l’organismo in se stes­
energia attuati a livello cellulare. Uno degli obiettivi della so rimane in uno stato stazionario e non va incontro a cam­
biamenti nell’ordine interno. Anche se un aumento dell’en­
biochimica è comprendere, in termini quantitativi e chimici,
tropia si origina spesso dalla dissipazione del calore, esso
i meccanismi deputati all’estrazione, all’incanalamento e al può anche derivare da un altro tipo di disordine, rappresen­
consumo dell’energia nelle cellule viventi. Le conversioni tato dalla reazione di ossidazione del glucosio:
energetiche cellulari, come le altre conversioni dell’energia,
C6H i 20 6 + 602---- > 6C0 2 + 6H20
possono essere considerate nel contesto delle leggi della
Possiamo rappresentare schematicamente questi processi:
termodinamica.

7 molecole 12 molecole
-> Gli organismi viventi si trovano in uno stato
stazionario dinamico, mai in equilibrio
con l’ambiente circostante
Anche se la composizione caratteristica di ogni organismo
cambia poco nel tempo, la popolazione delle molecole che
10 compongono non è affatto statica. Le piccole molecole, le
macromolecole e i complessi sopramolecolari vengono con­
tinuamente sintetizzati e demoliti in reazioni che richiedo­ Gli atomi contenuti in una molecola di glucosio più 6 mole­
cole di ossigeno sono dispersi in maniera più disordinata
no un flusso costante di massa e di energia attraverso il si­
dalla reazione di ossidazione e sono ora presenti sotto forma
stema. Il mantenimento di una concentrazione costante è il di 12 molecole (6C 0 2 + 6H20 ).
risultato di uno stato stazionario dinamico, ben lontano Quando una reazione chimica determina un aumento del
dalla condizione di equilibrio. Lo stato stazionario richiede numero di molecole, o quando una sostanza solida è conver­
11continuo apporto di energia e quando una cellula non è più tita in prodotti liquidi o gassosi, che mostrano una maggiore
libertà di movimento molecolare rispetto ai solidi, il disordi­
in grado di produrre energia, muore e comincia a tendere
ne molecolare, e quindi l’entropia, tende ad aumentare.
verso l’equilibrio con l’ambiente circostante.
i 88 08 06413 4 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica 111

FIGURA 1.14 • Alcune interconversioni di energia negli organismi


• Nutrienti nell’ambiente viventi. Durante le trasduzioni metaboliche la casualità del sistema e
(molecole complesse come dell’ambiente (espressa quantitativamente come entropia) aumenta se l’energia
Energia potenziale
zuccheri e grassi) potenziale delle molecole nutrienti complesse tende a diminuire, (a) Gli
• Luce solare organismi viventi ricavano l’energia dall'ambiente; (b) ne convertono una parte
In una forma capace di produrre lavoro; (c) ne restituiscono una parte
(a ) all’ambiente sotto forma di calore; (d) rilasciano prodotti finali meno organizzati
di quelli di partenza, generando un aumento dell’entropia dell’universo. Uno
Trasformazioni chimici«! degli effetti di queste trasformazioni è (e) un aumento dell’ordine (una diminuita
all’interno della cellula casualità) del sistema dovuto alla formazione di macromolecole complesse.
Torneremo a un'analisi quantitativa dell’entropia nel Capitolo 13.
La trasduzione
Lavoro cellulare:
energetica
• sintesi chimiche
porta anche
• lavoro meccanico uri
alla produzione
• gradienti osmotici ed elettrici
di lavoro • produzione di luce
• trasferimento dette infom ariom
genetiche
ricchi di energia e trasferendo poi gli elettroni all’0 2 atmo­
(b )
sferico per formare acqua, C 0 2 ed altri prodotti terminali
Calore che saranno poi riciclati nell’ambiente:

(c) C6H i 20 6 + 0 2----->6C02 + 6H20 + energia


Aumento della casualità (ossidazione del glucosio che rende energia)
(entropia) nell’ambiente
Quindi gli organismi fotosintetici e non fotosintetici parte­
Il metabolismo produce composti
più semplici delle molecole iniziali cipano al ciclo globale delT0 2 e della C02, che rende questi
di combustibile: C02) NH8, due grandi gruppi di organismi interdipendenti. Praticamen­
; H20, H?O f" '■ te tutte le trasduzioni energetiche cellulari dipendono da un

(d) flusso di elettroni “in discesa” da una molecola all’altra, pas­


sando da un potenziale elettrochimico maggiore ad un po­
Diminuzione della casualità tenziale minore. Formalmente, questo meccanismo è simi­
(entropia) nel sistèma
le al flusso elettronico in un circuito elettrico alimentato da
I composti semplici polimerizzano una batteria. Tutte le reazioni che comportano un flusso di
formando macromolecole ricche elettroni sono reazioni di ossidoriduzione: un reagente
di informazioni: DNà ) BtÌA, _
si ossida (perde elettroni), mentre un altro si riduce (acqui­
proteine
sta elettroni).
(e ) La casualità, 0 disordine, dei componenti di un sistema chi­
mico viene espressa come entropia, S (B ox 1.1). Qualun­
que variazione del disordine del sistema viene espressa
come variazione di entropia, AS, che per convenzione ha un
Il primo principio della termodinamica riguarda la conserva­
valore positivo quando il disordine aumenta. J. Willard
zione dell’energia: in ogni processo chim ico o fisico la
Gibbs, ha sviluppato la teoria sulle variazioni energetiche
quantità totale di energia dell’universo rimane costante,
che avvengono durante le rea­
anche se le form e in cu i si presenta l’energia possono
zioni chimiche, dimostrando
cambiare. Le cellule sono eccellenti trasduttori di energia, in
che il contenuto di energia
grado di interconvertire l’energia chimica, elettromagnetica,
libera, G, di un sistema chiuso
meccanica e osmotica con grande efficienza (Figura 1.14).
può essere definito da tre ter­
mini quantitativi: l’entalpia, H,
Il flusso degli elettroni fornisce energia
che riflette il numero e il tipo di
agli organismi
legami; l ’entropia (S ), e la tem­
Quasi tutti gli organismi viventi traggono la loro energia, di­
peratura assoluta, T (in gradi
rettamente o indirettamente, dalla luce solare. La scissione
Kelvin). La definizione del­
dell’acqua favorita dalla luce durante la fotosintesi rilascia
l’energia libera è G = H - TS.
elettroni necessari per la riduzione della CO2e per il rilascio
Quando una reazione avviene a j Wi||ard Gjbbs 1839_1903
dell’ex nell’atmosfera:
temperatura costante, la varia­
luce zione di energia libera, AG, è determinata dalla variazio­
ne di entalpia, A H, che riguarda il tipo e il numero di legami
6C0 2 + 6H20 ----- > C6H 120 2 + 602 chimici e di interazioni non covalenti che si formano e si
(riduzione della C0 2 favorita dalla luce) rompono, e dalla variazione di entropia, A S, che descrive la
variazione del disordine del sistema:
Le cellule e gli organismi non fotosintetici ricavano l’energia
di cui hanno bisogno ossidando i prodotti della fotosintesi AG = A # - TAS
i ; ' I CAPITOL01 Fondamenti di biochimica © 978-88-0Í '6413 4

dove, per definizione, AH ha un valore negativo per una Come si può applicare questo esempio alle reazioni chimi­
reazione che libera calore, e AS ha un valore positivo per che? Le reazioni chimiche nei sistemi chiusi procedono
un reazione che provoca un aumento del disordine del si­ spontaneamente fino a che non raggiungono l’equilibrio.
stema. Quando un sistema è all’equilibrio, la velocità di formazione
Un processo tende ad avvenire spontaneamente solo se il dei prodotti diventa uguale a quella con cui i prodotti stessi
AG è negativo (cioè se viene rilasciata energia libera du­ si riconvertono nei reagenti. Non vi è quindi una variazione
rante il processo). Per favorire lo svolgimento delle reazioni netta nella concentrazione di reagenti e prodotti. La varia­
termodinamicamente sfavorite, che cioè richiedono energia zione di energia che si ha quando il sistema passa dallo stato
(reazioni endoergoniche), la cellula deve accoppiarle ad iniziale a quello di equilibrio, in condizioni di pressione e
altre reazioni che liberano energia (reazioni esoergoni- temperatura costanti, è data dalla variazione di energia libe­
che), in modo che Tintero processo sia esoergonico: la ra, AG. Il valore di AG dipende dalla natura della reazione
somma delle variazioni di energia libera deve essere negati­ chimica e da quanto il sistema allo stato iniziale si trova
va. lontano dalla condizione d i equilibrio. Ogni composto
Grazie a questa strategia di accoppiamento, le cellule pos­ coinvolto in ima reazione chimica contiene una certa quan­
sono sintetizzare e mantenere stabili i composti ricchi di in­ tità di energia potenziale, dovuta al numero e al tipo di lega­
formazioni, indispensabili per la vita. mi chimici presenti. Nelle reazioni che avvengono sponta­
neamente, i prodotti possiedono meno energia libera rispet­
-> L’accoppiamento energetico unisce le reazioni to ai reagenti e quindi la reazione rilascia energia libera, che
biologiche tra loro diventa disponibile e utile per produrre un lavoro. Le rea­
Il punto centrale della bioenergetica (lo studio delle tra­ zioni di questo tipo sono dette esoergoniche; la diminuzio­
sformazioni dell’energia nei sistemi viventi) è di capire come ne di energia libera che si verifica quando i reagenti sono
l’energia derivata dai combustibili metabolici o dalla cattu­ convertiti in prodotti viene espressa con valori negativi. Le
ra della luce solare viene accoppiata alle reazioni che richie­ reazioni endoergoniche richiedono un apporto di energia e i
dono energia. Per meglio comprendere l’accoppiamento di loro valori di AG sdito positivi. Come accade nei processi
energia potenziale considereremo un semplice esempio meccanici, solo una parte dell’energia rilasciata da un siste­
meccanico, come mostrato nella Figura 1.15. Un oggetto ma esoergonico può essere impiegata per produrre un lavo­
posto alla sommità di un piano inclinato possiede una certa ro. Anche nei sistemi viventi una parte dell’energia viene
quantità di energia potenziale che dipende dall’altezza della dissipata sotto forma di calore oppure perduta, con conse­
sua posizione. Esso tende a scivolare verso il basso lungo il guente aumento dell’entropia.
piano, perdendo l’energia potenziale. Quando un appropria­ Negli organismi viventi, come nell’esempio meccanico nella
to dispositivo munito di spago e puleggia accoppia l’oggetto Figura 1.15, una reazione esoergonica può essere accoppia­
che scende ad un altro più piccolo, il moto spontaneo verso ta ad una reazione endoergonica, in modo da portare avanti
il basso può spingere verso l’alto l’oggetto più piccolo, svol­ reazioni altrimenti sfavorite.
gendo una certa quantità di lavoro. La quantità di energia L’accoppiamento di reazioni esoergoniche ed endoergoni­
immediatamente disponibile per produrre un lavoro è la va­ che tramite un intermedio comune è di fondamentale im­
riazione di energia libera, AG; questa sarà sempre infe­ portanza per gli scàmbi energetici nei sistemi viventi.
riore alla quantità teorica di energia rilasciata, in quanto una
parte viene dissipata come calore liberato dall’attrito tra og­
-> La Kgq e il A G° indicano la tendenza di una reazione
getto e piano.
a procedere spontaneamente
La tendenza di una reazione chimica ad andare a compimen­
to può essere espressa dalla sua costante di equilibrio. Per la
Esempio meccanico reazione di trasformazione di a moli di A e b moli di B in c
moli di C e d moli di D,

aA + b B ---- > cC + dD

la costante di equilibrio, K eq, è data da

_ [C] eq [D] eq

Ksq~ [A] |q [B] eq

dove [A]eq è la concentrazione di A, [B]eqè la concentrazione


di B, e così via, quando il sistema ha raggiunto l’equili­
' Endoergonico Esoergonico HB brio. Un valore elevato della K eq significa che la reazione
tende a procedere fino a che i reagenti sono quasi compieta-

FIGURA 1.16 • Accoppiamento energetico di tipo meccanico. Il moto mente trasformati in prodotti.
verso II basso di un oggetto rilascia energia potenziale che può generare un Gibbs dimostrò che il valore del AG (la variazione di ener­
lavoro meccanico. L'energìa potenziale resa disponibile dal moto spontaneo gia libera) per ogni reazione chimica è una funzione della
verso il basso, un processo esoergonico (parte in rosa), può essere accoppiata
al movimento verso l'alto di un altro oggetto, un processo endoergonico (parte variazione di energia libera standard, AG° - una co­
in azzurro). stante caratteristica di ogni specifica reazione - ed anche un
© 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica

termine che esprime le concentrazioni iniziali dei reagenti e


dei prodotti:

(l1)
[A] f [B]}>
dove [A]j è la concentrazione iniziale di A, e così via; R è la
costante dei gas; e r i a temperatura assoluta.
AG è una misura di quanto un sistema è lontano dalla posi­
zione di equilibrio. Quando la reazione ha raggiunto l’equi-
librio, non vi è più energia associata, e non può essere svol­
to alcun lavoro: AG = 0. Per questo caso speciale [A]i =
[A]eq, e così via, per i reagenti e per i prodotti, e

[C] T [D] i [C]eq [D]gq


[Air [B]!' [A]eq [B]gq FIGURA 1.16 • Variazioni energetiche di una reazione chimica.
L’elevata barriera di attivazione, che rappresenta lo stato di transizione (vedi il
Sostituendo 0 con A G e K eq con [C]f [D]?/ [A]f [B f nell’equa­ Capitolo 6), deve essere superata per la conversione dei reagenti A nei
zione 1.1, si ottiene la relazione prodotti B, anche se i prodotti sono più stabili dei reagenti, come indica l’alto
valore negativo delia variazione di energia libera (AG). L’energia necessaria
AG“ = - R T In K,,tl per superare la barriera di attivazione viene detta energia di attivazione (AG ).
Gli enzimi catalizzano le reazioni abbassando la barriera di attivazione. Essi
da cui si può vedere che AG° è semplicemente un secondo legano saldamente gli intermedi che si formano in corrispondenza dello stato
di transizione, e l’energia di legame di questa interazione riduce l’energia di
modo (oltre alla Keq) di indicare la forza trainante di una
attivazione da AGtnon cat (curva blu) a AG*cat (curva rossa). (Si noti che
reazione. Poiché Keq è misurabile sperimentalmente, abbia­ l’energia di attivazione non è correlata alla variazione di energia libera della
mo a disposizione un modo di determinare anche AG0, la co­ reazione, AG.)
stante termodinamica caratteristica di ogni reazione.
AG e AG0 si misurano in joule per mole (o in calorie per
m ole). Quando Keq» 1, il valore di AG 0 è fortemente nega­ zione rappresenta lo stato di transizione, e la differenza tra
tivo; quando Keq « 1, il valore di AG° è fortemente positi­ l’energia del reagente nel suo stato basale e nello stato di
vo. Conoscendo i valori misurati sperimentalmente di Keq o transizione è l’energia di attivazione AG*. Un enzima
di AG 0, si potrà stabilire quali reazioni tendono ad andare a catalizza una reazione in quanto ha un sito in cui adattare
compimento e quali no. in modo idoneo lo stato di transizione, cioè una regione
Bisogna però tenere presente che le costanti termodinami­ che si unisce allo stato di transizione sfruttando stereochi­
che come AG° indicano come procede una reazione per rag­ mica, polarità e carica. Il legame dell’enzima allo stato di
giungere il suo equilibrio, ma non dicono nulla sul tempo ri­ transizione è esoergonico, e l’energia rilasciata da questo
chiesto per raggiungerlo. La velocità delle reazioni è deter­ legame riduce l’energia di attivazione della reazione e au­
minata dai parametri della cinetica, che sarà trattata in det­ menta fortem ente la velocità della reazione. Un altro con­
taglio nel Capitolo 6. tributo alla catalisi si ha quando due o più reagenti si lega­
no alla superficie dell’enzima vicini gli uni agli altri e con
-> Gli enzimi promuovono sequenze orientamenti stereospecifici che favoriscono la reazione.
di reazioni chimiche Questa situazione aumenta di alcuni ordini di grandezza la
Tutte le macromolecole sono termodinamicamente molto probabilità di collisioni produttive fra i reagenti. Come ri­
meno stabili rispetto alle subunità monomeriche, ma sono sultato di questi fattori e di molti altri (ved i il Capitolo 6) ,
ugualmente cineticamente stabili; la loro demolizione non le reazioni catalizzate dagli enzimi procedono comunemen­
catalizzata avviene così lentamente (più anni che secondi) te ad una velocità IO 12volte superiore rispetto alle reazio­
che, in una scala temporale valida per l’organismo, queste ni non catalizzate (cioè ad una velocità un m ilione di m i­
molecole sono stabili. Praticamente ogni reazione chimica lio n i di volte superiore!).
in una cellula avviene ad una velocità significativa solo in Le migliaia di reazioni catalizzate da enzimi che avvengono
presenza di enzimi, biocatalizzatori che, come tutti gli altri nelle cellule sono organizzate in molte sequenze di reazioni
catalizzatori, aumentano la velocità di specifiche reazioni consecutive, dette vie metaboliche, in cui il prodotto di
chimiche senza essere consumati nel processo. una reazione diventa il reagente di quella successiva. Alcu­
La via di conversione del reagente (o dei reagenti) in pro­ ne vie degradano i nutrienti organici in prodotti finali sem­
dotto (o prodotti) quasi invariabilmente coinvolge una bar­ plici al fine di estrarre energia chimica e convertirla in una
riera energetica, chiamata energia di attivazione (Figura forma utilizzabile dalla cellula. Nel loro insieme queste rea­
1.16), che deve essere superata affinché la reazione possa zioni degradative che liberano energia sono definite cata­
procedere. La rottura di legami esistenti e la formazione di bolismo. Altre vie iniziano con piccole molecole precurso­
nuovi richiede generalmente per prima cosa la distorsione ri che sono convertite in m olecole progressivamente più
dei legami e la creazione di uno stato di transizione con grandi e complesse, tra cui le proteine e gli acidi nucleici.
una energia libera più elevata rispetto ai reagenti e ai pro­ Tali vie sintetiche richiedono un apporto di energia e sono
dotti. Il punto più alto nel grafico della coordinata di rea- complessivamente definite anabolismo. L’intero insieme
141 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica ©978-88-08-06413-4

delle vie catalizzate da enzimi costituisce il metabolismo filamento opposto. Prima che una cellula si divida i due fila­
cellulare. Le vie costituite da reazioni catalizzate enzimati­ menti di DNA si separano e ogni catena serve da stampo per
camente che coinvolgono molti componenti cellulari, come la sintesi di un nuovo filamento complementare, generando
proteine, grassi, zuccheri e acidi nucleici, sono praticamen­ due molecole a doppia elica identiche, una per ogni cellula
te identiche in tutti gli organismi viventi. figlia. Se un filamento è danneggiato la continuità dell’infor­
mazione è assicurata dall’informazione presente sull’altro fi­
lamento, che agisce come stampo per la riparazione del
danno.
i .4 Fondamenti di genetica
Tra le scoperte fondamentali in campo biologico nel vente­
simo secolo vi è sicuramente la definizione della natura chi­
mica e della struttura tridimensionale del materiale geneti­
co, l’acido deossiribonucleico o DNA. La sequenza delle
subunità monomeriche, i nucleotidi (più precisamente i de-
ossiribonucleotidi, come vedremo più avanti), di questo po­
limero lineare contiene le istruzioni per formare tutti gli
altri componenti cellulari e fornisce uno stampo per la pro­
duzione di altre molecole di D N A identiche da distribuire
alla progenie quando la cellula si divide. Per la perpetuazio­
ne di una specie biologica è necessario che la sua informa­
zione genetica sia mantenuta in una form a stabile, sia
espressa accuratamente nella forma di prodotti genici e sia
riprodotta con il minimo di errori. L’immagazzinamento,
l’espressione e la riproduzione del messaggio genetico sono
proprietà caratteristiche delle singole specie, che le distin­
guono le une dalle altre ed assicurano la loro continuità per
generazioni successive.

-> La continuità genetica dipende da singole molecole


di DNA
Il DNA è un lungo, sottile polimero organico, una strana mo­
lecola il cui diametro ha dimensioni atomiche e una lunghez­
za che può essere di molti centimetri. Lo sperma umano o
l’uovo, che contengono le informazioni ereditarie elaborate
in miliardi di anni di evoluzione, trasmettono questa eredità
sotto forma di molecole di D NA in cui la sequenza lineare
delle subunità nucleotidiche legate covalentemente codifi­
ca il messaggio genetico.
Uno spermatozoo umano fornisce all’uovo che feconda solo
una molecola di DNA per ognuno dei 23 cromosomi diversi,
che si combina con una sola molecola di DNA di ogni cromo­
soma corrispondente dell’uovo. Il risultato di questa unione è
facilmente prevedibile: un embrione intatto con tutti i suoi
~25 000 geni, costituiti da 3 miliardi di coppie di nucleotidi
intatti.

-> La struttura del DNA consente la sua replicazione


e la sua riparazione con fedeltà quasi assoluta
FIGURA 1.17 • Complementarità delle due catene del DNA.
La capacità delle cellule viventi di preservare il proprio ma­ Il DNA è un polimero lineare costituito da quattro tipi di deossiribonucleotidi
teriale genetico e di duplicarlo per generazioni successive è diversi: deossladenllato (A); deosslguanilato (G); deosslcltldllato (C) e
il risultato della complementarità strutturale tra le due metà deossltlmldllato (T), uniti tra loro da legami covalenti. Ogni nucleotlde, con la sua
peculiare struttura tridimensionale, può associarsi specificamente, ma In modo
della molecola di DN A (Figura 1.17). L’unità di base del non covalente, con un altro nucleotlde della catena complementare: A si associa
DNA è un polimero lineare con quattro diverse subunità mo­ sempre con T, e G con C. Quindi, nella molecola a doppia elica del DNA, la
nomeriche, i deossiribon u cleotidi, organizzati in una spe­ sequenza del nucleotidi In una catena è complementare alla sequenza dell’altra
catena. Le due catene del DNA, tenute Insieme da un gran numero di legami
cifica sequenza lineare. È questa sequenza lineare che con­ Idrogeno (rappresentati dalle linee verticali blu) tra le coppie di nucleotidi
tiene l’informazione genetica. Due di questi filamenti sono complementari, si avvolgono luna sull'altra, formando la doppia elica tipica del
avvolti a spirale l’uno sull’altro a formare la doppia elica ti­ DNA, Nella replicazione del DNA le due catene (In blu) si separano e vengono
sintetizzate due nuove catene, ciascuna con una sequenza complementare a
pica del DNA in cui ogni deossiribonucleotide di un filamen­ una delle catene del filamento originario. Il risultato è la formazione di due
to si appaia con il deossiribonucleotide complementare sul molecole a doppia elica esattamente uguali fra loro e al DNA originarlo.
© 978-^6^08-06413-4 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica |

-» La sequenza lineare del DNA codifica proteine 1.5 Fondamenti di biologia dell’evoluzione
con strutture tridimensionali
Niente in biologia ha senso, se non alla luce dell’evoluzione.
L’informazione nel DNA è codificata dalla sua sequenza li­
Theodosius Dobzhansky, L ’insegnante americano
neare (unidimensionale) di subunità deossiribonucleotidi-
di biologia, marzo 1973
che, ma l’espressione dell’informazione ha come risultato
una cellula tridimensionale. Questo cambiamento da una a I progressi della biochimica e della biologia molecolare degli
tre dimensioni avviene in due fasi. Una sequenza lineare di ultimi decenni hanno confermato la validità dell’affermazio­
deossiribonucleotidi nel D N A codifica (attraverso l’inter­ ne di Dobzhansky. La notevole somiglianza delle vie meta­
m edio R N A ) la produzione di proteine costituite da una boliche delle sequenze geniche lungo i phyla è a favore del­
corrispondente sequenza lineare di amminoacidi (Figura l’ipotesi che gli organismi attuali discendano da un comune
1. 18). progenitore attraversò una serie di piccoli cambiamenti
Le proteine si ripiegano in una particolare forma tridimen­ (mutazioni), ciascuno dei quali conferisce un vantaggio se­
sionale, determinata dalla loro sequenza amminoacidica sta­ lettivo ad alcuni organismi in nicchie ecologiche particolari.
bilizzata principalmente mediante interazioni non covalenti.
La struttura tridimensionale, o conformazione nativa, -> Variazioni nelle istruzioni ereditarie
della proteina è cruciale per la sua funzione. sono alla base dell’evoluzione
Una volta raggiunta la conformazione nativa, una proteina Nonostante la fedeltà quasi perfetta della replicazione g e ­
può associarsi con legami non covalenti ad altre proteine, netica, vengono commessi errori, anche se poco frequenti,
con acidi nucleici o lipidi per formare complessi sopramole­ che provocano variazioni della sequenza nucleotidica del
colari come i cromosomi, i ribosomi e le membrane. Le mo­ DNA, generando mutazioni genetiche e modificazioni nelle
lecole singole che compongono questi complessi hanno istruzioni per la sintesi di un componente cellulare. Un qual­
specifici siti di legame ad alta affinità l’uno per l’altro; all’in­ siasi danno in una delle due catene del DNA, se non ripara­
terno della cellula queste strutture si formano spontanea­ to correttamente, provoca lo stesso effetto. Mutazioni del
mente. DNA trasmesse ai discendenti, cioè mutazioni presenti nelle
cellule deputate alla riproduzione, possono essere dannose,
0 anche letali, per il nuovo organismo o per la nuova cellu­
Gene dell’esochinasi la. Occasionalmente, però, una mutazione m igliora le ca­
DNA i ratteristiche dell’organismo o della cellula. La cellula muta­

1
ta e la sua progenie possono sopravvivere meglio nel loro
trascrizione del DNA
ambiente rispetto alle cellule che non hanno subito muta­
in RNA complementare
zione (tipo selvatico). Questo è ciò che Darwin intendeva
per “sopravvivenza del migliore sotto la pressione selettiva” :
RNA messaggero
K j il processo di selezione naturale.
Nel corso dell’evoluzione molte mutazioni probabilmente

i
traduzione dell’RNA
in una catena polipeptidica sono state cancellate o modificate. Ma il DNA rimane la
sui ribosomi fonte migliore a nostra disposizione per leggere la lunga sto­
ria della biologia. La frequenza degli errori nella duplicazio­
Bsochinasi ne del D NA rappresenta un compromesso tra un numero
svolta eccessivo di errori, che produrrebbe cellule figlie non vitali,
e un numero troppo basso di errori, che impedirebbe quella
avvolgimento della catena variazione genetica che permette la sopravvivenza di cellu­
polipeptidica nella struttura
nativa dell’esochinasi le mutanti in nuove nicchie ecologiche.
Le variazioni genetiche casuali negli individui di una deter­
minata popolazione, insieme con la selezione naturale,
hanno prodotto nel corso dell’evoluzione un’enorme varie­
tà di organismi, ciascuno idoneo a vivere nella sua particola­
Esochinasi re nicchia ecologica.
cataliticamente
attiva
-> Le biomolecole si sono formate per evoluzione chimica
Nella nostra breve trattazione sulla cellula non abbiamo fin
qui preso in considerazione quello che potremmo conside­
rare il primo capitolo della storia dell’evoluzione: la compar­
FIGURA 1.18 * Dal DNA all’RNA alla proteina all’enzima (esochinasi). sa della prima cellula vivente. A l di fuori della loro presenza
Una sequenza lineare dei deossiribonucleotidi del DNA (il gene) che codifica la negli organismi viventi, i composti organici, come gli ammi­
proteina esochinasi viene prima trascritta in una molecola di acido ribonucleico
(RNA) con una sequenza complementare dì ribonucleotidi. La sequenza dell’RNA noacidi e i carboidrati, sono presenti solo in tracce sulla cro­
(RNA messaggero) viene quindi tradotta nella catena lineare dell’esochinasi, che sta terrestre, nel mare e nell’atmosfera. Come hanno potuto
si avvolge nella sua forma nativa tridimensionale, molto probabilmente con 1primi organismi viventi acquisire le loro caratteristiche
l'aiuto di molecole di chaperonine. Una volta nella sua forma nativa, l’esochinasi
acquista la sua attività catalitica, la fosforilazione del glucosio, usando l’ATP unità costitutive? Secondo una ipotesi, questi composti si
come donatore del gruppo fosforico, sono formati sotto la spinta di potenti forze atmosferiche -
1 6 1 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica ©978-88-08-06413-4

Elettrodi e la riparazione degli acidi nucleici. La mutua dipendenza


tra queste due classi di biomolecole pone una domanda che
ci lascia perplessi: chi venne prima, il DNA o le proteine?
La risposta più probabile è che essi siano apparsi circa nello
stesso momento, ma che l’RN A abbia preceduto entrambi.
La scoperta che le molecole di RNA potevano agire da cata­
lizzatori nelle reazioni implicate nella loro stessa formazio­
ne suggerisce che l’RNA, 0 una molecola simile, possa esse­
re stato il primo gene e al tempo stesso il primo catalizzato-
re. In base a questo nuovo scenario (Figura 1.20), la prima
tappa dell’evoluzione biologica fu la formazione casuale nel
“brodo primordiale” di una molecola di*RNA che aveva la ca­
pacità di catalizzare la formazione di altre molecole di RNA
con la stessa sequenza: una molecola di RNA autoreplicante.
Una m olecola con queste proprietà si può accumulare in
modo esponenziale, in quanto una molecola ne forma due
nuove, due ne formano quattro e così via. La fedeltà dell’au-
toreplicazione era probabilmente tutt’altro che perfetta, e
quindi il processo produceva m olecole di RNA varianti, al­
cune delle quali avrebbero potuto essere in grado di autore-
plicarsi meglio. Nella competizione per i nucleotidi liberi, le
m olecole più efficienti nell’autoreplicarsi avranno avuto 0
sopravvento su quelle meno efficienti, con il risultato di farle
scomparire dalla popolazione totale.
La divisione delle funzioni fra DNA (conservazione dell’in­
FIGURA 1.18 • Produzione abiotica di biomolecole. Apparecchio che formazione genetica) e proteine (catalisi) fu il risultato di
produce scariche elettriche del tipo di quello usato da Miller e Urey nei loro
esperimenti che dimostrarono la possibilità di formazione di composti organici
nelle condizioni atmosferiche primitive. Dopo aver sottoposto a scariche
Formazione del brodo prebiotico,
elettriche la miscela gassosa contenuta nell’apparecchio, i prodotti sono stati
comprendente i nucleotidi, dai componenti
raccolti per condensazione. Tra le biomolecole prodotte vi erano anche degli
dell’atmosfera primordiale della Terra
amminoacidi,

1
Produzione di piccole molecole di RNA
con una sequenza casuale
radiazioni ultraviolette, scariche elettriche, o eruzioni vul­
caniche - sui gas presenti nell’atmosfera terrestre prebioti­ 1
ca, oppure sui soluti inorganici delle correnti profonde ocea­ Replicazione selettiva di segmenti di RNA

I
niche superriscaldate. catalitici in grado di autoreplicarsi
Questa ipotesi è stata sottoposta a verifica in un classico
esperimento sull’origine abiotica (non biologica) della vita,
Sintesi di peptidi specifici
condotto nel 1953 da Stanley Miller nel laboratorio di Harold catalizzata daH’RNA
Urey. Miller sottopose miscele gassose come quelle presu­
mibilmente presenti sulla Terra in era prebiotica, contenen­
ti NH3, CH4, H20, e H2, a scariche elettriche prodotte da una Sempre maggiore importanza
coppia di elettrodi (per simulare i fulmini) per periodi di una dei peptidi nella replicazione deH’RNA;
coevoluzione di RNA e proteine
settimana o più, quindi analizzò il contenuto del recipiente
in cui era avvenuta la reazione (Figura 1.19). La fase gasso­
sa della miscela risultante conteneva CO e C 02, insieme con
Sviluppo di un primitivo sistema ;
i composti di partenza. La fase acquosa conteneva ima serie di traduzione, con un genoma a RNA,

::r:....
di composti organici, inclusi alcuni amminoacidi, acidi ossi- e RNA e proteine con»! catalizzatori
drilici, aldeidi e acido cianidrico (H C N). Questo esperimen­
to dimostrò la possibilità di produzione abiotica di biomole­
L’RNA genomico inizia ad essere copiato
cole in tempi relativamente brevi e in condizioni relativa­
sotto forma di DNA
mente blande.

Le molecole di RNA 0 i loro precursori potrebbero


essere stati i primi geni e i primi catalizzatori
Negli organismi attuali gli acidi nucleici contengono le infor­
mazioni genetiche che specificano le strutture degli enzimi,
e gli enzimi hanno la capacità di catalizzare la replicazione FIGURA 1.20 • Un possibile scenario di “mondo a RNA”.
i:©978^88-08epè4Ì3^4;^ CAPITOL01 Fondamenti di biochimica 117

un’evoluzione successiva, sempre in base all’ipotesi di un o


primo “mondo a R N A ”. Si svilupparono nuove molecole di I>iversiflca^qÌTi^?. là'ég^.’èud^feCóti
RN A in grado di autoreplicarsi e con la capacità di cataliz­ 500
_ muMcelhilm^ilSV®
zare la condensazione di amminoacidi in peptidi. In taluni (piante,

casi il peptide o i peptidi formati rinforzavano il potere au­


_ Alghe rosse
1000
toreplicante delle m olecole di RN A e le coppie così gene­
Bndosimbionti:'(rrtitqeqi®
rate - molecola di RN A e peptide di supporto - poterono
andare incontro ad altre modificazioni nelle loro sequen­ 1500 -,Protìsti,iprirrifétìcàfiqtiì
ze fino a produrre un sistema molto più efficiente. La re­
cente scoperta che nel macchinario di sintesi proteica
delle cellule attuali (i ribosomi) sono le molecole di RNA, e | 2000

non le proteine, a catalizzare la formazione dei legami pep-


tidici è sicuramente in accordo con l’ipotesi dell’esistenza | 2500 — Batteri aerobiriUì|:LL;ììtv(l:|i
di un mondo a RNA. Qualche tem po dopo questa prima : Sviluppo 02
evoluzione di un primitivo sistema di sintesi delle protei­
3000
ne vi fu un ulteriore impulso: le molecole di DN A con una
Cianobatteri fotóSifitéiicì;
sequenza complementare a quella delle m olecole di RNA
che producono S p ìL llL
autoreplicanti assunsero la funzione di conservatori del­ 3500 — Solfobatterì fotQàffiteÌ|ci)
l’informazione “genetica” , e le m olecole di RN A si adatta­ . ■ Metanogeni . W (M ì̧i
rono meglio alla sintesi delle proteine. Le proteine si rive­
4000 _ Formazione degliiìbéàhii
larono catalizzatori particolarm ente versatili, e con il e dei continenti
tempo perfezionarono questa funzione. I composti simili
ai lipidi presenti nel brodo primordiale formarono strati 4500 - Formazione denaLrertàM':
relativamente impermeabili che circondavano gli insiemi
di m olecole autoreplicanti. La concentrazione di proteine
e di acidi nucleici racchiusi in queste sacche lipidiche fa­ FIGURA 1.21 • Pietre miliari dell’evoluzione della vita sulla Terra.
vorì l’interazione fra le m olecole necessaria per un siste­
ma autoreplicante.
-> L’anatomia molecolare rivela
Le cellule eucariotiche si sono evolute le relazioni evolutive
da precursori più semplici in diverse tappe I biochimici hanno oggi a disposizione una messe di infor­
A partire da 1,5 miliardi di anni fa, nei reperti fossili si comin­ mazioni sull’anatomia molecolare delle cellule, che posso­
ciano a mettere in evidenza differenti organismi grandi e com­ no utilizzare per analizzare le relazioni evolutive perfezio­
plessi, probabilmente le cellule eucariotiche più primitive (Fi­ nandone la teoria. Le sequenze dei genomi, i patrimoni
gura 1.21). genetici completi degli organismi, sono state determinate
Affinché i procarioti potessero dare origine agli eucarioti per centinaia di organismi (Tabella 1.2). Disponendo di
dovettero avvenire tre grandi cambiamenti. Primo, appena tali sequenze, si possono chiarire i processi evolutivi m e­
la cellula acquisì più D N A divennero più elaborati i mecca­ diante un confronto dettagliato e quantitativo tra specie
nismi capaci di ripiegarlo e compattarlo in complessi di­ diverse.
screti insieme a specifiche proteine, e di ripartirlo durante Quando due geni possiedono sequenze comuni (sequenze
la divisione cellulare in parti assolutamente uguali fra le cel­ nucleotidiche nel D N A o amminoacidiche nelle proteine co­
lule figlie. Per questo furono necessarie proteine capaci di dificate) , queste sequenze vengono dette omologhe e le
stabilizzare il ripiegamento del D N A e di separare i com­ proteine codificate prendono il nome di omologhi. Se due
plessi DNA-proteina ( cromosomi) durante la divisione cel­ geni omologhi sono presenti nella stessa specie, si dicono
lulare. Secondo, quando le cellule aumentarono di dimen­ geni paraloghi e i loro prodotti proteici prendono il nome di
sioni si sviluppò un sistema di membrane intracellulari, paraloghi. Si pensa che i geni paraloghi siano derivati da
compresa una doppia membrana attorno al DNA; questa ima duplicazione genica, seguita da una graduale variazione
membrana separò il processo nucleare di sintesi dell’RNA, di sequenza in ambedue le copie. Le proteine paraloghe si
che utilizza il DNA come stampo, dai processi citoplasma­ somigliano non solo per la sequenza, ma anche per la strut­
tici di sintesi delle proteine, che avvengono sui ribosomi. tura tridimensionale, anche se possono avere acquisito fun­
Infine, le cellule eucariotiche prim itive che non erano in zioni diverse durante il processo evolutivo. Due geni (o pro­
grado di compiere la fotosintesi o di utilizzare l’ossigeno teine) omologhi che si trovano in due specie diverse si di­
come ossidante generarono con batteri fotosintetici o bat­ cono geni (o proteine) ortoioghi, e i loro prodotti prendo­
teri aerobici un’associazione e n d o sim b io tic a che divenne no il nome di ortologhi. Un genoma annotato contiene,
poi permanente. Alcuni batteri aerobici diedero origine ai oltre alla sequenza del DNA, anche una descrizione delle
mitocondri degli eucarioti attuali, mentre alcuni cianobatte- probabili funzioni dei prodotti genici, dedotte tramite il
ri fotosintetici divennero plastidi, come i cloroplasti delle confronto con sequenze genomiche a cui corrispondono
alghe verdi, i precursori più simili ai cloroplasti delle cellu­ funzioni proteiche note. Talvolta, attraverso l’identificazio­
le vegetali. ne di una via metabolica (una serie di enzimi) codificata da
1 8 1 CAPiïOLOI Fondamenti di biochimica i© 9 7 S Ä Ö S ;0 0 # 1 3 - 4

Alcuni organismi i cui genomi sono stati completamente sequenziati


Dimensione del genoma Numero
Organismo (coppie, di nucleotidi) di geni Interesse biologico

Mycoplasma genitalium 5,8X 10B 4,8 X 10a Il più piccolo organismo


Treponema pallidum : ; : i,i x io6 1,0X IO3 Causa la sifilide
Borrelia burgdorferi : 9,i x io5 8,5 X IO2 Causa la malattia di Lyme
Helicobacter pylori 1,7X IO6 1,6X IO3 Causa ulcere gastriche
Methanococcus jannaschii ; 1,7x IO6 1,7X IO3 Archea; cresce a 85°CI
Haemophilus influenzae ■ 1,8X' 1,6X IO3 Causa l’influenza batterica
Archaeoglobusfulgidus* :; ( : : 2,2 X io6 2,4 X IO3 Metaiiogeno ad alta temperatura
Synechocystis sp. : : : 3,6 X IO6 3,2 X IO3: X Cianobatterio
Bacillus subtilis 4,2X IO6 4,1 X IO3 Un comune batterio del terreno
Escherichia coli : 4,6X10® 4,4 X IO3 Alcuni ceppi sono patògeni per l’uomo
Saccharomyces cerevisiae 1,2X IO7 5,9X IO3 Eucariote unicellulare : .
Plasmodiumfalciparum 2,3 X IO7 5,3 X IO3 Causa la malaria ,
Caenorhabditis elegans 1,0 X IO8 2,3 x io4 : : Un verme cilindrico multicellulare
Anopheles gambiae . , y 2,3 X IO8 1,3X IO4 Vettore della malaria :
Arabidopsis thaliana 1,2X IO8 3,2 x io4 : ; Modello di pianta
Oryza saliva : . x ' X 3,9 X IO8 3,8X IO4 Riso
Drosophila melanogaster 1,2X IO8 2,0X IO4 Moscerino dèlia frutta (moscerino da laboratorio):
Mus musculus domesticus, xx 2,6 X IO9 2,7X IO4/ ; Cavia dà laboratòrio
Pan tr o g lo d y te s 8 . x 3,1 X IO9 4,9X IO4 Scimpanzé
Homo sapiens: : 3,1 X IO9 2,9 X IO4 : Uomo

Fonte: pagina di riferimento (RefSeq page) per ogni organismo: www.ncbi.nlm.nIh.gov/genomes.

un genoma, è possibile dedurre semplicemente dalla se­ TERMINI CHIAVE


quenza genomica le caratteristiche metaboliche d e li orga­
Tutti i termini sono definiti nel glossano.
nismo.
anabolismo 13
archea 3
-> Il confronto fra i diversi genomi ha un notevole Impatto batteri 3
nella biologia umana e nella medicina catabolismo 13
I genomi dello scimpanzé e dell’uomo sono iden­ centro chirale 9
tici per il 99,9%, eppure le differenze tra le due citoscheletro 3
specie sono notevoli. Le poche differenze del cor­ configurazione 8
redo genetico devono spiegare il possesso del linguaggio conformazione 9
nell’uomo, la straordinaria atleticità dello scimpanzé e molte energia di attivazione, AG* 13
altre differenze. Dal confronto tra i genomi i ricercatori co­ entalpia, H 11
entropia, S 11
minciano oggi a stabilire quali geni siano associati alle diver­
equilibrio 12
genze nei programmi di sviluppo degli uomini e degli altri
eucariote 2
primati e all’emergere di funzioni complesse come il linguag­
genoma 2
gio. Il quadro apparirà sempre più chiaro solo quando un
metabolismo 14
maggior numero di genomi dei primati diventerà disponibi­ mutazione 15
le per il confronto con il genoma umano. nucleo 2
Analogamente, le differenze nel corredo genetico tra sog­ procariote 2
getti umani diversi sono anche più piccole se confrontate reazione endoergonica 12
con quelle tra l’uomo e lo scimpanzé. Eppure esse sono re­ stereoisomeri 8
sponsabili della variabilità tra i diversi soggetti, come nel variazione di energia libera, A G 11
caso della suscettibilità alle malattie croniche. C’è ancora variazione di energia libera standard, AG ° 13

molto da imparare sulla variabilità delle sequenze nel geno­


ma dei diversi individui e certamente ulteriori informazioni
in questo senso avranno un forte impatto sulle diagnosi m e­
diche e siii trattamenti farmacologici. Dobbiamo aspettarci ULTERIORI LETTURE
che per alcune malattie genetiche i trattamenti palliativi sa­
Atkins, P.W. e de Paula, J. (2006) Physical Chemistry f o r the
ranno sostituiti da terapie efficaci, e che per la suscettibilità
Life Sciences, W. H. Freeman and Company, New York. [Ttad. it.:
a malattie associate a particolari marcatori genetici si inten­ Chimica fisica, Zanichelli, Bologna 2004.]
sificheranno, e forse prevarranno, le misure preventive. L’at­ Atkins, P.W. e Jones, L. (2005) Chemical Principles: The Quest
tuale “storia pregressa” (anamnesi) forse potrà essere sosti­ fo r Insight, 3a ed., W.H. Freeman and Company, New York. [Trad,
tuita dalla “previsione medica” . ■ ■ it.: P rin cip i di chimica, 2a ed., Zanichelli, Bologna 2005.]
© 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4 CAPITOL01 Fondamenti di biochimica

de Duve, C. (1996) The birth of complex cells. Sci. Am. 274 tro di 0,8 (im. Il volume di un cilindro è n rih, dove h è
(April), 50-57. [Trad, it.: “La nascita della cellula eucariote” , Le l’altezza del cilindro.
Scienze n. 334, Milano 1996.] (a ) Se la densità media di E. coli (la maggior parte è
Evolution of Catalytic Function. (1987) Cold Spring Harb. Symp. acqua) è 1,1 X IO3 g/L, qual è la massa di una singola
Quant. Biol. 52. cellula?
Fruton, J.S. (1999) Proteins, Enzymes, Genes: The Interplay of (b ) La parete cellulare protettiva dii?, coli è spessa 10 irai.
Chemistry and Biochemistry, Yale University Press, New Haven. Quale percentuale del volume totale della cellula occu­
pa la parete?
Un famoso storico della biochimica traccia lo sviluppo della di­
(c ) E. coli è in grado di crescere e di moltiplicarsi rapida­
sciplina e discute il suo impatto sulla medicina, le scienze far­
mente in quanto in ogni cellula sono presenti circa
macologiche e l’agricoltura
15 000 ribosomi sferici (diametro di 18 nm), utilizzati
Griffiths, A.J.F., Wessler, S.R., Lewinton, R.C., Gelbart,
continuamente per la sintesi di proteine. Quale percen­
W.M., Suzuki, D.T., e Miller, J.H. (2004) An Introduction to Ge­
tuale del volume della cellula è occupata dai ribosomi?
netic Analysis, W. H. Freeman and Company, New York. [Trad, it.:
Genetica: p rin c ip i di analisi formale 6a ed. italiana condotta 2. La vitamina C: la vitamina sintetica è buona
sulla 8a ed. americana, Zanichelli, Bologna 2006.] come quella naturale? Uno degli argomenti che por­
Judson, H.F. (1996) The Eighth Day of Creation: The Makers of tano avanti i sostenitori dei cibi naturali è che le vita­
the Revolution in Biology, edizione estesa, Cold Spring Harbor La­ mine ottenute da fonti naturali sono più efficaci di
boratory Press, Cold Spring Harbor, NY. [Trad, it.: L ’ottavo giorno quelle ottenute per sintesi chimica. Per esempio, si
della creazione: la scoperta del DNA, Roma, Editori riuniti 1986.] dice che l’acido L-ascorbico puro (la vitamina C ) otte­
- Una trattazione di facile lettura e al tempo stesso autorevole nuto dai frutti della rosa canina sia migliore per la sa­
sullo sviluppo della biochimica e della biologia molecolare nel lute dell’acido L-ascorbico puro prodotto in un impian­
ventesimo secolo. to chimico. Sono diverse le due vitamine ottenute da
Lazcano, A. e Miller, S.L. (1996) The origin and early evolution fonti diverse? Può il nostro organismo distinguere la
of life: prebiotic chemistry, the pre-RNA world, and time. Cell 85, fonte della vitamina?
793-798.
Una breve rassegna sugli sviluppi degli studi sull’origine della 3. La vita è basata sul silicio? Il silicio è nello stesso
vita: l’atmosfera primitiva, i vulcani sottomarini, l’origine degli gruppo del carbonio nella tavola periodica degli elemen­
organismi autotrofi ed eterotrofi, il mondo ad RNA e il mondo ti e, come il carbonio, può formare fino a quattro legami
covalenti. Molte storie di fantascienza hanno descritto
pre-RNA, e il tempo trascorso prima della comparsa della vita.
forme di vita basate sul silicio. È realistica questa ipote­
Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C.A., Krieger, M.,
si? Quali caratteristiche del silicio lo rendono meno ido­
Scott, M.R., Zipursky, S.L., e Darnell, J. (2004) Molecular Cell
neo del carbonio a essere l’elemento fondamentale della
Biology, 5“ ed., W. H. Freeman and Company, New York. [TYad. it.:
vita? Per rispondere a questa domanda, usate le infor­
Biologia molecolare della cellula, 3aed. italiana condotta sulla 6a
mazioni presenti in questo capitolo sulla versatilità del
americana, Zanichelli, Bologna 2009.]
carbonio e consultate anche un testo di chimica inorga­
¡ A Un testo classico, utile per approfondire gli argomenti di que­
nica per conoscere le proprietà di legame del silicio.
sto e di altri capitoli
Mayr, E. (1997) This Is Biology: The Science of the L iving 4. S 9 Azione dei farmaci e forma delle molecole.
World, Belknap Press, Cambridge, MA. S i i » Alcuni anni fa due società farmaceutiche produs­
Storia dello sviluppo della scienza, con speciale riguardo al­ sero un farmaco che distribuirono sotto i nomi commer­
l’evoluzione darwiniana, scritta da un eminente discepolo di ciali di Dexedrina e Benzedrina. La struttura del farma­
Darwin. co è riportata sotto:
Pierce, B. (2005) Genetics: A Conceptual Approach, 2a ed., W.H.
Freeman and Company, New York. [Trad, it.: Genetica, Zanichelli, H
I
Bologna 2005.] c h 2— c — c h 3
Vollhardt, K.P.C. e Shore, N.E. (2005) Organic Chemistry: I
nh2
Structure and Function, 5a ed., W. H. Freeman and Company,
New York. [Ttad. it.: Chimica organica, Zanichelli, Bologna 2005.]
' Una discussione aggiornata sulla stereochimica, sui gruppi fun­ Le proprietà fisiche (composizione in C, H e N, punto di
zionali, sulla reattività e sulla chimica delle principali classi di
fusione, solubilità ecc.) della Dexedrina e della Benze­
drina erano identiche. La dose orale raccomandata per
biomolecole.
la Dexedrina (che è ancora reperibile sul mercato) era
di 5 mg al giorno, mentre quella della Benzedrina (non
più in commercio) era due volte più alta. A quanto pare
PROBLEM I
era necessario somministrare molta più Benzedrina che
1. I componenti di E . c o li. L e cellu le di E. coli hanno Dexedrina per ottenere la stessa risposta fisiologica.
una form a a bastoncino, lungo circa 2 pjn, e un diam e­ Spiegate questa evidente contraddizione.
Struttura
. catalisi

a biochimica è la chimica della vita e la materia viven­

L te può così essere studiata, analizzata e capita. All’ini-


zio ogni studente deve familiarizzarsi con il linguaggio
della biochimica e con alcune nozioni fondamentali tratte da
altre discipline. La Parte 1 del testo assolverà a questo com­
pito.
I capitoli della Parte 1 riguardano la struttura e la funzione
delle classi più importanti dei costituenti cellulari: l’acqua
(Capitolo 2), gli amminoacidi e le proteine (dal Capitolo 3 al
Capitolo 6), gli zuccheri e i polisaccaridi (Capitolo 7), i nu-
cleotidi e gli acidi nucleici (Capitolo 8), gli acidi grassi e i li­
pidi (Capitolo 10), e, infine, le membrane e le proteine se­
gnale (Capitoli 11 e 12). Le informazioni sulla struttura delle
molecole saranno corredate da informazioni sulle tecnolo­
gie usate per studiarle. Le sezioni dedicate alle tecniche
sono distribuite un po’ in tutto il testo e il Capitolo 9 è inte­
ramente dedicato alla biotecnologia del clonaggio, della ge-
nomica e della proteomica.
Inizieremo con l’acqua (Capitolo 2) perché le sue proprietà
influenzano la struttura e la funzione di altri costituenti cellu­
lari. Per ogni classe di m olecole organiche considereremo
dapprima la chimica delle unità monomeriche costitutive
(amminoacidi, monosaccaridi, nucleotidi e acidi grassi); de-
2 L’acqua 23
3 Amminoacidi, peptidi
e proteine 37
4 Struttura tridimensionale
delle proteine 54
5 La funzione delle proteine 67
6 Gli enzimi 80
7 Carboidrati e geobiologia 96
8 Nucleotidi e acidi nucleici 107
8 Tecnologie basate sull’informazione
contenuta nel DNA 121
101 lipidi 133
11 Membrane biologiche e trasporto 142
12 Biosegnalazione 156

scriveremo poi la struttura delle macromolecole e dei com­


plessi macromolecolari. Le macromolecole polimeriche dei
sistemi viventi, anche se molto grandi, sono altamente ordi­
nate, caratterizzate da specifiche sequenze di unità mono-
meriche che a loro volta determinano altrettanto specifiche
strutture e funzioni. Questo tema fondamentale può essere
suddiviso in tre principi fra loro correlati: ( 1) la struttura
specifica di ogni macromolecola determina la sua funzione;
( 2) le interazioni non covalenti svolgono un ruolo cruciale
nella struttura e nella funzione delle macromolecole;
(3 ) le unità monomeriche che si trovano nelle macromoleco­
le secondo sequenze specifiche rappresentano una forma di
informazione da cui dipende l’ordine della materia vivente.
La relazione tra struttura e funzione è evidente soprattutto
nelle proteine, che svolgono un numero elevatissimo di fun­
zioni diverse.
Passando dalle unità monomeriche a polimeri sempre più
voluminosi, l’attenzione si sposta dai legami covalenti alle
interazioni non covalenti. I legami covalenti a livello mono-
merico e macromolecolare limitano le form e che possono
assumere le biomolecole di grosse dimensioni. Però sono le
numerose interazioni non covalenti che determinano le con­
formazioni originarie e stabili delle m olecole di grosse di-
I PARTF Struttura e catalisi M97H HH (»06413 A

mensioni, allo stesso tempo permettendo lóro la flessibilità rige ravvolgimento delle proteine in sequenze tridimensio­
necessaria per le loro funzioni biologiche. Come vedremo, nali specifiche, e in ultima analisi determina la funzione
le interazioni non covalenti sono essenziali per la catalisi en­ delle proteine. Alcuni oligosaccaridi hanno anche sequenze
zimatica, per le interazioni fra le basi degli acidi nucleici e caratteristiche e strutture tridimensionali che vengono rico­
per la formazione e le proprietà delle membrane. Il princi­ nosciute da altre macromolecole.
pio che le sequenze di unità monomeriche sono ricche di in­ Queste macromolecole quindi interagiscono tra loro, gene­
formazioni emergerà dallo studio degli acidi nucleici (Capi­ rando strutture sovramolecolari e organelli che permettono
tolo 8). Anche le proteine ed alcuni polimeri degli zuccheri alla cellula di svolgere le sue molteplici funzioni metaboli­
(oligosaccaridi) sono molecole ricche di informazioni. La se­ che. Nel loro insieme le m olecole descritte nella Parte 1
quenza amminoacidica è una forma di informazione che di­ sono l’essenza della vita.
. ** 'li
*.’■
1V
lo penso che, man mano che le metodiche della chimica strutturale


verranno applicate ai problemi fisiologici, si troverà che il
significato del legame idrogeno per la fisiologia è più rilevante di
quello di ogni altra caratteristica strutturale.
UmsPauìmq, The Nature of thè Chemical Bond, iQ39

2.1 Interazioni deboli nei sistemi acquosi 23 tro variazioni del pH nei sistemi biologici. Le m olecole di

2.2 Ionizzazione dell’acqua, degli acidi deboli acqua e i loro prodotti di ionizzazione, H+ e OH 3 influenza­
e delle basi deboli 29 no profondamente la struttura, il modo di combinarsi insie­
me e le proprietà di tutti i componenti cellulari, compresi le
2.3 Meccanismi di tamponamento delle variazioni
proteine, gli acidi nucleici e i lipidi. Le interazioni non cova­
di pH nei sistemi biologici 32
lenti responsabili del “riconoscimento” tra biomolecole sono
1 L’acqua come reagente 33 influenzate in modo determinante dahe proprietà solventi
2.5 L’ambiente acquoso è adatto alla vita 34 dell’acqua, come la sua capacità di formare legami idrogeno
con se stessa e con i soluti.
J acqua è la sostanza più abbondante in tutti gli esse­

L ri viventi e rappresenta più del 70% del peso della


maggior parte degli organismi. I primi organismi vi­
venti comparvero senza dubbio negli oceani primordiali e la
2 .i Interazioni deboli nei sistemi acquosi
loro evoluzione fu influenzata dalle proprietà del mezzo ac­ -> I legami idrogeno conferiscono all’acqua proprietà
quoso in cui avevano avuto origine. insolite
Questo capitolo inizia con la descrizione delle proprietà fi­ L’acqua ha un punto di fusione, un punto di ebollizione e un
siche e chimiche dell’acqua, a cui si sono adattate tutte le calore di evaporazione più elevati rispetto agli altri liquidi
caratteristiche strutturali e funzionali delle cellule. Le note­ che conosciamo (Tabella 2.1). Queste proprietà insolite
voli forze di attrazione tra le molecole di acqua e la sua scar­ sono una conseguenza delle forti attrazioni tra molecole di
sa tendenza a ionizzarsi sono caratteristiche fondamentali acqua adiacenti, che generano nell’acqua allo stato liquido
per la struttura e la funzione delle biomolecole. Rivedremo i una grande coesione interna. Osservando la struttura e la di­
concetti della ionizzazione in termini di costanti di equili­ stribuzione elettronica della molecola di acqua è possibile
brio, pH e curve di titolazione e prenderemo in considera­ identificare la causa di queste attrazioni intermolecolari.
zione il modo in cui le soluzioni acquose di acidi o basi de­ Ogni atomo di idrogeno di una molecola di acqua condivide
boli e dei loro sali possono agire da soluzioni tampone con­ una coppia di elettroni con l’atomo di ossigeno. La geome-

TABELLA 2.1 Punto di fusione, punto di ebollizione e calore di evaporazione di alcuni liquidi comuni
Punto Punto Calore
di fusione di ebollizione di evaporazione
(°C) (°C) (J/g)*

Acqua . 0 100 2260


Metanolo (CH3OH) !)H 65 1100
Etanolo (CH3CH2OH) 3; —117 3 3 ) 78 854
Propanolo (CH3CH2CH2OH) 3 3 3-127. 3 ) 97 3 687
Butanólo (CH3(CH2) 2CH2OH) : ■ -90 ; ;- :3 117:3; 590
Acetone (CH3COCH3) ; 96 333’ 562 - 33 523
Esano (C ILtO ILl/'Ib) 98 ' 33369 3 3 3 3) 423
Benzene {C.-.FI.O ■33 6 :: 3)80:33) 3 394
Butano (ClLfCILhCH;;) :3cL;i-:^Ì3 é:.rv;y:L :-.v':v3 3 3-0,5 \v,3; 381
Cloroformio (CHCI3) 3 :"--3-3: - 6 3 ); 61 247

* L'energia termica necessaria a convertire 1,0 g di un liquido al suo punto di ebollizione e a pressione atmosferica in gas alla stessa temperatura. È tuia misura
direttadell’energia necessaria per annullare le forze attrattive tra le molecole nella fase liquida.
24 j CAPITOLO 2 ¡ Ì l | | Ì Ì | | | ì | | | | | | i SSSiSSifi® listili®^

tria della molecola di acqua è determinata dalla disposizione zione acquosa (l’energia cinetica risultante dai moti dei sin­
dei due orbitali elettronici esterni dell’ossigeno, simile a goli atomi e delle singole m olecole) è dello stesso ordine di
quella degli orbitali sps di legame del carbonio. Questi orbi­ grandezza di quella necessaria a rompere i legami idroge­
tali descrivono grosso modo un tetraedro, con un atomo di no. Anche se in ogni dato momento la maggior parte delle
idrogeno a due degli angoli e gli elettroni non condivisi agli m olecole di acqua è impegnata in legami idrogeno, la vita
altri due (Figura 2.la ). Il legame H— 0 — H ha un angolo di media di ogni legam e varia da 1 a 20 picosecondi
104,5°, poco meno dei 109,5° di un tetraedro perfetto, in (1 ps = IO -12 s); dopo la rottura di un legame idrogeno se
quanto vi è uno schiacciamento dovuto agli orbitali dell’ossi­ ne forma immediatamente un altro, con la stessa molecola
geno non impegnati ih legami. 0 con una nuova, in 0,1 ps. Il gran numero di legami idroge­
Il nucleo dell’ossigeno attrae elettroni molto più fortemen­ no che si forma tra le molecole conferisce all’acqua allo stato
te del nucleo dell’idrogeno (cioè di un protone); ciò signi­ liquido una grande coesione interna. Questi reticoli di mo­
fica che l’ossigeno è più elettronegativo. La distribuzione lecole di acqua legate da legami idrogeno formano ponti tra­
degli elettroni in compartecipazione tra H e O non è quin­ sversali anche con i soluti (proteine e acidi nucleici, per
di simmetrica; gli elettroni si vengono a trovare molto più esempio) che permettono a molecole più grandi di interagi­
spesso nelle vicinanze dell’atomo di ossigeno che di quello re tra loro coprendo distanze di molti nanometri senza con­
dell’idrogeno. Il risultato di questa distribuzione ineguale tatto fisico.
degli elettroni è la formazione di due dipoli elettrici nella La disposizione quasi tetraedrica degli orbitali attorno all’os­
molecola dell’acqua, uno lungo ciascuno dei legami H— 0; sigeno (Figura 2.la ) consente a ogni molecola di acqua di
ogni atomo di idrogeno porta una parziale carica positiva formare legami idrogeno con altre quattro molecole vicine.
( 8+) e l’atomo di ossigeno ha quindi una parziale carica ne­ Però nell’acqua allo stato liquido, a temperatura ambiente e
gativa uguale alla somma di due cariche parziali positive a pressione atmosferica, le molecole sono in uno stato disor­
(28“ ). Si viene così a generare un’attrazione elettrostatica dinato e in continuo movimento, cosicché ogni molecola
tra l’atomo di ossigeno di una molecola d’acqua e l’atomo forma una media di 3,4 legami idrogeno con altre molecole.
di idrogeno di un’altra (Figura 2.1b) detta legame idro­ N el ghiaccio, invece, ogni molecola di acqua è bloccata nello
geno. In tutto il testo i legami idrogeno saranno rappre­ spazio e forma quattro legami idrogeno con molecole vicine,
sentati da tre lineette parallele in colore blu, come nella Fi­ determinando una struttura lineare a reticolo. Per rompere
gura 2.lb. ' 1legami idrogeno in questa disposizione simile a quella cri­
I legami idrogeno sono relativamente deboli e nell’acqua allo stallina sono necessarie quantità di energia termica superio­
stato liquido hanno un’energia di dissociazione (l’ener­ ri, in accordo con l’elevato punto di fusione del ghiaccio (Ta­
gia necessaria per rompere un legame) di circa 23 kJ/mole, bella 2.1). Quando il ghiaccio fonde o l’acqua evapora, il si­
rispetto ai 470 kJ/mole del legame covalente O— H dell’ac­ stema assorbe calore:
qua oppure ai 348 kJ/mole del legame covalente C— C. Il le­
game idrogeno è per circa il 10% covalente per la sovrappo­ H 20(solida) —» H 20(liquida) M i = +5,9 kJ/mole
sizione degli orbitali di legame e per il 90% circa elettrosta­ H 20(liquida) - » H 20(gassosa) M I = +44,0 kJ/mole
tico. A temperatura ambiente, l’energia termica di una solu-
Durante la fusione o l ’evaporazione, l’entropia del sistema
acquoso aumenta poiché la disposizione ordinata delle mo­
lecole di acqua nel ghiaccio decade in quella meno ordinata
dello stato liquido o addirittura nel caos dello stato gassoso.

-> L’acqua forma legami idrogeno con i soluti polari


I legami idrogeno non sono una prerogativa dell’acqua. Essi
si formano facilmente tra un atomo elettronegativo (accet-
tore di idrogeno, di solito ossigeno o azoto con una coppia
di elettroni non condivisi) e un atomo di idrogeno legato
covalentemente ad un altro atomo elettronegativo (dona­
tore di idrogeno) nella stessa o in un’altra molecola (Figura
2,2a). Gli atomi di idrogeno legati covalentemente ad atomi
di carbonio non partecipano alla formazione di legami idro­
geno in quanto il carbonio è leggermente più elettronegati­
vo dell’idrogeno e quindi il legame C— H è solo debolmente

F1GURA 2.1 • Struttura della molecola dell’acqua, (a) La natura dipolare polare. Questa distinzione spiega come mai il butanolo
della molecola d’acqua è mostrata in un modello a palle e bastoncini. Le linee (C H g(CH 2) 2CH 2OH) ha un punto di ebollizione piuttosto
tratteggiate rappresentano gli orbitali non Impegnati In legami. Le coppie di alto di 117 °C, mentre il butano (C H 3(CH 2) 2CH 3) bolle a
elettroni del guscio esterno dell’atomo di ossigeno si dispongono secondo una
- 0,5 °C. Il butanolo ha un gruppo ossidrilico polare e quin­
geometria pressoché tetraedrica, Ciascun atomo di Idrogeno ha una carica
parziale positiva localizzata (8+), mentre l’atomo di ossigeno ha una carica di le molecole di butanolo possono formare legami idrogeno
parziale negativa (8“). (b) Due molecole di H20 unite da un legame idrogeno fra loro. Le biomolecole non cariche ma polari, come gli zuc­
(Indicato qui e In tutto II testo da tre linee blu) tra l’atomo di ossigeno della
cheri, si sciolgono facilmente nell’acqua per l’effetto stabi­
molecola In alto e uno degli atomi di idrogeno della molecola In basso. I legami
Idrogeno sono più lunghi e più deboli dei legami covalenti 0 — H. lizzante dei legami idrogeno che si formano tra i gruppi ossi-
»»7 8 -80 -0 8-0 64 1 3 : GAI-¡“ GlJ 2 L’acqua 25

(a ) drilici e gli atomi di ossigeno carbonilici dello zucchero e le


molecole polari dell’acqua. Anche gli alcoli, le aldeidi, i che­
Accettare - % / \ / toni e i composti che contengono il gruppo N — H formano
y
j IO
di idrogeno N N
Y 0
legami idrogeno con l’acqua (Figura 2.2b) e tendono ad es­
Donatore H H H H H H sere solubili in acqua.
di idrogeno 1 1 1 1
Quando l’atomo di idrogeno e gli altri due atomi che parteci­
0
0 0
0 0
0 N N N
1 I I / \ / \ / ' pano al legame sono su una linea retta (Figura 2.3), in modo
che la carica positiva dello ione idrogeno sia posta tra le due
(b )
cariche parzialmente negative, il legame idrogeno è più
Tra il gruppo Tra il grappo Tra due gruppi forte. Vedremo in seguito che questa proprietà del legame
ossidrilico carbonilico peptidici
di un alcol di un chetane nei polipeptidi idrogeno determina la formazione di strutture tridimensio­
e l’acqua e l’acqua nali ben precise sia nelle proteine sia negli acidi nucleici.
L’acqua dissolve facilmente la maggior parte delle biomole­
R.
cole, che sono in genere composti carichi o polari (Tabella
0 2.2); i composti che si sciolgono facilmente in acqua sono
H idrofUici (dal greco, “amanti dell’acqua”). A l contrario, i sol­
venti non polari come 0 cloroformio e il benzene solubilizza-
0.
H H no solo in parte le biomolecole polari, mentre sono partico­
larmente idonei per quelle idrofobiche, cioè molecole non
polari come i lipidi e le cere.
L’acqua scioglie i sali come l’NaCl idratando e stabilizzando
Tra due basi gli ioni N a+ e C F , indebolendo le loro interazioni elettro-
complementari
statiche e quindi opponendosi alla loro tendenza ad asso­
di DNA
ciarsi in un’organizzazione cristallina (Figura 2.4). L’acqua
H

Ey Y ° H>
Timina
0
A A , Legame H Legame
H H idrogeno x 0 '^ idrogeno
\ forte — p-^ ^ debole
—P
A C
^ NH FIGURA 2.2 • I tipi più comuni
/
Adenina di legami idrogeno nei sistemi

A \ - //
, N — CH
biologici, (a) faccettare di
Idrogeno è di solito ossigeno o
azoto. Il donatore di idrogeno
è un altro atomo elettronegativo,
FIGURA 2.3 • Direzionalità del legame idrogeno. L’attrazione tra le due
cariche elettriche parziali (vedi la Figura 2.1) è massima quando i tre atomi
coinvolti (In questo caso 0, H e 0) sono disposti in linea retta. Quando i gruppi
che formano un legame sono soggetti a costrizioni strutturali (per esempio,
(b) Alcuni legami idrogeno di quando fanno parte di una singola molecola proteica) non sempre è possibile
importanza biologica. raggiungere la geometria ideale e II legame idrogeno risulta più debole.

Alcuni esempi di biomolecole polari, non polari e antipatiche (mostrate nella forma ionica a pH 7)

Polari Non polari ¡0 ;


: Glucosio Una cera tipica F. UiJ
CH3(CH2> - C H = C H - (C H 2)é -C H 2 -C .
o
CH3 ( Y ^ - 4 cY oÌì -(C H 2 )7-C H 2

Antipatiche
Feiiiir,lanini! ® jii
: Glicina COO-JVF
y . yCH 2;)Aì-ffiQI[
Acido asparticc) I l;ppi ;+n % .:
llP P lP c H a — C H - r q lÉ “ Fosfatidilcolina
Acido lattico CU„ -CH - -GOO CH3(()iy ,.,C II2 —0 — 0 —CHS
CH :,(0iy,!.CH 3 - G - O - G H ; ;| f| §| § p :); . ¡ ¡ p H a ) , ,
Glicèroltì; : ® Ì :F :F F 0 CU2 — 0 — P— O- OII:! 01i::
- I F L iL F a
HOCIL —GII (111,011 :

I j Grappi polari!-p i | Gruppi non polari


261 CAPITOLO 2 L’acqua ©978-88-08-06413-4

FIGURA 2 .4 • L’acqua come solvente.


L’acqua scioglie molti sali cristallini, idratando gli
ioni che li compongono. Il reticolo cristallino
dell’NaCl si disgrega quando le molecole
d’acqua si raggruppano intorno agli ioni CI“ e
N a t Le cariche ioniche vengono così
parzialmente neutralizzate, e le attrazioni
elettrostatiche necessarie per la formazione del
reticolo si indeboliscono.

si comporta nello stesso modo nei confronti delle biomole­ I composti non polari provocano variazioni
cole cariche, composti con gruppi funzionali come i grappi energeticamente non favorevoli nella struttura
carbossilici acidi ionizzati ( — C O O "), i gruppi amminici dell’acqua
protonati ( — NH 3+) e gli esteri fosforici o le anidridi fosfo­ Quando all’acqua viene aggiunto benzene o esano, si forma­
riche. no due fasi: nessuno dei due liquidi è solubile nell’altro.
L’acqua è particolarmente efficace nel disperdere gli ioni di­ Composti non polari, come il benzene e l’esano, sono idro­
sciolti perché la sua costante dielettrica è particolarmente fobici; essi non possono andare incontro a interazioni ener­
elevata. L’intensità o forza (F ) di queste interazioni ioniche geticamente favorevoli con le molecole d’acqua e inoltre in­
in una soluzione dipende dall’entità delle cariche (Q ), dalla terferiscono con la formazione di legami idrogeno. Tutte le
distanza fra i gruppi carichi ( f ) e dalla costante dielettrica molecole o gli ioni in soluzione acquosa interferiscono con
(e, che è adimensionale) del solvente in cui avviene l’intera­ la formazione di legami idrogeno tra le molecole d’acqua che
zione: si trovano nelle immediate vicinanze, ma i soluti polari o ca­
richi (come l’NaCl) compensano la rottura dei legami idro­
geno tra le molecole di acqua, formando nuove interazioni
tra l’acqua e il soluto. Invece i soluti idrofobici non hanno
Per l’acqua a 25 °C, £ è 78,5, mentre per il solvente non po­ questo meccanismo di compensazione e la loro aggiunta al­
lare benzene è pari a 4,6. Quindi le interazioni ioniche sono l’acqua può provocare un piccolo aumento di entalpia. La
molto più forti in un ambiente non polare. La dipendenza da rottura dei legami idrogeno tra le molecole d’acqua sottrae
r 2 fa sì che le attrazioni o le repulsioni ioniche operino solo energia al sistema, recuperandola dall’ambiente. Oltre alla
in ambiti molto limitati, cioè tra 10 e 40 nm. richiesta di tale apporto di energia, 1’aggiunta di composti
idrofobici all’acqua produce una diminuzione di entropia,
-> L’entropia aumenta quando le sostanze cristalline che può essere misurata. Le molecole d’acqua nelle imme­
si sciolgono diate vicinanze di un soluto non polare sono costrette ad as­
Quando un sale come l’NaCl si scioglie, gli ioni Na+ e CI" sumere un orientamento abbastanza preciso, formando una
che lasciano il reticolo cristallino acquistano una maggio­ struttura che circonda ciascuna molecola di soluto. L’ener­
re libertà di movimento (Figura 2.4). Il risultante aumento gia libera per sciogliere un soluto non polare in acqua è
dell’entropia (casualità) del sistema è in gran misura re­ quindi sfavorevole: A G = AH —T A S, dove AH ha un valore
sponsabile della facilità con cui i sali come l’NaCl si sciol­ positivo, A G ha un valore negativo, quindi A G è positivo.
gono nell’acqua. In termini termodinamici, durante la for­ I composti a n fip a tic i contengono nella loro molecola regio­
mazione della soluzione si ha una variazione di energia li­ ni polari (o cariche) e regioni non polari (ve d i la Tabella
bera favorevole: A G = A H - T A S, dove A H ha un piccolo 2.2). Quando un composto anfipatico viene mescolato all’ac­
valore positivo e T AS un valore nettamente positivo; A G qua, la regione polare idrofilica interagisce favorevolmente
è quindi negativo. con l’acqua e tende a dissolversi, mentre la regione non po­
I gas biologicamente importanti C0 2, 0 2 ed N 2non sono pola­ lare, idrofobica, evita il contatto con l’acqua (Figura 2.5). Le
ri. Nelle molecole 0 2 ed N 2gli elettroni sono egualmente di­ regioni non polari della molecola si raggruppano in modo da
stribuiti tra i due atomi, mentre nella C0 2il legame C = 0 è presentare al solvente acquoso la minore area superficiale
polare, ma i due dipoli generati dai due atomi di ossigeno possibile e le regioni polari si dispongono in modo da rende­
sono in direzioni esattamente opposte e si annullano recipro­ re ottimali le loro interazioni con l’acqua (Figura 2.5). Le
camente. La natura non polare di questi gas riduce molto la strutture stabili che assumono i composti anfipatici in
loro solubilità in acqua. acqua, chiamate m icelle, possono contenere centinaia o mi­
Altri tre gas, l’NH3, l’NO e l’H 2S, hanno ruoli biologici in al­ gliaia di molecole. I legami che tengono unite le regioni non
cuni organismi; sono gas polari, che si sciolgono facilmente polari delle molecole vengono detti in t e ra z io n i id r o fo b i­
in acqua e che, una volta in soluzione, ionizzano. che. La forza di queste interazioni idrofobiche non dipende
© 978-88^08-06413-4 CAPITOLO 2 L'acqua | ; Y

Gruppi
alchilici
idrofobici

Tutti i gruppi idrofobici sono separati


disposte in modo altamente ordinato, dall’acqua; non vi sono strati di
formano delle specie di “gabbie” molecole di acqua altamente
intorno alle catene alchiliche idrofobiche ordinate, e quindi l’entropia aumenta

FIGURA 2.5 • I composti anfipatici in soluzioni acquose. acqua. Raggruppandosi in micelle, le molecole di acido grasso espongono la
Gli acidi grassi a catena lunga hanno catene aichiliche molto idrofobiche,' minore area superficiale idrofobica possibile all’acqua, e quindi lo strato di
ognuna delle quali è circondata da uno strato altamente ordinato di molecole di molecole di acqua ordinate si assottiglia.

dalle singole attrazioni fra le molecole non polari, ma è il ri­ cendevolmente. Le variazioni casuali della posizione degli
sultato del raggiungimento da parte del sistema di una mag­ elettroni intorno a un nucleo possono creare un dipolo
giore stabilità termodinamica che rende minimo il numero elettrico transitorio, che induce la formazione di un altro
di molecole di acqua disposte in modo ordinato, necessarie dipolo elettrico transitorio, ma opposto. I due dipoli si at­
a circondare la porzione idrofobica delle molecole di soluto. traggono debolmente l’un l’altro, avvicinando ancora i due
nuclei. Queste deboli attrazioni sono chiamate in te ra z io n i
-> Le interazioni di van der Waals sono attrazioni d i v a n d e r W a a ls (o anche f o r z e di L o n d o n ). Man mano
interatomiche deboli che i due nuclei si avvicinano, le loro nubi elettroniche co­
Quando due atomi privi di carica vengono molto avvicinati minciano a respingersi. A l punto dove l’attrazione è massi­
l’uno all’altro, le loro nuvole elettroniche si influenzano vi- ma, si dice che i nuclei sono a contatto di van der Waals.
Ogni atomo ha un suo caratteristico r a g g i o d i v a n d e r
W a a ls , che è una misura di quanto l’atomo permette ad un
I TABELLA 2.3 Raggi di van der Waals e raggi covalenti
altro atomo di avvicinarsi (Tabella 2.3). N ei modelli “a spa­
(legami singoli) di alcuni elementi
zio pieno” che vengono mostrati in questo libro gli atomi
Raggio di Raggio covalente hanno dimensioni proporzionali ai loro raggi di van der
van der Waals per legami singoli
Elemento
Waals.
(nm) (nm)

H 0,11 0,030 -> Le interazioni deboli sono fondamentali


O t v iì:- 0,15) 0,066 per la struttura e la funzione delle macromolecole
N 7 0,15 0,070 Le interazioni non covalenti che abbiamo descritto, cioè i le­
iti; ; ■ 0,17 0,077 gami idrogeno e ionici, le interazioni idrofobiche e di van der
8 0,18 0,104 Waals (Tabella 2.4), sono molto più deboli dei legami cova­
I' 0,19 0 ,1 1 0
lenti, tuttavia l’effetto cumulativo di molte interazioni non
7) 0 ,21 0,133
covalenti può essere molto significativo.
Fonti: per i raggi di van der Waals, Chauvin, R. (1992) Explicit periodic trend Macromolecole come le proteine, il DNA e l’RNA contengo­
of van der Waal radii. J.Phys. Chem. 96, 9194-9197. Per i raggi covalenti, no così tanti siti per la formazione di potenziali legami idro­
Pauling, L. (1960) Nature ofthe Chemical Bond, 3a edizione, Cornell Uni­
versity Press, Ithaca, NY.
geno e di interazioni idrofobiche o di van der Waals che l’ef­
Nota: i raggi di van der Waals sono proporzionali alle dimensioni degli atomi fetto cumulativo di queste piccole forze può essere enor­
dei modelli a spazio pieno. Quando due atomi sono uniti covalentemente, i raggi me. P er le m acrom olecole la struttura più stabile (cioè
atomici al punto di legame sono inferiori ai raggi di van der Waals, perché gli
atomi legati sono tenuti assieme dalla coppia di elettroni condivisa. La distanza quella nativa) è generalmente quella in cui il numero delle
tra i nuclei di due atomi nelle interazioni di van der Waals o nei legami covalen­ interazioni deboli è più elevato. L’avvolgimento di un singo­
ti è circa uguale alla somma dei raggi di van der Waals o dei raggi covalenti dei
due atomi, rispettivamente. Per esempio, la lunghezza di un legame covalente
lo polipeptide o di una catena polinucleotidica nella struttu­
singolo carbonio-carbonio è di circa 0,077 nm + 0,077 nm = 0,154 nm. ra tridimensionale è determinato da questo principio. Il le-
1
2 8 CAPITOLO 2 L’acqua ©978-88-08-06413-4.

centrazione alla regione a più bassa concentrazione di acqua


TABELLA 2.4 I quattro tipi di interazioni non covalenti
(“ deboli”) che si formano tra biomolecole determinano una pressione osmotica (Figura 2.6). Questa
in soluzione acquosa pressione è indicata con II ed è espressa come la forza ne­
cessaria per opporsi allo spostamento dell’acqua (Figura
Legami idrogeno 2.6c); essa è descritta dall’equazione di van’t Hoff:

o-
\

4
Tra gruppi neutri iH — 0 — : ri;
n = ic R T
\
in cui R è la costante dei gas e T è la temperatura assoluta. Il
Tra legami peptidici ; - S u uH —N / '
\ termine i c rappresenta l’osmolarità della soluzione, il pro­
dotto del fattore i di van’t H off (una misura del grado di dis­
Interazioni ioniche 0
II . sociazione del soluto in più specie ioniche) e della concen­
II.
Attrattive — + n h 3—> “0— C f trazione molare c del soluto. L’NaCl in una soluzione diluita
— + n h 3 < - - > H aN + ' - si dissocia completamente in Na+ e CU, raddoppiando il nu­
Repulsive
mero delle particelle di soluto, quindi i = 2. Per le sostanze

acqua ) non ionizzateli, i = 1. Per le soluzioni con più soluti ( n ) , I l è


la somma dei contributi di ciascuna specie:
Interazioni idrofobiche
I l = R T ( i i c l + i 2c 2 + ••• + V A i)

L’osmosi, il passaggio dell’acqua attraverso una membrana


CH2 semipermeabile promosso da una pressione osmotica, è un
fattore importante nella vita della maggioranza delle cellu­
Interazioni di van der Waals Due atomi sufficientemente
le. Le membrane piasmatiche sono più permeabili all’acqua
vicini
rispetto alla maggioranza delle altre piccole molecole, ioni
o macromolecole. Soluzioni con osmolarità uguale a quella
del citosol cellulare si dicono isotoniche rispetto alla cel­
game di un antigene ad un anticorpo specifico dipende dal­ lula. Se è circondata da una soluzione isotonica; la cellula
l’effetto cumulativo di molte interazioni deboli. L’energia ri­ non acquista né perde molecole d’acqua. In una soluzione
lasciata quando un enzima si lega non covalentemente al ipertonica, con un’osmolarità più alta di quella del cito­
suo substrato è la fonte principale del potere catalitico del­ sol, la cellula si raggrinzisce man mano che l’acqua esce. In
l’enzima. Il legame di un ormone o di un neurotrasmettito­ una soluzione ipotonica, con una più bassa osmolarità ri-
re al suo recettore cellulare proteico è il risultato di molte
interazioni deboli. La grande dimensione degli enzimi e dei
recettori, rispetto ai loro substrati o ligandi, genera supera­ Forza (II)
ci che offrono molte opportunità alla formazione di intera­ che si oppone
Acqua Soluto all’osmosi
zioni deboli.

I soluti Influenzano le proprietà colligative


delle soluzioni acquose
Tutti i tipi di soluti alterano alcune proprietà fisiche dell’ac­
qua: la tensione di vapore, il punto di ebollizione, il punto di
fusione (il punto di congelamento) e la pressione osmotica.
Queste proprietà sono chiamate proprietà colligative per­
ché l’effetto dei soluti sulle quattro proprietà ha lo stesso
fondamento: la concentrazione dell’acqua è più bassa in so­
luzione rispetto all’acqua allo stato puro. L’effetto della con­
centrazione del soluto sulle proprietà colligative dell’acqua
non dipende dalle proprietà chimiche del soluto; dipende
solo del numero delle particelle di soluto (molecole, ioni) semipermeable
presenti nell’acqua. Un composto come l’NaCl, che si disso­
cia in soluzione, ha un effetto sulla pressione osmotica che è
FIGURA 2.8 • Osmosi e misura della pressione osmotica, (a) Stato
doppio rispetto a quello di un uguale numero di molecole di
iniziale, Il tubo contiene una soluzione acquosa, mentre II bicchiere contiene
un soluto che non si dissocia, come il glucosio. acqua pura; la membrana semipermeabile consente II passaggio dell'acqua, ma
Le molecole d’acqua tendono a spostarsi da una regione a non del soluto, L’acqua tende quindi a fluire dal bicchiere nel tubo per
pareggiare la sua concentrazione nei due compartimenti, (b) Stato finale.
più alta concentrazione ad un’altra a concentrazione più
L’acqua è entrata nel tubo, diluendo II soluto, e II volume di soluzione nel tubo è
bassa, in accordo con i sistemi naturali che tendono a rag­ aumentato, AH’equIIIbrlo, la forza di gravità che agisce sulla soluzione nel tubo
giungere un equilibrio. Quando due soluzioni acquose ven­ diventa uguale alla forza che spinge l’acqua dal bicchiere nel tubo, dove la sua
concentrazione è minore, (c) La pressione osmotica I I è una misura della forza
gono separate da una membrana semipermeabile (che per­
che si deve applicare per far ritornare l’acqua nel tubo al livello di partenza, cioè
mette il passaggio di acqua ma non di molecole di soluto), a quello del bicchiere; questa forza è proporzionale all’altezza h della colonna di
le molecole d’acqua diffondendo dalla regione a più alta con­ liquido del tubo In (b).
© 97&¡88® SÍ$ÍÍ;3-4 CAPITOLO 2 L’acqua 129

spetto a quella del citosol, la cellula si rigonfia man mano nici tra le molecole d’acqua legate da legami idrogeno si ge­
che l’acqua entra. N el loro ambiente naturale, le cellule nera un movimento netto protonico per lunghe distanze e
contengono in genere concentrazioni di biomolecole e di in tem pi brevissimi. Come risultato dell’elevata mobilità
ioni più elevate dell’ambiente circostante, quindi la pres­ degli ioni H+, le reazioni acido-base in soluzione sono in ge­
sione osmotica tende a fare entrare l’acqua dentro la cel­ nere molto veloci.
lula. Se non venisse controbilanciato, l’ingresso dell’acqua Poiché la ionizzazione reversibile è fondamentale per il
nella cellula distenderebbe la membrana piasmatica fino a ruolo dell’acqua nelle funzioni cellulari, dobbiamo avere un
produrre la sua rottura, causando la disgregazione della modo per esprimere la ionizzazione dell’acqua in termini
cellula (lisi osmotica). quantitativi. Stabiliamo come possiamo farlo, rivedendo al­
cune proprietà delle reazioni reversibili.
La posizione dell’equilibrio in una qualsiasi reazione chimica
è espressa dalla costante di equilibrio, K eti (qualche volta
2.2 Ionizzazione dell’acqua, indicata semplicemente con K ) . Per la reazione
degli acidi deboli e delle basi deboli A + B ;= ± C + D • (2.2)
Nonostante molte delle proprietà dell’acqua come solven­
è possibile definire la costante di equilibrio in base al rap­
te dipendano dal fatto che la molecola di H20 non è carica,
porto tra la concentrazione dei prodotti (C e D ) e dei rea­
bisogna tuttavia tener conto del piccolo grado di ionizza­
genti (A e B ) presenti all’equilibrio
zione dell’acqua, fenom eno che produce ioni idrogeno
(H +) e ioni ossidrilici (O H - ) . Come tutte le reazioni rever­ T [C]eq[D]eq
sibili, la ionizzazione dell’acqua può essere descritta m e­ eq [A]eq[B]eq
diante una costante di equilibrio. Quando un acido debole Per una maggiore correttezza, invece che di concentrazioni
viene sciolto in acqua, la sua ionizzazione arricchisce la so­ dovremmo parlare per ogni specie molecolare di attività,
luzione di ioni H +; le basi deboli consumano H + mediante cioè di concentrazioni effettive in soluzioni non ideali. Tran­
la loro protonazione. Anche questi processi sono governa­ ne che in alcuni lavori molto accurati, comunque, la costan­
ti da costanti di equilibrio. La concentrazione totale di ioni te di equilibrio viene calcolata in modo approssimativo mi­
H+ generati da qualsiasi fonte è sperimentalmente misura­ surando le concentrazioni all’equilibrio. Per ragioni che
bile ed è espressa come pH della soluzione. Per determi­ esulano dagli scopi degli argomenti qui trattati, la costante
nare lo stato di ionizzazione dei soluti in acqua dobbiamo di equilibrio è adimensionale. Abbiamo ugualmente mante­
tenere presenti le costanti di equilibrio delle varie reazioni nuto l’unità di misura della concentrazione ( m ) nelle equa­
di ionizzazione. Passeremo ora ad analizzare brevemente zioni di equilibrio utilizzate in tutto il testo nel calcolo della
la ionizzazione dell’acqua e quella degli acidi e delle basi K eq per ricordare che l’unità di misura usata è la concentra­
deboli sciolti in acqua. zione molare ( m).

L’acqua è poco ionizzata -> La ionizzazione dell’acqua è espressa


Le molecole di acqua hanno una bassa tendenza a ionizzar­ da una costante di equilibrio
si reversibilmente per formare uno ione idrogeno (protone) Il grado di ionizzazione dell’acqua all’equilibrio è molto
e uno ione ossidrilico, secondo l’equilibrio basso (Equazione 2.1); a 25 °C, soltanto due su IO9moleco­
le di acqua pura sono ionizzate in ogni istante. La costante
H2O ^ H + + OH- (2.1)
di equilibrio della reazione reversibile della ionizzazione del­
Anche se spesso indichiamo lo ione H + come uno dei pro­ l’acqua è
dotti della dissociazione dell’acqua, i protoni liberi non si
[H+][OH~]
trovano in soluzione. Quando in una soluzione si forma uno Ke (2.3)
[HaO]
ione H +, questo viene immediatamente idratato a ione idro-
nio (H 3CH). L’unione di due molecole d’acqua con un lega­ A 25 °C la concentrazione dell’acqua pura è 55,5 m - i gram­
me idrogeno rende l’idratazione del protone dissociato pra­ mi di acqua in 1 L divisi per la massa molecolare dell’acqua
ticamente istantanea espressa in grammi cioè (1000 g/L) / (18,015 g /mole) - ed è
essenzialmente costante in relazione alle concentrazioni
molto basse di H + e OH- , pari a l X IO -7 M. Possiamo quin­
H— o i ì ì H— 0 H — 0 +—H + OH-
di sostituire 55,5 M nell’espressione della costante di equili­
I
H H H brio (Equazione 2.3) ottenendo
La ionizzazione dell’acqua può essere misurata mediante la
.. [H+][OH- ]
sua conducibilità elettrica; l’acqua allo stato puro trasporta
la corrente elettrica sotto forma di ioni H +, che migrano eq [55,5 M]

verso il catodo, e di ioni OH- , che migrano verso l’anodo. Il Risolvendo, l’equazione diventa
movimento degli ioni idronio e ossidrilici in un campo elet­
(55,5 M ) (Keq) = [H+][OH- ] = Kw (2.4)
trico è molto più rapido rispetto agli altri ioni come Na+, K +
e CI- . Nessun protone individualmente percorre lunghe di­ dove Kwrappresenta il prodotto (55,5 M) (K eq) , cioè 0 pro­
stanze nella soluzione, ma attraverso una serie di salti proto­ dotto ionico dell’acqua a 25 °C.
i | | [I CAP[TOll$§||$qua © 978-88-08-06413-4

Il valore di-Keq, determinato mediante misure di conducibili­ Il simbolo p sta ad indicare il “logaritmo negativo di” . Per
tà elettrica dell’acqua pura, a 25 °C, corrisponde a 1,8 X una soluzione perfettamente neutra a 25 °C, dove la concen­
IO -16 M. Sostituendo questo valore nell’Equazione 2.4, otte­ trazione degli ioni idrogeno è 1,0 X IO -7 m , il pH può essere
niamo il prodotto ionico dell’acqua: calcolato come segue:

Kw= [H+][OH- ] = (55,5 m ) (1,8 X 1 (T 16m) 1


pH = log = 7,0
= 1,0 X IO-14 M2 1,0 x IO -7

Quindi il prodotto [H+][OH- ] nelle soluzioni acquose a 25 °C Si noti che la concentrazione degli H + deve essere espressa

è sempre uguale a 1 X IO -14 m2. Quando le concentrazioni in molarità ( m ) .

di ioni H + e OH- sono uguali, come nell’acqua allo stato Il valore del pH di una soluzione perfettamente neutra non è

puro, la soluzione ha un p H n e u tro . A questo valore di pH, stato scelto arbitrariamente; esso deriva dal valore assoluto

la concentrazione di ioni H+ e OH- può essere calcolata dal del prodotto ionico dell’acqua a 25 °C e solo per caso è un
numero intero. Le soluzioni che hanno un valore di pH su­
prodotto ionico dell’acqua nel seguente modo:
periore a 7 sono alcaline (o basiche) e la concentrazione
Kw = [H+][OH~] = [H +]2 = [OH - ]2 degli OH- è maggiore di quella degli H+. Le soluzioni con un
pH minore di 7 sono invece acide.
Risolvendo per [H+], otteniamo
Si tenga presente che la scala dei pH è logaritmica, non
[H+] = V X = V i X 10"14m2
” aritmetica. Se due soluzioni differiscono di una unità di
[H+] = [OH-] = 10~7m pH, una di esse avrà una concentrazione di ioni idrogeno
dieci volte più elevata dell’altra. Ma questo non ci dice
Essendo il prodotto ionico dell’acqua costante, se [H+] au­
nulla sulle concentrazioni reali delle due soluzioni. La Fi­
menta di 1 X IO -7 m , [OH-] deve necessariamente diminui­
gura 2.7 riporta i valori di pH di alcuni comuni liquidi biolo­
re di l X IO -7 m e viceversa. Quando [H+] è molto alta,
gici. La concentrazione idrogenionica della Coca Cola (pH
come in una soluzione di acido cloridrico, [OH- ] è molto
3,0) e del vino (pH 3,7) è circa 10000 volte più elevata di
bassa.
quella del sangue (pH 7,4).
Mediante il prodotto ionico dell’acqua diventa possibile cal­
colare la concentrazione di ioni H +, nota la concentrazione
di ioni OH- , e viceversa.
14 X M INfcLWn

-> La scala del pH indica le concentrazioni


13 Candeggina
degli ioni H+ e 0H“ (per usi domestici)
II prodotto ionico dell’acqua, Kw, è alla base della s c a la d e l
p H (Tabella 2.5) e rappresenta un m odo appropriato di indi­ 12 Ammoniaca
(per usi domestici)
care la concentrazione degli H + (e q u indi d e g li OH- ) in
qualsiasi soluzione acquosa, n ell’am bito com preso tra 1 ,0 m 11
Aumento
H + e 1,0 m OH- . Il termine p H è definito dall’espressione della basicità
10
pH = log — = - lo g [H+]
[H J
9 Soluzione di soda
(bicarbonato)
Acqua di mare,
8
bianco d’uovo

TABELLA 2.5 La scala dei pH Sangue umano,


7 Neutralità lacrime
[H +] (M) PH [O H ] (M) pO H*
- Latte, saliva
10° (1) 0 IO-14 14 6
IO-1 1 i 10-13x n 13
IO-2 2 . IO-12 v i v 12
5 Caffè
IO-3 3 i r 11 : : li
lO -io 10
IO-4 4 . ■. Birra
IO-5 5 ' ■ i o 2*' : 9 4
IO-8 6 '' IO-8 : 8 Vino rosso
IO-7 7 ■ IO-7 ) t; 7
3 Coca Cola, aceto
IO-8 8 IO-6 : Í.
IO-9 9 IO-5 5
io -19 10 " IO"4' 4 2 Succo di limone
IO-11 11 " IO-3 3 Succo gastrico
IO-12 12 IO-2 2
1
10-is 13 IO-1 1
IO-14 14 10° (1) 0
0 1 .. um
* L’espressione pOH viene usata qualche volta per indicare la basicità, o la
concentrazione di OH", di una soluzione; il pOH viene definito dall’espressio­
ne pOH = -log [OH-], che è analoga all’espressione del pH. Notate che in tutti FIGURA 2.7 • Il pH di alcune soluzioni acquose e di alcuni liquidi
i casi pH + pOH = 14. biologici.
© 9 78(68-Ó $)Ò 6413 -4 CAPITOLO 2 L'acqua :

■> Gli acidi e le basi deboli hanno caratteristiche costanti re è la sua tendenza a perdere protoni. La capacità degli
di dissociazione acidi (H A ) di perdere protoni e formare la base coniugata
Gli acidi cloridrico, solforico e nitrico, comunemente chia­ (A - ) è definita dalla costante di equilibrio della reazione
mati acidi forti, sono completamente ionizzati in soluzioni reversibile
acquose diluite; anche le basi forti NaOH e KOH sono com­
HA H+ + A "
pletamente ionizzate. Per i biochimici è più interessante il
per la quale
comportamento degli acidi e delle basi deboli, che in acqua
non sono completamente ionizzati. Nei sistemi biologici gli [H+]fA 1
Keq = *.
acidi e le basi deboli sono ubiquitari e svolgono ruoli impor­ [HA]
tanti nel metabolismo e nella sua regolazione. Per compren­
Le costanti di equilibrio per le reazioni di ionizzazione sono
dere il loro comportamento in soluzioni acquose è opportu­
in genere chiamate costanti di ionizzazione 0 costanti
no definire prima alcuni termini.
di dissociazione acide, spesso indicate con Ka. Le costan­
Gli acidi possono essere definiti come donatori di protoni, e
ti di dissociazione di alcuni acidi sono riportate nella Figura
le basi come accettori di protoni. Un donatore di protoni e
2.8. Gli acidi più forti, come l’acido fosforico 0 l’acido carbo­
il suo corrispondente accettore formano una coppia acido-
nico, hanno costanti di ionizzazione elevate, gli acidi più de­
base coniugata. L’acido acetico (CH3 COOH), un donatore
boli, come l’HPO2-, hanno costanti di ionizzazione più pic­
di protoni, e ¡’anione acetato (CH3 COO“), il corrisponden­
cole.
te accettore di protoni, costituiscono una coppia acido-base
La Figura 2.8 include anche i valori di pKa; quest’ultimo,
coniugata, i cui componenti sono correlati dalla seguente
analogamente al pH, è definito dall’equazione
reazione reversibile:

C H g C O O H ^ CH3COCT + H + pAa = log log Ka

In soluzione acquosa ciascun acido ha una sua caratteristi- Maggiore è la tendenza a liberare un protone, più forte è
ca tendenza a perdere protoni. Più forte è l’acido, maggio- l’acido e minore è il valore di pK&.

Acidi monoprotici
Acido acetico
(iTa = 1,74 X 10- 6 m)

Ammoniaca
(Ka = 5,62 X 10_ 10 m)

Acidi diprotici
Acido carbonico
1,70 10 4
(iT a = X _ m);

Bicarbonato
(Ka=6,31 10 X - u m)

Glicina,
gruppo carbossilico
(iT a = 4,57 10-3
X m);

Glicina,
grappo amminico
(Ka 2,51 10 10
= X ~ m)

Acidi triprotici
Acido fosforico
(Ka=7,25 10 8 X - m);

Fosfato diidrogenato
1,38 10 7
(K a = X - m);

Fosfato monoidrogenato
3,98 10-13
Cita = X M)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
PH

FIGURI. • Le coppie acido-base coniugate sono costituite da un pH a cui hanno luogo. Per ogni reazione vengono riportati i valori della costante di
donatore di protoni e da un accettore di protoni. Alcuni composti, come dissociazione (fQ e del suo logaritmo negativo, li ftk- .
l'acido acetico e lo ione ammonio, sono monoprotici, cioè possono liberare un solo * Per una spiegazione sulle apparenti discrepanze circa i valori dei pKa dell’acido
protone. Altri sono diprotici (acido carbonico, glicina) 0 triprotici (acido fosforico), Le carbonico (H2C03) vedi p. 33.
reazioni di dissociazione per ciascuna coppia sono riportate in corrispondenza del
3 2 1 CAPITOLO 2 L’acqua 8 978-88-08-06413-4

z.3 Meccanismi di tamponamento


delle variazioni di pH nei sistemi biologici
Quasi tutti i sistemi biologici dipendono dal pH; ima picco­
la variazione del pH può condurre a forti variazioni della
velocità di un processo. Questo è vero non solo per le nu­
m erose reazioni dove l ’H + è un reagente, ma anche per
quelle in cui l’H + sembra non avere alcun ruolo. Gli enzimi
che catalizzano le reazioni cellulari e le numerose m oleco­
le su cui agiscono contengono gruppi ionizzabili con carat­
teristici valori di pAa. Per esempio, i gruppi amminici e car- = [H+][Ac~]
bossilici protonati degli amminoacidi ed i gruppi fosfato dei [HAc]
nucleotidi si comportano come acidi deboli; il loro stato di
FIGURA 2.9 • La coppia acido acetico-acetato è un sistema tampone.
ionizzazione dipende quindi dal pH del mezzo circostante. Il sistema è in grado di assorbire sia H+ sia OH" attraverso la dissociazione
(Quando un gruppo ionizzabile viene sequestrato all’inter­ reversibile dell’acido acetico. Il donatore di protoni, in questo caso l’acido
no di una proteina, lontano dal solvente acquoso, il valore acetico (HAc), contiene una riserva di ioni H+ legati a sé, che possono essere
rilasciati per neutralizzare un'aggiunta di ioni OH" al sistema, formando acqua.
del suo p/fa, o pK» apparente, può essere significativamen­ Ciò avviene ogni volta che il prodotto [H+][0H"] eccede il valore di K„
te diverso da quello del p ffa in acqua.) Come abbiamo no­ (1 x 10“ 14 m2): l’equilibrio si stabilisce rapidamente fino a che il prodotto non
tato in precedenza, le interazioni ioniche sono tra le forze diventa uguale a 1 x 10"14 m2 (a 25 °C), riducendo cosi temporaneamente la
concentrazione di ioni H+. Ma ora il quoziente [H+][Ac"]/[HAc] è diventato più
che stabilizzano le proteine e permettono agli enzimi di ri­ basso della e quindi HAc si dissocia per ripristinare l’equilibrio.
conoscere e legare i loro substrati. Analogamente, la base coniugata Ac" può reagire con gli ioni H+ aggiunti al
Le cellule e gli organismi mantengono il loro pH interno ad sistema; le due reazioni di ionizzazione si modificheranno simultaneamente per
raggiungere di nuovo l’equilibrio. Quindi una coppia coniugata acido-base,
un valore costante e specifico, generalmente vicino a pH 7, come l’acido acetico e lo ione acetato, tende a resistere alle variazioni del pH
mantenendo le biomolecole nel loro stato ionico ottimale. quando al sistema vengono aggiunte piccole quantità di acido o di base.
Negli organismi multicellulari il pH dei liquidi extracellulari L’azione tamponante è semplicemente la conseguenza delle due reazioni
reversibili che avvengono simultaneamente per raggiungere il loro equilibrio,
è anche strettamente controllato. Il pH è mantenuto costan­ governato rispettivamente dalle costanti di equilibrio K* e /q.
te per la presenza dei tamponi biologici: miscele di acidi de­
boli e delle loro basi coniugate.

-> I tamponi sono miscele di acidi deboli di titolazione di ogni acido debole è descritto dall’equazione
e delle loro basi coniugate di Henderson-Hasselbalch, particolarmente importante per
I tam p on i sono sistemi acquosi che tendono ad opporsi alle comprendere l’azione tamponante e il bilancio acido-base
variazioni di pH quando vengono aggiunte piccole quantità nel sangue e nei tessuti dei vertebrati. L’equazione è sempli­
di un acido (H +) o di una base (O H " ). Un sistema tampone cemente un modo alternativo di esprimere la costante di io­
è costituito da un acido debole (donatore di protoni) e dalla nizzazione di un acido. Per la dissociazione di un acido de­
sua base coniugata (accettore di protoni). bole, l’equazione di Henderson-Hasselbalch può essere rica­
La capacità tamponante deriva da due reazioni all’equilibrio, vata come segue:
che avvengono in una soluzione contenente quantità quasi
[H+][A -]
uguali di un donatore di protoni e del suo accettore coniuga­
[HA]
to di protoni. La Figura 2.9 spiega come funziona un tampone.
Se si aggiungono H+ o OH- si osserva ima piccola variazione Risolvendo per [H+]:
del rapporto tra le concentrazioni relative dell’acido debole e [HA]
[H+] = Ka
del suo anione, e quindi solo una piccola variazione del pH. La [A“ ]
diminuzione della concentrazione di uno dei componenti del
Prendendo il logaritmo negativo di entrambi i termini:
sistema è esattamente bilanciata dall’aumento dell’altra.
Ogni coppia acido-base coniugata ha un ambito di pH carat­ [HA]
-log [H+] = - l o g A a—log
teristico nel quale esercita la funzione di tampone. La cop­ [A "
pia H2PO 4/HPOf" ha un pKàdi 6,88, quindi può tamponare Sostituendo -log[H +] con pH e -log [ALI con pKa :
approssimativamente tra pH 5,9 e 7,9. La coppia NH 4/NH3,
[HA]
che ha un p ifa di 9,25, può agire come tampone approssima­ pH = pAa - lo g
[A -
tivamente tra pH 8,3 e pH 10,3.
Ora invertiamo il rapporto -log[HA]/[A~], che comporta anche
-> L’equazione di Henderson-Hasselbalch il cambio di segno, e si ottiene l’equ az io n e d i H e n d e rso n -
mette in relazione tra loro il pH, il p/Ca H asselbalch:
e la concentrazione della soluzione tampone
[A~]
Le curve di titolazione dell’acido acetico, deH’H2P 04 , e del- pH = p lfa + log (2.5)
[HA]
l’N IL 1hanno ima forma quasi identica, suggerendo che ob­
bediscano ad una stessa legge o ad imo stesso tipo di inter­ Questa equazione esprime la curva di titolazione di tutti gli
relazione. Ed infatti è proprio così. L’andamento della curva acidi deboli e ci permette di dedurre alcune importanti rela-
3-88-08-06413-4 CAPITOLO 2 L’acqua 133
zioni quantitative. Per esempio, mostra perché il valore di pKd
di un acido debole è uguale al pH della soluzione al punto di ir - HCOa
mezzo della titolazione. A questo punto, [AH] = [A- ], e reazione 1

pH = pAa + log 1 = pAa + 0 = pKd


Fase acquosa 11*008
L’equazione di Henderson-Hasselbalch ci permette (1 ) di (sangue nei capillari)
calcolare il valore di p lfa, conoscendo il pH e il rapporto mo­ H20 ^ h 2o
lare tra il donatore di protoni e l’accettore di protoni; ( 2) di
C02(d)
calcolare il pH, conoscendo il pKae il rapporto molare tra il
donatore di protoni e l’accettore di protoni; (3 ) di calcolare reazione 3
Fase gassosa
il rapporto molare tra donatore e accettore di protoni, cono­
(spazi aerei del polmone) CO, (g )
scendo il pH e il pKa.

Gli acidi o le basi deboli si oppongono nelle cellule FIGURA 2 .1 0 • Il sistema tampone bicarbonato. La C02 negli spazi aerei
e nei tessuti alle variazioni di pH del polmoni è in equilibrio con il tampone bicarbonato del plasma sanguigno
che passa nei capillari polmonari. Poiché la concentrazione di C02 dlsclolta può
Il pH dei fluidi intracellulari ed extracellulari degli organi­
essere modificata rapidamente da variazioni della frequenza respiratoria, il
smi muLticeUulari viene mantenuto pressoché costante. La sistema tampone bicarbonato del sangue è potenzialmente In equilibrio con una
prima difesa contro le variazioni del pH intracellulare con­ grande riserva di C02.
siste nell’azione dei sistemi tampone: il citoplasma di quasi
tutte le cellule contiene proteine a concentrazioni elevate,
e le proteine contengono molti amminoacidi con gruppi fun­
In condizioni normali l’anidride carbonica è un gas e la con­
zionali riconducibili ad acidi o basi deboli. Per esempio, la
centrazione di C 0 2 disciolta è in costante equilibrio con la
catena laterale dell’istidina ha un pK d di 6,0; quindi le pro­
C 0 2nella fase gassosa (g ):
teine che contengono residui di istidina possono fungere da
tamponi a valori prossimi al pH neutro. A pH neutro, la cate­
C 0 2( g ) ^ C 0 2(d )
na laterale dell’istidina può esistere in forma protonata o de-
protonata. K= [C O z C d )]
I due sistemi tampone biologici più importanti sono il fosfa­ 3 [C0 2(g )]
to e il bicarbonato. Il sistema tampone fosfato, che agisce Il pH del sistema tampone bicarbonato dipende dalla con­
nel citoplasma di tutte le cellule, è costituito dal donatore di centrazione di H2C 0 3 e HC 03, rispettivamente donatore e
protoni H2P0J e dall’accettore di protoni HPOf~: accettore di protoni del sistema, ma la concentrazione di
H2C 0 3 dipende a sua volta dalla concentrazione della C0 2
H2P0J H + + IlPO f
disciolta, che è in equilibrio con la C0 2 presente nella fase
II sistema tampone fosfato è prevalentemente attivo a un gassosa, o pressione parziale della C 0 2, indicata come
pH intorno al suo valore di pKadi 6,86 (vedi la Figura 2.8) pC 02. Quindi il pH di un tampone bicarbonato in equilibrio
e quindi tende a resistere a variazioni del pH nella regio­ con la fase gassosa è in ultima analisi determinato dalla con­
ne compresa tra 5,9 e 7,9. Questo sistema è particolar­ centrazione di H C 0 3 nella fase acquosa e dalla pressione
mente efficace nel tamponare il pH dei fluidi intracellulari; parziale di C 0 2nella fase gassosa.
nei mammiferi, per esempio, i fluidi extracellulari e molti Il tampone bicarbonato è efficace al pH fisiologico intorno a
compartimenti citoplasmatici hanno un pH compreso tra 7,4, in quanto rH 2C 0 3 del plasma sanguigno è in equilibrio
6,9 e 7,4. con l’ampia riserva di C 0 2 (g ) dei polmoni. Come si è detto,
Il plasma sanguigno è tamponato in parte dal sistema bicar­ questo sistema tampone comprende tre equilibri reversibili,
bonato, costituito da acido carbonico (H 2C 03) come dona­ a partire dalla C 0 2 gassosa nei polmoni fino al bicarbonato
tore di protoni e da bicarbonato (H C 03) come accettore (K t (H C 03) nel plasma sanguigno (Figura 2.10).
è la prima di svariate costanti di equilibrio del sistema tam­
pone bicarbonato):
za L’acqua come reagente
H2CO3 H+ + HCOg
L’acqua non è solo il solvente in cui avvengono tutte le rea­
K [h +][ h c o 3-] zioni chimiche delle cellule viventi; spesso essa partecipa di­
1 [H2CO3] rettamente alle reazioni. Per esempio, la formazione di ATP
Questo sistema è più complesso delle altre coppie coniuga­ da ADP e fosfato inorganico è una reazione di condensa­
te acido-base, in quanto uno dei suoi componenti, l’acido zione, in cui vengono ehminati gli elementi dell’acqua. La
carbonico (H 2C 03), si forma dalla C 0 2disciolta (d ) in acqua reazione inversa, la scissione accompagnata dall’aggiunta
in base alla relazione reversibile: degli elementi dell’acqua, è detta reazione di idrolisi. Le
reazioni di idrolisi sono responsabili anche della depolime­
C0 2(d ) + H 20 ^ H 2C 0 3 rizzazione enzimatica delle proteine, dei carboidrati e degli
acidi nucleici. Le reazioni di idrolisi sono quasi invariabil­
K [H2CQ3]
mente esoergoniche. Poiché queste reazioni producono due
2 [C0 2(d )][H 20]
molecole da una, aumentano il disordine del sistema. La for-
1
3 4 CAPITOLO 2 L’acqua © 978-88-0* «6413 4

mazione di polimeri cellulari dalle loro unità costitutive sem­


plici tramite reazioni di condensazione è un processo endo-
ergonico e quindi non spontaneo.
Mentre state leggendo questo testo, consumate ossigeno.
L’acqua e ranidride carbonica (C 0 2) sono i prodotti finali
dell’ossidazione di combustibili come il glucosio. Il proces­
so globale può essere così riassunto:

C6H 120 6 + 6 0 2---- > 6 C 0 2 + 6 H20


Glucosio

L’acqua “metabolica” formatasi attraverso l’ossidazione dei


nutrienti e dei grassi di deposito permette la sopravvivenza
di alcuni animali (gerbilli, ratti canguro, cammelli) in am­
bienti aridi, senza bere acqua anche per lunghi periodi.
La C0 2prodotta dall’ossidazione del glucosio viene conver­
tita negli eritrociti nel più solubile ione HCO) in una reazio­
ne catalizzata dall’anidrasi carbonica:

C0 2 + H20 v ^ H C 0 i + H+

In questa reazione l’acqua non è solo un substrato, ma par­


tecipa anche al trasferimento protonico, formando un reti­
colo di molecole d’acqua unite da legami idrogeno attraver­
so il quale avviene il processo del salto protonico.
Le piante verdi e le alghe usano l’energia solare per scinde­
re l’acqua nel processo della fotosintesi: L'ambiente acquoso dà sostentamento a una miriade di specie. Delicati coralli,
spugne, briozoi e alghe si contendono lo spazio su questa scogliera al largo
2 H20 + 2 A ^ \ 0 2 + 2 AH2
dell’arcipelago delle Filippine.

In questa reazione A è un composto accettore di elettroni,


che varia a seconda dell’organismo fotosintetico; l’acqua
serve come donatore di elettroni in una sequenza di reazio­ impedendo allo stagno (e agli organismi che lo popolano) di
ni di ossidoriduzione fondamentale per la vita sulla Terra. congelare. Assai rilevante per tutti gli organismi viventi è il
fatto che molte delle proprietà fisiche e biologiche delle ma­
cromolecole cellulari, in particolare le proteine e gli acidi
nucleici, derivano dalla loro interazione con le m olecole
2.5 L’ambiente acquoso
d’acqua dell’ambiente circostante. L’influenza dell’acqua nel
è adatto alla vita corso dell’evoluzione biologica è stata determinante. Se altre
Gli organismi viventi si sono ben adattati all’ambiente ac­ forme di vita si sono evolute in qualche parte delTuniverso, è
quoso e hanno evoluto sistemi per sfruttare le speciali pro­ difficile che assomiglino a quelle della Terra, a meno che non
prietà dell’acqua. L’elevato calore specifico dell’acqua si siano originate in un luogo dove l’acqua allo stato liquido è
(l’energia termica richiesta per aumentate di 1 °C la tempe­ abbondante.
ratura di 1 g d’acqua) è utile alla cellula e agli organismi, in
quanto consente all’acqua di agire come “tampone termico”,
mantenendo la temperatura di un organismo relativamente
TERMINI CHIAVE
costante, anche se quella dell’ambiente circostante varia, o
viene generato calore come sottoprodotto del metabolismo. I termini in grassetto sono definiti nel glossario.
Inoltre alcuni vertebrati sfruttano l’elevato calore di vapo­
rizzazione dell’acqua (Tabella 2.1) utilizzando (quindi per­ antipatico 26
dendo) l ’eccesso di calore corporeo per evaporazione del­ condensazione 33
coppia acido-base coniugal a 31
l’acqua (il sudore). L’elevato grado di coesione interna del­
costante di dissociazione acida (K „ ) 31
l’acqua allo stato liquido, dovuto ai legami idrogeno, è sfrut­
costante di equilibrio ( l i ei|) 29
tato dalle piante per trasportare i nutrienti sciolti in acqua
energia di dissociazione 24
dalle radici alle foglie durante il processo della traspirazio­
equazione di Henderson-Hasselbalch 32
ne. Anche la densità del ghiaccio, più bassa di quella dell’ac­ forze di London 27
qua allo stato liquido, ha importanti conseguenze biologiche idrofilico 25
nel ciclo vitale degli ammali acquatici. Gii stagni ghiacciano idrofobico 25
dall’alto verso il basso, quindi lo strato di ghiaccio che si idrolisi 33
forma in superficie isola l’acqua sottostante dall’aria fredda, interazioni di van der Waals 27
©978¿88-0S)064Í3~4 CAPITOLO Z L’acqua

interazioni idrofobiche 26 3. S ig n ific a to fisic o d e l p KA. Quali delle seguenti solu­


ipertonìco 28 zioni acquose ha il pH più basso: 0,1 m HC1; 0,1 m acido
ipotonico 28 acetico (p ffa = 4,86); 0,1 m acido formico (p KR= 3,75)?
isotonico 28
legame idrogeno 24 4. Id e n tific a z io n e d e lla b a se con iu gata. Qual è la base
micella 26 coniugata in ciascuna delle seguenti coppie di compo­
osmolarità 28 sti?
osinosi 28 (a ) RCOOH, RCOCT (c ) H2P 0 4
~ , H 3PO 4
pH 30 (b ) RNH2, RNH3+ (d ) H 2CO3, HCO 3
Piia 31
B, S h| T r a t t a m e n t o d e l l ’e s a n t e m a d a v e le n o d i
prodotto ionico dell’acqua (K w) 29
e d e ra . I catecoli sostituiti con gruppi alchilici a
tampone 32
catena lunga sono i componenti del veleno di edera e di
quercia, che produce il caratteristico esantema prurigi­
noso.
OH
ULTERIORI U 7 : : v . .
OH
Denny, M.W. (1993) A ir and Water: The Biology and Physics of
Life’s Media, Princeton University Press, Princeton, NJ.
(C H A - C H 3
Un’ottima descrizione dell’importanza biologica dette proprie­
tà dell’acqua. pHa = 8
Franks F. e Mathias, S.F. (a cura di) (1982) Biophysics of Water, Se foste stati esposti al veleno dell’edera, quale dei se­
John Wiley e Sons, Ine., New York. guenti trattamenti usereste per trattare l’area colpita?
’ Una grande raccolta di lavori sulla struttura dell’acqua pura e Giustificate la vostra scelta.
del citoplasma. (a ) Lavaggio dell’area con acqua fredda.
Frieden, E. (1975) Non-covalent interactions: key to biological fle­ (b ) Lavaggio dell’area con aceto o succo di limone diluito.
xibility and specificity. J. Chem. Educ. 52, 754-761. (c ) Lavaggio dell’area con sapone e acqua.
Una rassegna sui quattro tipi di interazioni deboli che stabilizza­ (d ) Lavaggio dell’area con sapone, acqua e bicarbonato.
no le macromolecole e conferiscono specificità biologica, cor­
redata di ottimi esempi. e. gsg p h e a s s o r b im e n t o d e i fa rm a c i. L’aspirina è
Jeffrey, G.A. (1997) A n Introduction to Hydrogen Bonding, Ox­ un acido debole con un pKadi 3,5:
ford University Press, New York.
., Una discussione dettagliata di livello avanzato sulla struttura e
sulle proprietà dei legami idrogeno, inclusi quelli che coinvol­
gono le molecole d’acqua e le biomolecole.
Kunz, I.D. e Zipp, A. (1977) Water in biological systems. N. Engl.
J.Med. 297, 262-266.
Una breve rassegna sullo stato fisico dell’acqua citosolica e sulle
sue interazioni con le biomolecole disciolte.
Segei, I.H. (1976) Biochemical Calculations, 2a ed., John Wiley &
Sons, Ine., New York. Essa viene portata nel sangue attraverso le cellule
Iknford, C. (1978) The hydrofobic effect and the organization of dello stomaco e dell’intestino tenue. L’assorbimento ri­
living matter. Science 200,1012-1018. chiede l’attraversamento della membrana piasmatica,
Una classica rassegna sulle basi chimiche ed energetiche delle
che è limitato dalla polarità della molecola: le moleco­
le cariche o altamente polari non possono attraversare
interazioni idrofobiche tra biomolecole in soluzione acquosa.
la membrana, mentre quelle neutre e idrofobiche sono
Westhof, E. (a cura di) (1993) Water and Biological Macromole-
permeabili. Il pH del succo gastrico nello stomaco è
cules, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.
circa 1,5 e il pH del m ezzo contenuto nell’intestino
Quattordici capitoli, ognuno di un autore diverso, prendono in
tenue è circa 6. Viene assorbita e portata al sangue più
considerazione (ad un livello avanzato) la struttura dell’acqua e
aspirina nello stomaco 0 nelFintestino tenue? Giustifi­
le sue interazioni con le proteine, gli acidi nucleici, i polisacca­
cate la vostra scelta.
ridi e i lipidi.

J, C alc olo d e l p H d alla concentrazione m olare. Qual è


il pH di una soluzione contenente 0,12 moli/L di NH 4C1 e
0,03 moli/L di NaOH (il pK-ddi NH 4/NH3 è 9,25)?

8. C a lc o lo d e l p H p e r t it o la z io n e d i u n a cid o d e b o ­
1. S o lu b ilit à d e ll’e t a n o lo in a c q u a . Spiegate perché le. Il pK&di un composto è 7,4. A 100 mL di una solu­
l ’eta n o lo (C H 3 CH 2 O H ) è più solubile in acqua che in zione 1,0 m del composto a pH 8 si aggiungono 30 mL di
etano (C H 3 CH 3). una soluzione di acido cloridrico 1,0 M. Qual è il pH della
soluzione risultante?
2. C a lc o lo d e l p H d a lla c on c e n tra z io n e d i io n i id r o ­
gen o. Qual è il pH di una soluzione che ha una concen­ 9. P r o p r ie t à d i u n ta m p o n e . L’amminoacido glieina è
trazione d iH +: (a ) 1,75 X l ( T 6moli/L; (b ) 6,50 X IO “ 10 usato molto spesso come ingrediente principale di un
moli/L; (c ) 1,0 X 10^4moli/L; (d ) 1,50 X 10~Bmoli/L? tampone negli esperimenti biochimici. Il gruppo arruni-
nico della glieina, che ha un piTa di 9,6, può trovarsi sia
3 6 1 CAPITOLO 2 L’acqua « o r a HH-OR 06413 4

nella form a protonata ( — NH 3) sia come base libera tra base coniugata e acido a pH 5,0 per un acido debole
( — NH2) per l’equilibrio reversibile con un pKa di 6,0.

R— N ili R— NH 2 + H+
13. Preparazione di un tampone con un determinato
(a ) In quale ambito di pH la glieina può essere usata come pH e una determinata forza ionica. Data una solu­
tampone, utilizzando le proprietà acido-base del suo zione 0,10 M di acido acetico (p ffa = 4,76) e sodio ace­
gruppo amminico? tato, descrivete come fareste a preparare 1,0 L di tam­
(b ) In una soluzione 0,1 M di glieina a pH 9,0, quale frazione pone acetato 0,10 m a pH 4,00.
di glicina ha il suo gruppo amminico nella forma — NHg ?
(c ) Quanta KOH 5 M deve essere aggiunta a 1,0 L di glicina 14. Scelta di un acido debole per la preparazione di
0,1 M a pH 9,0 per portare il suo pH a 10,0? un tampone. Quale di questi composti sarebbe il mi­
(d ) Per avere il 99% della glicina con il suo gruppo ammini­ glior tampone a pH 5: acido formico (p K3 = 3,8), acido
co nella forma — N H j, quale deve essere la relazione acetico (pila = 4,76), 0 l’etilammina (p ifa = 9,0)? Com­
numerica tra il pH della soluzione e il pJTa del gruppo mentate brevemente la risposta.
amminico della glicina?
15. Lavorando con i tamponi. Un tampone contiene
10. Preparazione di un tampone fosfato. Quale rap­ 0,010 moli di acido lattico ( p = 3,86) e 0,050 moli di
porto molare tra HPOt- e H2POJ in soluzione corri­ lattato di sodio per litro, (a ) Calcolate il pH del tampo­
sponderà ad un valore di pH pari a 7,0? L’acido fosforico ne. (b ) Calcolate la variazione di pH quando si aggiun­
(H 3P O 4) , un acido triprotico, ha tre valori di pK a: 2,14, gono 5 m L di HC10,5 M a 1 L di tampone, (c ) Quale va­
6,86, e 12,4. Suggerimento: solo uno dei tre valori di p K& riazione di pH vi aspettereste, aggiungendo la stessa
interessa per la risoluzione del problema. quantità di HC1 a 1 L di acqua pura?

11. Preparazione di un tampone standard per calibra­ 1G. Uso delle concentrazioni molari per calcolare il
re un pHmetro. L’elettrodo a vetro usato nei pHmetri pH. Qual è il pH di una soluzione che contiene 0,2 M di
commerciali produce una risposta proporzionale alla sodio acetato e 0,6 m di acido acetico (p K&= 4,76)?
concentrazione di ioni idrogeno. Per convertire questa
risposta in pH, l’elettrodo a vetro deve essere calibrato 17. Preparazione del tampone acetato. Calcolate la
utilizzando una soluzione standard con ima concentra­ concentrazione di acido acetico (pfTa = 4,76) e dell’ace­
zione di ioni idrogeno nota. Determinate il peso in gram­ tato di sodio necessaria per preparare una soluzione
mi di sodio diidrogeno fosfato (NaH 2P 0 4• H20; peso for­ tampone 0,2 M a pH 5,0.
mula 138) e di disodio idrogeno fosfato (Na 2H P04; peso
formula 142) necessario a preparare 1 L di un tampone 18. Effetto del trattenere il respiro sul pH del san­
, standard a pH 7,0 con una concentrazione totale di fo­ gue. Il pH dei liquidi extracellulari è tamponato dal si­
sfato di 0,1 M (vedi la Figura 2.9). Vedi il problema 10 stema bicarbonato/acido carbonico. Se si trattien ejl re-
per i valori di pK&dell’acido fosforico. spiro, aumenta la concentrazione della C 0 2(g ) nel san­
gue. Quale potrebbe essere l’effetto sul pH dei liquidi
12. Calcolo del rapporto molare tra base coniugata e extracellulari? Spiegate mostrando gli equilibri delle
acido debole dal valore del pH. Calcolate il rapporto reazioni coinvolte in questo sistema tampone.
Il termine proteina che ti propongo... deriva da proteios, perché ■>"
sembra essere la sostanza primitiva o principale della nutrizione jh>
animale che le piante producono per gli erbivori e che questi
forniscono ai carnivori.
J.J. Berzelius, lettera a G.J. Mulder, 1838

Amminoacidi,
e proteine
3.1 Gli am m ino a cid i 37 3.i Gli amminoacidi
3.2 I p eptidi e le proteine 42
-> Gli amminoacidi hanno proprietà strutturali comuni
3 .3 Lavorando con le proteine 44 Tutti i 20 amminoacidi presenti nelle proteine sono a-am-
3 .4 S tru ttu ra delle proteine: stru ttu ra p rim a ria 48 minoacidi. Essi hanno un gruppo carbossilico e un gruppo
amminico legati allo stesso atomo di carbonio (il carbonio
e proteine mediano praticamente tutti i processi che a ) (Figura 3.1), e differiscono l’uno dall’altro per la catena

L hanno luogo nelle cellule e svolgono un numero enor­


me di funzioni. Quando studiano i meccanismi moleco­
lari dei processi biologici, i biochimici quasi inevitabilmente
laterale, o g ru p p o R, che si differenzia per struttura, dimen­
sioni e carica e quindi influenza anche la solubilità dell’am-
minoacido nell’acqua. In aggiunta a questi 20 amminoacidi
ne esistono altri meno comuni. Alcuni di questi subiscono
si imbattono in una o più proteine. Le proteine sono le macro-
molecole biologiche più abbondanti, presenti in tutti i tipi di modificazioni dopo essere stati inseriti nelle proteine; altri
cellule e in tutte le frazioni subcellulari. La loro varietà è sono amminoacidi presenti nell’organismo ma che non
molto grande: in una singola cellula se ne possono trovare mi­ fanno parte delle proteine. A ogni amminoacido presente
gliaia di diversi tipi. Poiché la funzione di un organismo dipen­ nelle proteine è stata assegnata un’abbreviazione a tre let­
de dalla funzione delle proteine, esse possono essere consi­ tere e un simbolo a una lettera (Tabella 3.1), utilizzati per
derate il prodotto finale dei processi di informazione analiz­ indicare le sequenze e le composizioni in amminoacidi delle
zati nella Parte 3 di questo libro. Le proteine sono gli stru­ proteine.
menti molecolari con cui si esprime Finformazione genetica. Il codice a tre lettere utilizzato
Unità monomeriche relativamente semplici sono alla base è di facile interpretazione, per- •
della struttura delle migliaia di differenti proteine. Sia che ché consiste delle prime tre let­
appartengano alle specie batteriche più antiche, o alle forme tere del nome inglese dell’am-
di vita più complesse, le proteine sono formate sempre dalla minoacido; il codice a una let­
stessa serie di 20 amminoacidi, uniti covalentemente in ca­ tera fu introdotto Margaret Oa-
ratteristiche sequenze lineari. Poiché ogni amminoacido ha kley Dayoff (1925-1983), con­
una catena laterale con specifiche proprietà chimiche, i siderata dai più come il fonda­
venti amminoacidi possono essere considerati come l’alfa­ tore della bioinformatica. Il co­
beto con cui è scritto il linguaggio della struttura delle pro­ dice a una lettera è stato intro­
teine. Le proteine possono avere dimensioni diverse, da dotto al tempo dei computer a Margaret Oakley Dayhoff
quella dei piccoli peptidi formati da un numero relativamen­ scheda perforata per risponde- (1925-1983)
te basso di residui amminoacidici a quella dei grossi polime­
ri dal peso molecolare di milioni.
La struttura e la funzione delle proteine sono gli argomenti cocr FIGURA 3.1 • Struttura generale di un
dì questo e dei successivi tre capitoli. In questo capitolo + | amminoacido. Questa struttura è comune a tutti
tratteremo le proprietà chimiche fondamentali degli ammi­ H 3N —-( — H gli a-ammlnoacldl, meno uno (la pralina, un
[ amminoacido cìclico, è l'eccezione.) Il gruppo R
noacidi, dei peptidi e delle proteine. Vedremo anche come i 1 (o catena laterale, in rosso) è legato al carbonio a
biochimici studiano le proteine. (In blu) ed è diverso in ogni amminoacido.
3 8 1 CAPITOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine ©978-88-08-06413-4’

re alla necessità di ridurre le dimensioni dei file usati per le razioni correlate alla L-gliceraldeide sono designati con la
sequenze amminoacidiche. lettera l ; gli stereoisomeri correlati alla D-gliceraldeide sono
In tutti i comuni amminoacidi, eccettuata la glioma, il carbo­ indicati con la lettera d . I gruppi funzionali della L-alanina
nio a è legato a quattro gruppi differenti: un gruppo carbos- sono disposti come quelli della L-gliceraldeide, allineando
silico, un gruppo amminico, un gruppo R, e un atomo di quelli che possono essere interconvertiti da una semplice
idrogeno (Figura 3.1; nella glieina il gruppo R è un altro reazione chimica in una singola tappa. Il gruppo carbossilico
atomo di idrogeno). Il carbonio a è dunque un centro chi- della L-alanina occupa la stessa posizione intorno all’atomo
rale (p. 9). A causa della disposizione tetraedrica degli orbi­ di carbonio chirale del gruppo aldeidico nella L-gliceraldei­
tali di legame, i quattro gruppi differenti possono disporsi de, in quanto il gruppo aldeidico può essere facilmente con­
nello spazio in due modi diversi, quindi per ogni amminoa­ vertito (ossidato) in un gruppo carbossilico. In passato una
cido sono possibili due stereoisomeri. Essendo immagini nomenclatura simile d ed l era stata usata per indicare l’at­
speculari luna dell’altra non sovrapponibili (Figura 3.2), le tività ottica delle molecole levogire (ruotano il piano della
due forme rappresentano una classe di stereoisomeri detti luce polarizzata verso sinistra) e destrogire (ruotano il piano
enantiomeri. della luce polarizzata verso destra). Non tutti gli L-ammino-
È stato sviluppato uno speciale sistema di nomenclatura per acidi sono levogiri e la convenzione mostrata nella Figura
specificare la configurazione assoluta dei quattro sosti­ 3.3 cerca solo di evitare ambiguità a livello della configura­
tuenti degli atomi di carbonio asimmetrici. La configurazio­ zione assoluta. Nella convenzione di Fischer l e d si riferi­
ne assoluta di zuccheri e amminoacidi semplici viene stabi­ scono soltanto alla configurazione assoluta dei quattro so­
lita con il sistema d , l (Figura 3.3), basato sulla configura­ stituenti attorno a un carbonio chirale e non alle proprietà
zione assoluta dello zucchero a tre atomi di carbonio glice- ottiche della molecola.
raldeide, una convenzione proposta da Emil Fischer nel
1891. (A quel tempo Fischer conosceva quali erano i gruppi -> | residui amminoacidici delle proteine
che circondavano il carbonio asimmetrico della gliceraldei- sono tutti stereoisomeri l
de, ma poteva solo supporre quale fosse la sua configurazio­ Quasi tutti i composti biologici con un centro chirale sono
ne assoluta; l’analisi della diffrazione dei raggi X dei compo­ presenti in natura soltanto in una forma stereoisomerica, l o
sti cristallini ha poi confermato le previsioni di Fischer.) Per d . I residui degli amminoacidi nelle molecole proteiche sono
tutti i composti chirali, gli stereoisomeri che hanno configu- tutti stereoisomeri l . Gli amminoacidi della serie d sono pre­
senti solo in pochi peptidi; solitamente piccoli, come quelli
della parete cellulare dei batteri, e in qualche peptide con
COO ...... - COCr funzioni di antibiotico.
È degno di nota che tutti i residui amminoacidici delle pro­
teine abbiano la configurazione assoluta l . Le cellule sono in
grado di sintetizzare specificamente l’isomero l degli ammi­
noacidi in quanto i siti attivi degli enzimi sono asimmetrici e
le reazioni che essi catalizzano possono essere stereospeci­
fiche.
(a ) L-Manina D-Manina

CO.O“ X " cocr

H3N— C—H H ^ G —NH, Gli O

OH 3 GII:; H O -^G ^H H— C —«OH

(b ) l -Manina D-Manina sCH2OH CH2OH


L-Gliceraldeide D-Gliceraldeide

eoo- cocr GOO. eoo.


+ I I +
H 3N — C — H H— C—N H ; HSN ^ Q — H H — C— N H 3
I
ch 3 CH3 ch3

(c ) l -Manina D-Manina l -Manina d-Manina

FIGURA 3.2 • Stereoisomeria degli a-amminoacldi. (a) I due FIGURA 3.3 • Relazione sterica tra gli stereoisomeri dell’alanina e la
stereoisom eri dell'alanina, l - e D-alanina, sono immagini speculari non configurazione assoluta della l~ e della D-gliceraldeide. In queste formule
in prospettiva gli atomi di carbonio son o allineati in senso verticale, con l’atom o
sovrapponibili l’una rispetto all’altra (enantiomeri), (b, c) Le due diverse
chirale al centro. Gli atomi di carbonio son o numerati a partire dal gruppo
convenzioni che descrivono la con figurazione nello spazio degli stereo isomeri.
Nelle formule In prospettiva (b) i legami cuneiformi solidi si proiettano sopra II aldeidico o dal gruppo carbossilico posto a un’ estrem ità (in rosso)

piano del foglio, mentre i legami indicati da un cuneo tratteggiato puntano sotto e p roceden do dall’alto in basso verso l’ estrem ità della m olecola
il piano del foglio. Nelle formule di proiezione (c) si assume che i legami (da 1 a 3). Con questo tipo di rappresentazione il gruppo R d ell’ am minoacido
orizzontali si proiettino sopra II plano, quelli verticali sotto il piano del foglio. Le (inquesto ca s o il gruppo metilico dell’ alanina) è sem pre sotto il carbonio a .
Gli L-amminoacidi hanno il gruppo «-a m m in ic o sulla sinistra, mentre ì
formule di proiezione vengono spesso usate casualmente senza riferirsi a
D-ammlnoacldi hanno II gruppo «-a m m in ic o sulla destra.
specifiche configurazioni stereochimiche.
0 ) 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4 SALOLO 8 Amminoacidi, peptidi e proteine

-» Gli amminoacidi possono essere classificati zioni idrofobiche. La glieina ha la struttura più semplice ed
in base al loro gruppo R anche se si raggruppa più facilmente con gli amminoacidi
Per poter intraprendere lo studio della biochimica è essen­ non polari la sua minuscola catena laterale non'contribuisce
ziale conoscere le proprietà chimiche degli amminoacidi più alla formazione di interazioni idrofobiche. La metionina,
comuni. Questo argomento può essere semplificato, rag­ uno dei due amminoacidi contenenti zolfo, ha un gruppo
gruppando gli amminoacidi in cinque classi principali, sulla tioetere non polare nella sua catena laterale. La prolina ha
base delle proprietà dei gruppi R (Tabella 3.1), utilizzando una catena laterale alifatica con una caratteristica struttura
in particolare la loro polarità, cioè la tendenza a interagire ciclica. Il gruppo amminico secondario (imminico) dei resi­
con l’acqua al pH fisiologico (intorno a 7,0). I gruppi R dui di prolina è mantenuto in una conformazione rigida, che
hanno uria polarità molto variabile, da quelli non polari e riduce la flessibilità strutturale delle regioni polipeptidiche
idrofobici (insolubili in acqua), fino a quelli altamente pola­ in cui è presente la prolina.
ri e idrofilici (solubili in acqua).
Le strutture dei 20 amminoacidi più comuni sono mostrate Gruppi R aromatici I tre amminoacidi fenilalanina, ti-
nella Figura 3.4, mentre alcune delle loro proprietà sono rosina e triptofano, con le loro catene laterali aromati­
elencate nella Tabella 3.1. All’interno di ciascun gruppo tro­ che, sono relativamente non polari (idrofobici). Tutti e tre
viamo amminoacidi con diverse gradazioni di polarità, gran­ possono intervenire nelle interazioni idrofobiche. Il grup­
dezza e forma dei gruppi R. po ossidrilico della tirosina può formare legami idrogeno,
e agisce come un gruppo funzionale importante in alcuni
Gruppi R alitatici, non polari I gruppi R di questa classe enzimi. La tirosina e il triptofano sono sensibilmente più
di amminoacidi sono non polari e quindi idrofobici. Le cate­ polari della fenilalanina, per la presenza del gruppo ossi­
ne laterali di alanina, vaiina, leucina e isoleucina tendo­ drilico nella tirosina e dell’atomo di azoto nell’anello indo-
no a raggrupparsi all’interno delle proteine, tramite intera­ lico del triptofano.

TABELLA 3.1 Proprietà e simboli convenzionali degli amminoacidi comuni presenti nelle proteine
Valori di p K*

Abbreviazione/ pf?i pK2 pKR Presenza


Amminoacido simbolo MT* (— COOH) ( — N H i) (gruppo R) nelle proteine (%)*

Grappi R animici, non polari


G li c i n a Gly G 75 2,34 9,60 7,2
A la n in a Ala A 89 2,34 9,69 7,8
Prolina Pro P 115 1,99 10,96 5,2
Vaiina Val V 117 2,32 9,62 6 ,6

Leucina Leu L 131 2,36 ' 9,60 9,1


Isoleucina Ile I 131 2,36 9,68 5,3
Metionina Met M 149 2,28 9,21 2,3

Gruppi R aromatici • ^ E Jj§§ -. '1

Fenilalanina Phe F 165 1,83 9,13 3,!l


Tirosina Tyr Y 181 2 ,2 0 9,11 10,07 3,2
Triptofano Trp W 204 2,38 9,39 1,4

Gruppi R polari, non carichi ri ri. ri


Senna Ser S 105 2 ,2 1 9,15 6 ,8

Treonina Thr T 119 2 ,1 1 9,62 5,9


Cisteina5 Cys C 12 1 1,96 10,28 8,18 1,9
Asparagina Asn N 132 2 ,0 2 8,80 4,3
Glutammina Gin Q 146 2,17 9,13 4,2

Gruppi R carichi positivamente


Lisina Lys K 146 2,18 8,95 10,53 5,9
Istidina His H 155 1,82 9,17 6 ,0 0 2,3
Arginina Arg R 174 2,17 9,04 12,48 5,1

Gruppi R carichi negativamente L ri ri (F ri ijjji.- . j¡¡¡¡¡


Aspartato Asp D 1 3 :: 1 ,8 8 9,60 3,65 . 5,3
Glutammato Giu E 147 2,19 9,67 4,25 6,3

* I valori diMr si riferiscono alle strutture mostrate nella Figura 3.4. (Gli elementi dell’acqua (Mt 18) non vengono inclusi quando l’amminoacido è incorporato in
un polipeptide.
* Presenza media in più di 1150 proteine. Tratto da Doolittle, R.F. (1989) Redundancies in protein sequences. ìn P r e d ic tio n o f P r o te in S tru ctu re a n d the P r i n ­
ciples o f P r o t e in C o n fo rm a tio n (Fasman, G.D., a cura di), pp. 599-623, Plenum Press, New York.
§ La cisteina viene generalmente classificata come polare, per la capacità del suo gruppo sulfidrilico di comportarsi da acido debole e formare un legame idroge­
no con l’ossigeno o l’azoto.
4 0 1 CAPITOLO 8 Amminoacidi, peptidi e proteine © 9 7 8 -8 8 ^0 8 -0 6 4 1 3 -4

Gruppi R alitatici, non polari

cocr eoo- cocr COO“

H3N+ I
H + I I j ì +
-H I

ffi
I
—C — h 3n - - +

0
.I.
c h
I

2
H CH;i h 2n
2| I
wh2
.- / CH
I

h 2c --------- c h 2
CH,. \ CHS
Glicina Alanina------ Prolina Vaiina

eoo- eoo- ' eoo -


I H N—C—H I H3N+ — CI —' H
H N—C—H
+ +

I I
3 3

OH, : l i - C—C1I 3 GII,

GII CIL CH,


0 1 f3 CII.'i
/ \ |
OH, | Gruppi R carichi positivamente
ch 3 COO' COO' COO'
Leucina Isoleucina Metionina + 1 + + 1

1
H3N — C —H H3N — C —H

2
-0
a
CIL OH, OH,.
1

Grappi R polari, non carichi


CH, GII, o - N ii r

eoo-
C1I2 OH, 1 //(:H
eoo- COO' C N
+ I + 1 + 1 ; ch2 NU
H3N — C—H HoN— C—H H3N — C —H 1
1 1 ; +n h 3 C---NIÍ2
CH ,O Il : ri C -OH CH,
NH,
; oh3 SH
Lisina Arginina Istidina
Serina Treonina Cisteina

eoo- COO“ Gruppi R carichi negativamente


+ I + 1
H3N — C—H H3N — C—H COO' COO'
I + 1 + 1
, ,c h 2 h 3n — c —h H3N — C—H
r
Òh 2 ch2 GII,
:H 2N 0
0

H gN ^ \ >
, n io '
#
COO'
Asparagina Glutammina Aspartato Glutammato

FIGURA 3.4 • 120 amminoacidi comuni presenti nelle proteine. è mostrato In una forma priva di carica, Il suo valore di pKa (vedi la Tabella 3.1)
Le formule di struttura mostrano lo stato ionizzato, che predomina a pH 7,0, è tale da far si che una parte piccola ma significativa di questi gruppi possieda
La parte non ombreggiata della struttura è comune a tutti gli amminoacidi; le una carica positiva a pH 7,0.
porzioni ombreggiate In rosa sono I gruppi R, Anche se II gruppo R dell’lstldina

G ru p p i R p o la ri, n o n c a rich i I gruppi R di questi ammi­ te ossidabile e forma, mediante un legame covalente, un di­
noacidi sono molto più solubili in acqua, o più idrofilici, di mero chiamato cistiua, in cui i due monomeri sono uniti da
quelli degli amminoacidi non polari perché contengono un ponte disolfuro (Figura 3.5). I residui di cisteina uniti da
gruppi funzionali che formano legami idrogeno con l’acqua. un ponte disolfuro sono molto idrofobici (non polari). Ponti
Questa classe di amminoacidi comprende la serin a, la tre o - disolfuro sono presenti in molte proteine e ne stabilizzano la
n in a, la c istein a, i’a s p a r a g in a e la glu tam m in a. La pola­ struttura, unendo mediante un legame covalente parti di una
rità della serina e della treonina è dovuta al loro gruppo os- stessa proteina o due proteine diverse.
sidrilico, quella della cisteina al gruppo sulfidrilico che è un
acido debole per cui può formare legami idrogeno deboli G ru p p i R c a rich i p o sitiv am e n te (b a s i c i ) I gruppi R più
con l’ossigeno e con l’azoto, e quella delTasparagina e della idrofilici sono quelli che contengono cariche nette sia positi­
glutammina ai loro gruppi ammidici. ve sia negative. Gli amminoacidi che hanno una catena late­
L’asparagina e la glutammina sono ammidi di altri due ammi­ rale con una carica netta positiva a pH 7,0 sono : la lisina, che
noacidi presenti nelle proteine, l’aspartato e il glutammato, ha un secondo gruppo amminico primario nella posizione e
rispettivamente, in cui le due ammidi possono essere conver­ della sua catena alifatica, l’argin in a, che ha un gruppo gua-
tite per blanda idrolisi acida o basica. La cisterna è facilmen­ nidinico carico positivamente, e l’istidina, che contiene un
© 978-88 -08-06413-4 CAPITOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine 141

COO- COO- nella sua catena laterale, il punto isoelettrico è semplice-


mente la media aritmetica dei due valori di pKa:
HSN — CH HgN — CH
Cisteina
ch2 ch2 pi = | (pKi + PKz) = | (2,34 + 9,60) = 5,97
. 1 2H- + 2e~ 1
SH S
s I Cistina Un amminoacido può avere una carica netta negativa a valo­
SH "\ S ri di pH superiori a quello del suo pi, e quindi in un campo
I 2H+ + 2e~ 1 elettrico migrerà verso il polo positivo (l’anodo). A pH infe­
ch2 ch2
Cisteina 1 + 1 + riori al valore di pi, la glieina ha una carica netta positiva, e
C H — NH 3 C H — NH 3
migrerà verso il polo negativo (il catodo). Più il pH di una
eoo- eoo- soluzione di un amminoacido è lontano dal suo punto isoe­
lettrico, maggiore sarà la carica netta della popolazione delle
FIGURA 3.5 • Formazione reversibile di un ponte disolfuro per ossidazione di molecole di un amminoacido.
due molecole di cisteina. I ponti disolfuro tra residui di Cys stabilizzano la
/
struttura di molte proteine.
-» Gli amminoacidi differiscono,
per le loro proprietà acido-base
gruppo imidazolico aromatico. L’istidina è il solo amminoaci­ Le proprietà che gli amminoacidi hanno in comune consen­
do delle proteine ad avere una catena laterale ionizzabile con tono di fare alcune generalizzazioni circa il loro comporta­
un pK&vicino alla neutralità; a pH 7 l’istidina può essere cari­ mento acido-base. Innanzitutto, gli amminoacidi con un solo
ca positivamente o pressoché priva di carica. In molte rea­ gruppo a-amminico, un solo gruppo «-carbossilico e un
zioni catalizzate da un enzima un residuo di His facilita la rea­ gruppo R non ionizzabile hanno valori di p A a molto simili,
zione agendo da donatore o da accettore di protoni. anche se non identici: il pKadel gruppo — COOH ha una va­
riabilità da 1,8 a 2,4 e il pKadel gruppo — N H Ì ha una varia­
Gruppi R carichi negativamente (acidi) I due amminoa­ bilità da 8,8 a 11,0 (Tabella 3:1). Si noti che il gruppo car­
cidi che hanno gruppi R con una carica negativa netta a pH bossilico di questo amminoaòido è circa 100 volte più acido
7,0 sono l’aspartato e il glutammato, ognuno dei quali ha (più facilm ente ionizzabile) del gruppo carbossilico del­
un secondo gruppo carbossilico. l’acido acetico. Il valore più basso del pAa è dovuto alla re­
pulsione tra il protone uscente e la vicina carica positiva
Gli amminoacidi possono comportarsi del gruppo amminico anch’esso legato al carbonio a, come
da acidi e da basi descritto nella Figura 3.7. Le cariche opposte sullo zwitte­
I gruppi amm inici e i gruppi carbossilici degli amminoacidi, rione risultante sono stabilizzanti. Analogamente, il pAa del
insiem e con i grappi R ionizzabili di alcuni di essi, agiscono gruppo amminico della glieina si sposta verso valori più
da acidi e basi deboli. Quando un amm inoacido che non pos­ bassi rispetto al valore medio del pAa di un gruppo ammini-
siede un g ru ppo R ion izza bile v ie n e sciolto in acqua a pH
neutro, esso esiste in soluzione sotto form a d i ion e dipola­
re, o zwitterione (d a l tedesco, “ione ibrido”) , e può com ­ H H
1
portarsi com e acido o co m e base (F ig u ra 3.6). I com posti
o-

R— C- R — C— C:
1

che hanno questa doppia natura (acido-base) sono detti an- | |


h 2n OH H;,N ! ()
foterici e spesso sono chiamati anfoliti (d a “ elettroliti an-
Forma non ionica Forma zwitterionica
fo terici”). Quando è com pletam ente protonato, un sem pli­
ce a-am m in oacido m onoam m ino m on ocarbossilico, com e
l’alanina, è un am m inoacido d ip rotico in quanto p o ssied e H H
due gru ppi funzionali che possono ced ere protoni: il grup- R — C — COO ' R — C — COO ~ + H +
po —'COOH e il gruppo - - n h 3+ . I
+n h 3 NH2
H Zwitterione
H+ H
? T come acido
R — C— COOH - ^ - * R— C— COO- R— C— COO
| j j

Carica +I ®3 +NH3 NH2


H H
netta: +1 0 -1 !
R — C — COO - + H R — C — COOH
I
+n h 3 +NH S
-» È possibile predire la carica elettrica
Zwitterione
degli amminoacidi come base
In base agli equilibri mostrati sopra, un amminoacido può
presentare una carica netta pari a zero, quando la carica ne­
gativa del gruppo carbossilico e la carica positiva del gruppo FIGURA 3.G • Forme non ioniche e zwitterioniche degli amminoacidi.
amminico si equivalgono. Il pH a cui si ha questa condizio­ La forma non ionica non è presente in quantità significativa in soluzione
acquosa. Lo zwitterione predomina a pH neutro. Uno zwitterione può
ne viene detto punto isoelettrico, o pH isoelettrico, in­ comportarsi da acido (donatore di protoni), ma anche da base (accettore
dicato con pi. Per la glieina, che non ha gruppi ionizzabili di protoni).
mm CAPITOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine 378-88-085-06413-45

pK, 2 4 6 8 IO 12

Gruppo; carbossiUco
v e gruppo ainmiuic.o
legali am i gruppo C II.. C O I 111 CH:i — COO- 1 CH3— NH 3 ^ CH:i— NH9.
metìlico
H+ H+
Acido acetico MeUlammina
Il valore normale dei P£a Il valore normale dei pKa
dei gruppi carbossilici è intiorno a 4,f dei gruppi anminici è intorno a 1 0 ,6

Gruppo carbossilico N IL
;i;:o gruppo amminieo I
dolía glicina H— G — COCT
I r
II
u-anrnunoaicido (filicina) «-amminoacidi (gliein a)
PKs = 2,34 pKa = 9 60
La repulsio re tra il gruppo Gli atomi di ossigeno
amrninico e i protone uscenti ;lettronegativi del gruppo
abbassa il p d e gruppo carboss:litico, caitoossilico tendoiio a sottrarre
e i gruppi coi i cariche opposti eléttroni dal gruppo amrninico
abbassano 1 valóre di p K, ■ abbassando illsuo pifa
stabilizzane o lo zwitterione

FIGURA 3.7 • Effetto della composizione dell’intorno chimico sul p K,. verso valori più bassi è dovuto a interazioni intramolecolari. Effetti analoghi
I valori di p/fa dai gruppi ionizzabiii della glieina sono più bassi di quelli dei gruppi possono essere causati da gruppi chimici nel caso che vengano a trovarsi l’uno
amminici e carbossilici legati a un gruppo metilico. Lo spostamento dei p/(, vicino all’altro, come può accadere nel sito attivo di un enzima.

co. Q uesto e ffe tto è dovu to in parte agli atomi di ossigeno mente più favorevole, il gruppo carbossilico deve essere chi­
e lettro n ega tivi d ei gru ppi carbossilici, che tendono ad at­ micamente modificato o attivato in modo che il suo gruppo
tra rre g li ele ttro n i, au m en tan do la tendenza del gruppo ossidrilico sia più facilmente eliminabile.
am m inieo a ced ere il p roton e. Quindi il gruppo a-ammini- Tre amminoacidi possono essere uniti tra loro da due legami
co ha un pK a più basso di qu ello di un’ammina alifatica, peptidici, formando un tripeptide; quattro amminoacidi ge­
co m e la m etila m m in a (Figura 3.7). Quindi il piTa di un nerano un tetrapeptide, cinque un pentapeptide e così via.
gru ppo funzionale è fortem ente influenzato dall’ambiente Quando il numero degli amminoacidi è relativamente picco­
ch im ico circostante. lo la struttura viene detta oligopeptide; se gli amminoacidi
sono invece tanti, il prodotto viene chiamato polipeptide.
Le proteine possono avere migliaia di residui amminoacidici.
Anche se i termini “proteina” e “polipeptide” sono spesso
3.2 I peptidi e le proteine
Rivolgiamo ora l’attenzione ai polimeri degli amminoacidi, i
R1 H R2
peptidi e le proteine. I peptidi presenti negli organismi vi­
+ I I I
venti hanno dimensioni che variano da due 0 tre residui am- H 3N — CH— C — OH + H—N — CH— COO"
minoacidici fino a migliaia di residui. Prenderemo ora in
0
esame le proprietà chimiche fondamentali di questi polimeri.
•H„0

-> I peptidi sono catene di amminoacidi


Due molecole di amminoacidi possono unirsi covalentemen­ R1 II R2
te mediante un legame ammidico, chiamato legame pepti- + I .il I
H 3N — CH— GS-N— CH— COO
dico, formando un dipeptide. Questo tipo di legame si ge­ II
nera per eliminazione di una molecola di acqua (deidrata­ O
zione) dal gruppo a-carbossilico di un amminoacido e dal
gruppo a-amminico dell’altro (Figura 3.8). La formazione
FIGURA 3.8 • Formazione di un legame peptidico per condensazione.
del legame peptidico è un esempio di una reazione di con­ Il gruppo a-amminico di un amminoacido (con il gruppo R2) agisce da nucleofilo
densazione, un tipo di reazione comune nelle cellule. Nelle e reagisce con un gruppo ossidrilico di un altro amminoacido (con il gruppo R1),
condizioni biochimiche standard, l’equilibrio della reazione formando un legame peptidico (ombreggiato in giallo). I gruppi amminici sono
buoni nucleofili, ma il gruppo ossidrilico non è un buon gruppo uscente e non
m ostrato nella Figura 3.8 favorisce gli am m inoacidi liberi ri­ viene facilmente spiazzato. Al pH fisiologico la reazione mostrata nella figura
spetto al dipeptide. P e r rendere la reazione term odinam ica­ non avviene a velocità apprezzabile.
S 9 7 S -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4 :i CAñTíl.O 0 Amminoacidi, peptidi e proteine

Alcune proteine sono costituite da una singola catena poli­


peptidica, mentre altre, chiamate proteine m u ltisu bu nità,
QHs-vC hanno due o più polipeptidi associati non covalentemente
\ :;h (Tabella 3.2). Le catene polipeptidiche presenti in una pro­
teina multisubunità possono essere identiche o diverse tra
NI Í >l( H il H <'H H OH.
+ I I I I I T I loro. Se almeno due sono identiche, la proteina viene detta
H 3N — C --C — N — C -C — N — C— O - N — C— C— N — C- e o o -
I " o lig om e ric a e le unità identiche (che possono essere costi­
I II I I II I
h or H 0 H O H Qà H tuite da una o più catene polipeptidiche) sono chiamate p r o ­
Estremità Estremità tom eri. L’emoglobina, per esempio, contiene quattro sub-
amminoterminale carbossiterminale unità polipeptidiche: due catene a identiche e due catene |3
identiche, unite da interazioni non covalenti. AU’intemo della
FIGURA 3.9 • Il pentapeptlde serilgllclltirosllalanllleuclna, proteina multisubunità ogni subunità a è appaiata a una sub­
o Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu, o SGYAL. I peptldl vengono denominati a partire dal unità p, e quindi l’emoglobina può essere considerata sia un
residuo amminoterminale, che per convenzione viene posto a sinistra. I legami
peptidicl sono ombreggiati In giallo e I gruppi R colorati In rosso, tetramero con quattro subunità polipeptidiche sia un dimero
di protomeri affi
Solo un numero limitato di proteine contiene due o più cate­
ne polipeptidiche unite da legami covalenti. Per esempio, le
considerati sinonimi, i polipeptidi hanno in genere masse
due catene dell’insulina sono unite da ponti disolfuro. In
molecolari inferiori a ÌO 000, mentre le. proteine hanno pesi
questi casi i singoli polipeptidi non sono più considerati sub­
molecolari più alti.
unità, ma sono indicati semplicemente come catene (poli­
Nella Figura 3.9 è riportata la struttura di un pentapeptide.
peptidiche).
Le unità amminoacidiche presenti in un peptide sono chia­
mate re s id u i (ogni residuo è un amminoacido che ha perso
-» Alcune proteine contengono gruppi chimici diversi
un protone dal suo gruppo amminico e un ossidrile dal suo
dagli amminoacidi
gruppo carbossilico). In un peptide, il residuo amminoacidi-
Molte proteine, come gli enzimi ribonucleasi A e chimotri-
co con cui termina la catena polipeptidica, il residuo am m i-
psinogeno, contengono soltanto amminoacidi e nessun altro
n o te rm in a le (Ai-terminale), ha il gruppo a-amminico libe­
gruppo chimico; queste sono considerate proteine semplici.
ro; il residuo all’altra estremità ha un gruppo a-carbossilico
Altre proteine contengono, oltre agli amminoacidi, gruppi
libero: è il residuo c a rb o s site rm in a le (C-terminale).
chimici addizionali permanentemente associati; esse sono
chiamate p r o t e in e con iu gate. La parte non amminoacidi-
-» I peptidi biologicamente attivi e i polipeptidi hanno
ca della proteina coniugata viene detta di solito g r u p p o
dimensioni e composizioni molto variabili
p rosté tic o. Queste proteine sono classificate in base alla na-
Non è possibile fare generalizzazioni sul peso molecolare dei
peptidi biologicamente attivi e delle proteine in relazione
alla loro funzione. I peptidi naturali hanno dimensioni che TABELLA 3.2 Dati molecolari di alcune proteine
vanno da due a molte migliaia di residui. Anche i peptidi più Numero Numero
Peso di di catene
piccoli possono avere importanti effetti biologici, come ad
molecolare residui polipeptidiche
esempio il dipeptide L-aspartil-L-fenilalanina metil estere,
un prodotto commerciale meglio conosciuto come asparta­ Citocromo c 12400 104 1
(umano)
me, usato come dolcificante artificiale.
Ribonucleasi A 13700 124 1
(pancreas bovino)
r ^ ì Lisozima 14300 129 1
eoo- X / (bianco dell’uovo)

ch2 o ch 2 0 Mioglobina 16700 153 1

+ I II I il (cuore di cavallo)
h 3n — ch—c —n — c h — c — och3 Chimotripsina 25200 241 3
H (pancreas bovino)
L-Aspartil-L-fenilalanina metil estere Chimotripsinogeno 25 700 245 1
(aspartame) (bovino)
Emoglobina 64500 574 4
Molti peptidi di piccole dimensioni svolgono la loro funzio­ (umana)
ne biologica a concentrazioni molto basse. Albumina del siero 66000 609 1

Quanto sono lunghe le catene polipeptidiche delle protei­ (umana)


Esochinasi 107 900 972 2
ne? Come mostra la Tabella 3.2, la lunghezza varia consi­
(lievito)
derevolmente. Il Citocromo c umano contiene 104 residui
RNA polimerasi 450000 4158 5
in una singola catena; il chimotripsinogeno bovino ne ha (F. coli)
245. La titina, un costituente del muscolo dei vertebrati, Apolipoproteina B ; 513000 ) 4536 1
ne possiede circa 27 000 e ha una massa m olecolare di ... (umana)
Glutammina sintetasi . 619000 5628 12
circa 3000000. Però la grande maggioranza delle catene
(E. coli)
polipeptidiche in natura contiene in genere meno di 2000
Titina (umana) 2993000, 26926 1
residui ammino addici.
AA I CAPITOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine © 978-8R-08-06413-4

TABELLA Proteine coniugate tappe del frazionamento delle proteine sfruttano le differen­
ze nella solubilità delle proteine, che dipendono da pH, tem­
Gruppi
Classe prostetici Esempio peratura, concentrazione salina ed altri fattori. La solubilità
generalmente diminuisce in funzione della concentrazione
Lipoproteine Lipidi ßi-Lipoproteina salina, un effetto chiamato “salting out”. L’aggiunta di certi
del sangue
sali nella quantità giusta può selettivamente far precipitare
Glicoproteine Carboidrati Immunoglobulina G
solo alcune proteine, mentre altre rimangono in soluzione,
Fosfoproteine Gruppi fosforici Caseina dèi latte
Emoglobina
n solfato di ammonio (N H ^ S C L è particolarmente adatto
Eme-proteine Eme (ferro porfirina)
Flavoproteine Nucleoüdi flavinid Succinato deidrogenasi atto scopo, e viene spesso usato per far precipitare le protei­
Metalloproteìne Ferro Ferritina ne. Le proteine così precipitate vengono rimosse da quelle
Zinco Alcol deidrogenasi rimaste in soluzione per centrifugazione a bassa velocità.
Calcio Calmodulina La soluzione che contiene la proteina di interesse deve subi­
Molibdeno Dinitrogenasi re altri trattamenti prima di procedere oltre nel processo di
Rame Plastocianina purificazione. Per esempio, la dialisi è una tecnica che se­
para le proteine dalle piccole molecole in soluzione, sfrut­
tando le maggiori dimensioni dette proteine. L’estratto par­
tura chimica del loro gruppo prostético (Tabella 3.3); per zialmente purificato viene trasferito in un sacchetto o in un
esempio, le lipoproteine contengono lipidi, le glicoproteine tubo costituiti da una membrana semipermeabile, che è im­
contengono gruppi saccaridìcì e le metalloproteine con­ merso in un gran volume di una soluzione tampone a forza
tengono imo specifico metallo. Un certo numero di protei­ ionica appropriata; si ha cosi uno scambio dei sali e del tam­
ne possiede più di un gruppo prostético. Di norma il gruppo pone tra il sacchetto o il tubo stessi e la soluzione, ma non
prostético ha un ruolo determinante nella funzione biologi­ dette proteine. Quindi la dialisi mantiene le proteine att’in-
ca della proteina. terno del sacchetto o del tubo, mentre la concentrazione
degli altri soluti varia, fino a che non raggiungono una condi­
zione di equilibrio con la soluzione che si trova att’estem o

« Lavorando con le proteine detta membrana semipermeabile. La dialisi può essere uti­
lizzata, per esempio, per rimuovere il solfato d’ammonio da
L e nostre conoscenze biochimiche sulla struttura e sulla una soluzione di proteine.
funzione dette proteine derivano dallo studio di molte singo­ Il metodo più adatto atta separazione dette proteine è la cro­
le proteine. Per analizzare in dettaglio una proteina bisogna matografia su colonna, che sfrutta differenze di carica,
prim a separarla dalle altre, ottenerla in forma pura e dispor­ grandezza, affinità di legame e altre proprietà (Figura 3.10).
re dì tecniche adatte a determinarne le proprietà. I metodi Un tubo di vetro (colonna) viene riempito di un materiale
necessari derivano dalla chimica delle proteine, una disci­ solido poroso dotato di proprietà chimiche opportune (la
plina vecchia quanto la stessa biochimica, che continua a fase stazionaria), e una soluzione tampone (la fase mobile)
conservare un posto centrale nella ricerca biochimica. viene fatta percolare attraverso la colonna. La soluzione pro­
teica viene stratificata sulla sommità detta colonna e fatta
-» Le proteine possono essere separate e purificate percolare attraverso la matrice solida, e diffondendo lungo
Per poter studiare le proprietà strutturali e funzionali di una la colonna tende a dividersi in zone contenenti proteine di­
proteina per prima cosa bisogna ottenerla in forma pura. Ma verse. Le singole proteine migrano più o meno velocemen­
come è possiate isolare una proteina, quando netta cellula è te in base alle loro proprietà.
insieme a migliaia di diverse altre proteine? I metodi classici La cromatografia a scambio ionico sfrutta le differenze
sfrattano le proprietà che differenziano ima proteina dall’al­ nel tipo e nell’intensità della carica elettrica netta dette pro­
tra, tra cui la grandezza, la carica e le proprietà di legame. teine ad un certo pH. La matrice della colonna è un polime­
Attiri m etodi, che includano il donaggio del D N A e la sequen­ ro sintetico (resina) contenente gruppi carichi. Le resine
za d el genoma, in grado dì sem plificare il processo dì sepa­ con gruppi carichi negativamente sono dette scambiatori
razione dette proteine, verranno descritti nel Capìtolo 9. di cationi e quelle con gruppi carichi positivamente scam­
La fonte detta proteina è in genere un tessuto o una coltura biatori di anioni. L’affinità, di ciascuna proteina per i grup­
dì cellule batteriche. 1 primo passaggio dì purificazione con­ pi carichi detta colonna dipende dal pH (da cui dipende lo
sìste nella rottura delle cellule, provocando il rilascio dette stato di ionizzazione detta molecola) e dalla concentrazione
proteine in una soluzione, chiam ata e s tr a tt o grezzo. Sì dei sali presenti nella soluzione tampone. La separazione
può utilizzare poi la centrifugazione frazionata, per prepa­ può essere ottimizzata variando gradualmente il pH e/o la
rare frazioni su bceW arì o isolare specifici organetti (vedi la concentrazione salina della fase mobile, in modo da creare
Figura 1.5). un gradiente di pH o salino. Netta cromatografia a scam ­
lina volta ottenuto restretto grezzo o la preparazione di or­ b io cationico (Figura 3.I l a ) la matrice solida possiede
ganetti, sono disponibili diversi m etodi per purificare le pro­ gruppi carichi negativamente. Netta fase mobile le proteine
teine. fri genere, restealto vien e sottoposto a trattam enti con una carica netta positiva migrano attraverso la matrice
che hanno lo scopo di separare le diverse protein e in fr a ­ più lentamente di quelle con una carica netta negativa, in
zioni, sfruttando proprietà com e la grandezza e la carica, quanto la migrazione delle prime viene ritardata daU’intera-
mediante un processo chiamato fra zio n a m e n to . L e prim e à on e con la fase stazionaria.
© 9 7 8 -8 8 )0 8 -0 6 4 1 3 -4 CAPITOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine 145

N ella crom atografia a scam bio ionico, la diffusion e della (Figura 3.11b), separa le proteine secondo le loro dimensio­
banda proteica (la soluzione proteica) nella fase mobile è cau­ ni: le proteine più grandi eluiscono prima di quelle più pic­
sata sia dalla separazione delle proteine, che hanno proprietà cole, un dato che sembra contrario al senso comune. La fase
diverse, sia dalla sem plice diffusione della banda. Se si au­ solida è costituita da granuli di polimeri molto intrecciati
menta la lunghezza della colonna, in genere si migliora la se­ che creano nel loro interno pori o cavità di specifiche di­
parazione di due proteine che hanno cariche diverse. P erò la mensioni. Le proteine più grandi non possono entrare nelle
velocità con la quale la soluzione proteica attraversa la colon­ cavità e quindi attraversano la colonna più rapidamente,
na diminuisce con l’aumentare della lunghezza della colonna. percorrendo un cammino più breve, essendo escluse dalle
Aum entando il tem po di perm anenza nella colonna, la risolu­ cavità. Invece le proteine più piccole penetrano nelle cavi­
zione tra le proteine diminuisce, in quanto le bande proteiche tà, vengono trattenute e quindi impiegano più tempo ad at­
si m escolano p er diffusione. Man mano che la soluzione con­ traversare la colonna.
tenente le proteine fuoriesce dalla colonna, porzioni succes­ La cromatografia per affinità si basa sulla formazione di
sive d ell’efflu en te (fra z io n i) ven go n o ra ccolte in una serie legami specifici (Figura 3.1 le ). I granuli con cui viene riem­
di provette. L e frazioni che conten gon o la p rotein a di in te­ pita la colonna sono legati covalentemente a un gruppo chi­
resse ven gon o riunite e costituiscono il prodotto finale della mico chiamato ligando, un gruppo o una molecola in grado
crom atografia. di interagire con una macromolecola come una proteina.
L e parti (b ) e (c ) della Figura 3.11 mostrano altri due tipi di Quando si aggiunge alla colonna una miscela di proteine,
separazioni crom atografiche su colonna. La cromatografia ogni specie proteica che ha affinità per il ligando si lega ai
per esclusione molecolare, d etta anche g e l-filtra zio n e granuli, e quindi la sua migrazione attraverso la matrice

Supporto Proteine
poroso

Effluente

FIGURA 3.10 • Cromatografia su colonna. Gli elementi standard della modo diverso, a seconda del grado di interazione con la matrice. La banda
cromatografia su colonna includono un materiale solido e poroso (matrice) con proteica complessiva tende quindi ad allargarsi, man mano che si muove lungo la
cui viene riempita la colonna, generalmente di vetro o di plastica. Una soluzione, colonna, Le varie proteine (come la A, la B e la C, mostrate in blu, rosso e verde)
la fase mobile, fluisce attraverso la matrice, la fase stazionarla. La soluzione che gradualmente si separano Luna dall'altra, formando bande discrete all'interno
esce dalla parte bassa della colonna (effluente) viene costantemente rimpiazzata della più ampia banda che comprende l'intera gamma delle proteine. La
da una soluzione contenuta in un recipiente di riserva posto In cima alla colonna. separazione migliora (cioè la risoluzione delle bande aumenta) se si aumenta la
La soluzione di proteine che devono essere separate viene stratificata sulla parte lunghezza della colonna. Però anche le singole bande si allargano con II tempo,
alta della colonna e la si lascia penetrare nella matrice. SI aggiunge altra per effetto della diffusione delle molecole, un processo che diminuisce la
soluzione. La soluzione proteica forma una banda all’Interno della fase mobile, Il risoluzione. In questo esemplo, la proteina A è ben separata dalle proteine B e C,
cui spessore iniziale dipende dal volume della soluzione proteica caricata. Man ma la diffusione impedisce la completa separazione di B e C.
mano che le proteine migrano attraverso la colonna, esse vengono ritardate In
•Hi I CAPITOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine ;© 97 8 -8 8 -Ò 8 -0 6 4 Ì 3-4

• Carica netta positiva elevata


O Carica netta positiva
O Carica netta negativa
® Carica netta negativa elevata

Granuli di polimero
con gruppi funzionali
carichi negativamente
La miscela di proteine viene
La miscela di proteine è aggiunta
caricata su una colonna
alla colonna contenente
contenente un polimero
scambiatori di cationi '"IT
con legami crociati

Le proteine si muovòno attraverso la colonna a =r - == •


una velocità che dipende dada loro carica netta !"» Le molecole proteiche sono
w n n
generata dal pH della soluzione usata. Con uno
(t
separate per dimensione; le molecole • 9
più grandi passano più liberamente,
scambiatore di cationi, le proteine con cariche
nette più negative attraversano la colonna più 12 3 4 5 6 comparendo nelle prime frazioni
2
13 l#J
4 5 6
rapidamente e sono eluite per prime
( b ) Cromatografia per esclusione molecolare
(a ) Cromatografia a scambio ionico

FIGURI 3.11 • Tre metodi cromatografici usati per la purificazione


delle proteine, (a) La cromatografia a scambio ionico si basa sul segno della
carica e sull'entità della carica delle proteine ad un determinato pH. (b) La
cromatografia per esclusione molecolare, detta anche gel-filtrazione, separa le
proteine sulla base delle loro dimensioni, (c) La cromatografia per affinità
separa le proteine sulla base delle loro proprietà di tegame. Ulteriori dettagli
sono riportati nel testo.

viene ritardata. Aggiungendo alla fase mobile il ligando libe­


ro, che compete con il ligando legato ai granuli, la proteina
viene staccata dalla matrice.
Un affinamento delle metodiche cromatografiche è costitui­
to dall’H PLC , o cromatografia liquida ad alta perfor­
mance, che utilizza pompe ad alta pressione per aumentare
la velocità dei flussi delle molecole proteiche attraverso la
colonna, e matrici cromatogràfiche dì elevata qualità, in
grado di sopportare forti pressioni. Riducendo il tempo di
transito attraverso la colonna, l’HPLC limita la diffusione
delle bande proteiche e quindi migliora notevolmente la ri­
soluzione.

-» Le proteine possono essere separate


e caratterizzate mediante elettroforesi
Un altro metodo per la separazione delle proteine si basa che porta legato Le proteine La proteina
un ligando non di interesse di interesse
sulla migrazione delle proteine cariche in un campo elettri­
specifico vengono eliminate, è eluita
co, un processo chiamato elettroforesi. Questa procedu­ per la proteina mediante lavaggio, dalla soluzione
ra non viene di solito usata per purificare grandi quantità di di interesse dalla colonna di ligando
proteine poiché sono disponibili metodi alternativi più sem­
( c ) Cromatografia per affinità
plici.
« 9 ? B 88 OB <¡6413-4 CAPITOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine 1 47

L’elettroforesi delle proteine è di solito effettuata in gel co­ La migrazione di una proteina in un gel durante l’elettrofo­
stituiti da polimeri con numerosi legami crociati, come la po- resi è di conseguenza una funzione delle sue dimensioni e
liacrilammide. Il gel di poliacrilammide agisce come un se­ della sua forma (Figura 3.12a). .
taccio molecolare che rallenta la migrazione delle proteine Un metodo elettroforetico usato comunemente per valutare
proporzionalmente al loro rapporto carica/massa molecola­ la purezza e la massa molecolare delle proteine comprende
re. Anche la forma delle proteine può alterare la loro veloci­ l’uso del detergente sodio dodecil solfato (SDS) (dodecil
tà di migrazione. N ell’elettroforesi, la forza che muove le indica una catena formata da 12 atomi di carbonio).
macromolecole è il potenziale elettrico, E. La mobilità elet- O
troforetica della molecola, (uc, è il rapporto tra la velocità della + Il
Na 'O — S— 0 — (CH2) nCH3
particella, V, e il potenziale elettrico. La mobilità elettrofore-
tica è anche uguale al rapporto tra la carica netta della mo­ O
lecola, Z, e il coefficiente frizionale, /, che dipende in parte Sodio dodecil solfato
(SDS)
dalla forma della proteina. Quindi,
Questo composto si lega alla maggior parte delle proteine in
V Z
quantità proporzionali alla massa molecolare della proteina,
cioè circa ima molecola di SDS ogni due residui amminoaci-
dici. L’SDS legato conferisce una carica netta negativa alla
proteina, rendendo insignificante la sua carica intrinseca;
ciascuna proteina acquisisce un rapporto massa/carica simi­
le. Inoltre il legame con l’SDS altera la conformazione origi­
naria delle proteine, che vengono ad assumere tutte una
forma simile. L’elettroforesi in presenza di SDS (Figura
3.12) separa quindi le proteine principalmente in base alla
massa molecolare e i polipeptidi più piccoli migrano più ve­
locemente. Dopo avere effettuato l’elettroforesi, le proteine
possono essere visualizzate mediante il trattamento con un
colorante come il blu di Coomassie (Figura 3.12b), che si
lega alle proteine ma non al gel.

FIGURA 3.12 • Elettroforesi su gel di poliacrilammide di proteine in


SDS. (a) Aliquote di differenti campioni vengono depositate nel pozzetti posti in
cima al gel di poliacrilammide, Le proteine si muovono all’interno del gel, se si
applica un campo elettrico. Il gel riduce al minimo le correnti di convezione
causate da piccoli gradienti di temperatura e gli spostamenti delle molecole
proteiche diversi da quelli Indotti dal campo elettrico, (b) Alla fine della corsa
elettroforetlca, le proteine possono essere visualizzate trattando II gel con un
colorante come il blu di Coomassie, che si lega alle proteine, ma non al gel.
Ciascuna banda sul gel rappresenta una proteina (o subunltà proteica) diversa.
Nella corsia 1 sono state separate proteine standard a massa molecolare nota.
Le proteine marker possono essere usate per valutare II peso molecolare di una
proteina sconosciuta (corsia 2), (c) Determinazione della massa molecolare di
una proteina. La mobilità elettroforetlca di una proteina su gel di
poliacrilammide In presenza di SDS è correlata al suo peso molecolare, M,.
La relazione tra logaritmo della Mr e migrazione elettroforetlca è lineare e
consente di calcolare II valore del peso molecolare di una proteina sconosciuta
da un grafico come quello mostrato.

Il» Y
Proteina
sconósciuta

V
Mr Proteina
0 0 standard sconosciuta (c ) Migrazione relativa
481 CAPÌTOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine 0 0 7 8 -8 8 08 06413-4

FIGURA 3.13 • Elettroforesi bidimensionale.


Le proteine vengono prima separate mediante isoelettrofocalizzazione e
successivamente mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in
presenza di SDS. In questo gel bidimensionale la separazione orizzontale
riflette le differenze nel valore del pi, mentre la separazione verticale
riflette le differenze nella massa molecolare. Con questa tecnica si
possono separare oltre 1000 proteine diverse presenti nella cellula
di E coli.

del pi

Dal confronto della migrazione nel gel di una proteina sco­


3a Struttura delle proteine:
nosciuta con quella di proteine a peso molecolare noto, è
possibile determinare il suo peso molecolare approssimativo
struttura primaria
(Figura 3.12c). La purificazione delle proteine è solo una fase prelimina­
L’isoeiettrofocalizzazione è una tecnica usata per deter­ re, che precede la caratterizzazione della loro struttura e
minare il punto isoelettrico (p i) di una proteina sfruttando della loro funzione. Ma che cos’è che rende una certa pro­
un gradiente di pH e distribuendo una miscela di acidi e basi teina un enzima, un’altra un ormone, un’altra una protei­
di natura organica a basso peso molecolare (anfoliti) gene­ na strutturale e un’altra ancora un anticorpo? Come diffe­
rato attraverso il gel. Quando si applica un campo elettrico, riscono dal punto di vista chimico? Le differenze più ovvie
ciascuna proteina presente nella miscela migra fino a quan­ sono quelle di carattere strutturale, e quindi rivolgeremo
do raggiunge il pH corrispondente al suo pi. Quindi le pro­ subito la nostra attenzione alla struttura delle proteine.
teine con diverso punto isoelettrico si distribuiscono in zone Per le m olecole di grandi dimensioni come le proteine, la
diverse del gel. Combinando l’isoelettrofocalizzazione con descrizione e la comprensione della loro struttura richie­
l’elettroforesi su SDS, una tecnica chiamata elettroforesi dono approcci a vari livelli di complessità, in una sorta di
bidimensionale, è possibile ottenere la risoluzione di una gerarchia concettuale. In genere vengono riconosciuti
miscela complessa di proteine (Figura 3.13). Questo meto­ quattro livelli di struttura delle proteine (Figura 3.14). La
do analitico è più efficace di ogni singolo metodo elettrofo- definizione di tutti i legami covalenti (principalmente i le­
retico. L’elettroforesi bidimensionale permette di separare gami peptidici e i legam i disolfuro) che legano tra loro i
proteine di identico peso molecolare, ma con differente pi, vari amminoacidi in una catena polipeptidica costituisce
o proteine con lo stesso pi, ma con differente peso moleco­ la struttura primaria. L’elemento principale della strut­
lare. tura primaria di una proteina è la sequenza degli ammi-

Struttura
primaria Struttura

Residui Catena polipeptidica Subunità associate


amminoacidici

FIGURA 3.14 • Livelli di struttura delle proteine. La stuttura primaria è esemplo l a elica. L’a elica fa parte della struttura terziaria del pollpeptlde
costituita da una sequenza di amminoacidi uniti da legami peptidici; comprende avvolto, che può essere a sua volta una delle subunltà che costituiscono la
anche I ponti dlsolfuro, I polipeptidi risultanti possono disporsi secondo una struttura quaternaria di proteine formate da più unità costitutive, come
struttura regolare ricorrente, che viene definita struttura secondaria, come ad l'emoglobina.
.'i -ST8-88-08* 06413* A GAPIT0L0 3 Amminoacidi, peptidi e proteine |4 9

noacidi che la compongono. La struttura secondaria si ti possono avere dimensioni e sequenze amminoacidiche
riferisce a particolari organizzazioni di brevi sequenze am- molto diverse.
minoacidiche, che danno origine ad aspetti strutturali per
tratti della molecola che si ripetono. La struttura terzia­ -> I polipeptidi di piccole dimensioni possono essere
r ia descrive tutti gli aspetti tridimensionali di un polipep- sequenziati con procedimenti automatizzati
tide. Se la proteina è costituita da due o più subunità poli- Se la funzione di una proteina è direttamente correlata alla
peptidiche, la sua struttura è definita quaternaria. disposizione degli amminoacidi nella sua molecola, la deter­
Le differenze nella struttura primaria tra le proteine posso­ minazione della sequenza potrà rivelare molte informazioni
no fornire numerose informazioni. Ogni proteina ha una pro­ sulla relazione tra struttura e funzione.
pria sequenza amminoacidica, che ne determina anche la Per sequenziare un intero polipeptide si usa il m etodo di
funzione. Pehr Edman. La degradazione di Edman marca e rimuove
solo il residuo ammmoterminale dei peptidi, lasciando intat­
-» La funzione delle proteine ti tutti gli altri legami peptidici (Figura 3.15). Si fa reagire 0
dipende dalla loro struttura primaria peptide in condizioni blandamente alcaline con il fenilisotio-
Il batterio Escherichia coli sintetizza più di 3000 differen­ cianato, che converte lamminoacido ammmoterminale in un
ti proteine; l’uomo ha circa 25 000 geni, che codificano un addotto feniltiocarbammilico (P T C ). Il legame peptidico più
gran numero di proteine (tram ite meccanismi genetici vicino all’addotto PTC viene scisso dall’acido trifluoroaceti-
analizzati nella Parte 3 del testo). In ambedue i casi, cia­ co in ambiente anidro, con rimozione dell’amminoacido am-
scun tipo di proteina ha un’unica struttura tridimensiona­ minoterminale, che si libera come derivato anilinotiazolino-
le, che le conferisce una altrettanto specifica funzione. nico. Il derivato amminoacidico viene estratto con solventi
Ciascun tipo di proteina ha anche una specifica sequenza organici, convertito nella forma più stabile feniltioidantoini-
amminoacidica. L’intuito suggerisce che la sequenza am­ ca per trattamento con acidi diluiti, e quindi identificato.
minoacidica abbia un ruolo fondamentale nel determinare L’uso di reazioni sequenziali, condotte prima in ambiente ba­
la struttura tridimensionale della proteina, e quindi anche sico e poi acido, permette di controllare l’intero processo.
la sua funzione. Ciascuna reazione che coinvolge 1’amminoacido amminoter-
Ma la sequenza amminoacidica di una particolare proteina minale può andare essenzialmente a completamento senza
è veramente sempre la stessa, cioè invariante? La risposta è interessare nessuno degli altri legami peptidici del peptide.
no; è possibile una certa flessibilità. Si può affermare che dal Dopo rimozione e identificazione del residuo amminotermi-
20% al 30% delle proteine umane sono p o lim o rfich e, cioè nale, il nuovo residuo amminoterminale ora esposto può es­
mostrano alcune piccole variazioni nella popolazione sere staccato e identificato attraverso la stessa serie di rea­
umana. Molte di queste variazioni non producono alcun ef­ zioni. Questa procedura è ripetuta fino a che tutta la se­
fetto sulla funzione della proteina. Inoltre, proteine che svol­ quenza è stata determinata. La degradazione di Edman può
gono funzioni simili in specie anche evolutivamente distan­ essere condotta in imo strumento, chiamato sequenziato-

Polipeptide

Si identifica il residuo
amminotemiinalcv, si purifica
e si ricicla il frammento
peptidico rimanente attraverso
la degradazione di Edman

FIGURA 3.15 • Le tappe del


sequenziamento dei polipeptidi. La
degradazione di Edman rivela l’intera
sequenza di un peptide. Per I peptidi
relativamente corti è sufficiente la sola
degradazione di Edman.
0 [ CAPITOLO I Amminoacidi, peptidi e proteine i© i9 7 S :8 8 « 8 -0 6 4 1 3 ^ :.

re, che mescola i reagenti nelle proporzioni opportune, se­ della catena polipeptidica. I due metodi usati per scindere
para i prodotti, li identifica e infine registra i risultati. Questi in modo irreversibile i ponti disolfuro sono: il trattamento
metodi sono molto sensibili. Spesso è possibile determinare con acido performico, che ossida il ponte disolfuro a due
la completa sequenza amminoacidica partendo solo da gruppi solforici e la riduzione con ditiotreitolo che libera i
pochi microgrammi di proteina. gruppi tiolici.

-> Strategie per il sequenziamento della proteina Rottura della catena polipeptidica Si possono usare di­
Le varie fasi della strategia che si può utilizzare per il se­ versi metodi per frammentare la catena polipeptidica. Gli
quenziamento chimico di una proteina sono descritte in enzimi detti proteasi catalizzano l’idrolisi dei legami pepti-
questo paragrafo e illustrate nella Figura 3.16. dici. Alcuni di questi enzimi rompono soltanto legami pe-
ptidici adiacenti a specifici residui amminoacidici (Tabella
Rottura dei legami disolfuro I legami disolfuro possono 3.4), frammentando quindi il polipeptide in modo riprodu­
generare interferenze con il procedimento di sequenzia­ cibile e in un numero di peptidi che può essere previsto. Un
mento. I legami disolfuro possono interferire anche con le certo numero di reagenti chimici possiede anch’esso un’ele­
reazioni chimiche o enzimatiche utilizzate per la rottura vata specificità di rottura dei legami peptidici.

Procedimento Risultati Conclusioni

idrolisi; separazione A 5 H 2 R 1 Il polipeptide ha 38 residui amminoacidici.


degli amminoacidi C 2 I 3 S 2 La tripsina potrà scindere i legami
D 4 K 2 T 1 tre volte, a livefio di una R (Arg)
E 2 L 2 V 1 e di due K (Lys), generando quattro
F 1 M 2 Y 2 frammenti. Il bromuro di cianogeno
Polipeptide G 3 P 3 scinderà i legami a livello di due M (Met),
formando tre frammenti

reazione con l’FDNB; idrolisi;


v separazione degli amminoacidi
2,4-Dinitrofenilglutammato E (Giu) è il residuo
riduzione
identificato amminoterminale
dei ponti
disolfuro
' -(se presenti)

HS SH
, .
/ : X ......

rottura con ! rìpsi- •; T -l) GASMALIK (Tri) viene posto aU’aminmo-


separazione dei frammenti;
sequenziamento terminaie in quanto
. con la degradazione di Edman T 2 ) EGAAYHDFEPIDPR inizia con E (Giu)
V----------------- ------------------ >
DCVHSD U y viene posto al carbossi-
terminale in quanto
T 4 ) YLIACGPMTK non termina né con R (A rg)
né con K (Lys)
rottura con I»-ornimi ili cianogen
separazione dei frammenti;
sequenziamento EGAAYHDFEPIDPRGASM (G-3) si sovrappone a
con la degradazione di Edman
■> C-2) TKDCVHSD
ri e a (l'-ij, consentendo
di metterli in ordine
ALIKYLIACGPM

sequenza
V stabilita
Ammino- Carbossi-
E G A A Y H D F E P ID P R G A S M A L IK Y L IA C G P M T K D C V H S D
termìnale terminale

FIGURA 3.16 • Frammentazione di una proteina, sequenziamento e sono soltanto due residui di Cys (C) e quindi una sola possibilità di formazione
ordinamento dei frammenti peptidici. Per prima cosa viene determinata di un ponte disolfuro. Nei polipeptidi con tre o più residui di Cys la posizione
su un campione del polipeptide la composizione in residui amminoacidici. dei ponti disolfuro può essere determinata con il metodo descritto nel testo.
Prima della frammentazione bisogna rompere i ponti disolfuro, in modo che il (Le abbreviazioni per gii amminoacidi sono nella Tabella 3.1.)
sequenziamento possa procedere senza impedimenti. In questo esempio vi
© 9/8-SH-OÌÌ C6413-4 CAPITOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine 151

I Q Q Q I Specificità di alcuni metodi comuni per la le regioni della catena polipeptidica intatta unite dal ponte
frammentazione delle catene polipeptidiche disolfuro.

Reagente (fonte biologica)* Punti di rotturat


-> Le sequenze amminoacidiche possono essere
Tripsina (pancreas bovino) Lys, Arg (C )
determinate con altri metodi
Proteasi di Submaxillarus Arg (C )
(ghiandola submascellare di topo) È possibile dedurre la sequenza di un polipeptide determi­
Chimotripsina (pancreas bovino) Phe, Trp, Tyr (C ) nando la sequenza del gene che lo codifica (Figura 3.17). Le
Proteasi V 8 di Staphylococcus aureus Asp, Glu (G ) tecniche utilizzate per sequenziare le proteine e il D N A sono
(batterio S. aureus) complementari. Quando è disponibile il gene, la sequenza del
Asp-A-proteasi Asp, Glu ( \ )
DNA può essere determinata più velocemente della sequen­
(batterio Pseudomonas firagi)
za delle proteine. La maggioranza delle proteine viene oggi
Pepsina (stomaco suino) Leu, Phe, Trp, Tyr (N )
Endoproteinasi Lys C Lys (C ) sequenziata con questo metodo indiretto. Se il gene non è
(batterio Lysobacter enzymogenes) stato isolato, bisogna sequenziare il peptide con le metodi­
Bromuro di cianogeno Met (C ) che chimiche. È così possibile ottenere informazioni (per
esempio sulla localizzazione dei ponti disolfuro) non otteni­
* Tutti i reagenti, eccetto il bromuro di cianogeno, sono proteasi; sono tutti
disponibili in commercio. bili dalla sequenza del DNA. Inoltre, anche se è nota la se­
t Residui che rappresentano i siti di riconoscimento primario per la proteasi quenza di una piccola porzione di un polipeptide, da questa
o per il reagente chimico; i legami peptidici possono essere rotti sia dal lato
sarà possibile isolare il gene corrispondente.
carbonilico (C) sia da quello amminico (N) dei residui amminoacidici indica­
ti nella tabella. È stato coniato il termine proteoma per descrivere l’intero
patrimonio di proteine codificato dal DNA degli organismi.
Le nuove discipline, la genomica e la proteomica, costituisco­
I peptidi generati dall’azione della tripsina (o da altri enzi­ no un necessario complemento alla ricerca sul metabolismo
mi o da reagenti chimici) possono essere separati con m e­ intermedio cellulare e sul metabolismo degli acidi nucleici.
todi cromatografici o elettroforetici.
-> Dalle sequenze amminoacidiche si possono ricavare
Sequenziamento dei peptidi Tutti i frammenti peptidici importanti informazioni biochimiche
prodotti dalla tripsina e separati vengono sequenziari con la La sequenza amminoacidica di una proteina offre numero­
degradazione di Edman. se informazioni su struttura tridimensionale, funzione, loca­
lizzazione cellulare ed evoluzione di una proteina. Molte di
Ordinamento dei frammenti peptidici Ora bisogna de­ queste informazioni possono essere ottenute dalle somi­
terminare l’ordine dei “frammenti di tripsina” nella catena glianze tra la proteina di interesse e proteine studiate in pre­
polipeptidica originale. Un altro campione del polipeptide cedenza. Sono oggi accessibili via Internet nette banche dati
originario viene rotto in piccoli frammenti usando un enzi­ migliaia di sequenze amminoacidiche. Comparando una
ma o un reagente chimico diverso che spezzi la catena poli­ nuova sequenza con tutte le sequenze contenute in queste
peptidica in punti diversi da quelli scissi dalla tripsina. Per banche di informazioni spesso si scoprono relazioni sorpren­
esempio, il reagente bromuro di cianogeno scinde soltanto denti, ma anche illuminanti.
i legami peptidici il cui gruppo carbonilico è fornito da un Non è ancora ben chiaro come la sequenza amminoacidica
residuo di Met. I frammenti generati da questa nuova pro­ determini la struttura tridimensionale delle proteine e non
cedura vengono quindi separati e sequenziari come è stato è neanche possibile prevedere o ipotizzare la funzione di
descritto per la prima serie di peptidi. una proteina a partire dalla sequenza amminoacidica. Sulla
Viene ora esaminata la sequenza amminoacidica di ogni base della somiglianza fra le sequenze amminoacidiche si
frammento ottenuto con i due tipi di rottura della catena possono identificare famiglie di proteine che hanno in co­
polipeptidica, con l’intento di trovare peptidi della seconda mune caratteristiche strutturali e funzionali. Le singole
serie la cui sequenza generi una continuità, mediante sovrap­ proteine sono assegnate alla famiglia in base al grado di so­
posizioni, con i peptidi della prima serie (Figura 3.16). La so­ miglianza della sequenza amminoacidica. I membri di una
vrapposizione delle sequenze dei peptidi generati dalla se­ famiglia proteica generalmente hanno il 25% o più di omo­
conda procedura di frammentazione con le sequenze dei logie e spesso hanno in comune alcune caratteristiche
peptidi generati dalla prima frammentazione determina l’or­ strutturali e funzionali. Alcune famiglie, però, sono identi-
dine corretto in cui disporre i peptidi.

Localizzazione dei ponti disolfuro Se nella struttura pri­


Sequenza ammino-
maria vi sono ponti disolfuro, la tappa successiva è la deter­
acidica (proteina) G ln -T y r -P ro -T h r-Ile -T rp
minazione della loro posizione. Un campione della proteina i---------- il--------il--------- il---------il-------- il---------- 1
viene frammentato con un reagente come la tripsina, que­ Sequenza CAGTATCCTAGGATTTGG
del DNA (gene)
sta volta senza rompere prima i ponti disolfuro. I peptidi ot­
tenuti sono separati per elettroforesi e confrontati con quel­
li generati dall’azione della tripsina. Per ogni ponte disolfuro FIGURA 3.17 • Corrispondenza tra sequenza del DNA e sequenza
amminoacidica. Ogni amminoacido viene codificato da una specifica
mancheranno due dei peptidi originari e apparirà un nuovo sequenza di tre nucleotidi nel DNA. Il codice genetico è descritto in dettaglio nel
e grande polipeptide. I due peptidi mancanti rappresentano Capitolo 27.
ò2 J CAPÌTOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine © 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4

ficabili solo in base a pochi residui amminoacidici cruciali ULTERIORI LETTURE


per una certa funzione. Un certo numero di substrutture
Creighton, T.E. (1992) Proteins: Structures and Molecular Pro­
simili, o “domini” (che saranno definiti in dettaglio nel Ca­
perties, 2a ed., W.H. Freeman and Company, New York.
pitolo 4), si trovano in molte proteine con funzioni diver­
Una fonte di molte informazioni generali.
sificate. Questi domini spesso si avvolgono in strutture che
K re il, G. (1997) D-Amino acids in animal peptides. Annu. Rev.
hanno un grado di stabilità non comune o che si sono spe­
Biochem. 66, 337-345.
cializzate per interagire con un determinato ambiente. Si m t Un aggiornamento sulla presenza di questi rari stereoisomeri di
possono anche dedurre relazioni evolutive dalle somiglian­ amminoacidi. ]
ze funzionali tra famiglie di proteine. Li, W.-H. e Graur, D. (2000) Fundamentals of Molecular Evolu­
Alcune sequenze amminoacidiche fungono da segnali che tion, 2a ed., Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.
determinano la localizzazione cellulare, la modifica chimica * Un testo ben scritto che illustra i metodi di analisi delle sequen­
e il tempo di emivita di una proteina. Speciali sequenze se­ ze delle proteine e degli acidi nucleici: Il Capitolo 5 contiene
un’ottima descrizione su come si costruisce un albero evolutivo
gnale, localizzate in genere verso la terminazione amminica,
dai dati sulle sequenze amminoacidiche.
vengono usate per “etichettare” alcune proteine che devo­
Sanger, F. (1988) Sequences, sequences, sequences. Annu. Rev.
no essere esportate fuori dalla cellula. Altre vengono inve­
Biochem. 5 7 ,1-28.
ce indirizzate verso il nucleo, sulla superficie cellulare, nel
Un’interessante rassegna storica su come si sono sviluppati i
citosol o in altre zone della cellula. Altre sequenze agiscono metodi per la determinazione delle sequenze.
come siti di legame per i gruppi prostetici, come ad esem­ Scopes, R.K. (1994) Protein Purification. Principles and Prac­
pio i gruppi saccaridici nelle glicoproteine e i lipidi nelle li­ tice, 3a ed., Springer-Verlag, New York.
poprotéine. fiBS Una buona fonte per una più completa descrizione dei principi
alla base della cromatografia e di altri metodi.
Snel, B., Huynen, M A e Dutìlh B.E. (2005) Genome trees and
the nature of genome evolution. Annu. Rev. Microbiol. 59,191-209.
TERMINI CHIAVE Zuckerkandl, E. e Pauling, L. (1965) Molecules as documents of
evolutionary history. J. Theor. Biol. 8 ,357-366.
1 termini in grassetto sono definiti nel glossario.
MM Molti considerano questo lavoro come il fondamento della di­
amminoacidi 37
sciplina dell’evoluzione molecolare.
centro chirale 38
configurazione assoluta 38
cromatografia a scambio ionico 44
cromatografia liquida ad alta performance (H P L C ) 46
cromatografia per affinità 45 PR0RLEM I
cromatografia per esclusione molecolare 45
1. Quanta alanina è presente come specie compieta-
cromatografia su colonna 44
mente priva di carica? A un pH uguale al punto iso­
degradazione di Edman 49
elettrico, la carica netta delTalanina è zero. Le struttu­
dialisi 44 .
re delTalanina con una carica netta pari a zero sono due
elettroforesi 46 j (una forma priva di carica e una forma zwitterionica),
enantiomeri 38 ma quella predominante al punto isoelettrico è quella
estratto grezzo 44 zwitterionica:

ch 3
frazionamento 44
frazione 44 ch3 o
gruppi E 37 h 3n
+ I
—c — HoN —C—Q
gruppo prostético
isoelettrofocalizzazione 48
43
H O' H \)H
Zwitterionica Completamente priva di carica
legame peptidico 42
oligopeptìde 42 (a ) Spiegate perché M anina al suo p i è nella forma zwitte­
peptide 42 rionica piuttosto che in quella completamente priva di
pH isoelettrico (punto isoelettrico, p i) 41 carica.
polarità 39 (b ) Quale frazione di alanina è presente nella forma com­
polipeptide 42 pletamente priva di carica al suo pi (p i = 6,01)? Spie­
proteasi 50 gate come siete arrivati alla vostra risposta.
proteina 42
2, Separazione degli amminoacidi mediante croma­
proteina coniugata 43
tografia a scambio ionico. Le miscele di amminoaci­
proteina oligomerica 43 di vengono prima analizzate separando i loro componen­
proteoma 51 ti mediante cromatografia a scambio ionico: gli ammi­
protomero 43 noacidi vengono fatti passare su una resina cationica
sistema D, L 38 contenente gruppi solforato (— SO3 ) e fluiscono a velo­
sodio dodecil solfato (SDS) 47 cità diverse a causa di due fattori che ritardano il loro
struttura primaria 48 movimento: ( 1) l’attrazione ionica tra i gruppi solforato
struttura quaternaria 49 della colonna e i gruppi carichi positivamente degli am­
struttura secondaria 49 minoacidi; ( 2) le interazioni idrofobiche tra le catene la­
struttura terziaria 49 terali degli amminoacidi e lo scheletro fortemente idro­
zwitterione 41 fobico della resina polistirenica. Per ogni coppia di am-
© 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4 CAPÌTOLO 3 Amminoacidi, peptidi e proteine

minoacidi riportata sotto, determinate quale amminoaci­ co (Hsp90). Tutte le Hsp90 contengono una “sequenza
do sarà eluito per primo da una colonna a scambio catio- di riconoscimento” di 10 amminoacidi, che permette di
nico in un tampone a pH 7,0. riconoscerle facilmente nelle banche dati. Sono qui ri­
portati due modi di rappresentare queste sequenze di
(a ) A sp e L y s (b ) A rg e M e t riconoscimento.
(c ) Giu e Val (d ) G ly eL e u
(e ) S ere Ala Y-x-[NQHD]-[KHR]-[DE]-[IVA]-F-[LM]-R-[ED].
4
3, La dimensione di una proteina. Qual è il peso mole­ 3
colare approssimato di una proteina con 682 residui § 2
1
amminoacidici in una sola catena polipeptidica?
0

4. La carica elettrica netta dei peptidi. Un peptide ha N C


la sequenza (a ) In questa sequenza, quali sono gli amminoacidi inva­
rianti (conservati in tutte le specie)?
Glu-His-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (b ) hi q u a le© posizione© sono permessi solo amminoaci­
di con una catena laterale carica positivamente? Per
(a ) Determinate la carica netta del peptide a pH 3, 8 e 11. ciascuna posizione, qual è ramminoacido che vi si trova
(Usate i valori di pAa delle catene laterali e dei gruppi più comunemente?
arnmino- e carbossiterminali riportati nella Tabella 3.1.) (c ) In q u ale© posizione© sono permessi solo amminoaci­
(b ) Determinate il pi del peptide.S. di con una catena laterale carica negativamente? Per
ciascuna posizione, qual è ramminoacido che vi si trova
S. Confronto di sequenze. Le proteine chiamate chape- più comunemente?
ronine (descritte nel Capitolo 4 ) aiutano il processo (d ) Una posizione può essere occupata da un qualunque
dell’avvolgimento delle proteine. Una classe di chape- amminoacido, anche se un amminoacido la occupa con
ronine presenti in organismi che vanno dai batteri ai maggior frequenza. Qual è la posizione, e qual è rammi­
mammiferi è quella della proteina 90 dello shock termi­ noacido?
Forse le caratteristiche più sorprendenti [della mioglobina] sono
la complessità e la mancanza di simmetria. L’organizzazione
della molecola manca quasi totalmente di ogni tipo di regolarità
che ci si poteva aspettare, ed è più complicata di quanto era
stato previsto da tutte le teorie sulla struttura delle proteine.
John Kendrew, da un articolo su Nature, 1958

Str "tura tridimensionale


delle proteine
4.1 Uno sguardo alla struttura delle proteine 54 volgimento, un altro legame idrogeno (o un legame ener­
geticam ente equivalente) deve essere rotto tra lo stesso
4.2 Struttura secondaria delle proteine 56
gruppo e l’acqua. Perciò il contributo che ciascun legame
4.3 Struttura terziaria e quaternaria delle proteine 58 idrogeno dà alla stabilità globale, cioè la differenza tra
4.4 Denaturazione e ripiegamento delle proteine 63 l’energia libera tra gli stati avvolto e non avvolto, è vicino
allo zero. Le interazioni ioniche possono essere stabilizzan­
n questo capitolo esamineremo come una sequenza di am­ ti o destabilizzanti. Dobbiamo quindi rivolgere la nostra at­

I minoacidi in una catena polipeptidica è organizzata in una


ben precisa struttura proteica tridimensionale, ponendo
l’accento su cinque temi. Primo, la struttura tridimensionale
tenzione altrove per capire perché la conformazione nativa
è quella favorita.
Esaminando più da vicino il contributo delle interazioni de­
di una proteina è determinata dalla sua sequenza amminoa- boli alla stabilità delle proteine, si può osservare che in ge­
cidica. Secondo, la funzione di una proteina dipende dalla sua nere sono le interazioni idrofobiche quelle predominan­
stessa struttura. Terzo, una certa proteina presenta un’unica ti. L e m olecole di acqua pura sono unite tra loro da una
o poche conformazioni stabili. Quarto, le forze più importan­ rete di legami idrogeno e nessun’altra molecola ha la stes­
ti che stabilizzano la specifica struttura di una data proteina sa capacità di formare legami. La presenza di qualunque
sono interazioni non covalenti. Infine, tra le numerosissime altra molecola nell’acqua rompe i legami idrogeno. Quan­
strutture delle diverse proteine, si possono individuare alcuni do l ’acqua circonda una m olecola idrofobica si form a un
modelli strutturali comuni che ci consentono di classificare le guscio ordinato di m olecole di ossigeno unite da legami
varie strutture proteiche. idrogeno, che prende il nome di strato di solvatazione.
L’aumento dell’ordine nelle molecole d’acqua nello strato
di solvatazione crea una diminuzione sfavorevole dell’en­
tropia, ma quando più gruppi non polari si riuniscono, la
4.1 Uno sguardo alla struttura delle proteine dimensione dello strato di solvatazione si riduce in quanto
La disposizione spaziale degli atomi di una proteina è detta ciascun gruppo non presenta più l’intera superficie rivolta
conformazione. Le conformazioni possibili di una protei­ verso l’acqua. Il risultato è un aumento favorevole dell’en­
na corrispondono a tutte le strutture che la proteina può as­ tropia. Come si è detto nel Capitolo 2, questo aumento di
sumere senza rottura di legami covalenti. Per esempio, va­ entropia costituisce la forza termodinamica principale che
riazioni conformazionali si verificano per rotazione intorno consente l’associazione di gruppi idrofobici nell’acqua. Allo
ai legami singoli. Le conformazioni che la proteina assume stesso modo, le catene laterali idrofobiche degli amminoa­
in condizioni diverse sono in genere quelle termodinamica­ cidi tendono a raggrupparsi alfintem o delle proteine, lon­
mente più stabili, cioè quelle che possiedono il più basso va­ tano dall’acqua.
lore di energia libera. Quando si trovano in uno dei loro stati Le interazioni idrofobiche sono importanti per stabilizzare
conformazionali funzionali le proteine sono dette native. la conformazione. L’interno di una proteina è in genere co­
La stabilità di una proteina non è semplicemente la somma stituito da un nucleo di catene laterali idrofobiche addensa­
delle energie di formazione delle molte interazioni deboli te. È anche importante che tutti i gruppi polari o carichi al­
all’interno della proteina stessa. Per ogni legame idrogeno l’interno delle proteine trovino le giuste controparti per la
che si forma all’interno di una proteina durante il suo av­ formazione di legami idrogeno e di interazioni ioniche.
978-8S-Ö 8-Ö 6413-4 CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine ¡5;>

Anche se un legame idrogeno contribuisce poco alla stabili­ una parziale condivisione di due
tà della struttura nativa, la presenza di gruppi che possono coppie di elettroni tra l’ossigeno
formare legami idrogeno nei nuclei idrofobici delle proteine carbonilico e l’azoto ammidico
senza partner corretto può essere destabilizzante e confor­ (Figura 4.l a ) . L’ossigeno ha una
mazioni che contengono tali gruppi sono spesso termodina­ carica parziale negativa e l’azo­
micamente improbabili. to una carica parziale positiva,
generando così un piccolo dipo­
Il legame peptidico è rigido e planare lo elettrico. I sei atomi del grup­
Anche i legami covalenti hanno un ruolo importante nel de­ po peptidico giacciono sullo
terminare la conformazione di un polipeptide. Alla fine degli stesso piano e l’atomo di ossige­
anni ’30 Linus Pauling e Robert no del gruppo carbonilico è in
Corey iniziarono una serie di posizione trans rispetto all’ato­ Robert Corey, 1897-1971
studi che gettarono le basi per mo di idrogeno legato all’azoto
la comprensione della struttura ammidico. Da queste osservazioni Pauling e Corey concluse­
delle proteine. Essi iniziarono ro che i legami C— N, a causa del loro parziale carattere di
con un’analisi dettagliata delle doppio legame, non possono ruotare liberamente. È invece
proprietà del legame peptidico. permessa la rotazione tra i legami N — Ca e C0— C. Lo sche­
Gli atomi di carbonio a di resi­ letro della catena polipeptidica può quindi essere considera­
dui amminoacidici adiacenti to come una serie di piani rigidi in cui i piani consecutivi
sono separati da tre legami co­ hanno in comune un punto di rotazione, corrispondente al
valenti che si susseguono in Cc, (Figura 4.1b). La rigidità del legame peptidico limita con­
questo modo: Ca— C— N — Ca. siderevolmente il numero delle conformazioni che la catena
Linus Pauling, 1901-1994 Studi condotti con la tecnica polipeptidica può assumere.
della diffrazione dei raggi X su La conformazione del peptide è definita dagli angoli diedri
cristalli di amminoacidi e su dipeptidi e tripeptidi semplici (detti anche angoli di torsione) chiamati <)> (phi), i(< (psi) che
hanno dimostrato che il legame peptidico C— N è un po’ più riflettono la rotazione intorno a ciascuno dei tre legami che si
corto del legame C— N delle animine primarie e che gli atomi ripetono nello scheletro del peptide (Ficura 4.le ).
che fanno parte del legame peptidico sono complanari. Que­ In linea di principio, 4> e t|» possono avere qualsiasi valore,
ste osservazioni indicavano 1’esistenza di una risonanza o di compreso tra —180° e +180°, ma molti valori non sono per-

0 o s- L’ossigeno carbonilico possiede una parziale


II carica negativa e l’azoto ammidico una parziale
Q=

carica positiva, generando un piccolo dipolo


0
p
/

/
\

M Ga 'N elettrico. Praticamente tutti i legami peptidici


I
I delle proteine hanno la configurazione trans;
H H
un’eccezione è quella mostrata nella Figura 4.4b.

FIGURA 4.1 • Il gruppo peptidico planare, (a) Ciascun legame peptidico possiede
un parziale carattere di doppio legame dovuto alla risonanza, perciò non può ruotare,
(b) Tre legami separano due atomi di carbonio a in una catena polipeptidica, I legami
N— Ca e Ca— C, possono ruotare descrivendo due angoli diedri, chiamati
rispettivamente <j> e i|c Il legame C— N non è libero di ruotare, La rotazione degli altri
legami singoli dello scheletro peptidico è resa difficoltosa dalle dimensioni e dalle
cariche dei gruppi R. (c) Gli atomi ed i piani che definiscono 4>. (d) Per convenzione, il
valore degli angoli <[> e è di 180° (o -180°), quando il primo e il quarto atomo sono il
più lontano possibile tra loro, e il peptide si trova nella sua configurazione più estesa.
Osservando il legame C„— C che va incontro a rotazione (in una direzione o nell’altra,
cioè o nel senso Ca— C o nei senso C— CJ, gli angoli <(> e 4< aumentano se il quarto
atomo ruota in senso orario rispetto al primo. Nelle proteine alcune delle conformazioni
mostrate (per esempio 0°) non sono permesse, a causa della sovrapposizione degli
atomi. In (b), (c) e (d), le sfere che rappresentano gli atomi non sono in scala con i raggi
di van derWaals.
5 6 1 CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine :0 978-88-08-Ò6413-4

messi a causa degli impedimenti sterici tra gli atomi dello ginario che attraversa longitudinalmente la parte centrale
scheletro carbonioso e le catene laterali degli amminoacidi. della spirale, mentre i gruppi R dei residui amminoacidici
Per questo motivo la conformazione in cui gli angoli 4> e sporgono al di fuori dello scheletro elicoidale. L’unità che si
hanno valore = 0° (Figura 4.1d) non è permessa; essa deve ripete è un singolo giro dell’elica, che si estende per circa
essere considerata semplicemente come punto di riferimen­ 5,4 Á lungo l’asse maggiore; ogni giro dell’elica contiene 3,6
to per la descrizione degli angoli. residui. I segmenti di a elica nelle proteine spesso deviano
leggermente da questi valori e variazioni possono trovarsi
anche all’interno di un singolo segmento. Si formano così
lievi torsioni o ripiegamenti rispetto all’asse dell’elica. In
4.2 Struttura secondaria delle proteine tutte le proteine l’avvolgimento dell’a elica è destrorso.
Il termine st ru ttu ra se c o n d a ria si riferisce ad un segmen­ L’a elica è la struttura predominante delle a-cheratine.
to polipeptidico della proteina e descrive l’organizzazione Circa un quarto di tutti i residui amminoacidici nelle protei­
spaziale della catena principale, senza tener conto della con­ ne si trova in strutture ad a elica, ma i valori esatti variano
formazione delle catene laterali o della relazione con altri da proteina a proteina.
segmenti della proteina. Una struttura secondaria regolare La struttura è stabilizzata dai legami idrogeno che si formano
si ha quando ogni angolo diedro 4>e i|r rimane invariato al­ tra l’atomo di idrogeno legato all’azoto parzialmente positivo
l’interno di un segmento. Solo poche strutture secondarie di un legame peptidico e l’atomo di ossigeno carbonilico del
hanno una particolare stabilità e possono così intervenire quarto amminoacido successivo nella direzione dell’estremi­
regolarmente in molte proteine. Le principali sono l’a elica e tà amminica (Figura 4.2a). N e lla elica ciascun legame pepti-
la configurazione p; abbastanza comune è anche il ripiega­ dico (eccetto quelli vicini alle estremità dell’elica) partecipa
mento p. Se non è possibile individuare una struttura rego­ alla formazione di legami idrogeno. Ogni giro d e lla elica è
lare, la struttura viene definita casuale ( random coil). Que- collegato ai giri adiacenti da tre o quattro legami idrogeno,
st’ultima definizione, però, è impropria, perché ravvolgi­ che conferiscono una buona stabilità alla struttura.
mento di uno scheletro polipeptidico non è mai casuale, ma
assume sempre una conformazione specifica, adatta alla -> La sequenza amminoacidica influenza
struttura e alla funzione svolte dalla proteina. Inizieremo ora la stabilità dell’a elica
la trattazione delle strutture regolari più comuni. Non tutti i polipeptidi possono formare a eliche stabili. Cia­
scun residuo amminoacidico in un polipeptide ha una intrin­
-> L’a elica è una comune struttura secondaria seca tendenza a formare un’a elica, che dipende dalle pro­
La più semplice organizzazione regolare che una catena po- prietà del residuo R e dal modo in cui influenzano la capaci­
lipeptidica può assumere, tenendo conto della planarità dei tà degli atomi dello scheletro peptidico di formare i caratte­
legami carbamidici, è una struttura elicoidale, detta a e lic a ristici angoli 4>e v|j.
(Figura 4.2). In questa struttura lo scheletro carbonioso po­ L’avvolgimento dell’a elica può generare anche interazioni
lipeptidico si avvolge strettamente intorno ad un asse imma­ tra una catena laterale amminoacidica e un’altra distante tre

Terminale amininico

FIGURA 4.2 • Tre modelli d e lla elica,


che mostrano aspetti diversi della
5,4 Á struttura, (a) Modello a palle e
(3,6 residui) bastoncini, che mette In evidenza I legami
Idrogeno Intracatena. L'unità ripetitiva è
un giro completo dell’elica contenente
3,6 residui, (b) L a elica vista dall'alto,
lungo l'asse longitudinale della struttura
(da PDB ID 4TNC). Notare le posizioni del
gruppi R, rappresentati da sfere viola,
Questo modello a palle e bastoncini mette
bene in luce la successione elicoidale
degli atomi dello scheletro polipeptidico,
ma dà la falsa impressione dell’esistenza
di un foro centrale, In quanto le palle non
hanno dimensioni In scala con I raggi di
van der Waals del singoli atomi, (c) Il
modello a spazio pieno che mostra gli
atomi al centro d e lia elica In stretto
Terminale carbossilico (c) contatto tra loro.
(a ) (b )
S J 9 ? 8 :8 8 - Ò 8 § 6 4 Ì ^ Ì lÌ |g CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine 15 /

(talvolta quattro) residui. Spesso gli amminoacidi carichi una conformazione a zig-zag, invece che in una conforma­
positivamente si trovano distanziati di tre residui da quelli zione a spirale (Figura 4.3). Le catene polipeptidiche a zig­
carichi negativamente, in modo che possa formarsi un’inte­ zag possono essere disposte luna accanto all’altra, forman­
razione ionica. Due residui aromatici che si trovano distan­ do una struttura che nel suo insieme presenta una serie di
ziati di tre residui formano interazioni idrofobiche. pieghettature. In questa disposizione delle catene polipepti­
Una limitazione alla formazione dell’a elica è rappresentata diche, detta fo g lie t t o 0, i legami idrogeno si formano tra
dai residui di Pro e Gly che hanno la propensione più bassa a regioni adiacenti delle catene polipeptidiche. I singoli seg­
formare l’a elica. Nella prolina, l’atomo di azoto fa parte di un menti che formano un foglietto 0 generalmente sono vicini
anello rigido (vedi la Figura 4.4b) e non è possibile alcuna ro­ l’uno all’altro nella catena polipeptidica, ma possono anche
tazione intorno al legame N — Ca. Quindi, ogni residuo di Pro trovarsi lontani nella sequenza lineare del polipeptide e pos­
introduce un ripiegamento destabilizzante in una struttura ad sono addirittura trovarsi in catene polipeptidiche diverse. I
a elica. Inoltre, l’atomo di azoto di un residuo di Pro impegna­ gruppi R di amminoacidi adiacenti sporgono dalla struttura
to in un legame peptidico non ha l’atomo di idrogeno sosti­ a zig-zag in direzioni opposte, creando un’alternanza “sopra­
tuente che è necessario per generare un legame idrogeno con sotto” che è possibile osservare nella “prospettiva laterale”
altri residui. Per questi motivi la prolina è solo raramente pre­ della Figura 4.3.
sente all’interno di uria elica. La glieina è anch’essa difficil­ Le catene polipeptidiche adiacenti di un foglietto 0 posso­
mente presente in uria elica, ma per motivi diversi: questo no essere o parallele, o antiparallele (possono cioè avere lo
amminoacido ha una flessibilità conformazionale superiore a stesso orientamento o un orientamento opposto del legame
tutti gli altri residui. I polimeri di glieina tendono ad assume­ carbamidico NH— CO). Le due strutture sono abbastanza si­
re strutture avvolte casualmente, molto diverse dalla elica. mili, anche se il periodo che si ripete è più corto per la con­
Vi sono quindi quattro tipi principali di restrizioni che altera­ formazione parallela (6,5 A contro 7 A per l’antiparallela).
no la stabilità di uria elica: ( 1) la propensione intrinseca di Non tutti i tipi di amminoacidi possono far parte di un fo­
un residuo amminoacidico a formare uria elica; ( 2) l’intera­ glietto 0. Quando due o più foglietti 0 si trovano sovrapposti
zione tra gruppi R, specialmente quelli che si trovano lonta­ l’uno sull’altro in una proteina, i gruppi R dei residui ammi-
ni 3 o 4 residui; (3 ) l’ingombro sierico di gruppi R adiacenti; noacidici delle superfici di contatto devono essere relativa­
(4 ) la presenza di residui di Pro e di Gly. La tendenza di un mente piccoli.
dato segmento di una catena polipeptidica a ripiegarsi in
forma di a elica dipende dal tipo di residui che lo compongo­ -> I ripiegamenti 0 sono frequenti nelle proteine
no e dalla loro sequenza all’interno del segmento. Nelle proteine globulari, che hanno una struttura ripiegata
compatta, quasi un terzo dei residui amminoacidici si trova
-> La conformazione (3 organizza le catene polipeptidiche in ripiegamenti o anse, dove la catena polipeptidica inverte
in foglietti la sua direzione (Figura 4.4). Questi ripiegamenti collegano
In un secondo tipo di struttura ripetitiva, la c o n fo rm a z io ­ tratti successivi in a eliche o in conformazioni 0. Molto co­
ne 0 , lo scheletro della catena polipeptidica si estende in muni sono i rip ie g a m e n t i 0, che collegano le estremità di

FIGURA 4.3 • Conformazione 0 delle catene polipeptidiche. Queste pieghettato). Sono anche mostrati i legami idrogeno tra catene adiacenti.
illustrazioni, in cui le catene polipeptidiche sono osservate dall’alto o di lato, L’orientamento delle catene adiacenti (frecce) (dall’estremità amminica verso
mostrano la disposizione dei gruppi R che sporgono al di fuori del foglietto 0 e l’estremità carbossilica) può essere nello stesso senso o in senso opposto,
mettono in risalto l’andamento pieghettato dei piani in cui giacciono i legami formando (a) un foglietto 0 antiparallelo, o (b) un foglietto 0 parallelo.
peptidici (infatti una denominazione alternativa della struttura è foglietto 0
5 8 1 CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine ; © 978^88-08-06413-4

R
O

/A?-X^
/ C\

H
/ — -,

(1 = 0
R H

o/ “ N
II

trans

Tipo Tipo II
( a ) Ripiegamenti fi (b ) Isomeri di prolina

FIGURA 4 .4 • Struttura di un ripiegamento (ì. (a) I ripiegamenti fi di tipo I a cui partecipa l’atomo di azoto amminico secondario delia pralina. Oltre il
e II sono i più comuni. Il tipo I ha una frequenza nelle proteine circa doppia 99,95% dei legami peptidici tra residui amminoacidici diversi dalla pralina è
rispetto al tipo II. Il ripiegamento p di tipo II ha sempre un residuo di Gly alla nella configurazione trans. Circa il 6% dei legami peptidici in cui è coinvolto
terza posizione. Si noti la formazione di un legame idrogeno tra i gruppi l’atomo di azoto amminico secondario della pralina è invece nella
peptidici del primo e del quarto residuo dei ripiegamento. (I singoli amminoacidi configurazione cis e molti di questi sono presenti in ripiegamenti p.
sono racchiusi in cerchi azzurri.) (b) Gli isomeri trans e cis del legame peptidico

due segmenti adiacenti di un foglietto p antiparallelo. La condarie possono interagire fra loro nella forma compieta-
struttura consiste di un ripiegamento a 180° di una sequen­ mente avvolta della proteina.
za di quattro residui, dove il gruppo carbonilico del primo Alcune proteine contengono due o più catene polipeptidi-
residuo forma un legame idrogeno con l’idrogeno legato al­ che distinte, o subunità, che possono essere identiche o di­
l’azoto del quarto. I legami peptidici dei due residui centra­ verse. La disposizione di queste subunità in complessi tridi­
li non partecipano alla formazione di legami idrogeno. Resi­ mensionali prende il nome dì s t r u t t u r a q u a te rn a ria .
dui di glieina e di prolina spesso si trovano nei ripiegamenti Considerando questi livelli strutturali, diventa utile classi­
(3; i primi in quanto hanno una struttura piccola e flessibile. ficare le proteine in due gruppi principali: le p r o t e in e f i ­
I legami peptidici che coinvolgono l’azoto amminico secon­ b ro se , che hanno catene polipeptidiche disposte in lunghi
dario della prolina assumono facilmente la configurazione fasci o in foglietti, e le p ro te in e g lo b u la ri, che hanno inve­
cis (Figura 4.4b), particolarmente adatta ai ripiegamenti p. ce catene polipeptidiche ripiegate e assumono forme globu­
I due tipi di strutture p mostrati nella Figura 4.4a sono quel­ lari o sferiche. I due gruppi sono strutturalmente distinti: le
li più comuni e si trovano spesso vicino alla superficie delle proteine fibrose sono costituite in gran parte da un unico
proteine. tipo di struttura secondaria e la struttura terziaria è relati­
vamente semplice, mentre le proteine globulari contengono
più tipi di struttura secondaria. I due gruppi differiscono
anche funzionalmente per il fatto che le proteine che deter­
4.3 Struttura terziaria e quaternaria minano la resistenza, la forma e la protezione esterna delle
deile proteine
cellule dei vertebrati sono fibrose, mentre gli enzimi e le
La disposizione nello spazio di tutti gli atomi di una proteina proteine regolatrici sono per la maggior parte globulari.
viene definita come st ru ttu ra te rz ia ria . Mentre l’espres­
sione “ struttura secondaria” si riferisce alla disposizione -> Le proteine fibrose sono adattate a ruoli strutturali
spaziale di residui amminoacidici adiacenti in un segmento L’a-cheratina, il collageno e la fibroina della seta sono esempi
di un polipeptide, la struttura terziaria tiene conto delle re­ della relazione esistente tra la struttura di una proteina e la
lazioni a lungo raggio nella sequenza amminoacidica. Gli sua funzione biologica (Tabella 4.1). Le proteine fibrose
amminoacidi che si trovano lontani in una sequenza polipep- hanno proprietà tali da conferire resistenza e/o elasticità alla
tidica e quindi fanno parte di tipi differenti di strutture se­ struttura di cui fanno parte. In ogni caso l’unità strutturale di

[222H 2E Struttura secondaria e proprietà di alcune proteine fibrose


Struttura Caratteristiche Esempi

a Elica, con ponti disolfùro Strutture protettive dure e insolubili «-Cheratina di capelli, penne e unghie
trasversali di varia resistenza flessibilità
Conformazione p : : - Filamenti soffici e fi: r-.il ili (p Fibrohra detta setapt
Tripla elica del collageno Molto resistente alla tensione, senza elasticità 4 Collageno dei tendini, della matrice delle ossa
© 9 7 8 -S & 0 8 -0 6 4 1 3 -4 GAPiTO.04 Struttura tridimensionale delle proteine 159

base è un semplice elemento di struttura secondaria ripetu­


to. Tutte le proteine fibrose sono insolubili in acqua, una ca­
ratteristica che dipende dalla presenza di elevate concentra­
zioni di amminoacidi idrofobici sia all’interno sia sulla superfi­
cie della proteina. Le superflui idrofobiche sono ben nascoste
al solvente mediante l’associazione con catene polipeptidiche
simili in elaborati complessi sopramolecolari.

a-Cheratina Le a-cheratine si sono evolute con una strut­


tura adatta a resistere alla tensione. Si trovano solo nei
mammiferi dove rappresentano la quasi totalità del peso
secco dei capelli, della lana, delle penne, delle unghie, degli
artigli, delle coma, degli zoccoli e degli strati esterni della
pelle.
L’a elica dell’a-cheratina è destrorsa ed è presente in molte
altre strutture proteiche. Due catene di a-cheratina con la
FIGURA 4.8 • Struttura del collageno. (Ottenuta da PDBID1CGD.) (a) La
stessa direzionalità (con gli amminoacidi amminoterminali
catena a del collageno ha una struttura secondaria ripetitiva, La sequenza ripetitiva
alla stessa estremità) si avvolgono una sull’altra per formare del tripeptide Gly-XTro oppure Gly-X-4Hyp assume una struttura elicoidale
un superawolgimento (coiled coir). Questa organizzazione sinistrorsa con tre residui per giro. La sequenza ripetitiva usata per generare questo
modello è Gly-X-4Hyp. (b) Modello a spazio pieno della stessa catena a del
strutturale aumenta la resistenza dell’intero complesso,
collageno. (c) Tre di queste eliche (mostrate in grigio, azzurro e viola) si avvolgono
come accade in una corda (Figura 4.5). Le superfici dove le Luna intorno all’altra con un andamento destrorso, (d) Una rappresentazione a
due eliche si toccano nella struttura avvolta sono rivestite palle e bastoncini della superelica a tre catene del collageno vista da una delle
estremità. I residui di Gly sono in rosso. La glieina, proprio per le sue piccole
da amminoacidi idrofobici; i loro gruppi R si inseriscono
dimensioni, è necessaria per conferire compattezza alla tripla elica, consentendo la
l’uno vicino all’altro con un’alternanza perfettamente regola­ formazione di giunzioni forti nei punti In cui le tre catene entrano In contatto. I
re. Non è quindi sorprendente che le a-cheratine siano ric­ modelli usati in questa rappresentazione non rispettano le dimensioni reali del raggi
di van der Waals dei singoli atomi. Il centro della tripla elica non è vuoto, come
che di residui idrofobici Ala, Val, Leu, Ile, Met e Phe.
appare nella figura, ma è invece totalmente riempito.
La resistenza delle proteine fibrose è aumentata da legami
covalenti crociati tra le catene polipeptidiche, presenti al­
l’interno di una struttura “ a corda” o tra catene adiacenti
nel complesso sopramolecolare. Nelle a-cheratine più dure Collageno II collageno, come le a-cheratine, si è evoluto
e resistenti, come quelle del corno dei rinoceronti, più del per resistere alle tensioni. È presente nel tessuto connettivo
18% dei residui totali è costituito da cisteine impegnate in come il tendine, la cartilagine, la matrice organica delle ossa
ponti disolfuro. e la cornea dell’occhio. L’elica del collageno è una struttura
secondaria del tutto distinta d a lla elica. È sinistrorsa e ha
tre residui amminoacidici per giro (Figura 4.6). Il collageno
è un coiled coil, ma con caratteristica struttura terziaria e
quaternaria: tre catene polipeptidiche separate, dette cate­
ne a (da non confondere con le a eliche), sono superawol-
te le une sulle altre (Figura 4.6c). L’awolgimento supereli­
coidale è destrorso nel collageno, mentre le singole catene a
sono sinistrorse.
N ei vertebrati esistono molti tipi di collageno nei quali la
Gly rappresenta il 35% dei residui totali, l ’Ala l’11% e la
Pro insieme alla 4-Hyp (4-idrossiprolina, un amminoacido
non standard) circa il 21%. Questa insolita composizione
in amminoacidi è imposta dalle restrizioni strutturali pre­
senti nell’elica del collageno. La sequenza amminoacidica
del collageno è costituita da un’unità tripeptidica ripetuta,
Gly-X-Y, dove X è spesso Pro e Y è spesso 4-Hyp. I residui
di Gly sono gli unici che si possono adattare ai punti in cui
le catene a si accostano molto strettamente (Figura 4.6d);
i residui di Pro e 4-Hyp consentono lo stretto avvolgimen­
to della catena polipeptidica del collageno.

----- _ j 4.5 • Struttura del capello, fa-cheratina dei capelli è una lunga Fibroina della seta La fibroina, la proteina della seta, viene
a elica con diversi ispessimenti in corrispondenza delle terminazioni amminiche prodotta dagli insetti e dai ragni. Le sue catene polipeptidi­
e carbossiliche. Coppie di queste eliche si avvolgono con andamento sinistrorso che si trovano quasi esclusivamente nella conformazione (3.
e formano strutture avvolte (coiled coil). Queste, a loro volta, generano strutture
ancora più ordinate dette protofilamenti e protofibrille, Un capello è un La fibroina è ricca di residui di Ala e Gly, che permettono di
aggregato di molti filamenti di a-cheratina. avvicinare molto le catene tra loro e di formare un foglietto
6 0 1 CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine « ja æ «s o i «-u à 1

acidi, di cui è nota la sequenza, e da una singola protoporfi-


Conformazione 0
2000 X 5 Â
rina, o gruppo eme. Lo stesso gruppo eme della mioglobina
è presente anche nell’emoglobina, la proteina che lega l’ossi­
geno negli eritrociti, responsabile del colore rosso brunastro

a elica Forma globulare nativa


sia della mioglobina che dell’emoglobina. La mioglobina è
900 X 11 À 100 X 60 À particolarmente abbondante nei muscoli dei mammiferi ma­
rini che rimangono immersi a lungo, come il capodoglio, la
FIGURA 4.7 • La struttura delle proteine globulari è varia e compatta. foca e la focena, tanto da conferire ai muscoli di questi ani­
L’albumina del siero umano (M, 64500) ha 585 amminoacidi in una sola catena mali un intenso colorito brunastro. La funzione di deposito
polipeptldica. Nella figura sono mostrate le dimensioni approssimate che questo
dell’ossigeno della mioglobina e la sua distribuzione permet­
singolo polipeptide potrebbe avere se potesse assumere per intero conformazioni
ad a elica o a foglietto 0. È anche indicata la dimensione reale della proteina tono ai mammiferi marini di rimanere immersi per lunghi
nella sua forma globulare nativa, determinata per cristallografia ai raggi X. La periodi.
catena polipeptldica deve avvolgersi in modo molto compatto, per poter
La Figura 4.8 mostra alcune immagini della struttura della
assumere queste dimensioni.
mioglobina che illustrano come la catena polipeptìdica si av­
volga per assumere la sua struttura tridimensionale caratte­
ristica, cioè la sua struttura terziaria. Il gruppo in rosso, cir­
P compatto in quanto le catene laterali R si integrano perfet­ condato dalla proteina, è il gruppo eme. Lo scheletro della
tamente. La struttura complessiva è stabilizzata da molti le­ molecola della mioglobina è costituito da otto segmenti rela­
gami idrogeno tra i gruppi peptidici nelle catene polipeptidi- tivamente compatti di a eliche interrotte da ripiegamenti,
che impegnate nel foglietto p e dall’ottimizzazione delle in­ alcuni dei quali sono ripiegamenti p. L’a elica più lunga ha
terazioni di van der Waals tra foglietti differenti. 23 residui amminoacidici e la più corta ne ha soltanto sette;
tutte sono destrorse. Più del 70% degli amminoacidi della
-» Nelle proteine globulari la diversità strutturale molecola della mioglobina è strutturato in a eliche. L’analisi
riflette la diversità funzionale __ ai raggi X ha rivelato la posizione precisa di ogni gruppo R,
Nelle proteine globulari diversi segmenti della catena poli- ciascuno dei quali riempie tutto lo spazio esistente all’inter­
peptidica (o catene polipeptidiche multiple) si avvolgono gli no della catena ripiegata.
uni sugli altri, generando una struttura più compatta di Si possono trarre altre conclusioni rilevanti dalla struttura
quella delle proteine fibrose (Figura 4.7). L’avvolgimento della mioglobina. La posizione delle catene laterali degli am­
delle proteine è anche responsabile delle molteplicità strut­ minoacidi è dovuta a una struttura la cui stabilità dipende in
turali, che permettono una gamma di funzioni così vasta. Le gran parte da interazioni idrofobiche. La maggior parte dei
proteine globulari includono gli enzimi, le proteine di tra­ gruppi R idrofobici si trova all’interno della molecola della
sporto, le proteine regolatrici, le immunoglobuline, e tante mioglobina, lontano dal contatto con l’acqua. Tutti i gruppi R
altre proteine con le più svariate funzioni. polari, meno due, sono localizzati sulla superficie esterna
della molecola e tutti sono quindi idratati. La molecola della
-> La mìoglobina è il primo esempio della complessità mioglobina è così compatta che nel suo interno vi è spazio
strutturale delle proteine globulari solo per quattro molecole di acqua. Questo denso nucleo idro­
La mioglobina è una proteina muscolare relativamente picco­ fobico è tipico delle proteine globulari.
la (Mr 16 700), che le^a l’ossigeno. La sua funzione è quella H gruppo eme relativamente piatto è confinato in un’infossa-
di immagazzinare l’ossigeno, e di facilitarne la diffusione nei tura, o tasca, della molecola della mioglobina. L’atomo di
muscoli in rapida contrazione. È costituita da 153 ammino­ ferro posto al centro del gruppo eme ha due legami (posizio-

(a ) (b ) (c ) (d )

FIGURA 4.8 * Struttura terziaria della mioglobina di capodoglio. (PDB ID della struttura proteica si mettono in evidenza le infossature o tasche
1MB0) L’orientamento della proteina è lo stesso da (a) a (d); il gruppo eme è superficiali a cui si possono legare altre molecole, (c) Rappresentazione a
mostrato In rosso. Oltre ad Illustrare la struttura della mioglobina, la figura nastro che Include le catene laterali (In blu) del residui idrofobici Leu, Ile, Val e
mostra anche esempi di modi diversi di rappresentare le strutture proteiche. Phe. (d) Modello a spazi pieni comprendente tutte le catene laterali
(a) Lo scheletro del polipeptide è rappresentato sotto forma di nastro, secondo ammlnoacldiche. Ciascun atomo è rappresentato da una sfera proporzionale al
una convenzione Introdotta da Jane Richardson, per mettere in evidenza le suo raggio di van der Waals. I residui Idrofobici sono ancora rappresentati In
regioni a struttura secondaria. Qui sono evidenti le regioni ad a elica. blu. La maggior parte di essi, però, non è visibile perché nascosta all'interno
(b) Immagine della superficie della proteina; In questa rappresentazione della molecola.
© 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4 CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine 161

e di conformazione 0 (espresse come percentuale dei vari


0
A ,» ' / residui nell’una o nell’altra) in piccole proteine globulari.
c c
/ \r Ciascuna di queste proteine ha una sua caratteristica strut­
ch2 .c h 2
tura, adatta alla sua particolare funzione biologica; tuttavia
ch2 CH.
esse hanno importanti proprietà in comune con la mioglo­
/ V /CI\ bina.
c h 3 - c^ c c \ - ch3
Per comprendere la struttura tridimensionale di una protei­

s - k na occorre analizzare come le sue parti si avvolgono nello


C\ / F e\ / CH spazio. Inizieremo definendo due termini importanti per le
G— N +N = C catene polipeptidiche, per giungere poi ad enunciare le re­
// | | \
gole che determinano il processo di ripiegamento.
ch2 c nch C Il primo term ine è il motivo, detto anche struttura su­
CH 3 CH persecondaria (o ripiegamento). Un motivo è costitui­
%
(a ) CH 2 (b ) to da un avvolgimento polipeptidico caratteristico, perciò
ben riconoscibile, formato da due o più elementi di struttu­
ra secondaria e dagli elementi di connessione. Anche se esi­
FIGURA 4.9 • Il gruppo eme. Questo gruppo è presente nella mlogloblna,
nell’emoglobina, nei citocromi e In molte altre proteine (proteine contenenti ste una certa confusione in letteratura sulla nomenclatura
eme). (a) L’eme è costituito da una struttura organica ad anello, la adottata per indicare queste strutture, i vari nomi sono co­
protoporfirlna, a cui è legato un atomo di ferro sotto forma di ione ferroso munque intercambiabili. Un motivo può essere costituito
(Fe2+). L’atomo di ferro ha sei valenze di coordinazione: quattro sullo stesso
plano, legate alla molecola della porfirina, e due perpendicolari al piano delle semplicemente da due elementi di struttura secondaria, ri­
altre quattro, (b) Nella mioglobina e nell'emoglobina uno dei legami piegati l’uno sull’altro, che rappresentano solo una piccola
perpendicolari di coordinazione è legato a un atomo di azoto di un residuo di parte di una proteina. Un esempio è l’ansa p-a-p (Figura
His. L’altro è “vuoto" e serve come sito di legame per una molecola di 0 2.
4.10a). Ma il motivo può anche essere una struttura elabo­
rata, che comporta diversi segmenti uniti insieme a forma­
ni) di coordinazione perpendicolari al piano dell’eme (Figura re una struttura carati eristica,, come il barile 0 (Figura
4.9). Uno di questi si lega al gruppo R di un residuo di His 4.10b). Con il termine “motivo” si intendono tutti i ripiega­
nella posizione 93; l’altro è invece il sito a livello del quale si menti ricorrenti in proteine diverse. Il motivo non è stabile
lega la molecola di ossigeno. In questa tasca l’accessibilità del se isolato dal contesto della proteina. Il motivo non è un
gruppo eme al solvente è molto limitata. Ciò è molto impor­ elemento strutturale gerarchico, da porre tra la struttura
tante per il funzionamento della proteina, in quanto i gruppi secondaria e la terziaria, ma è un caratteristico tipo di av­
eme liberi in una soluzione ossigenata vengono rapidamen­ volgimento che descrive parte del peptide. Il secondo ter­
te ossidati e l’atomo di ferro passa dallo stato di ossidazione mine è il dominio, una parte di una catena polipeptidica di
Fe2+, capace di legare reversibilmente l’ossigeno, allo stato per sé stabile.
di ossidazione Fes+, che non è in grado di legare l’ossigeno. I polipeptidi costituiti da qualche centinaio di residui am-
minoacidici spesso si avvolgono nello spazio formando due
-> Le proteine globulari hanno varie strutture terziarie o più domini, che talvolta svolgono funzioni diverse. In
Da quello che sappiamo oggi sulla struttura terziaria di molti casi, un dominio di una proteina di grandi dimensioni
centinaia di proteine globulari è chiaro che quello della mantiene la sua struttura tridimensionale anche se viene
mioglobina è solo uno dei tanti tipi di avvolgimento protei­ separato dal resto della catena polipeptidica. In una protei­
co esistenti. La Tabella 4.2 mostra le proporzioni di a elica na con molti domini, ciascuno di questi può apparire come

| 2 | Percentuali approssimative del contenuto


di n elica e di conformazione |l in alcuni
tipi di proteine a singola catena
Residui (%)*

Proteina (residui totali) a elica conformazione 0

Chimotripsina (247) 45
Ribonucleasi (124) 35
Carbossipeptidasi (307) 17
Citocromo c (104) 4K4U)3'9v ):::ì o .y ;y .
Lisozima (129) i 2 ..;)yy>y'’
Mioglobina (153) (y y y ^ y y q y «y ;
(b ) Barile (8
Fonte: dati tratti da Cantor, C.R. e Schimmel, P.R. (1980) Biophysical Che-
mistry , Parte I: The Conformation of Biological Macromolecules, p. 100,
W.H. Freeman and Company, New York. FIGURA 4 .1 0 • Due motivi, (a) Un motivo semplice, l’ansa
* Le porzioni della catena polipeptidica non strutturate ad a elica o a configura­ p - a - M b ) Un motivo più elaborato, il barile 0. Il barile 0 costituisce un singolo
zione (3 sono costituite da ripiegamenti, da avvolgimenti irregolari o da tratti in dominio presente nell’a-emolisina (una tossina che uccide le cellule, formando
conformazione estesa. Alcuni segmenti di a elica o di configurazione (3 talvolta un poro che attraversa le membrane) del batterio Staphylococcus aureus
deviano alquanto dalle normali dimensioni e dalla normale geometria. (ottenuto da PDBID 7AHL).
tìlPITOU) 4 Struttura tridimensionale delle proteine © 9 7 S -8S -08-06413-4

tiple e complesse. Per esempio ogni ribosoma, il sito della


sintesi proteica, è costituito da decine di subunità proteiche
insieme a numerose molecole di RNA.
Una proteina costituita da più subunità viene anche deno­
minata multimero. Un multimero costituito da poche sub­
unità viene spesso definito oUgomero. Se un multimero è
costituito da subunità con diverse strutture, la struttura glo­
bale della proteina può essere asimmetrica e quindi molto
complessa. L’unità strutturale ripetitiva di una proteina mul-
timerica, sia essa una subunità singola o un gruppo di sub-
unità, viene detta protomero e si usano lettere greche per

FIGURA 4.11 • Domini strutturali della catena polipeptidica della distinguere le singole subunità.
troponina C. (PDBID 4TNC) Questa proteina che lega il calcio nel muscolo La prima proteina oligomerica di cui è stata determinata la
possiede due domini separati, colorati In viola e in blu, contenenti I siti per II struttura tridimensionale è l’emoglobina (M r 64 500), che
calcio.
contiene quattro catene polipeptidiche e quattro gruppi
prostetici eme, in cui gli atomi di ferro sono allo stato ferro­
so ( F e 2+) (Figura 4.9). La proteina, una globina, è formata
un lobo globulare distinto (Figura 4.11). Dall’attenta osser­ da due catene a (ciascuna di 141 residui) e due catene (3
vazione degli avvolgimenti proteici sono state ricavate al­ (ciascuna di 146 residui). Le subunità dell’emoglobina si di­
cune regole generali. spongono simmetricamente in due coppie (Figura 4.12),
ciascuna contenente una subunità a e una subunità (3. Quin­
1. Le interazioni idrofobiche contribuiscono in larga misu­ di l’emoglobina può essere considerata o come un tetrame­
ra alla stabilità delle strutture proteiche. ro oppure come un dimero formato da due protomeri ot(3.
2. Quando in una proteina sono presenti a eliche e strut­ Le subunità identiche delle proteine multimeriche in genere
ture p, si trovano sempre in comparti strutturali diffe­ sono disposte in modo da formare un limitato numero di
renti. strutture simmetriche. La descrizione di tali strutture neces­
3. Segmenti adiacenti nella struttura primaria generalmen­ sita di una breve introduzione sulle convenzioni usate per de­
te sono in contatto tra di loro nella struttura avvolta finire le simmetrie. Gli oligomeri possiedono o una simme­
della proteina. Segmenti distanti possono venire a con­ tria rotazionale o una simmetria elicoidale, cioè le singo­
tatto, ma questa non è una regola. le subunità possono essere sovrapposte (cioè fatte coincide­
4. Le connessioni tra le strutture secondarie non possono re) tramite la rotazione intorno ad uno o più assi rotazionali,
incrociarsi, né formare nodi. oppure mediante ima rotazione elicoidale.
5. La conformazione p è più stabile quando i singoli segmen­ Esistono diverse forme di simmetria rotazionale. La più
ti cha la compongono sono leggermente piegati in senso semplice è chiamata simmetria ciclica, che implica la ro­
destrorso. tazione intorno ad un singolo asse (Figura 4.13). Se le subu­
nità possono essere sovrapposte per rotazione intorno ad un
La s tru ttu ra q u a te rn a ria co m p re n d e s tru ttu re p ro te ic he singolo asse, la proteina possiede una simmetria definita
che va nno dai d ìm e ri a co m p le s si m o lto p iù g randi come C„ (C sta per ciclica, n è il numero di subunità intorno
Molte proteine sono formate da più subunità polipeptidiche all’asse). Lo stesso asse viene indicato come asse n volte ro­
(da due a centinaia). Alcuni complessi proteici di grandi di­ tazionale. I protomeri a|3 dell’emoglobina (Figura 4.12) sono
mensioni costituiscono il sito dove si svolgono reazioni mul­ correlati da una simmetria di tipo C2.

FIGURA 4.1 2 • Struttura quaternaria della deossiemoglobina. (PDB ID 2HHB) L’analisi mediante diffrazione ai raggi X
della deossiemoglobina (emoglobina senza le molecole di ossigeno legate ai gruppi eme) mostra come le quattro subunità siano
unite tra loro, (a) Modello a nastro, (b) Analisi della superficie proteica. Le subunità a sono rappresentate In grigio; le subunità
|3 In blu. Si noti che i gruppi eme (In rosso) sono relativamente distanti l’uno dall’altro.
CO(WS 88-CH 06413 A CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine 163

Due volte Tre volte VEscherichia coli. Non è ancora chiaro come piccole diffe­
renze possano essere responsabili di una stabilità così ele­
vata alle alte temperature.
Le proteine si denaturano anche a pH estremi o in solventi
organici miscibili con l’acqua, come l’alcol e l’acetone, o in
soluti come urea, cloruro di guanidina e detergenti. Ciascu­
no di questi agenti denaturanti di per sé rappresenta un
C2 Cg trattamento relativamente blando, perché lascia intatti i le­
gami covalenti delle catene polipepeptidiche. I solventi or­
FIGURA 4.13 • Simmetria rotazionale nelle proteine. Nella simm etria
ciclica le subunità sono correlate da una rotazione attorno a un singolo asse n ganici, i detergenti e l’urea agiscono soprattutto rompendo
volte rotazionale, dove n
è il numero di subunità che circondano l'asse. Gli assi le interazioni idrofobiche che stabilizzano il nucleo centrale
sono rappresentati co m e linee nere; i numeri son o i valori di n.
Sono mostrate
delle proteine globulari; i pH estremi alterano la carica netta
solo due delle possibili organizzazioni C„.
delle proteine, causando repulsioni elettrostatiche e la rot­
tura dei legami idrogeno.

4.4 Denaturazione e ripiegamento -> La sequenza degli amminoacidi determina


delle proteine la struttura terziaria
-> La perdita della struttura provoca la perdita Che la struttura terziaria di una proteina globulare sia de­
della funzione delle proteine terminata dalla sua sequenza amminoacidica è suggerito dal
Le proteine si sono evolute per svolgere la loro funzione nelle fatto che la denaturazione delle proteine è un processo re­
particolari condizioni ambientali della cellula. In ambienti di­ versibile. Questo processo è chiamato rinaturazione.
versi esse possono andare incontro a variazioni strutturali, Un classico esempio di denaturazione e rinaturazione è
anche di notevole entità. La perdita della struttura tridimen­ l’esperimento condotto da Christian Anfinsen negli anni ’50
sionale è detta denaturazione, un processo che non impli­ sulla ribonucleasi A. La proteina purificata si denatura com­
ca necessariamente il completo srotolamento della struttu­ pletamente in una soluzione concentrata di urea in presen­
ra proteica e l’acquisizione di una struttura casuale. Nella za di un agente riducente, che spezza i quattro ponti disolfu­
maggior parte dei casi le proteine denaturate assumono con­ ro, producendo otto residui di cisteina; l’urea invece rompe
formazioni parzialmente ripiegate, ancora non ben definite. le interazioni idrofobiche che stabilizzano la proteina. La pro­
La maggior parte delle proteine si denatura al calore, che teina viene così completamente srotolata, un processo che si
produce effetti complessi sulle interazioni deboli (principal­ accompagna alla perdita della sua attività catalitica. Se l’urea
mente sui legami idrogeno). Se la temperatura aumenta len­ e l’agente riducente vengono rimossi per dialisi, la ribonu­
tamente, in genere la conformazione di una proteina rima­ cleasi denaturata, che ora possiede una struttura casuale, si
ne intatta, fino a che la sua struttura (e quindi la sua funzio­ riavvolge spontaneamente, riacquistando la sua struttura
ne) non cambia bruscamente, entro un ristretto ambito di terziaria e la sua attività catalitica (Figura 4.15). Il riawolgi-
temperatura (Figura 4.14). La rapidità del cambiamento di mento della ribonucleasi è molto accurato, e nella ribonu­
struttura induce a pensare che la perdita della struttura na­ cleasi rinaturata i quattro ponti disolfuro intracatena si rifor­
tiva sia un processo cooperativo; la perdita della struttura mano nelle stesse posizioni presenti nella ribonucleasi nativa.
in una regione della proteina favorisce la destabilizzazione L’esperimento di Anfinsen dimostrò che la sequenza degli
di altre regioni. L’effetto del calore sulle proteine non è fa­ amminoacidi di un polipeptide contiene tutte le informazio­
cilmente prevedibile. Le proteine molto stabili dei batteri ni necessarie per avvolgere la catena nella sua struttura tri­
termofili e degli archea si sono evolute in modo da funzio­ dimensionale, corrispondente al suo stato nativo. Anche se
nare anche alle temperature delle sorgenti calde (~100 °C). tutte le proteine potenzialmente possono ripiegarsi nella
Eppure la struttura di queste proteine differisce solo di poco loro struttura nativa, alcune richiedono l’assistenza di altre
da quella delle corrispondenti proteine di altri batteri, come proteine, come vedremo qui di seguito.

FIGURA 4 .1 4 • Denaturazione termica delle proteine. La transizione tra


lo stato ripiegato e quello non ripiegato è molto brusca, probabilmente per
effetto di un processo cooperativo che facilita lo srotolamento della catena
polipeptidica. Nel grafico, denaturazione termica dell’apomioglobina di cavallo
(mioglobina senza il gruppo prostetico eme) e della ribonucleasi A (con i ponti
disolfuro intatti; vedi la Figura 4.15). Il punto di mezzo dell’intervallo di _— ttU S____i______ yvyBvV:
temperatura In cui avviene la denaturazione viene detto temperatura di 0 20 40 60 80 100
fusione, Tm.
Temperatura (°C )
6-<| CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine ; @ '9 7 8 -8 8 -0 S ^0 6 4 Ì'3 '4

itìl||||||||énte attivo

:StätÖ:srÖtbiäto,
FIGURA 4.16 • Simulazione del processo di ripiegamento di un
polipeptide. Il percorso seguito da un segmento di 36 amminoacidi della vllllna
;;äisöiteiiS;süÄo stati
(una proteina che lega lactina, che si trova principalmente nel mlcrovilll
Intestinali) è stato simulato con l’aiuto di un programma computerizzato. Il
processo ha Inizio con un peptide avvolto casualmente, circondato da 3000
molecole di acqua, In una virtuale “scatola d’acqua” . Per costruire ¡I percorso
più probabile che porta alla struttura finale attraverso una miriade di strutture
alternative, sono stati presi In considerazione gli effetti del movimenti molecolari
del peptide e delle molecole d’acqua. Il ripiegamento simulato In teoria avviene
In 1 ms.

StMÖi^ätiyÖii I te delle proteine in cui molte interazioni a lungo raggio tra


jbäfflitiGMddte attivo.; parti diverse del polipeptide impongono vie di ripiegamento
sl^ p rtilìd isd jf^ dei I
Jpaíltplfeadüi^di più complesse.
HdiSdffidfiäqnp; Non tutte le proteine si avvolgono spontaneamente dopo
la loro sintesi nella cellula. L’avvolgimento di molte protei­
:tìdrréttàmèitted^
ne richiede la presenza di chaperoni molecolari, protei­
ne che interagiscono con polipeptidi ripiegati parzialmen­
te o ripiegati in modo improprio, facilitando il compito del
FIGURA 4.15 • Rinaturazione della ribonucleasi srotolata e denaturata.
L'urea è usata per denaturare la ribonucleasi, e il mercaptoetanolo processo o fornendo un microambiente in cui l’awolgimen-
(H0CH2CH2SH) per ridurre e quindi scindere i ponti disolfuro, formando otto to avviene correttam ente. Questi chaperoni molecolari
residui di Cys. La rinaturazione ristabilisce i ponti disolfuro nelle posizioni “proteggono” le nuove molecole polipeptidiche non ancora
corrette.
ripiegate, impedendo il ripiegamento di proteine che de­
vono rimanere non ripiegate fino a che non sono state tra­
sferite attraverso la membrana oppure facilitando l’orga­
-> I polipeptidi si ripiegano rapidamente nizzazione in strutture quaternarie delle proteine oligome-
secondo un processo a tappe riche.
Il ripiegamento di una catena polipeptidica molto lunga è
senz’altro un processo complicato e i principi su cui si basa -> I difetti nell’awolgimento delle proteine
non sono stati chiariti. Esistono però alcuni modelli plausibi­ sono la base molecolare di un vasto numero
li. In uno di essi il processo di ripiegamento ha carattere ge­ di malattie genetiche
rarchico. Prima si formano strutture secondarie. Alcune se­ Molte patologie, fra cui il diabete tipo 2, il morbo di Alzhei­
quenze amminoacidiche si ripiegano spontaneamente in mer, il morbo di Huntington e il morbo di Parkinson, hanno
a eliche o foglietti p, che si formano secondo i principi esa­ in comune un meccanismo simile di avvolgimento sbagliato.
minati nella trattazione della struttura secondaria. Le intera­ In molti casi, una proteina solubile viene secreta da ima cel­
zioni ioniche che interessano gruppi carichi spesso vicini lula con un avvolgimento sbagliato e convertita in una fibra
nella sequenza lineare della catena polipeptidica possono extracellulare insolubile amiloide. Le malattie che ne deri­
svolgere un ruolo importante nel determinare questi primi vano prendono collettivamente il nome di amiloidosi. Le
ripiegamenti. L’organizzazione di strutture locali è seguita fibre sono altamente ordinate, con un diametro da 7 a 10 nm
da interazioni ad ampio raggio, per esempio tra due a eliche ed un elevato grado di strutture a foglietti ß.
che vengono ad avvicinarsi per formare strutture superse­ Molte proteine possono assumere una struttura amiloide
condarie stabili. Questo processo continua fino a che non si alternativa alle loro conformazioni strutturali normali, e
formano domini completi e l’intero peptide assume la sua molte di esse mostrano un’elevata concentrazione di resi­
forma nativa (Figura 4.16). Le proteine in cui avvengono in­ dui amminoacidici aromatici localizzati in una regione cen­
terazioni a corto raggio (tra residui abbastanza vicini nella trale (nucleo) della struttura ß. Queste proteine vengono
sequenza polipeptidica) tendono a ripiegarsi più velocemen- secrete in una forma parzialmente avvolta. La regione cen-
© 978-88-08-06413-4 CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine 165

gruppo peptidico 55
interazioni idrofobiche 54
motivo 61
multimero 62
oligomero 62
proteine fibrose 58
Struttura nativa Struttura parzialmente Struttura denaturata proteine globulari 58
avvolta
protomero 62
ripiegamento p 57
simmetria 62
strato di solvatazione 54
struttura quaternaria 58
struttura secondaria 56
struttura supersecondaria 61
struttura terziaria 58

ULTERIORI LETTURE . ' ' ^


Branden, C. e Tooze, J. (1991) Introduction to Protein Structu­
re, Garland Publishing, Inc., New York. [TYad. it.: Introduzione
alla struttura delle proteine, Zanichelli, Bologna 2001.]
Struttura del nucleo Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C. e Craig, E.A. (2000) Get­
J, delle fibrille amiloidi ting newly synthesized proteins into shape. Cell 101,119-122.
Ulteriore organizzazione dei protofilamenti Un buon compendio sul meccanismo dei chaperoni.
Creighton, T.E. (1993) Proteins: Structures and Molecular Pro­
perties, 2aed., W. H. Freeman and Company, New York.
FIGURA 4.17 • Formazione delle fibrille amiloidi che causano malattie.
Molecole proteiche, la cui normale struttura comprende regioni a foglietto p, Una fonte autorevole e di vasta portata.
che vanno Incontro ad un avvolgimento parziale, In un piccolo numero di Kendrew, J.C. (1961) The three-dimensional structure o f a pro­
molecole, prima che si completi l’avvolgimento normale, le regioni a foglietto p tein molecule. Sci. Arre. 205 (dicembre), 96-111.
di un polipeptlde si associano con le stesse regioni di un altro pollpeptide, Descrive come è stata determinata la struttura della mioglobina
formando II nucleo di una struttura amllolde. Altre molecole proteiche
e che cosa si è appreso da essa.
lentamente si associano aH’amilolde, che si estende a forma di fibrilla.
Luque, I., Leavitt, S.A. e Freire, E. (2002) The linkage between
protein folding and functional cooperativity: two sides of the same
coin?. Arnrn. Rev. Biophys. Struct. 3 1,235-256.
trale (3 (o parte di essa) si forma prima che il resto della
Una rassegna su come le variazioni strutturali delle proteine ne
proteina si avvolga correttam ente e i foglietti p di due o
alterino la funzione.
più proteine avvolte in modo incom pleto si associno e Rose, G.D., Fleming, P.J., Banavar, J.R., e Maritan, A . (2006)
diano vita a una fibrilla amiloide. Questa struttura cresce A backbone-based theory of protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci.
nello spazio extracellulare. Altre parti della proteina si av­ USA 103,16623-16633.
volgono in modo differente e rimangono all’esterno del fo­ « S i Un buon compendio, di facile lettura, delle idee attuali sull’ar­
glietto p centrale nella fibrilla in crescita (Figura 4.17). gomento, insieme ad interessanti ipotesi.
Poiché la maggioranza delle molecole proteiche si avvolge
normalmente, la comparsa dei sintomi nelle amiloidosi av­
viene molto lentamente.
PROBLEM I
1. Proprietà del legame peptidico. Negli studi ai raggi
X di peptidi cristallini, Linus Pauling e Robert Corey
TERMINI CHIAVE scoprirono che il legame C— N nel gruppo peptidico ha
I term ini in grassetto sono definiti nel glossario. una lunghezza intermedia (1,32 À ) tra quella del tipico
legame singolo C— N (1,49 A ) e quella del doppio lega­
a-cheratina 59
me C = N (1,27 A ). Essi scoprirono anche che il legame
peptidico è planare (tutti i quattro atomi attaccati al
ol elica 56
gruppo C— N sono posti sullo stesso piano) e che i due
amiloide 64
atomi di carbonio a legati al gruppo C— N sono nella
chaperone molecolare 64
configurazione trans l’uno rispetto all’altro (ai lati op­
collageno 59
posti del legame peptidico).
conformazione 54
(a ) Che cosa indica la lunghezza del legame C— N del lega­
conformazione p 57
me peptidico circa la sua forza e 0 suo ordine (se è un
conformazione nativa 55 legame singolo, doppio o triplo)?
denaturazione 63 (b ) Quale valore hanno le osservazioni di Pauling e Corey
dominio 61 circa la possibilità di rotazione attorno al legame pepti­
fibroma della seta 59 dico C— N?
foglietto p 57
6 6 1 CAPITOLO 4 Struttura tridimensionale delle proteine ì>978-88-08-06413^4?:

2. C o rr e la z io n e f r a s t ru t tu ra e fu n z io n e n e lle p r o ­
te in e fib r o s e . William Astbury scoprì che la diffrazio­
ne dei raggi X della lana presenta un’unità strutturale
ripetitiva spaziata di 5,2 À lungo la direzione della fibra 3 - IPcrìCGKi)?
della lana. Quando egli scaldò e stirò la lana, la diffra­
zione dei raggi X dimostrò che era comparsa una nuova
unità strutturale ripetitiva spaziata di 7,0 A. Se dopo il i Conformazione
ieàsiiale
riscaldamento umido e la tensione si lasciava restringe­
re la lana, rimmagine ai raggi X diventava simile a quel­
la originaria con ima spaziatura di 5,2 A. Anche se que­
ste osservazioni contengono importanti informazioni ____ ) iConformmipiie casuale
sulla struttura molecolare della lana, a quel tempo
Astbury non fu in grado di interpretarle.
(a ) Utilizzando le attuali conoscenze sulla struttura della pH
lana, cercate di interpretare le osservazioni di Astbury. Quale potrebbe essere la spiegazione di questo effetto del
(b ) Quando le maglie o le calze di lana sono lavate con pH sulla conformazione del poli(Glu) e della poli(Lys)?
acqua calda e poi asciugate a caldo, tendono a restrin­ Perché la transizione avviene in un ambito di pH così ri­
gersi. La seta invece non si restringe nelle stesse con­ stretto?
dizioni. Spiegate il perché.
5. Sequenza amminoacidica e struttura delle protei­
3. La velocità di sintesi dell’a-cheratina dei capelli. ne. Le conoscenze attuali sul ripiegamento delle proteine
Nell’uomo i capelli crescono di circa 15-20 cm all’anno. consentono ai ricercatori di prevedere la struttura di una
Questa crescita è concentrata alla base del capello, dove proteina basandosi sulla sua sequenza amminoacidica.
vengono sintetizzati e organizzati in strutture filiformi fi­
lamenti di a-cheratina all’interno delle cellule dell’epi­ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
dermide (vedi la Figura 4.5). L’elemento strutturale fon­ Ile-A la -His -T h r-T y r-G ly -P r o -P h e -G lu -A la -
damentale dell’a-cheratina è l’a elica che ha 3,6 residui
Il 12 13 14 15 16 17 18 19 20
per giro e un passo di 5,4 Â (vedi la Figura 4.2a). Sup­
Ala -M e t-C y s-L y s -Trp -G lu -A la -G in - P r o - A s p -
ponendo che la biosintesi delle catene elicoidali dell’a-
cheratina sia il processo da cui dipende la velocità di 21 22 23 24 25 26 27 28
crescita del capello, calcolate la velocità di formazione Gly -M et - Giu -Cys - Ala -Ph e - His - Arg
dei legami peptidici (legami peptidici per secondo) per
spiegare la crescita del capello osservata in un anno. (a ) Basandovi sulla sequenza del polipeptide mostrato
sopra, siete in grado di prevedere dove si potranno for­
4. L’effetto del pH sulla struttura secondaria ad mare dei ripiegamenti p?
a elica. Lo srotolamento di un’a elica di una catena po- (b ) Dove possono formarsi ponti disolfuro intracatena tra­
lipeptidica fino a raggiungere una struttura a gomitolo sversali?
casuale è accompagnato da una grossa diminuzione di (c ) Supponendo che questa sequenza sia parte di una pro­
una sua proprietà chiamata rotazione specifica, una mi­ teina globulare più grande, indicate la probabile localiz­
sura della capacità della soluzione di ruotare il piano zazione (sulla superficie esterna, o all’interno della pro­
della luce polarizzata. Il poliglutammato, un polipepti- teina) dei seguenti residui amminoacidici: Asp, Ile, Thr,
de costituito soltanto da residui di l-G1u , ha una confor­ Ala, Gin, Lys. Spiegate i motivi della vostra scelta.
mazione ad a elica a pH 3. Quando il pH viene aumenta­
to a 7, si osserva una diminuzione della rotazione spe­ 6. Prevedere la struttura secondaria. Quale dei se­
cifica della soluzione. Analogamente la polilisina (resi­ guenti peptidi ha più probabilità di assumere una strut­
dui di L-Lys) è un’a elica a pH 10; invece, se il pH viene tura ad a elica, e perché?
abbassato a 7, la rotazione specifica diminuisce, come (a ) LKAENDEAARAMSEA
è mostrato nel grafico che segue. (b ) CRAGGFPWDQPGTSN
Poiché in un modo o nell’altro le proteine partecipano a tutti i
processi chimici degli organismi viventi, c’è da aspettarsi che la ; ('
delucidazione della loro struttura e delle trasformazioni a cui
vanno Incontro porterà un contributo significativo alla chimica
biologica.
Emil Fischer, articolo In Berichte der deutschen chemischen
Gesellschaft zu Berlin, 1906

ìfunzione
elle proteine
r ' Legame reversibile di una proteina con un ligando: • Il legame tra una proteina e un ligando è spesso accop­
le proteine che legano l’ossigeno 67 piato a una modificazione conformazionale della protei­

Interazioni complementari tra proteine e ligandi: na che rende il sito di legame più complementare al li­
il sistema immunitario e le immunoglobuline 76 gando, un processo chiamato a d a tta m e n to in d otto.
• In un sistema multisubunità, una modificazione confor­
\ onoscere la struttura tridimensionale delle proteine è mazionale che avviene in una subunità può influenzare
molto importante per comprendere la loro funzione. la conformazione delle altre subunità.
Però le strutture riportate in due dimensioni sulla pa­ • Le interazioni tra proteine e ligandi possono essere re­
gina di un libro sono ingannevolmente statiche. Le proteine golate.
sono molecole dinamiche, le cui funzioni dipendono invaria­
bilmente da interazioni con altre molecole. Per la maggior Gli enzimi rappresentano un caso speciale di funzione pro­
parte questi contatti molecolari sono fugaci, ma rappresen­ teica. Essi legano e trasformano chimicamente altre mole­
tano ugualmente le basi di processi fisiologici importanti cole, cioè catalizzano una reazione. Le molecole su cui agi­
come il trasporto dell’ossigeno e la funzione immunitaria, ar­ scono gli enzimi sono dette s u b s t ra t i e il sito che lega il li­
gomenti che esamineremo in dettaglio in questo capitolo. Le gando viene detto in questo caso sito c a ta litic o o sito a t­
proteine che portano avanti questi processi illustrano in tivo.
modo significativo i seguenti principi basilari sulla funzione
delle proteine (alcuni li abbiamo già incontrati nel capitolo
precedente).•
5.i Legame reversibile di una proteina
• Le funzioni di molte proteme richiedono il legame rever­ con un ligando: le proteine che legano
sibile di altre molecole. Una molecola unita reversibil­
mente a una proteina viene detta lig a n d o.
l’ossigeno
• Un ligando si lega ad un sito sulla protema detto sito di La mioglobina e l’emoglobina sono fra le proteme più studia­
legam e, complementare al ligando stesso per dimensio­ te e meglio caratterizzate. Sono state le prime proteine di
ne, forma, carica e carattere idrofobico o idrofilico. L’in­ cui è stata determinata la struttura tridimensionale; esse il­
terazione è specifica: la proteina può discriminare tra lustrano quasi ogni aspetto del più importante processo bio­
migliaia di molecole diverse presenti intorno a sé e le­ chimico: il legame reversibile tra una proteina ed il suo li­
game solo ima o poche. Una data protema può avere siti gando.
di legame strutturalmente diversi per ligandi altrettan­
to diversi. -» L’ossigeno si lega al gruppo prostetico eme
• Le proteine sono flessibili. Le modificazioni conformazio- L’ossigeno è poco solubile in acqua e non può essere tra­
nali possono essere impercettibili e sono un riflesso delle sportato ai tessuti in quantità sufficiente in forma disciolta
vibrazioni molecolari e dei piccoli movimenti dei residui nel plasma sanguigno. Nessuna delle catene laterali degli
amminoacidici nella proteina. Le modificazioni conforma- amminoacidi risulta idonea a legare reversibilmente la mole­
zionali sono molto spesso essenziali per la funzione della cola dell’ossigeno. Questo ruolo può essere svolto da certi
proteina. metalli di transizione, tra cui il ferro e il rame, che hanno
68 j GfiiiìTAO 5 La funzione delle proteine 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4

una forte tendenza a legare l’ossigeno. Gli organismi multi- FIGURA 5.2 • Il gruppo eme visto
Vista di lato
cellulari utilizzano le proprietà di questi metalli, in particola­ di lato. Sono ben visibili I due
legami dì coordinazione del Fe2+
re del ferro, per il trasporto dell’ossigeno. Il ferro allo stato
perpendicolari al piano dell'anello
libero provoca la formazione di specie dell’ossigeno alta­ porfirinico, Uno di questi legami è
mente reattive come i radicali ossidrilici, che possono dan­ Impegnato con un residuo di His,
chiamato anche His prossimale;
neggiare il DNA e altre macromolecole. Il ferro usato nelle
l'altro è II sito di legame
cellule è invece sequestrato in forme che lo rendono meno dell'ossigeno, GII altri quattro legami
reattivo. Il ferro negli organismi multicellulari è spesso in­ di coordinazione giacciono nel plano
della porfirina, impegnati con I
corporato nel gruppo prostetico legato ad una proteina chia­
Residuo Piano quattro atomi di azoto dell'anello.
mato eme, costituito da una struttura organica complessa di istidina dell’anello
ad anello, la protoporfirina, a cui è legato un singolo porfirinico

atomo di ferro nello stato di ossidazione ferroso (F e2+) (F i­


gura 5.1). L’atomo di ferro ha sei legami di coordinazione,
quattro dei quali sono impegnati con i quattro atomi di azoto -> La mioglobina ha un solo sito di legame
che fanno parte dell’anello porfirinico; gli altri due sono per l’ossigeno___.
invece perpendicolari al piano della porfirina. Gli atomi di La mioglobina (Mr 16 700, abbreviata con Mb) è una protei­
azoto coordinati (che hanno la caratteristica di donatori di na relativamente semplice che lega l’ossigeno, presente nel
elettroni) impediscono la conversione del ferro dell’eme tessuto muscolare di quasi tutti i mammiferi. Come proteina
nello stato ferrico (F e s+). Il ferro nello stato Fe2+ lega re­ di trasporto, essa facilita la diffusione dell’ossigeno nel mu­
versibilmente l’ossigeno; nello stato ossidato Fe3+ non è in­ scolo. La mioglobina è particolarmente abbondante nei mu­
vece in grado di legare l’ossigeno. scoli dei mammiferi marini come le foche e le balene, che
Quando l’eme non è legato a proteine e quindi è libero in devono immagazzinare ossigeno per le loro prolungate im­
soluzione, la reazione di uno dei due siti di coordinazione mersioni. Proteine molto simili alla mioglobina sono ampia­
del ferro (perpendicolari al piano dell’anello porfirinico) mente diffuse e-si trovano anche in alcuni organismi unicel­
con l’ossigeno genera l’ossidazione irreversibile del F e2+ a lulari.
Fe3+. Quando Teme è inserito in una proteina questa rea­ La mioglobina è un singolo polipeptide di 153 residui ammi-
zione non avviene, in quanto il gruppo eme è immerso in noacidici, contenente una molecola di eme. Appartiene alla
profondità nella struttura proteica e l’accessibilità ai siti di famiglia delle proteine chiamate globine, che hanno strut­
coordinazione è limitata. Uno dei due legami di coordina­ tura primaria e terziaria simili. La catena polipeptidica della
zione è impegnato con un atomo di azoto di una catena la­ mioglobina è costituita da otto segmenti ad a elica, collega­
terale di un residuo di His, mentre l’altro legame è il sito a ti da ripiegamenti (Figura 5.3). Circa il 78% dei residui am-
cui si lega la molecola di ossigeno ( 0 2) (Figura 5.2). Quan­ minoacidici della proteina si trova nei segmenti ad a elica.
do si lega l’ossigeno, le proprietà elettroniche del ferro si Una trattazione dettagliata della funzione di ogni proteina
modificano; ciò spiega il diverso colore che ha il sangue ve­ deve necessariamente tener conto della sua struttura. Nel
noso povero di ossigeno (rosso scuro) rispetto al sangue caso della mioglobina verranno prima introdotte alcune con­
arterioso ricco di ossigeno (rosso brillante). venzioni sulle caratteristiche peculiari delle globine. Come

FIGURA 5.1 • Eme. Il gruppo eme è presente nella mioglobina, plrrollcl uniti da ponti metlnlcl con sostituzioni alle posizioni Indicate con una X,
nell’emoglobina e In molte altre proteine, chiamate proteine eme. L’eme è (b, c) Due rappresentazioni del gruppo eme (derivate da PDBID1CCR),
costituito da una complessa struttura organica ad anello, la protoporfirina IX, a L’atomo di ferro dell’eme ha sei legami di coordinazione: quattro sono
cui è legato uno ione ferro nello stato di ossidazione 2+ (Fe2+), (a) Le porfirine, Impegnati sul piano dell'anello porfirinico, mentre gli altri due sono
di cui la protoporfirina IX è solo un esempio, sono costituite da quattro anelli perpendicolari al piano della porfirina (d).
©978-88-08^0641:3®; CAPÌTOLO 5 La funzione delle proteine i 69

n e (da non confondere con la Kdche indica la costante di


dissociazione di un acido) che indica l’equilibrio tra il com­
plesso e i componenti non legati del complesso. La costan­
te di associazione è una misura dell’affinità del ligando L
per la proteina P. Ti* ha come unità m - 1; un valore di isTa ele­
vato corrisponde a un’elevata affinità del ligando per la
proteina.
Consideriamo la reazione all’equilibrio mettendo in rappor­
to i siti di legame occupati con i siti di legame presenti nella
proteina, 9 (theta) :.

siti di legame occupati rpLl


0 = ---- v-----° ------------ ----- = ------1 1 ---- (5.3)
totale dei siti di legame [PL] + [P]

Ricavando [PL] dall’Equazione 5.2 (pari a ¿fa [L] [P]) e sosti­


tuendolo a [PL] si ha

q KJjL][P] iCa[L] [L] g


ÌTa[L][P] + [P] KM + 1 J_

FIGURA 5.3 • Struttura della mloglobina. (PDBID1MBO) Gli otto segmenti


ad a elica (mostrati sotto forma di cilindri) sono indicati con le lettere da A ad H.
I ripiegamenti non elicoidali che uniscono i vari cilindri sono indicati con le Il valore d ilfapuò essere determinato dal grafico di 0 in fun­
lettere dei segmenti che interconnettono: AB, CD, EF e cosi via. Alcuni di questi, zione della concentrazione del ligando libero [L] (Figura
come BC e DE, sono ripiegamenti bruschi, senza segmenti non elicoidali
5.4a). La frazione di siti di legame per il ligando occupata
intermedi, quindi non sono indicati. (Il breve segmento tra le a eliche D ed E è
un artefatto dell'elaborazione al computer dell’immagine,) Il gruppo eme è tende ad arrivare asintoticamente a saturazione quando [L]
legato in una tasca costituita in gran parte dalle a eliche E ed F; sono presenti aumenta. Il valore di [L] al quale metà dei siti di legame sono
residui anche dì altri segmenti della proteina.
occupati dal ligando (a 0 = 0,5) corrisponde a 1/K&.

è mostrato nella Figura 5.3, i segmenti ad a elica vengono


indicati con le lettere da A ad H. I singoli residui amminoaci-
dici vengono identificati o dalla loro posizione nella sequen­
za amminoacidica, o dalla loro localizzazione in un particola­
re segmento ad or elica. Per esempio, il residuo His coordi­
nato all’eme della mioglobina, l’His93 (il 93° residuo a partire
dalla terminazione amminica della sequenza amminoacidi­
ca della catena polipeptidica della mioglobina), viene anche
indicato come His F8 (l’ottavo residuo dell’a elica F ). I ripie­
gamenti che uniscono tra loro le a eliche vengono indicati
con AB, CD, EF, FG e così via, cioè con le lettere delle eli­
che che i ripiegamenti stessi interconnettono.

-> Le interazioni proteina-ligando possono


essere descritte quantitativamente
La funzione della mioglobina dipende dalla capacità delle
proteine non solo di legare l’ossigeno, ma anche di rilasciar­
lo quando è necessario. In biochimica la funzione di una pro­
teina dipende spesso da questo tipo di interazioni reversibi­
li proteina-ligando. La descrizione quantitativa di queste in­
terazioni ha rappresentato uno dei temi di ricerca più rile­
vanti della biochimica.
In genere il legame reversibile di un ligando (L ) a una protei­
na (P ) può essere descritto dalla re a z io n e alT e qu ilib rio:
F1GURA 5.4 • Rappresentazione grafica del legame del ligando. La
P + L PL (5.1) frazione dei siti di legame occupati dal ligando, 6, è riportata nel grafico in
funzione della concentrazione del ligando libero. Ambedue le curve descrivono
La reazione è caratterizzata da una costante di equilibrio Ka: iperboli rettangolari, (a) Una curva ipotetica di legame per il ligando L, La [L]
[PL] = K alla quale metà dei siti di legame dei ligando sono occupati corrisponde a 1//Ca,
(5.2) o Ki. La curva ha un asintoto orizzontale, che tende a 0 = 1, e un asintoto
[P][L] kd verticale (non mostrato) ad una [L] = —1//Ca. (b) Curva di legame dell'ossigeno
alla mioglobina. La pressione parziale dell’ossigeno presente nell’aria a contatto
dove fca e kd sono costanti di velocità (maggiori dettagli qui con la soluzione è espressa in kilopascal (kPa). L’ossigeno si lega saldamente
sotto). Il termine K a identifica la c o sta n te d i a sso c ia z io - alla mioglobina, con una P50 di soli 0,26 kPa.
70 j CAPltQLffi^ La funzione delle proteine © 976-88^08-06413^

TABELLA5.1 Costanti di dissociazione di alcune proteine


Proteina Ligando iid (M )*

Avidina (chiara d’uovo) Biotina 1X IO“ 15


Recettore dell’insulina (umana) Insulina 1X IO- 10
Immunoglobulina anti-HIV (umana) 4 gp41 (proteina della superficie di HIV-1) 4X IO“ 10
Proteina che lega il nichel (E. coli ) Ni"' IX IO- 7
Calmodulina (ratto)* Ca2+ 3X IO" 6
2X IO -5
Tipiche interazioni recettore-ligando

Interazioni proteina-DNA sequenza-specifiche


«
Biotina-avidina
Antigene-anticorpo Enzima-substrato
I
l___ l____l___
1 0-18 1 0 -14 10"
alta affinità bassa affinità
i f d (M)
Le barre colorate indicano l’ambito dei valori tipici delle costanti di dissociazione delle varie classi di interazioni nei sistemi biologici. Alcune in­
terazioni, come quella tra la proteina avidina e il cofattore enzimatico biotina, si trovano al di fuori di tale ambito. L’interazione avidina-biotina
è così forte che può essere considerata irreversibile. Le interazioni proteina-DNA sequenza-specifiche si riferiscono a proteine che si legano ad
una particolare sequenza nucleotidica del DNA, anziché ad un sito aspecifico del D N A
* I valori della costante di dissociazione sono validi solo nelle condizioni in cui sono stati misurati. I valori di K d delle interazioni proteina-ligando possono varia­
re anche di diversi ordini di grandezza, modificando la concentrazione salina della soluzione, il pH o altre variabili.
1 Questa immunoglobulina è stata isolata durante lo sviluppo di un vaccino contro l’HIV. Le immunoglobuline (descritte più avanti in questo capitolo) sono alta­
mente variabili e il valore di Kà riportato qui non può essere considerato caratteristico di tutte le immunoglobuline.
* La calmodulina ha quattro siti di legame per il calcio. I valori mostrati si riferiscono ai siti ad alta e a bassa affinità osservati in un gruppo di esperimenti.

Qualche volta è intuitivamente più semplice considerare la Come per qualsiasi ligando, Kd corrisponde al valore di [O2]
costante di dissociazione, K<¡, cioè il reciproco di A7, al quale metà dei siti disponibili sono occupati, che quindi si
(K¿ = 1/KjJ, espressa in unità di concentrazione molare ( m) . può indicare con [O 2]o,5- L’Equazione 5.8 diventa:
K¿ è la costante di equilibrio della reazione di rilascio del li­
[Qa]
gando. Le espressioni si modificano quindi in questo modo: 0= (5.9)
[0 2] + [0 2]o,B
, [P][L] *d (5.5)
[PL] fea Negli esperimenti in cui viene usato ossigeno come ligando,
viene usata la pressione parziale di questo gas, p 0 2, in quan­
[P][L]
[PL] = (5.6) to è molto più facile misurare quest’ultima che non la con­

centrazione del gas disciolto nella soluzione. Se definiamo
0 = ---- [L]
LJ— . (5.7) la pressione parziale di ossigeno [O2]o,s come P 50e sostituia­
[LJ + A d mo il termine nell’Equazione 5.9, otteniamo:

In pratica il termine Kti viene usato molto più spesso di ATa pOa
per esprimere l’affinità di una proteina per il suo ligando. Si e= (5.10)
p 0 2 + P B0
noti che un valore molto basso di Kd corrisponde ad un’ele­
Nella Figura 5.4b è mostrata una curva di legame dell’ossi­
vata affinità della proteina per il ligando. La matematica può
geno alla mioglobina in funzione della p 0 2.
ridurre questo concetto a una semplice asserzione: Kd corri­
sponde alla concentrazione molare di ligando a cui metà dei
-> Il meccanismo di legame dei ligandi dipende dalla
siti di legame disponibili sono occupati dal ligando. A que­
struttura delle proteine
sto punto la proteina ha saturato metà dei suoi siti di lega­
Quando l’0 2 si lega all’eme libero la molecola dell’ossigeno
me. Quanto più saldamente la proteina lega il ligando, tanto
si posiziona con un certo angolo rispetto alla direzione del
più bassa è la concentrazione di ligando necessaria a occu­
legame con il ferro (Figura 5.5a). Nella mioglobina il residuo
pare metà dei siti di legame e minore è il valore di K d. Nella
di His64 (His E 7), presente sullo stesso lato delibine a cui si
Tabella 5.1 sono riportati dei valori delle costanti di disso­
lega l’ossìgeno, è troppo lontano per generare un legame di
ciazione di alcune proteine e gli ambiti di valori delle costan­
coordinazione con il ferro, ma può interagire con il ligando
ti di dissociazione di alcune importanti interazioni.
unito all’eme. Questo amminoacido, chiamato His distale
Il legame dell’ossigeno alla mioglobina ha lo stesso anda­
(per distinguerlo dall’Tfts prossimale, 0 His F 8), forma un
mento osservato in precedenza. Però, essendo l’ossigeno un
legame idrogeno con l’0 2 (Figura 5.5b), e facilita il legame
gas, occorre apportare alcune piccole variazioni alle equa­
del ligando.
zioni, in modo da facilitare la sperimentazione in laborato­
Il legame dell’ossigeno all’eme nella mioglobina dipende
rio. Dobbiamo prima sostituire a [L] la concentrazione di os­
anche dai movimenti molecolari, 0 “respirazione”, della pro­
sigeno disciolto nell’Equazione 5.7 e otteniamo:
teina. La molecola delibine è immersa in profondità nella
[Od struttura proteica e l’ossigeno non ha una via diretta per pas­
(5.8)
[02] + Kà sare dalla soluzione circostante al sito di legame sull’eme.
© 9 7 8 -8 8 -0 8 < )é 4 W i CAPITOLO S La funzione delle proteine j i 1

-> L’e m o g lo bin a tra s p o rta l’o ssigeno nel sangue Gruppo
Quasi tutto l’ossigeno trasportato neU’organismo degli ani­
mali è legato all’emoglobina negli eritrociti (globuli rossi). \
x „ f
Gli eritrociti normali dell’uomo sono cellule di piccole di­ '' r '¿ s v * /
mensioni (con un diametro di 6-9 ixm), a forma di disco bi­ if
M KVr

h u
concavo, che originano da precursori cellulari staminali detti * > $ v
4 «
e m oc itobla sti. Durante il processo di maturazione le cel­ jTvv fe %
lule staminali producono molte cellule figlie che formano ■* - *
wL-
grandi quantità di emoglobina e perdono tutti gli organelli ■ V
. A .. $-
citoplasmatici: nucleo, mitocondri e reticolo endoplasmati- &
co. Gli eritrociti sono quindi vestigia di cellule, incapaci di v i - '
replicarsi e destinati a sopravvivere, almeno nell’uomo, solo Mioglobina Subunità p
per circa 120 giorni. La loro funzione principale è quella di dell’emoglobina
trasportare l’emoglobina disciolta nel loro citosol a una con­ FIGURA 5.6 • Confronto tra le strutture della mlogloblna (PDBID 1MBO) e
centrazione molto elevata (circa il 34% del loro pe so ). della subunità p dell’emoglobina (derivata da PDB ID 1HGA).

-> Le s u b u n ità d e ll’e m o g lo b in a sono stru ttu ra lm e n te


s lm ili a lla m io g lo b in a (141 residui ciascuna) e due catene p (146 residui ciascu­
L’emoglobina (M r 64 500, abbreviata con Hb) ha una forma na) . La struttura tridimensionale dei due tipi di catene del­
quasi sferica, con un diametro di circa 5,5 nm. È una protei­ l’emoglobina è molto simile, anche se meno della metà dei re­
na tetramerica contenente quattro gruppi prostetici eme, sidui sono identici nelle sequenze amminoacidiche delle
uno per ciascuna subunità. L’emoglobina A (emoglobina del­ subunità a e p. Inoltre la struttura tridimensionale di que­
l’adulto) contiene due tipi di globine, e cioè due catene a ste due subunità è simile anche a quella della mioglobina (Fi­
gura 5.6), ma la sequenza dei tre polipeptidi è identica solo a
livello di 27 posizioni.
La struttura quaternaria dell’emoglobina è caratterizzata da
interazioni molto forti tra le quattro subunità. L’interfaccia
a iP i (e la sua controparte a 2p2) comprende circa 30 residui
ed è sufficientemente forte da resistere a blandi trattamen­
ti denaturanti; l’esposizione all’urea causa la dissociazione
dei tetrameri di emoglobina nei dimeri ap, che restano in­
tatti. Le interfacce a iP 2e a 2Pi comprendono 19 residui (Fi­
gura 5.7). A livello delle interfacce predominano le intera­
zioni idrofobiche, ma vi sono anche molti legami idrogeno e
alcune coppie ioniche (chiamate anche ponti salini).

FIGURA 5.5 • Effetti eterici causati dal legame di ligandi all’eme della FIGURA 5.7 • Interazioni dominanti tra le subunità dell’emoglobina.
mioglobina. (a) L'ossigeno si lega alterne formando un angolo con II ferro, una In questa rappresentazione schematica le subunltà a sono In grigio chiaro
conformazione che si adatta molto facilmente agli spazi Interni della mlogloblna. e le subunltà p sono in grigio più scuro. Le interazioni più forti tra
(b) Rappresentazione (derivata da PDB ID 1 MBO) che mostra I residui che le subunità, messe In evidenza, avvengono tra subunità diverse. Quando
circondano II gruppo eme nella mlogloblna, L'ossigeno legato è impegnato con l'ossigeno si lega, I contatti a i|3i si modificano di poco, mentre quelli
un legame Idrogeno con l'HIs distale, Hls E7 (Hls64), facilitando ulteriormente II a-i|32 subiscono una profonda variazione, con la rottura dì diverse coppie
legame dell’0 2 stesso, Ioniche (PDB ID1HGA).
72 j CAPÌTOLO 5 La funzione delle proteine «S97H ft3 08 06413 4

Stato R

FIGURA 5.8 • La transizione T ^ R . (PDB ID 1HGA e 1BBB) In questa subunità, modificando alcune coppie ioniche. La transizione più rilevante è
rappresentazione della molecola della deossiemogloblna le subunità p sono In quella dei residui di His carbossiterminaii HC3 delle subunità 0, che sono
azzurro e le subunltà a In grigio. Le catene laterali cariche positivamente e i coinvolti in un ponte salino nello stato T. Essi ruotano verso il centro della
gruppi terminali Impegnati in ponti salini sono indicati In blu, mentre le molecola e non fanno più parte di coppie ioniche nello stato R. Un'altra
controparti cariche negativamente sono In rosso. I residui Lys C5 di ciascuna conseguenza molto importante della transizione T —^ R è il restringimento della
subunità a e Asp FG1 di ciascuna subunità p sono visibili, ma non indicati. La tasca centrale tra le subunità p.
transizione dallo stato T allo stato R sposta In modo sostanziale le coppie di

-> Il legame dell’ossigeno provoca una variazione gendo così la tasca tra le subunità p (Figura 5.8). Durante
strutturale nell’emoglobina questo processo alcuni legami ionici che stabilizzano lo stato
L’analisi ai raggi X ha messo in evidenza due differenti con­ T si spezzano e se ne formano altri.
formazioni dell’emoglobina: lo sta to R e lo sta to T. Le let­ Nello stato T la porfirina ha una forma a cupola e pertanto
tere T e R indicano due stati conformazionali, detti teso e ri­ il ferro aU’intemo dell’eme tende a protrudere dal lato del-
lassato, che l’emoglobina può assumere. L’ossigeno si lega l’istidina prossimale (His F 8) . Il legame dell’ossigeno co­
ad entrambi gli stati dell’emoglobina, ma ha un’affinità mag­ stringe l’eme ad assumere una conformazione più planare,
giore per lo stato R. Il legame dell’ossigeno stabilizza lo stato modificando la posizione dell’His prossimale e dell’elica F ad
R. In assenza di ossigeno, una condizione che si può ottene­ essa legata (Figura 5.9). Queste modificazioni conducono
re in laboratorio, lo stato T è più stabile ed è quindi la con­ ad un aggiustamento delle coppie ioniche all’interfaccia
formazione prevalente della d e o s sie m o g lo b in a . Il legame °qp 2-
dell’02 ad una delle subunità nello stato T dell’emoglobina
innesca una variazione conformazionale, che converte la -> L’emoglobina lega l’ossigeno
subunità nello stato R. La transizione non modifica sostan­ con un meccanismo cooperativo
zialmente le strutture delle singole subunità, ma i due proto­ L’emoglobina deve legare efficientemente l’ossigeno nei pol­
meri a(3 scivolano l’uno rispetto all’altro e ruotano, restrin- moni, dove la p0 2 del gas è di circa 13,3 kPa, e rilasciare os­
sigeno nei tessuti, dove la pC>2è di circa 4 kPa. La mioglobi-
na, o qualsiasi proteina che leghi l’ossigeno con un anda­
mento iperbolico, non sarebbe altrettanto adatta a questo
ruolo per i motivi illustrati nella Figura 5.10. Una proteina
che lega l’ossigeno con un’elevata affinità si saturerà facil­
mente nei polmoni, ma non libererà molto ossigeno nei tes­
suti. Se invece la proteina ha una bassa affinità per l’ossige­
no, potrà rilasciarlo nei tessuti, ma non sarà in grado di satu­
rarsi nei polmoni.
L’emoglobina risolve_questi problemi mediante la sua tran­
sizione da uno stato a bassa affinità (lo stato T ) a uno ad alta
affinità (lo stato R ) quando lega l’ossigeno. Il risultato di
questa transizione è una curva di legame dell’ossigeno con
FIGURA 5.9 * Modificazioni della conformazione vicino al gruppo eme un andamento sigmoide (a forma di S; Figura 5.10). Una
in seguito ai legame con l’ossigeno. (Derivata da PDB ID 1 HGA e 1BBB) Lo proteina con una sola subunità, con un singolo sito di lega­
spostamento dell'elica F conseguente al legame dell’ossigeno alterne è una
delle modificazioni che innescano la transizione T —> R. me del ligando, non può produrre una curva sigmoide -
© 9/8 3 » CB 06413 4 CAPITOLO 5 La funzione delle proteine 173

p02 p02 alle variazioni nella concentrazione del ligando ed è determi­


nante per la funzione di molte proteine multimeriche.

-> Il legame cooperativo di un ligando


può essere descritto quantitativamente
Il legame cooperativo dell’ossigeno all’emoglobina è stato
studiato per la prima volta da Archibald Hill nel 1910. Da
questo lavoro è derivato un approccio generale per studia­
re il legame cooperativo nelle proteine multimeriche.
Per una proteina con n siti di legame, la reazione descritta
dall’Equazione 5.1 diventa

P + riL PL„ (5.11)

e l’espressione della costante di associazione è

= [pL"l (5.12)
[P ][L f
FIGURA 6.10 • Una curva di legame sigmoide (cooperativa). Una curva di
legame con un andamento sigmoide può essere considerata come una curva Quindi l’espressione di 0 (vedi l’Equazione 5.7) diventa
ibrida che riflette la presenza di forme a bassa affinità e ad alta affinità. Il
legame cooperativo, indicato dall’andamento sigmoide, rende l'emoglobina 9 = ... W (5.13)
molto più sensibile a piccole variazioni della concentrazione di ossigeno; m n + Kd
mediante questo processo l’emoglobina è più efficiente nel legare ossigeno nei
polmoni, dove la p02 è alta, e nel rilasciarlo nei tessuti periferici, dove la p02 è Questa equazione verifica l’andamento sigmoide del legame
bassa, dell’ossigeno all’emoglobina, in cui la relazione fra ligando e
proteina è esponenziale.

-> L’emoglobina trasporta anche H+ e C02


anche se il ligando induce una modificazione conformazio- Oltre a trasportare quasi tutto l’ossigeno necessario alle cel­
nale - in quanto ogni molecola di ligando agisce singolar­ lule dai polmoni ai tessuti, l’emoglobina trasporta anche due
mente e non può alterare le proprietà di legame di altre mo­ prodotti finali della respirazione cellulare, H + e C02, dai tes­
lecole di ligando. A l contrario, il legame-dell’essigene-ad unar suti ai polmoni e ai reni, dove sono escreti. La C02, prodotta
delle subunità dell’emoglobina può modificare l’affinità per nei mitocondri dall’ossidazione delle sostanze organiche nu­
l’0 2delle subunità adiacenti. La prima molecola di 0 2che in­ trienti, viene idratata in forma di bicarbonato:
teragisce con la deossiemoglobina si lega debolmente, per­
ché si lega ad una subunità nello stato T. Questo legame de­ C0 2 + H20 H + + HC03-
termina però una modificazione conformazionale che viene
comunicata alle subunità adiacenti, rendendo più facile l’in­ Questa reazione è catalizzata dall’anidrasi carbonica, un
terazione con altre molecole di ossigeno. Dopo che l’ossige­ enzima particolarmente abbondante negli eritrociti. L’anidri­
no si è legato alla prima subunità, la transizione T —» R de carbonica non è molto solubile in acqua, e quindi nei tes­
rende più facile il legame di una seconda molecola di ossi­ suti e nel sangue si potrebbero formare bollicine di questo
geno. L’ultima (la quarta) molecola di ossigeno si lega ad un gas se esso non venisse rapidamente convertito in bicarbo­
gruppo eme di una subunità che è ormai nello stato R e nato. Come si può osservare dalla reazione chimica, l’idrata-
quindi presenta la massima affinità per il suo ligando. zione della C 0 2determina un aumento della concentrazione
Una p ro tein a a llo sterica è appunto quella in cui il legame di ioni H + (una diminuzione del pH ) nei tessuti. Il legame
di un ligando a un sito modifica le proprietà di un altro sito dell’ossigeno all’emoglobina è profondamente influenzato dal
sulla stessa molecola proteica. Il termine “allosterico” deriva pH e dalla concentrazione di C 02; la conversione in bicarbo­
dalle parole greche allos, “altro”, e stereos, “solido” o nato diventa quindi un processo molto importante per la re­
“forma”. Le proteine allosteiiche possono avere forme o con­ golazione del legame dell’ossigeno e del rilascio nel sangue.
formazioni diverse indotte dal legame di ligandi chiamati L’emoglobina trasporta ai polmoni e ai reni circa il 40% degli
anche modulatori. Le modificazioni conformazionali indotte ioni H + totali e il 15-20% della C0 2 formata dai tessuti. (Gli
dai modulatori interconvertono tra loro forme più o meno at­ ioni H+ rimanenti vengono assorbiti dal tampone bicarbona­
tive della stessa proteina. I modulatori di una proteina allo­ to del plasma, mentre la C 0 2 rimanente viene trasportata
sterica possono quindi avere effetti attivatori o inibitori. sotto forma di HCO 3 e C 0 2disciolta.) Il legame di H + e di
Il legame cooperativo di un ligando a ima proteina multime- C 0 2all’emoglobina è inversamente proporzionale al legame
rica, come abbiamo osservato per il legame dell’ossigeno al­ dell’ossigeno. Nelle condizioni di pH relativamente basso e
l’emoglobina, è una forma di legame allosterico che si riscon­ di elevata concentrazione di C 0 2presenti nei tessuti perife­
tra spesso nelle proteine multimeriche. Una curva sigmoide è rici, l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno diminuisce man
un indice dell’esistenza di un legame di tipo cooperativo. mano che H + e C 0 2 si legano e 0 2 è rilasciato nei tessuti. Al
Questo fenomeno consente una risposta molto più sensibile contrario, nei capillari dei polmoni la C0 2viene eliminata e
7 4 1 CAPITOLO 5 La funzione delle proteine S 3 7 8 ÍB 8 W 0 6 4 1 3 - 4

si ha un incremento del pH del sangue; l’affinità dell’emoglo­ amminoterminale di ciascuna catena globinica; si genera in
bina per l’ossìgeno aumenta e la proteina può legare più os­ questo modo carbamminoemoglobina:
sigeno da trasportare ai tessuti periferici. Questo effetto del
pH e della concentrazione di C 0 2 sul legame e sul rilascio H
| r or ? ?
dell’ossigeno dall’emoglobina è detto e f f e t t o B oh r, dal 1— C — C— N — C - -C—
nome del fisiologo danese Christian Bohr (padre del fisico 1 II II 1 II
R 0 0 R 0
Niels Bohr) che lo scopri nel 1904.
Residuo Residuo
L’equilibrio della reazione dell’emoglobina con l’0 2 può es­
amminoterminale carbamminoterminale
sere rappresentato dalla reazione:
Questa reazione produce ioni H+ e contribuisce a generare
Hb + 0 2 ;==± Hb0 2 l’effetto Bohr. I carbammati che si formano sull’emoglobina
generano ponti salini, che stabilizzano ulteriormente lo stato
che però non è sufficientemente precisa. Per spiegare l’ef­ T e favoriscono il rilascio di ossigeno.
fetto della concentrazione degli H+ sull’equilibrio della rea­ Questa capacità delle catene polipeptidiche dell’emoglobina
zione, è meglio riscrivere la reazione nel modo seguente: di passare le informazioni sul legame dell’ossigeno dall’una al­
l’altra rende l’intera molecola particolarmente adatta al tra­
HHb+ + 0 2 H b0 2 + H+
sporto integrato di 0 2, C0 2e ioni H+ da parte degli eritrociti.
dove HHb+ è la forma protonata dell’emoglobina. Scritta in
questa forma, l’equazione ci dice che la curva di saturazio­ -> Il legame dell’ossigeno all’emoglobina
ne dell’emoglobina è influenzata dalla concentrazione degli è regolato dal 2,3-bisfosfoglicerato
H + (Figura 5.11). L’0 2 e l’H + si legano all’emoglobina, ma L’interazione del 2,3 -b isfo sfo glic era to (B P G ) con le mo­
con affinità opposte: quando la concentrazione dell’ 02 è ele­ lecole di emoglobina regola ulteriormente la funzione del­
vata, come nei polmoni, l’emoglobina lega l’ossigeno e rila­ l’emoglobina e fornisce un chiaro esempio di modulazione
scia i protoni; quando invece la concentrazione dell’ossigeno allosterìca eterotropica.
è bassa, come nei tessuti periferici, l’emoglobina lega l ’H + e
rilascia l’ 0 2.
O
Protoni e ossigeno non si legano allo stesso sito sull’emoglo­
bina. L’ossigeno si lega agli ioni ferrosi dei gruppi eme, men­ H — C— O — P — 0 "
I I
tre lo ione H+ può legarsi alle catene laterali di diversi resi­ H— C — H 0“
dui amminoacidici della proteina. I
0
Le quattro catene polipeptidiche dell’emoglobina possono
comunicare le une alle altre non solo l’awenuto legame del­ - 0 —P = 0
l’ossigeno ai loro gruppi eme, ma anche 0 legame di ioni H + cr
a specifici residui amminoacidici. Ma c’è dell’altro. L’emoglo-
2,3-Bisfosfoglicerato
bina lega anche la C 0 2in maniera inversamente proporzio­
nale al legamerièlTòssigerio. L’anidride carbonica si lega for­ li BPG è presente in concentrazioni relativamente elevate
mando carbammato al gruppo a-amminico dell’estremità negli eritrociti. L’emoglobina purificata contiene legata a sé
una quantità notevole di BPG, che è difficile rimuovere com­
pletamente. Infatti le curve di saturazione finora prese in
esame sono state ottenute con emoglobina contenente BPG.
Il 2,3-bisfosfoglicerato riduce fortemente l’affinità dell’emo­
globina per l’ossigeno; c’è quindi una relazione inversa tra il
legame dell’0 2 e quello del BPG. Possiamo quindi scrivere
un’altra reazione di legame dell’ossigeno all’emoglobina:

HbBPG + 0 2 H b0 2 + BPG

Il BPG si lega in un sito distante da quello dell’ossigeno e re­


gola l’affinità del legame dell’02 all’emoglobina in relazione
alla p 0 2 nei polmoni. Il BPG svolge una funzione importante
nell’adattamento fisiologico alla bassa p 0 2che si riscontra per
esempio a quote elevate. A l livello del mare, in un soggetto
sano il legame dell’ossigeno all’emoglobina è regolato in modo
che l’0 2trasferito ai tessuti sia circa il 40% della quantità tota­
le di gas che il sangue può trasportare (Figura 5.12).
Se la stessa persona viene portata rapidamente su una mon­
tagna a 4500 m di altezza, dove la pressione di ossigeno è
FIGURA 5.11 • Effetto del pH sul legame dell’ossigeno all’emoglobina. considerevolmente più bassa, il trasferimento di ossigeno ai
Il pH del sangue nel polmoni è 7,6 e nel tessuti scende a 7,2. Le misure
tessuti si riduce. Alcune ore più tardi la concentrazione di
sperimentali di legame dell’ossigeno all’emoglobina sono spesso effettuate
a pH 7,4. BPG nel sangue della persona in questione comincia ad au-
©•978-8^09*06413-4 CAPITOLO 5 La funzione delle proteine [ 7

p 0 2 nei p 0 2 nei La regolazione del legame dell’ossigeno operata dal BPG ha


p 0 2 nei polmoni polmoni una funzione essenziale nello sviluppo fetale. Dato che il feto
tessuti (4500 m) (a livello del mare)
deve ottenere l’ossigeno dal sangue materno, l’emoglobina fe­
tale deve avere un’afSnità per l’0 2 superiore a quella dell’emo­
globina materna. Nei feti invece delle subunità p sono prodot­
te subunità 7 , e si forma emoglobina con una composizione in
subunità ol2~ì 2- Questo tetramero, chiamato emoglobina feta­
le (H bF ), ha un’affinità molto bassa per il BPG e di conse­
guenza un’alta affinità per l’ossigeno.

-> L’anemia a cellule falciformi è una malattia


delle molecole emogloblniche
L’anemia a cellule falciformi, una malattia ereditaria dell’uo­
mo, dimostra la grande importanza della sequenza ammi-
noacidica nella determinazione delle strutture secondaria,
terziaria e quaternaria delle proteine globulari, e quindi
anche nel determinare le loro funzioni biologiche.
Questo tipo di anemia colpisce quei soggetti che ereditano
l’allele dell’emoglobina a cellule falciformi da entrambi i ge­
nitori. Il numero degli eritrociti diminuisce e anche la loro
forma risulta alterata. Oltre ad un numero più elevato di cel­
lule immature, il sangue di questi soggetti contiene eritroci­
FIGURI 5.12 • Effetto del BPG sul legame dell’ossigeno all’emoglobina. ti allungati, sottili, a forma di falce (Figura 5.13). Se l’emo­
La concentrazione del BPG nel sangue dei soggetti adulti sani è di circa 5 miu a globina estratta dalle cellule falciformi (chiamata emoglobi­
livello del mare e di circa 8 mM In altitudine. SI noti che l'emoglobina si lega
all'ossigeno molto saldamente quando II BPG è totalmente assente, e la curva di na S) viene deossigenata, diventa insolubile e forma polime­
legame assume un andamento quasi Iperbolico, In realtà II coefficiente di Hill ri che si aggregano in fibre tabulari. L’emoglobina normale
per II legame deH’0 2 diminuisce solo di poco (da 3 a circa 2,5) In seguito alla (emoglobina A ) rimane invece solubile anche dopo la deos­
rimozione del BPG dall'emoglobina; si osserva un andamento sigmoide della
curva in quanto la sua parte ascendente è confinata in una piccolissima regione sigenazione. Le fibre insolubili dell’emoglobina S deossige­
in prossimità dell'origine. A livello del mare, l'emoglobina è saturata quasi per il nata causano la deformazione a falce degli eritrociti. La
100% dall’ossigeno nel polmoni, ma solo perii 60% nei tessuti, quindi la quantità di cellule a forma di falce aumenta rapidamente
quantità di ossigeno rilasciato nel tessuti è di circa il 38% rispetto al massimo
che può essere trasportato dal sangue. In altitudine, la cessione dell’ossigeno man mano che il sangue viene deossigenato.
diminuisce di circa un quarto e raggiunge solo il 30% del massimo. Ma Le proprietà peculiari dell’emoglobina S sono il risultato di
l’aumento della concentrazione del BPG diminuisce l’affinità dell’emoglobina per
una singola sostituzione amminoacidica, un residuo di Val in­
l’Oz e quindi la quantità di ossigeno rilasciato nei tessuti in queste condizioni è
di circa il 37% rispetto al massimo che può essere trasportato dal sangue. vece di un residuo di Giu in posizione 6 nelle due catene (3.
Il gruppo R della vaiina non possiede cariche elettriche,
mentre il glutammato possiede una carica negativa a pH 7,4.
Quindi l’emoglobina S ha due cariche negative in meno ri­
meritare, generando una diminuzione delTaffinità dell’emo­ spetto all’emoglobina A (una per ogni catena p). La sostitu­
globina per l’ossigeno. Questa variazione nei livelli di BPG zione di un residuo di Giu con un residuo di Val crea un
provoca solo un piccolo effetto sul legame dell’ossigeno a li­ punto di contatto idrofobico “appiccicoso” nella posizione 6
vello dei polmoni, ma ha un effetto molto evidente sul rila­ della catena p, che si trova sulla superficie esterna della mo-
scio dell’0 2 a livello dei tessuti periferici. Il trasferimento di
ossigeno ai tessuti torna ad essere circa il 40% della quanti­
tà totale di gas che il sangue può trasportare. L’inverso av­
viene quando la persona ritorna a livello del mare. La con­
centrazione di BPG negli eritrociti aumenta anche nelle per­
sone che soffrono di ipossia, dovuta ad una minore ossige­
nazione dei tessuti periferici per effetto di un cattivo funzio­
namento dei polmoni o del sistema circolatorio.
Il BPG si lega all’emoglobina nella cavità tra le subunità (3
nello stato T. Questa cavità è rivestita da amminoacidi con
gruppi R carichi positivamente che interagiscono con i grup­
pi carichi negativamente del BPG. A l contrario dell’ossigeno,
una sola molecola di BPG si lega ad ogni tetramero di emoglo­
bina. Il BPG abbassa l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno
e stabilizza lo stato T; la transizione allo stato R restringe la
tasca in cui si va a legare il BPG, impedendogli qualsiasi inte­
FIGURA 5.13 • Confronto tra un eritrocita normale, a forma di disco biconcavo
razione. In assenza di BPG l’emoglobina viene convertita più (in basso in centro), ed eritrociti tipici dell'anemia a cellule falciformi, che
facilmente nello stato R. assumono forme diverse (spinose, falciformi).
7 6 1 CAPITOLO 5 La funzione delle proteine t t é t S i 8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4

lecola. Queste zone appiccicose fanno sì che le molecole di ¡¡¡¡¿- 1, . .. Alcuni tipi di leucociti associali al sistema
deossiemoglobina S si associno in modo anomalo l’una con immunitario
l’altra formando aggregati di fibre allungati tipici della ma­
Tipo cellulare Funzione
lattia.
Macrofagi Ingeriscono grandi particelle
e cellule per fagocitosi t i
Linfociti B (cellule B) Producono e secernono anticèrpi
Linfociti T (cellule T )
5.2 Interazioni complementari tra proteine Cellule T citotossiche Interagiscono con le ceUùlé )
e ligandi: il sistema immunitario (cellule Tei cèllule killer) dell’organismo infettate mediante
recettori presenti sulla loro
e le immunoglobuline superficie
Cellule T Kelper (T H) Interagiscono con macrofagi e
Tutti i vertebrati possiedono un sistema immunitario in secernono citochine
grado di distinguere le molecole “proprie” da quelle “estra­ (interleuchine), che inducono le
Cellule T0, T h e B a proliferare
nee” e quindi di distruggere ciò che viene identificato come
estraneo. In tal modo il sistema immunitario elimina virus,
batteri ed altri patogeni, oltre alle molecole che costituisco­
no una minaccia per l’organismo. A livello fisiologico la ri­
sposta del sistema immunitario richiede l’intervento di tutta per (cellule TH, cellule T “ausiliarie”) , la cui funzione è di
una serie di interazioni coordinate tra molte classi di mole­ produrre segnali proteici solubili, le citochine, di cui fanno
cole, proteine e tipi cellulari. A livello delle singole proteine, parte le interleuchine. La Tabella 5.2 riassume le funzioni
la risposta immunitaria dimostra come un sistema biochimi­ dei vari tipi di leucociti del sistema immunitario.
co sensibile e specifico si basi su interazioni reversibili tra Qualsiasi molecola, o patogeno, capace di indurre una rispo­
proteine e ligandi. sta immunitaria è detta antigene. Un antigene può essere
un virus, una parete cellulare batterica, o una singola pro­
-» La risposta immunitaria utilizza una serie teina o un’altra macromolecola. Un antigene con una strut­
di cellule e proteine specializzate tura complessa può essere legato da un certo numero di an­
Alla risposta immunitaria contribuiscono una varietà di leu­ ticorpi diversi. Un singolo anticorpo o un singolo recettore
cociti (i globuli bianchi del sangue), compresi i macrofagi e riconoscono solo una particolare struttura all’interno del-
i linfociti, che derivano tutti da cellule staminali indifferen­ l’antigene, che viene detta determinante antlgenico o
ziate presenti nel midollo osseo. epitopo.
La risposta immunitaria viene prodotta da due sistemi com­ Passiamo ora ad una descrizione più dettagliata degli anti­
plementari, cioè i sistemi immunitari umorale e cellulare. Il corpi e delle loro proprietà di legame.
sistema immunitario umorale (dal latino humor, “flui­
do”) è diretto contro le infezioni batteriche e i virus extra­ -> Gli anticorpi hanno due siti identici
cellulari (quelli presenti nei fluidi corporei), ma può rispon­ per il legame dell’antigene
dere anche a singole proteine introdotte nell’organismo. Il Le immunoglobuline G (IgG) costituiscono la classe prin­
sistema immunitario cellulare distrugge le cellule del­ cipale di molecole anticorpali e sono le proteine più abbon­
l’organismo infettate dai virus, come anche alcuni parassiti e danti nel siero. Le IgG possiedono quattro catene polipepti-
tessuti estranei. diche: due di grandi dimensioni, dette catene pesanti, e due
La risposta immunitaria umorale è mediata da proteine solu­ di piccole dimensioni, dette catene leggere, unite da legami
bili dette anticorpi o immunoglobuline, abbreviate con non covalenti e ponti disolfuro in un complesso con M r pari
Ig. Le immunoglobuline legano batteri, virus o m olecole a 150 000. Le catene pesanti di una molecola di IgG interagi­
molto grandi identificate come estranee e li portano alla di­ scono tra loro ad un’estremità, e poi si dividono ed interagi­
struzione. Esse rappresentano circa il 20% delle proteine scono separatamente conte due catene leggere, producendo
del sangue e sono prodotte dai linfociti B o cellule B, così una molecola che viene così ad assumere una forma simile ad
chiamate perché completano il loro differenziamento nel mi­ una Y (Figura 5.14). A livello delle “cerniere”, dove inizia la
dollo osseo ( bone vnarrow). divaricazione ad Y, l’immunoglobulina può essere scissa dalle
Tra i principali componenti della risposta immunitaria cel­ proteasi. La digestione con papaina genera il frammento basa­
lulare vi sono i linfociti T o cellule T (così chiamate in le Fc, così chiamato in quanto è facile da cristallizzare, e due
quanto l ’ultima fase del loro differenziamento avviene nel ramificazioni dette invece Fab, cioè frammenti che legano
timo), note come cellule T citotossiche (cellule Tc o cel­ l’antigene. Ogni ramificazione ha un singolo sito di legame per
lule T killer). Il riconoscimento di cellule infettate o di pa­ l’antigene.
rassiti avviene attraverso proteine dette recettori delle cel­ In molti vertebrati l’IgG è una delle cinque classi di immu-
lule T presenti sulla superficie dei linfociti T c. I recettori noglobuline che circolano all’interno dell’organismo. Ogni
sono proteine, di solito localizzate sulla superficie della cellu­ classe ha un caratteristico tipo di catena pesante, indicato
la, che attraversano la membrana piasmatica. Essi riconosco­ con le lettere a, S, e, 7 e p, rispettivamente presente nelle
no e legano ligandi extracellulari, provocando modificazioni immunoglobuline IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. In tutte le classi
all’interno della cellula. di immunoglobuline ci sono due tipi di catene leggere, k e \.
Oltre ai linfociti T citotossici, vi sono anche le cellule T hel- La struttura complessiva delle IgD e delle IgE è simile a
© 9 7 8 - 8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4 CAPITOLO 5 La funzione delle proteine | /

Sito
di legame
dell’antigene
Siti /
di rottura */
X / .M *

(b )

FIGURA 5 .1 4 * Struttura deirimmunoglobulina G.


(a) Una coppia di catene pesanti si combina con due catene leggere formando
una molecola simile ad una Y. I due siti antigenici sono costituiti dai siti
ooc eoo”
variabili di una catena leggera (Vl) e di una catena pesante (VH). La protesisi
con papaina separa i frammenti Fab e Fc rompendo la molecola a livello dei
punti di flessione, che funzionano da cerniera. La porzione Fc contiene anche
C = dominio costante carboidrati legati, (b) Legame di una IgG a un antigene. Per ottenere un
V = dominio variabile adattamento ottimale con l'antigene, i siti di legame dell’lgG spesso subiscono
piccoli cambiamenti conformazionali. Questo adattamento indotto è un
H, L = catena pesante, catena leggera
(a ) comportamento comune in molte interazioni proteina-ligando.

quella delle IgG. Le Ig M possono essere legate alla membra­ Un test E L I S A (dosaggio con enzimi legati ad immunoas-
na in una forma monomerica, oppure vengono secrete in sorbenti) consente una rapida quantificazione di un anti­
forma di pentamero unito da molti legami trasversali. Le gene in un campione biologico (Figura 5.15b). Le proteine
IgA , presenti principalmente nelle secrezioni come la sali­ sono assorbite su una superficie inerte, di solito una pia­
va, le lacrime e il latte, possono essere monomeriche, dime- stra di polistirene che è poi lavata con una soluzione di una
riche o trimeriche. proteina non specifica in modo da bloccare l’assorbimento
delle proteine che verranno usate in seguito. La superficie
-> Molte importanti tecniche analitiche si basano viene poi coperta con una soluzione contenente l’anticorpo
sulle interazioni antigene-anticorpo primario, cioè quello diretto contro la proteina di interes­
Per la straordinaria affinità e specificità di legame, gli anti­ se. L’anticorpo che non si lega viene eliminato con lavaggi e
corpi sono ottimi reagenti analitici. Si può disporre di due la superficie viene poi ricoperta con una soluzione conte­
tipi di preparazione di anticorpi: policlonali e monoclonali. nente un secondo anticorpo diretto contro l’anticorpo pri­
Gli anticorpi policlonali sono prodotti da molti linfociti B mario. Questo secondo anticorpo è legato ad un enzima in
in risposta a un antigene, ad esempio ima proteina iniettata grado di catalizzare una reazione che forma un prodotto
in un animale. Quindi le preparazioni di anticorpi policlona­ colorato. Dopo aver rimosso l’anticorpo secondario in ec­
li contengono una miscela di anticorpi che riconoscono di­ cesso, si aggiunge la soluzione contenente il substrato del­
verse parti dello stesso antigene. Gli anticorpi monoclo­ l’enzima legato all’anticorpo. La formazione del prodotto
nali, al contrario, sono sintetizzati da una popolazione di lin­ (valutata in base all’intensità del colore) è proporzionale
fociti B identici (un clone) cresciuta in un terreno di coltu­ alla concentrazione della proteina che interessa nel cam­
ra. Questi anticorpi sono omogenei e riconoscono tutti lo pione biologico.
stesso epitopo. In un dosaggio con immunoblot (Figura 5.15c) le protei­
In una tecnica analitica molto versatile un anticorpo viene ne sono prima separate per elettroforesi su gel e poi trasfe­
marcato con un radioisotopo o con un altro reagente che lo rite su un foglio di nitrocellulosa. Questo foglio viene imbe­
renda facilmente identificabile. Quando l’anticorpo si lega vuto in una soluzione proteica inerte, come nel test ELISA,
; alla sua proteina bersaglio, la marcatura rivela la presenza e trattato in successione con l’anticorpo primario e poi con
: della proteina in una soluzione, in un gel o anche in una cel- l’anticorpo secondario legato all’enzima e il suo substrato.
lula vivente. Nella Figura 5.15 sono illustrate diverse appli- Lungo la banda in cui è localizzata la proteina che interessa
¡eazioni di questa procedura. si forma precipitato colorato (macchia).
7 8 1 CAPITOLO S La funzione delle proteine

(T ) Superficie rivestita con i


campioni (antigeni). u
(2 ) Le regioni non occupate
dai campioni vengono riempite
con una proteina non specifica.
(3 ) Incubazione con l’anticorpo
primario diretto contro
l’antigene specifico.
(D Incubazione con l’anticorpo
secondario unito ad un enzima;
il complesso si lega
all’anticorpo primario.
(5 ) Viene aggiunto il substrato
dell’enzima.
( 6 ) La formazione di un prodotto
colorato indica la presenza
di un antigene specifico.

(a)

1 2 3 4 5 6
_i 4 -r +- -
1-97 ,4- ;
! f . .1
-4 4 - ~ 1—66,2-7

r
-4 ■■ 4 - . . 4.
:- 4 5 , 0 - |

4 - 8h M b 6 h
-31,0-1;):

■. H S l I -2 1 ,5 -1
v m ê
li -1 4 ,4 -
ELISA SDS gel Immunoblot
(b ) IO

FIGURA 5.1 5 • Tecniche che utilizzano gli anticorpi. La reazione specifica concentrazioni di anticorpi anti HSV tenderanno a colorarsi in giallo.
tra un antigene e il suo anticorpo viene sfruttata in diverse tecniche analitiche (c) Un immunoblot. Le corsie da 1 a 3 derivano da una elettroforesi su gel
mirate a identificare e quantificare una specifica proteina presente in un in presenza di SDS; le proteine presenti in campioni raccolti nelle successive
complesso campione biologico, (a) Una rappresentazione schematica delia tappe di purificazione di una proteina chinasi sono state separate e colorate
metodologia, (b) Un dosaggio ELISA per verificare la presenza di anticorpi contro col blu Coomassie. Le corsie da 4 a 6 mostrano gli stessi campioni, che dopo
il virus dell’herpes simplex (HSV) nel sangue. I pozzetti sono stati ricoperti con un la separazione elettroforetica sono stati trasferiti su un foglio di nitrocellulosa.
antigene derivato dall’HlV, al quale si legheranno gli anticorpi contro l'HSV. il Il foglio è stato quindi trattato con un anticorpo contro la proteina chinasi,
secondo è un anticorpo contro le IgG umane, legato alla ossidasi di rafano. I numeri tra l'SDS gel e ['immunoblot si riferiscono ai valori delle M,, indicate
Secondo lo schema presentato in (a), i campioni contenenti sangue con elevate in migliaia.

TERMINI CHIAVE! m ligando 67


linfociti 76
I term ini in grassetto sono definiti nel glossario. linfociti B, 0 cellule B 76
adattamento indotto 67 linfociti T, o cellule T 76
anticorpi 76
proteina allosterica 73
anticorpi monoclonali 77 protoporfirina 68
anticorpi policlonali 77 reazione aJl’equilibrio 69
antigene 76 sito di legame 67
costante di associazione, Kn 69
costante di dissociazione, K A 70
effetto Bohr 74
ULTERIORI LETTURE
ELISA 77
eme 68 Ackers, G.K. e Hazzard, J.H. (1993) Transduction of binding
epitopo 76 energy into hemoglobin cooperativity. Trends Biochem. Sci. 18,
globine 68 pp. 385-390.
immiinoglobuline 76 Perutz, M.F., W ilkinson, A.J., Paoli, M. e Dodson, G.G.
immunoblot 77 (1998) The stereochemical mechanism of the cooperative effects
© 978-88-08-06413 4 CAPITOLO 5 La funzione delle proteine ¡7 9

in hemoglobin revisited. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. HbS (Hb delle cellule falciformi): un Giu sulla superfi­
27, 1-34. cie sostituito con Val.
Squires, J.E. (2002) Artiflcial blood. Science 295,1002-1005. Hb Cowtown: è eliminata una coppia ionica coinvolta
Una interessante descrizione delle difficoltà tecniche che si in­ nella stabilizzazione dello stato T.
contrano quando si tenta di riprodurre in laboratorio un siste­ Hb Memphis: sostituzione di un residuo non carico sulla
ma così sofisticato come quello del trasporto dell’ossigeno. superficie con un altro di dimensioni simili.
Hb Bibba: sostituzione di una Leu in un’a elica con una
Pro.
Hb Milwaukee: sostituzione di una Val con un Giu.
PU L'BLEMI Hb Providence: sostituzione di una Lys che di solito si
proietta nella cavità centrale del tetramero con
1. Affinità per l ’ossigeno della mioglobina e del­ un’Asn.
l’emoglobina. Qual è l’effetto delle seguenti modifica­ Hb Philly: sostituzione di una l y r con una Phe, elimi­
zioni di affinità per l ’02 della mioglobina e dell’emoglo­ nando un legame idrogeno all’interfaccia ai|3i.
bina? (a ) Un abbassamento del pH del plasma sangui­
gno da 7,4 a 7,2. (b ) Una diminuzione della pressione Rispondete alle seguenti domande, motivando la vostra
parziale di CO2nei polmoni da 6 kPa (trattenendo il re­ scelta.
spiro) a 2 kPa (respiro norm ale). (c ) Un aumento dei (a ) Qual è la variante che meno probabilmente causa sin­
livelli di BPG da 5 irai (ad altitudini m edie) a 8 m M (in tomi patologici?
quota). (d ) Un aumento del CO da una parte per milio­ (b ) Quali sono le varianti che più probabilmente hanno va­
ne (ppm ), come si riscontra in un appartamento di lori di pi diversi da quello dell’HbA quando sono analiz­
città, a 30 ppm, con un impianto di riscaldamento mal- zate in un’isoelettrofocalizzazione?
funzionante. (c ) Quali sono le varianti che più probabilmente mostrano
una diminuzione dell’affinità per il BPG e un aumento
2. Cooperatività dell’emoglobina. Nelle condizioni ap­ dell’affinità per l’ossigeno?
propriate, l’emoglobina si dissocia nelle sue quattro
. subunità. La subunità a isolata lega l ’ossigeno, ma la 4. Legame dell’ossigeno e struttura dell’emoglobi­
curva di saturazione è iperbolica, e non sigmoide. Inol­ na. Un gruppo di biochimici si avvale dell’ingegneria ge­
tre, il legame dell’Og alla subunità a non è influenzato netica per modificare l’interfaccia tra le subunità del­
dalla presenza di H+, C 02, o BPG. Che cosa suggerisco­ l’emoglobina. Le varianti emoglobiniche così ottenute
no queste osservazioni sull’origine della cooperatività in soluzione si trovano sotto forma di dimeri a (8 (p o ­
nell’emoglobina? chissimi, forse nessuno sotto forma di tetrameri 012P2) •
Queste varianti emoglobiniche legheranno l’ossigeno
3. Varianti dell’emoglobina. Vi sono circa 500 varianti di con più o meno forza? Spiegate la risposta.
emoglobina. Molte di queste sono il risultato della sosti­
tuzione di un singolo residuo arnminoacidico nella catena 5. Legame reversibile (ma forte) di un anticorpo. Un
polipeptidica di una globina. Alcune varianti producono anticorpo si lega all’antigene con una Ad di 5 X IO -8 M.
malattie, ma non tutte sono dannose per l’organismo. Di A quale concentrazione di antigene il valore di 9 sarà
seguito è riportato un breve elenco di queste forme. (a ) 0,2; (b ) 0,5; (c ) 0,6; (d ) 0,8?
'll
Per soddisfare questa condizione le molecole dovrebbero,
quando combinate con l’enzima, disporsi ancora più lontano
rispetto alle distanze necessarie per formare [legami covalenti],
ma più vicino rispetto alle distanze di quando le molecole sono
libere... Usando il modello di Fischer a “chiave-serratura”, la
chiave non si adatta perfettamente, ma esercita un certo sforzo.
J.B.S. Haldane, Enzymes, 1930

La catalisi può essere formalmente descritta come la


stabilizzazione dello stato di transizione attraverso un forte
legame al catalizzatore.
William P. Jencks, in Advances in Enzymology, 1975

Gli enzimi
Introduzione agli enzimi 80 Termineremo con una trattazione della regolazione dell’at­
tività enzimatica.
Come lavorano gli enzimi 81
La cinetica enzimatica, un approccio
alla comprensione del meccanismo di azione
degli enzimi 85 6.i Introduzione agli enzimi
Esempi di reazioni enzimatiche 89 -> La maggior parte degli enzimi sono proteine
Enzimi regolatori 90 Ad eccezione di un piccolo gruppo di molecole di RN A ca­
talitico, tutti gli enzimi sono proteine.
Essi, come tutte le proteine, hanno un peso molecolare che

I
n questo capitolo ci occuperemo dei catalizzatori delle
reazioni che avvengono nei sistemi biologici: gli enzim i, può variare da circa 12 000 a oltre un milione. Alcuni hanno
proteine altamente specializzate dotate di straordinarie bisogno di componenti chimici addizionali chiamati cofattori,
proprietà. Gli enzimi hanno un notevole potere catalitico, che possono essere costituiti da uno o da più ioni inorganici,
molto spesso più elevato dei catalizzatori sintetici o inorga­ come Fea+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+ (Tabella 6.1), oppure da com­
nici. Essi hanno un alto grado di specificità per i loro substra­ plesse molecole organiche o metallorganiche chiamate coen ­
ti, accelerano enormemente le reazioni chimiche e agiscono zimi. I coenzimi agiscono come trasportatori transitori di spe­
in soluzione acquosa in condizioni molto blande di tempera­ cifici gruppi funzionali (Tabella 6.2). Certi enzimi necessita­
tura e di pH. Solo pochi catalizzatori non biologici hanno que­ no per il loro funzionamento sia di un coenzima sia di ioni
ste proprietà. metallici. Un coenzima o uno ione metallico legato covalente­
Passeremo poi alla cinetica enzimatica, che può essere con­ mente alla proteina enzimatica viene detto g ru p p o p r o s t é ­
siderata la base di ogni successiva discussione sugli enzimi. tico. Un enzima cataliticamente attivo con tutti i suoi coenzi-

:TABELLA 6.1 Elementi inorganici che servono da cofattori di enzimi


Ioni Enzimi

Cu2+ Citocromo ossidasi


Fe2+ o Fe3+ Citocromo ossidasi, catalasi, perossidasi
K+ Piruvato chinasi
Mg2+ Esochìnasì, glucosio 6 -fosfatasi, piruvato chinasi
Mn2+ Arginasi, ribonucleotide reduttasi
Mo Dinitrogenasi
Ni2+ Ureasi
Se Glutatione perossidasi
Zn2+ Anidrasi carbonica, alcol deidrogenasi, carbossipeptidasi A e B
«¡> 9/8-8 8 0 8 C 6 4 1 3 4 CAPITOLOS Gli enzimi ¡81

S J i i l É f l A,cuni coenzimi che servono da trasportatori temporanei di specifici atomi o gruppi funzionali
Coenzima Esempi di grappi chimici trasferiti Precursore nella dieta dei mammiferi

Biotina C0 2 Biotina
Coenzima A Gruppi acilici Acido pantotenico e altre molecole
5'-Deossiadenosilcobalammina (coenzima Bi 2) Atomi di H e grappi alchilicì Vitamina Big
Flavin adenin dinucleotidè Elettroni Riboflavina (vitamina B2)
Acido lipoico Elettroni e gruppi acilici Non necessario nella dieta
Nicotinammide adenin dinucleotide Ione idruro ( : I I ) Acido nicotinico (macina)
Piridossal fosfato Gruppi ammiraci Piridossina (vitamina Be)
Tetraidrofolato Grappi a un atomo di carbonio Folate
Tiammina pirofosfato Aldeidi Tiammina (vitamina BQ

Nota: la struttura ed il meccanismo d’azione di questi coenzimi sono descritti nella Parte 2.

mi o ioni metallici è detto oloenzima, mentre la parte protei­ quoso presente all’interno delle cellule. Inoltre, molte reazio­
ca di un enzima viene chiamata apoenzima o apoproteina. ni biochimiche comuni sono processi che possono essere non
spontanei o improbabili nell’ambiente cellulare.
-> Gli enzimi sono classificati in base alle reazioni Un enzima supera questi problemi generando un ambiente
che catalizzano specifico in cui una data reazione è energeticamente favori­
Molti enzimi hanno nomi che derivano da quello del loro sub­ ta. Una caratteristica delle reazioni catalizzate dagli enzimi
strato o da una parola o una frase che descrive la loro attività, è proprio quella di avvenire all’interno dei confini di una
a cui è stato aggiunto il suffisso “-asi”. Quindi l’ureasi cataliz­ tasca dell’enzima chiamata sito attivo. La molecola che si
za l’idrolisi dell’urea e la DNA polimerasi catalizza la sintesi lega al sito attivo e su cui l’enzima agisce è detta substrato.
del DNA. Altri enzimi hanno il nome assegnato dai loro sco­ La superficie di un sito attivo è rivestita da residui amminoa-
pritori in base ad una data funzione, prima che fosse cono­ cidici i cui gruppi funzionali legano il substrato e catalizza­
sciuta la reazione specifica catalizzata. Per esempio, un enzi­ no la reazione chimica. La formazione del complesso enzi­
ma conosciuto per il suo ruolo nella digestione dei cibi è stato ma-substrato è essenziale per la catalisi ed è anche il punto
chiamato pepsina, dal greco pepsis, “digestione”, e il lisozima di partenza per l ’elaborazione matematica che definisce il
è stato così definito per la sua capacità di iisare la parete della comportamento cinetico delle reazioni catalizzate da enzi­
cellula batterica. A causa di ambiguità nella nomenclatura m i e per la descrizione teorica del meccanismo d’azione
degli enzimi e del numero sempre maggiore di nuovi enzimi degli enzimi.
che vengono identificati, è stato adottato per convenzione un
sistema di classificazione che suddivide questi catalizzatori -> Gli enzimi modificano la velocità delle reazioni,
biologici in sei classi principali, ognuna suddivisa in sottoclas­ non gli equilibri
si in base al tipo di reazione chimica catalizzata (Tabella 6.3). Una semplice reazione enzimatica può essere scritta:

E + S ES EP E + P (6.1)

6.2 Come lavorano gli enzimi


dove E, S e P rappresentano rispettivamente l’enzima, il
La catalisi enzimatica delle reazioni è un processo essenziale substrato e il prodotto. ES ed EP sono i complessi transito­
per gli organismi viventi. Nelle condizioni biologiche, le rea­ ri dell’enzima con il substrato e con il prodotto.
zioni non catalizzate tendono ad essere troppo lente; la mag­ Per comprendere la catalisi dobbiamo prima essere in grado
gior parte delle molecole biologiche è abbastanza stabile ad di distinguere tra equilibrio chimico e velocità di reazione. La
un pH neutro, a temperatura ambiente e nell’ambiente ac­ funzione di un catalizzatore è quella di aumentare la veloci-

TABELLA 6.3 Classificazione internazionale degli enzimi


Numero Classe Tipo di reazione catalizzata

1 Ossidoreduttasi Trasferimento di elettroni (ioni idruro ò atomi di H)


2 Trasferasi Reazióni di trasferimento di gruppi funzionali : .
3 Idrolasi Reazioni di idrolisi (trasferimento di gruppi funzionali all’acqua)
4 Liasi Addizione di grappi a legami doppi o formazione d: dóppi legami
mediante rimozione di grappi
5 Isomerasi Trasferimento di grappi all’intemo di molecole i>ei formare
isomeri
6¡ Ligasi Formazione di legami C— C, C— S, C— O e C — N mediante reazióni
di condensazione accoppiate alla scissione di ATP o coiattoli sìmili
8 2 1 iìfit-ITOLO 6 Gli enzimi ©978-88-08-06413-4

L’equilibrio tra S e P dipende dalla differenza tra i livelli di


energia libera dei due composti ai loro stati basali. N el­
l’esempio mostrato nella Figura 6.1 l ’energia libera dello
stato basale di P è minore di quella di S, e quindi il A G '0
della reazione è negativo e l’equilibrio favorisce P. Questo
equilibrio non viene modificato da un catalizzatore.
Se un equilibrio è favorevole non significa però che la veloci­
tà della conversione di S in P sia elevata. La velocità di una
reazione dipende da un parametro completamente diverso.
Tra S e P esiste ima barriera energetica che corrisponde al­
l’energia libera necessaria ad allineare i gruppi reagenti, a
formare cariche transitorie instabili, a riorganizzare legami e
FIGURA 6.1 • Grafico della coordinata di reazione di una reazione a produrre altre trasformazioni necessarie alla reazione per
chimica. L'energia libera del sistema viene riportata in funzione del progredire
procedere in una delle due direzioni. Questa barriera è illu­
della reazione S P, Un diagramma di questo tipo descrive la variazione
energetica durante il corso della reazione, e l’asse orizzontale (la coordinata di strata dall’andamento dell’energia nel grafico della coordi­
reazione) riflette il progredire della reazione (per esemplo la formazione o la nata di reazione, che ricorda una collina, com’è mostrato
rottura di un legame) man mano che S viene convertito in P. Sono indicate le
nelle Figure 6.1 e 6.2. Perché possa avvenire la reazione le
energie di attivazione A i? per le reazioni S —> P e P —> S. Aff° è la
variazione complessiva nella direzione S —» P. molecole devono superare questa barriera e quindi devono
raggiungere un livello energetico più elevato di quello basa­
le. A l punto più alto della curva, la molecola ha la stessa pro­
tà di una reazione. I catalizzatori non modificano però gli babilità di decadere verso S o verso P (entrambe le vie sono
equilibri delle reazioni. Qualsiasi reazione, come S P, in discesa). Questa condizione viene chiamata stato di
può essere descritta dal grafico della coordinata di reazione transizione, che corrisponde a un momento molecolare
[Figura 6.1), che analizza le variazioni energetiche che av­ transitorio che precede la formazione del prodotto o il ritor­
vengono nel corso della reazione. Nel grafico della coordi­ no al substrato. La differenza tra i livelli di energia dello
nata, l’energia libera di un sistema viene analizzata in fun­ stato di base e dello stato di transizione è l’energia di atti­
zione del procedere della reazione (la coordinata di reazio­ vazione (AG*). L’energia di attivazione può essere abbas­
ne). Il punto di partenza per la reazione in un senso o nel sata aggiungendo un catalizzatore (Figura 6.2). Il cataliz­
senso opposto è definito stato basale e corrisponde al con­ zatore aumenta la velocità della reazione abbassando
tributo di energia libera fornito al sistema da una molecola l’energia di attivazicme.
(S o P ) in ben definite condizioni (e quindi il valore medio Gli enzimi non sfuggono alla regola fondamentale dei cata­
di energia posseduto da quella popolazione di m olecole). La lizzatori, e cioè che essi non alterano gli equilibri delle rea­
variazione di energia libera a cui il sistema può andare in­ zioni a cui partecipano. Le frecce bidirezionali nella reazione
contro in queste condizioni è indicata come \G °, la varia­ chimica dell’Equazione 6.1 stanno ad indicare che un enzi­
zione di energia libera standard. Poiché nei sistemi bio­ ma che catalizza la reazione S —» P catalizza anche la reazio­
logici la concentrazione degli ioni H + è molto lontana dal­ ne P —> S. Il suo ruolo è quello di accelerare l’interconver-
l ’essere 1 M, i biochimici hanno definito la variazione di sione tra S e P. L’enzima non viene consumato durante que­
energia libera standard biochimica, indicata con A G '', sto processo e l’equilibrio resta inalterato. La reazione rag­
cioè la variazione di energia libera standard a p i i 7; questo giunge però l’equilibrio molto più rapidamente quando è
termine verrà utilizzato sempre in questo testo. presente l ’enzima, in quanto la velocità della reazione è
molto superiore a quella normale.
Ogni reazione è costituita da diverse tappe, in cui si ha la
formazione e la scomparsa di specie chimiche transitorie
chiamate intermedi di reazione*. Un intermedio di rea­
zione può essere definito come qualunque specie chimica
che si forma lungo il percorso della reazione. Nel caso di
una reazione catalizzata da un enzima, spesso si formano
intermedi chimici meno stabili (Figura 6.2) e quindi, la ve­
locità complessiva della reazione è determinata dalla tappa
(o dalle tappe) con l’energia di attivazione più elevata, che
viene detta tappa che limita la velocità.
Le energie di attivazione sono sì delle barriere per le reazio­
ni chimiche, ma sono ugualmente importanti per la vita. Se
FIGURA 6.2 • Confronto tra II grafico della coordinata di reazione di
una reazione non catalizzata e di una reazione catalizzata da un * In questo capitolo i termini tappa ed in te rm e d io si riferiscono alle specie
enzima. Nella reazione S —> P gii Intermedi ES ed EP sono presenti a livello di chimiche che fanno parte di una reazione catalizzata da un singolo enzima.
minimi energetici nella curva di progressione dell’energia associata alla Nel contesto delle vie metaboliche in cui sono coinvolti numerosi enzimi
reazione catalizzata da un enzima, I termini AG^mcat e A f l ^ corrispondono (Parte 3), questi termini tendono ad assumere significati diversi. Una reazio­
alte energìe di attivazione della reazione non catalizzata e della reazione ne enzimatica completa viene spesso definita una‘tappa” di una via, e il pro­
catalizzata. L’energia di attivazione è più bassa quando l’enzima catalizza la dotto di una reazione enzimatica (che diventa il substrato dell’enzima suc­
reazione. cessivo della via) viene definito “intermedio”.
f © 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 A Ì Ì ( ( CAPITOLO S Gli enzimi ¡il

non esistesse questa barriera energetica, le macromolecole La seconda parte della risposta sta nelle interazioni non co­
complesse potrebbero convertirsi spontaneamente in forme valenti che si instaurano tra enzima e substrato. Molta del­
molecolari più semplici. l’energia che serve ad abbassare l’energia di attivazione de­
riva dalle interazioni deboli e non covalenti che si instaurano
La velocità e gli equilibri delle reazioni tra il substrato e l’enzima. L’energia che si libera dalle intera­
hanno precise definizioni termodinamiche zioni enzima-substrato viene detta energia di legame
Gli equilibri delle reazioni sono strettamente correlati alla (A G b). Il suo significato va oltre la semplice stabilizzazione
variazione di energia libera standard della reazione stessa, dell’interazione tra enzima e substrato. L ’energia di lega­
A G '0; la velocità di una reazione è invece correlata all’ener­ me è lafonte principale di energia libera usata dall’en­
gia di attivazione, AG*. La descrizione di queste relazioni zim a p er abbassare l’energia di attivazione della rea­
termodinamiche è essenziale per comprendere come lavo­ zione.
rano gli enzimi.
Un equilibrio come S P è descritto dalla sua costante Le interazioni deboli tra l’enzima e il substrato
di equilibrio, K eq, o semplicemente K (p. 29). Nelle con­ diventano ottimali nello stato di transizione
dizioni standard usate per confrontare i processi biochimi­ Come utilizza un enzima l’energia di legame per abbassare
ci, la costante di equilibrio è indicata con AT'eq (o K 'f. l’energia di attivazione di una reazione? La formazione del
complesso ES non è una spiegazione sufficiente, anche se le
[P]
K' = — (6.2) prime considerazioni sul meccanismo degli enzimi sono par­
tite proprio da quest’idea. È stato Emil Fischer nel 1894 a
Dalla termodinamica sappiamo che la relazione tra K 'eq e ipotizzare che gli enzimi fossero strutturalmente comple­
AG '° può essere descritta dall’espressione: mentari al loro substrato e che quindi i due elementi si adat­
tassero l’uno all’altro esattamente come ima “chiave” alla
A G'° = —R T In K 'eq (6.3) sua “serratura”. Tuttavia, l’ipotesi “chiave-serratura” può es­
sere non corretta se applicata alla catalisi enzimatica. Un en­
dove R è la costante dei gas, 8,315 J/mole-K, e T è la tempe­ zima perfettamente complementare al suo substrato potreb­
ratura assoluta, 298 K (25 ° C ). La costante di equilibrio è be essere un “cattivo” enzima.
quindi direttamente proporzionale alla variazione comples­ Consideriamo una reazione immaginaria: la rottura di una
siva di energia libera standard della reazione. Un valore barretta di metallo. La reazione non catalizzata è mostrata
molto negativo di AG '° riflette un equilibrio favorevole, ma nella Figura 6.3a. Esaminiamo ora due ipotetici enzimi - due
non dà alcuna informazione sulla velocità a cui procede la “metallasi” - in grado di catalizzare la reazione; entrambi
reazione. usano forze magnetiche al posto dell’energia di legame degli
enzimi reali. Vediamo prima un enzima del tutto complemen­
-> Il potere catalitico e la specificità degli enzimi tare al substrato (Figura. 6.3b). Il sito attivo della metallasi
dipendono dal legame del substrato è una tasca rivestita di magneti. Perché possa reagire (rom­
Gli enzimi sono catalizzatori straordinari. L’aumento della persi), la barretta di metallo deve raggiungere lo stato di
velocità di una reazione determinato da un enzima può va­ transizione della reazione. La barretta si adatta così bene al
riare da 5 a 17 ordini di grandezza (Tabella 6.4). Gli enzimi sito attivo che non può piegarsi, in quanto il movimento di
sono anche molto specifici e possono discriminare tra mo­ piegatura eliminerebbe parte delle interazioni con i magneti.
lecole molto simili. Come è possibile spiegare questo enor­ Un enzima di questo genere impedisce che la reazione possa
me aumento della velocità indotto dagli enzimi? Da dove ar­ avvenire, in quanto si ha una stabilizzazione del substrato.
riva l’energia necessaria ad abbassare così drasticamente Nel grafico della coordinata di reazione (Figura 6.3b) la for­
: l’energia di attivazione di una specifica reazione? mazione del complesso ES genera una depressione energeti­
Le risposte a queste domande sono costituite da due parti ca molto profonda, da cui difficilmente il substrato potrebbe
tra loro interconnesse. La prima è il riarrangiamento di lega- liberarsi. Questo enzima è quindi assolutamente inutile.
; mi covalenti che si verifica durante una reazione catalizzata La moderna teoria sulla catalisi enzimatica propone che un
tra i gruppi funzionali del substrato e dell’enzima (le catene enzima deve essere complementare allo stato di transizio­
: laterali di alcuni amminoacidi, ioni metallici e coenzim i). ne della reazione. Ciò significa che le interazioni diventano
ottimali solo quando il substrato raggiunge lo stato di transi­
zione. La Figura 6.3c mostra come può agire un enzima. La
p¿.\ ^ 2 L’aum enlo della velocità prodotto barretta di metallo si lega, ma per la formazione del com­
da alcuni enzimi plesso ES vengono usate soltanto poche interazioni magne­
Ciclofillma IO5 tiche. Il substrato legato deve andare incontro ad un aumen­
Anidrasi carbonica IO7 to della sua energia libera, necessario per raggiungere lo
iTriosio fosfato isomerasi IO9 stato di transizione. Le intera zion i deboli di legame tra
iiGarbossipeptidasi A IO11
l’enzima e il substrato rappresentano la prin cipale
Fosfoglucomutasi IO12
forza trainante della catalisi.
Succinil-CoA trasferàsi 'io 18
La stessa energia di legame che favorisce la catalisi deter­
ìUreasi IO14
mina anche la specificità dell’enzima, cioè la capacità di di­
sOrotidina monofosfàto decarbossilasi IO17
scriminare tra il substrato e molecole simili. In teoria sem-
84 j CAPITOLO 6 GII enzimi '.!? S - ì ' m B C 6 4 1 3 4

(a > Senza enzima

.' 77 > ----- -*


Substrato Stato di transizione
(barretta di metallo) (barretta piegata)

( b ) Complementarità tra enzima e substrato

/ Magneti

ES

( c ) Complementarità tra enzima e stato di transizione

FIGURA 6.3 • Un enzima immaginario (“metallasi”) che catalizza la l’aumento di energia libera richiesto per piegare la barretta. I grafici della
rottura di una barretta di metallo, (a) Per essere rotta, la barretta deve coordinata di reazione (a destra) mostrano le conseguenze energetiche della
prima essere piegata (lo stato di transizione). Nei due esempi con la metallasi complementarità tra enzima e substrato o tra enzima e stato di transizione (i
le interazioni magnetiche sostituiscono le interazioni con legami deboli complessi EP non sono stati indicati). Il termine AG m rappresenta la differenza
enzima-substrato. (b) Un enzima, con una tasca rivestita da magneti In energia libera tra lo stato di transizione della reazione non catalizzata e
complementare alla struttura della barretta (il substrato), stabilizzerà II quello della reazione catalizzata, fornita dalle interazioni magnetiche tra la
substrato. Il piegamento della barretta sarà Impedito dalle attrazioni barretta e la metallasi. Quando l'enzima è complementare al substrato come
magnetiche tra metallasi e barretta, (c) Un enzima con una tasca In (b), il complesso ES è più stabile e nello stato basale possiede meno
complementare allo stato di transizione della reazione favorirà la energia libera del substrato. Il risultato è un aumento dell’energia di
destabilizzazione della barretta, contribuendo quindi ad accelerare la reazione. attivazione.
Le Interazioni magnetiche forniscono l’energia necessaria a compensare

bra abbastanza facile distinguere il concetto di specificità da dalle molteplici interazioni deboli che si generano tra pro­
quello di catalisi. Le cose sono invece molto più complicate teina e ligando. Questo meccanismo, chiamato a d a t t a ­
a livello sperimentale, in quanto specificità e catalisi deriva­ m e n to in d otto , può interessare una piccola parte dell’en­
no dallo stesso fenomeno. Se il sito attivo di un enzima pos­ zima in prossimità del sito attivo, o anche un intero domi­
siede gruppi funzionali disposti in modo da formare diverse nio. Di solito all’interno dell’enzima si determina una serie
interazioni ottimali con un dato substrato nello stato di tran­ di piccoli adattamenti, che portano il sito attivo nella cor­
sizione, l’enzima non sarà in grado di interagire altrettanto retta struttura.
bene con un’altra molecola.
L’energia di legame mantiene i substrati nella posizione e -> La c a ta lis i d ip e n d e da sp e c ific i g ru p p i fu n zio n a li
nell’orientamento corretti per la reazione; questo è imo dei Per la maggior parte degli enzimi l’energia di legame che si
contributi maggiori alla catalisi, in quanto le collisioni pro­ ottiene dalla formazione del complesso ES è solo uno dei di­
duttive tra due molecole in soluzione possono essere molto versi elementi che partecipano alla catalisi.
rare. I substrati si trovano nel giusto allineamento con l’enzi­ Tra i meccanismi meglio caratterizzati vi sono la catalisi
ma grazie a ima moltitudine di interazioni deboli tra il sub­ acido-base generale, la catalisi covalente e la catalisi da ioni
strato e gruppi dell’enzima disposti strategicamente sulla metallici. Questi sono processi distinti da quelli basati sul­
sua molecola. Questo effetto di prossimità e orientamento l’energia di legame e coinvolgono in genere interazioni co­
dei substrati è detto rid u z io n e e ntropica. valenti transitorie con il substrato o il trasferimento di
In secondo luogo, la formazione di legami deboli tra l’enzi­ gruppi dal o al substrato.
ma e il substrato porta anche ad una d e s o lv a ta z io n e del
substrato. Le interazioni enzima-substrato sostituiscono la C a t a lis i a c id o -b a se g e n e ra le La catalisi a cui partecipano
maggior parte dei legami idrogeno che esistevano tra la mo­ ioni H + (H 30 +) oppure OH- presenti nell’acqua viene chia­
lecola del substrato e l’acqua. mata c a t a lis i a c id o -b a s e s p e c ific a . Il termine c a t a lis i
Infine, un enzima quando lega il substrato può andare in­ a c id o -b a s e g e n e r a le si riferisce ad un trasferimento di
contro ad una m odificazione conformazionale, indotta protoni mediato da altre classi di molecole.
<£> 9 ? 8 -8 ^ 0 8 -o é 4 1 3 s 4 CAPITOLO 6 Gli enzimi 85

e.3 La cinetica enzimatica, un approccio


alla comprensione del meccanismo
di azione degli enzimi

Analizzeremo ora le basi della cinetica delle reazioni cataliz­


zate dagli enzimi. L’approccio principale al problema resta
sempre la determinazione della velocità della reazione e di
come questa cambi in risposta a modificazioni dei parametri
sperimentali, una metodica che va sotto il nome di c in e ti­
c a enzim atica.

-> La co n c e n tra z io n e del s u b s tra to m o d ific a la v e lo c ità


d e lle reazioni ca ta lizz a te d a g li e nzim i
Uno dei fattori chiave che modificano la velocità di una rea­
zione catalizzata da un enzima purificato è la concentrazio­
ne del substrato, [S], Però lo studio degli effetti del substra­
to è complicato dal fatto che [S] varia durante il corso di una
reazione, man mano che il substrato viene convertito in pro­
dotto. Per eliminare questo problema in esperimenti di ci­
FIGURA 0.4 » Gli amminoacidi nella catalisi acido-base generale. Molte netica si può valutare la v e lo c it à in izia le, indicata con la
reazioni organiche sono rese più facili da donatori di protoni (catalisi acida sigla V 0 (Figura 6.5), quando [S] è in genere molto più gran­
generale) o da accettori di protoni (catalisi basica generale). I siti attivi di alcuni
enzimi contengono amminoacidi con gruppi funzionali, come quelli riportati nella de della concentrazione dell’enzima [E]. In una tipica reazio­
figura, che possono partecipare ai processi catalitici come donatori o come ne l’enzima è presente in quantità nanomolari, mentre [S]
accettori di protoni.
può essere più elevata di 5 o 6 ordini di grandezza. Se il
tempo in cui si effettua la misura è sufficientemente breve
(in genere non più dei primi 60 secondi) e subito all’inizio
Nel sito attivo di un enzima vi possono essere catene latera­ della reazione, la variazione di [S] è limitata ad una piccola
li di amminoacidi capaci di svolgere la funzione di accettori percentuale, e quindi [S] resta pressoché costante. La velo­
o donatori di protoni (Figura 6.4). Questi gruppi possono far cità iniziale può essere valutata variando [S], come stabilito
parte di un sito attivo e provvedere al trasferimento di pro­ dal ricercatore. L’effetto della variazione di [S] su V 0, quando
toni; questo processo determina un aumento della velocità la concentrazione dell’enzima viene mantenuta costante, è
della reazione di un fattore variabile tra IO2 e IO 5volte. mostrato nella Figura 6.6. A concentrazioni relativamente
basse di substrato, V0aumenta praticamente in modo linea­
C a t a lis i c o v a le n te Nella catalisi covalente si forma un le­ re con l’aumento di [S], A concentrazioni di substrato più
game covalente transitorio tra l’enzima e il substrato. Consi­
deriamo l’idrolisi di un legame tra i gruppi A e B:

h2o
A — B --- > A + B

In presenza di un catalizzatore covalente (un enzima con un


grappo nucleofilo X:) la reazione diventa:

A — B + X: ---- > A — X + B A + X: + B

Ciò altera l’andamento della reazione, ma ne risulta una ca­


talisi solo se il nuovo percorso della reazione ha un’energia
di attivazione inferiore a quella della reazione non catalizza­
ta. Un certo numero di catene laterali amminoacidiche, in­
cluse tutte quelle della Figura 6.4, e i gruppi funzionali di al­
cuni cofattori enzimatici possono fungere da nucleofili nella
formazione di legami covalenti con i substrati.
FIGURA 8.5 • Velocità Iniziali delle reazioni catalizzate da enzimi. Un
C atalisi da io n i m etallici I metalli, sia legati saldamente al­ ipotetico enzima catalizza la reazione S P, ed è presente ad una
concentrazione sufficiente per catalizzare la reazione a una velocità massima,
l’enzima, sia ottenuti dalla soluzione con il substrato, parteci­
l/max, di 1 p-M/mln. La costante di Michaelis, Km(spiegata nel testo), è 0,5 p.M.
pano alla catalisi in diversi modi. Le interazioni ioniche tra un Sulle curve è indicata la concentrazione del substrato: la curva intermedia è la
metallo legato all’enzima e il substrato possono contribuire ad risultante delle determinazioni ottenute quando [S] = K^. La velocità della
reazione catalizzata dall’enzima diminuisce In funzione della trasformazione del
orientare il substrato e favorire la reazione o stabilizzare uno
substrato In prodotto. La tangente a ciascuna curva che passa per II tempo 0
stato di transizione in cui sono presenti cariche elettriche. definisce la velocità Iniziale, l/0, di ogni reazione,
86 S CAPITOLO G Gli enzimi 08-06413 4

In qualsiasi istante di una reazione catalizzata l’enzima è


presente in due forme, quella libera E e quella combinata
con il substrato, ES. Quando la concentrazione di substrato
[S] è bassa, la maggior parte dell’enzima sarà nella forma li­
bera E . Quindi la velocità è proporzionale a [S] dal momento
che, in base all’equilibrio considerato nell’Equazione 6.4,
man mano che [S] tende ad aumentare viene favorita la for­
mazione del complesso ES. La velocità iniziale massima
della reazione catalizzata (Fmax) si osserva quando pratica-
mente tutto l’enzima è presente nella forma di complesso
ES e la concentrazione di E libero diventa trascurabile. In
queste condizioni l’enzima è “saturato” con il suo substrato
e quindi ulteriori aggiunte di substrato non avranno effetti
sulla velocità della reazione.
Concentrazione del substrato, [S] (imi)
La reazione raggiunge rapidamente lo s t a to sta z io n a rio ,
in cui [ES] (com e pure la concentrazione di qualunque
FIGURA 0.0 • Effetto della concentrazione del substrato sulla velocità altro interm edio) rimane approssimativamente costante
iniziale della reazione catalizzata da un enzima. La velocità massima,
nel tempo.
è stata estrapolata in quanto l/0 si avvicina, ma non raggiunge mai l/max- La
concentrazione del substrato alia quale V0 è pari alla metà della l/maxcorrisponde a La curva che esprime la relazione tra [S] e F 0 (Figura 6.6)
Km, la costante dl Michaelis. La concentrazione dell'enzima In un esperimento ha lo stesso andamento nella maggior parte degli enzimi (è
come questo è In genere molto bassa e quindi [S] » [E], anche quando [S] è
simile ad un’iperbole rettangolare) ed è espressa algebrica­
bassa o relativamente bassa. Le unità riportate nella figura sono quelle tipiche
delle reazioni catalizzate da enzimi e servono ad illustrare meglio II significato di l/0 mente dall’equazione di Michaelis-Menten. I due studiosi
ed [S], (SI noti che la curva descrive parte di una Iperbole rettangolare, con un formularono questa equazione partendo dall’ipotesi di base
asintoto a l/max. Se la curva continuasse al di sotto dl [S] = 0, si avvicinerebbe ad
che la tappa limitante di una reazione enzimatica fosse la
un asintoto verticale ad [S] = —Km).
demolizione del complesso ES per formare l’enzima libero e
il prodotto. L’equazione è:
elevate, V0 aumenta in misura sempre minore in funzione
( 6 .6)
Fmax[S]
dell’aumento di [S], Alla fine si arriva ad un punto in cui gli
Km + [S]
aumenti di Fo in funzione di [S] diventano estremamente
piccoli. In questa regione più piatta della curva la velocità I termini importanti sono [S], F0, Fmax e una costante detta
della reazione si avvicina alla velocità massima, Fmax. costante di Michaelis o Km. Tutti questi termini possono es­
Il complesso ES è la chiave per la comprensione del compor­ sere valutati sperimentalmente.
tamento cinetico degli enzimi, esattamente come rappre­ Quella sopra è l’e q u a z io n e d i M ic h a e lis -M e n t e n ,
senta il punto di partenza della discussione sulla catalisi. l’e q u a z io n e d e lla v e lo c it à di una reazione a singolo sub­
L’andamento cinetico, riportato nella Figura 6.6, spinse nel strato catalizzata da un enzima. Questa è quindi la relazio­
1903 Victor Henri, sulla scia degli studi di Wurtz, a proporre ne quantitativa tra la velocità iniziale Fo, la velocità massi­
che un enzima si potesse combinare con una molecola del ma Fmax e la concentrazione iniziale del substrato [S], ter­
suo substrato per formare un complesso ES, la tappa neces­ mini tra loro correlati dalla costante di Michaelis, K m. Si
saria per iniziare la catalisi. Questa idea diventò una teoria noti che Kmè misurata con la stessa unità con cui è misura­
generale sull’azione degli enzimi ad opera in particolare di ta la concentrazione.
Leonor Michaelis e Maud Menten nel 1913. Essi ipotizzarono Dall’equazione di Michaelis-Menten emerge un’importante
che l’enzima per prima cosa si combinasse in modo reversi­ relazione numerica nel caso particolare in cui Fo sia esatta­
bile con il substrato, formando il complesso enzima-substra­ mente uguale a V2 Fmax (Figura 6.7). Quindi
to in una tappa relativamente veloce e reversibile:
Fnax _ Fmax [S]
fc, " Km + [SÌ
E + S ES (6.4)
k-ì Dividendo per otteniamo

H complesso ES si decompone poi in una seconda tappa 1 [S]


( 6 .8)
più lenta, che produce l’enzima libero e il prodotto della 2 Km+ [S]
reazione P:
Risolvendo per Km, abbiamo c h e ffm + [S] = 2[S], oppure

ES ^ E + P (6.5)
. Km = [S], quando F0 = ~ Fmax (6.9)
k-2

La seconda reazione (Equazione 6.5) è più lenta e quindi li­ Questa è una definizione molto utile e pratica di Km: Kmè
mita la velocità della reazione complessiva. La velocità della equivalente alla concentrazione del substrato a cui Fo è
reazione complessiva deve quindi essere proporzionale alla metà della Fmax. L’equazione di Michaelis-Menten (Equazio­
concentrazione delle specie chimiche che reagiscono nella ne 6.6) può essere trasformata algebricamente in una forma
seconda tappa, e cioè ad ES. ancora più utile per le determinazioni pratiche di Km e di
'978^88¿ÓSo6 4 # Í CAPÌTOLO8 Gli enzimi |PF

talmente, ma queste entità non sono indicative del nume­


ro, della velocità o della natura chimica delle tappe attra­
verso cui avviene la reazione. La cinetica dello stato stazio­
nario rappresenta ugualmente un sistema standard per va­
lutare, caratterizzare e confrontare l’efficienza catalitica di
enzimi diversi.

-> M o lti e n zim i c a ta lizz a n o re a zio n i a due


o p iù s u b s tra ti
Abbiamo visto come [S] influenzi la velocità di una semplice
reazione enzimatica (S —> P ) con un solo substrato. In molte
reazioni enzimatiche, però, due (e talvolta più) molecole di­
verse di substrato si legano all’enzima e partecipano alla rea­
[S] (mM) zione. Per esempio, nella reazione catalizzata dalla esochi-
nasi l’ATP e il glucosio sono i substrati, mentre l’ADP e il glu­
cosio 6-fosfato sono i prodotti:
FIOiIRA8.7 • Dipendenza della velocità iniziale dalla concentrazione del
substrato. Questo grafico mostra alcuni parametri cinetici che definiscono
l’andamento della funzione ad alta e bassa concentrazione di substrato [S]. A TP + glucosio —>AD P + glucosio 6-fosfato
Quando [S] è bassa, si ha che Km » [S] e il termine [S] al denominatore
dell’equazione di Michaelis-Menten (Equazione 6.6) diventa irrilevante;
Anche le velocità di queste reazioni a due substrati possono
l’equazione può essere semplificata In questo modo: Va = ^ [ S ] / / ^ , e l/0
presenta una dipendenza lineare da [S], cioè varia proporzionalmente all'aumento essere analizzate sulla base della teoria di Michaelis-Menten.
di [S], Ad alta [S], quando cioè [S] > > Km, il termine Km al denominatore L’esochinasi ha una caratteristica Kmper ciascuno dei suoi
dell’equazione di Mlchaelis-Menten diventa trascurabile e l’equazione può essere
substrati, pari a 0,4 mM per l’ATP e 0,05 mM per il glucosio.
semplificata come V0 = l/max; ciò spiega la parte piatta della curva quando [S] è
elevata, L’equazione di Mlchaelis-Menten verifica quindi la dipendenza della Le reazioni enzimatiche a due substrati comportano gene­
velocità Iniziale dalla concentrazione di substrato, e l’andamento della curva è ralmente il trasferimento di un atomo o di un gruppo funzio­
definito dai termini VmJ K m a bassa [S], e da l/max ad alta [S],
nale da un substrato all’altro. Queste reazioni procedono se­
guendo un percorso caratteristico, che può essere di diver­
sa natura. In alcuni casi ambedue i substrati si legano insie­
Fmax e, come vedrem o più avanti, per l’analisi dell’azione me e contemporaneamente in una regione precisa dell’en-
degli inibitori. zima, formando un complesso ternario non covalente (Figu­
ra 6.8a). I substrati si legano con una sequenza casuale o
"> I p a ra m e tri c in e tic i possono e ssere u tiliz za ti con un ordine specifico. In altri casi il primo substrato viene
p e r c o n fro n ta re le a ttiv ità d e g li e n zim i convertito in prodotto e si dissocia dall’enzima prima che si
L’equazione di Michaelis-Menten descrive il comportamen­ leghi il secondo substrato; in questo modo non si forma nes­
to cinetico di molti enzimi, e tutti gli enzimi che presentano sun complesso ternario, come nel meccanismo a ping-pong
una relazione di tipo iperbolico tra velocità della reazione o a doppio spostamento (Figura 6.8b).
catalizzata e concentrazione del substrato seguono la cin e­
tica d i M ic h a e lis-M e n te n . La regola pratica che Km = [S] -> Gli e n zim i possono esse re so g g e tti
quando F 0 = 1/2Fmax (Equazione 6.9) è valida per tutti gli ad in ib iz io n e re ve rsib ile o irre ve rs ib ile
enzimi che seguono la cinetica di Michaelis-Menten (l’ecce­ Gli inibitori enzimatici sono molecole che interferiscono con
zione principale è rappresentata dagli enzimi regolatori, la catalisi, rallentando o bloccando le reazioni enzimatiche.
che saranno esaminati alla fine di questo capitolo). Fmax e Gli enzimi catalizzano la quasi totalità dei processi cellulari e
Km sono parametri che si possono determinare sperimen­ quindi non sorprende che gli inibitori enzimatici siano tra i

( a ) Reazione enzimatica con formazione di un complesso ternario

Ordine casuale
FIGURA 0.8 » Meccanismi delle reazioni enzimatiche
^ ESl^ a due substrati, (a) L’enzima e ambedue i substrati
E E S ^ a --------» E + P i + P 2 interagiscono per formare un complesso ternario. Nel
meccanismo ordinato, ii substrato 1 deve legarsi prima che
^ ES2^ si leghi il substrato 2. Nel meccanismo casuale, i substrati
possono legarsi in qualunque ordine, (b) Si forma un
Ordinata S2 complesso enzima-substrato, uno dei prodotti abbandona
E + Si ESi ESiS2 --------> E + Pi + P2 ii complesso, l’enzima modificato forma un secondo
complesso con un’altra molecola di substrato, e il secondo
prodotto abbandona l’enzima modificato, rigenerando
l’enzima nello stato non modificato. Il substrato 1 può
( b ) Reazione enzimatica senza formazione di un complesso ternario
trasferire all’enzima un gruppo funzionale (per formare l’E'
covalentemente modificato), che viene poi trasferito al
Pi s2 substrato 2. Questo meccanismo è detto a ping-pong o a
E + Si ESi ^ E 'P j ^ E' E 'S 2 -------- > E + P 2 doppio spostamento.
881 CAPITOLO 6 Gli enzimi :© 978-88-0^06413-4

più importanti farmaci conosciuti. Per esempio, l’aspirina Un in ib it o r e c o m p e titiv o compete con il substrato per
(acetilsalicilato) inibisce l’enzima che catalizza la prima il sito attivo dell’enzima. Quando l’inibitore (I ) occupa il
tappa della sintesi delle prostaglandine, composti che inter­ sito attivo, impedisce il legame del substrato con l’enzima.
vengono in molti processi biologici, compresi quelli che par­ Molti inibitori com petitivi sono strutturalmente simili al
tecipano alla produzione del dolore. Lo studio degli inibito­ substrato e si combinano con l’enzima formando comples­
ri enzimatici ha fornito anche molte informazioni sui mecca­ si EI, senza dar luogo alla catalisi. Anche combinazioni re­
nismi di azione degli enzimi e ha contribuito a individuare versibili di questo tipo sono in grado di ridurre l’efficienza
alcune vie metaboliche. Esistono due tipi dì inibizione enzi­ dì un enzima. Considerando la geometria molecolare degli
matica: l’inibizione reversibile e l’inibizione irreversibile. inibitori, possiamo individuare quali sono le parti del sub­
strato che si legano all’enzima. L’inibizione competitiva può
In ib iz io n e r e v e r s ib ile Un tipo comune di inibizione re­ essere analizzata quantitativamente per mezzo della cine­
versibile è chiamata inibizione competitiva (Figura 6.9). tica dello stato stazionario. In presenza di un inibitore
competitivo l’equazione di Michaelis-Menten (Equazione
6.6) diventa
( a ) Inibizione competitiva
UmaxtS]
( 6 .10)
CiKm + [S]

dove

[E] [Il
a = 1 + IÍL e K¡ =
K, [EI]

L’Equazione 6.10 descrive una importante caratteristica del­


l’inibizione competitiva. La variabile aKm, che corrisponde
alla K jb. osservata in presenza dell’inibitore, spesso viene
( b ) Inibizione incompetitiva
chiamata “Kmapparente”.

E+ S Poiché l’inibitore si lega reversibilmente all’enzima, la com­


petizione può essere superata semplicemente aumentan­
do la concentrazione del substrato. Quando il valore di [S]
è più elevato di [I], la probabilità che una molecola di ini­
bitore si leghi all’enzima diminuisce sensibilmente, per cui
la reazione tenderà normalmente a Umax. Quando la [S] a
cui V0 = '^Umax, ü valore Kmapparente aumenta in presen­
za dell’inibitore di un fattore pari ad a. Questo aumento
della Km (apparente), insieme alla possibilità di raggiunge­
re ugualmente Umax, indica che l’inibizione è di tipo com­
petitivo.
Due altri tipi di inibizione reversibile, rinibizione incompe­
titiva e l’inibizione mista, si osservano praticamente solo
( c ) Inibizione mista con gli enzimi a due o più substrati, ma spesso vengono ri­
feriti anche a enzimi che catalizzano reazioni ad un sub­
E+ S
+ strato. L’in ib ito r e in c o m p e titiv o (Figura 6.9b) si lega ad

I un sito distinto da quello del substrato e, contrariamente


aU’inibitore competitivo, solo al complesso ES. In presenza
di un inibitore incompetitivo l’equazione di Michaelis-Men­
ten diventa
El + S
FnaJS]
F0 = ( 6 . 11)
Km + a'[S]

dove

a' = 1 + I1! e
, _ [ES][I]
K'i 1 [ESI]

Come descritto dall’Equazione 6.11 ad elevate concentra­


FIGURA 6.9 • Ite tipi di inibizione enzimatica reversibile, (a) Gli inibitori
zioni di substrato Vo si avvicina a Fmax/a'. Quindi, l’inibito-
competitivi si legano al sito attivo dell'enzima; Ai è la costante di equilibrio della
reazione di dissociazione dei complesso E. (b) Gli inibitori incompetitivi si legano re incompetitivo diminuisce la Umax. Anche la Kmapparen­
in siti diversi da quello del substrato, ma solo al complesso ES; K{ è la costante te ha un valore più basso di quello normale, perché la [S]
di equilibrio della reazione di dissociazione del complesso ES. (c) Gli inibitori
necessaria per raggiungere la metà della Umax diminuisce
misti si legano in siti diversi da quello del substrato, ma possono legarsi sia a E
sla a ES. del fattore a'.
©978-88-08-06413-4 CAPITOLO 6 Gli enzimi i 89

Anche un inibitore misto (Figura 6.9c) si lega ad un sito


diverso dal sito attivo, ma può legarsi sia ad E, sia ad ES.
L’equazione che descrive rinibizione mista è

VnmxlS]
6 12)
( .
°'-Km + «'[S ]
dove a ed a ' sono definiti come sopra. Un inibitore misto in
genere modifica i valori di Kme di Vmax. Nel caso sperimen­
talmente piuttosto raro in cui a e a ' siano uguali, questa ini­
bizione viene definita non competitiva. Se si esamina
l’Equazione 6.12, si vedrà che l’inibitore non competitivo ri­
duce il valore di Umax, ma non quello di Km.
L’equazione 6.12 è l’espressione generale per gli effetti degli
FIGURA 6.11 • Attività di due enzimi in funzione del pH.
inibitori reversibili che ci riconduce alle espressioni per la
Le due curve sono state ottenute riportando le velocità iniziali delle reazioni,
inibizione competitiva e incompetitiva quando a ' = 1,0 o misurate in tamponi a pH diverso. Poiché il pH è una funzione logaritmica, una
a = 1,0, rispettivamente. differenza di una unità corrisponde ad una variazione di 10 volte della [H+].
Anche i valori di l/0 sono stati riportati utilizzando una scala logaritmica. Il pH
ottimale dell’attività di un enzima In genere è vicino al pH deH’amblente in cui
Inibizione irreversibile Gli inibitori irreversibili si le­ l’enzima si trova normalmente. La pepsina, che idrolizza alcuni legami peptidicl
gano covalentemente, eliminando così gruppi funzionali es­ nelle proteine durante la fase della digestione che avviene nello stomaco, ha un
pH ottimale di circa 1,6 ed il pH del succo gastrico varia da 1 a 2. La glucosio
senziali all’attività degli enzimi, o formano associazioni non
6-fosfatasl degli epatociti, responsabile del rilascio del glucosio nel sangue, ha
covalenti particolarmente stabili. La formazione di un lega­ un pH ottimale intorno a 7,8 ed il pH del citosol degli epatociti è di circa 7,2.
me covalente tra un inibitore irreversibile e l’enzima è una
condizione abbastanza comune. La Figura 6.10 mostra da basi deboli e possono quindi svolgere funzioni che dipen­
l’esempio del diisopropilfluorofosfato. dono dal loro stato di ionizzazione. Il gruppo ionizzato po­
Una speciale classe di inibitori irreversibili è costituita dagli trebbe avere qualche m olo essenziale nel mantenimento
inattivatori suicidi. Questi composti sono relativamente della struttura della proteina. Per esempio, la rimozione di
stabili fino a che non si legano al sito attivo di uno specifico un protone dalle catene laterali di un residuo di His potreb­
enzima, essendo convertiti in composti molto reattivi che si be eliminare un’interazione ionica essenziale per la stabiliz­
combinano irreversibilmente con l’enzima. Gli inattivatori zazione della conformazione attiva dell’enzima. Sono molto
suicidi hanno un ruolo importante nella progettazione ra­ meno comuni i casi in cui la dipendenza dal pH è dovuta alla
zionale dei farm aci, un approccio moderno che serve ad titolazione (il rilascio o il legame di un protone) di un grup­
ottenere nuovi farmaci basandosi sulla conoscenza dei mec­ po appartenente al substrato.
canismi di reazione degli enzimi.
L’ambito del pH in cui si hanno queste variazioni dell’attività
enzimatica dipende dalla natura degli amminoacidi coinvol­
L’attività enzimatica dipende dal pH ti (vedi la Tabella 3.1). Per esempio, una variazione dell’atti­
Gli enzimi hanno un pH ottimale, o un ambito di pH ottima­ vità enzimatica ad un pH vicino a 7,0 è dovuta spesso alla ti­
le, in cui la loro attività diventa massima (Figura 6.11) ; a va­ tolazione di un residuo di His. L’effetto del pH deve essere
lori di pH più bassi o più elevati l’attività enzimatica tende a
interpretato però con qualche cautela. Nell’ambiente molto
diminuire. Questo comportamento non è sorprendente; le compatto delle proteine, il valore di p ifa delle catene latera­
catene laterali degli amminoacidi possono agire da acidi e li dei residui amminoacidici può variare considerevolmente.
Per esempio, un residuo di Lys nell’enzima acetoacetato de­
9 c h 3 carbossilasi ha un valore di pK&di 6,6 (il valore normale è
Il /
— CH2— OH + F — P — O— CH 10,5) a causa degli effetti elettrostatici di cariche positive
.c,,.. 1953 I \ vicine.
(Ser -> O CHa

h 3c h c h 3
DIFP
6.4 Esempi di reazioni enzimatiche
^ F~ + H +
Abbiamo osservato in precedenza che l’enorme potere ca­
o /CHg talitico degli enzimi dipende da una serie di eventi che
II vanno dal legame del substrato alla stabilizzazione dello
-CH 2— O—P — 0 - ■CH
\ stato di transizione e all’uso di diversi tipi di catalisi. Anche
0 CH,
se per nessun enzima sono stati identificati tutti i dettagli
I
del meccanismo d’azione, uno sguardo ai processi catalitici
H aC H CHS di quattro enzimi tra i meglio studiati può chiarire molti di
questi aspetti. La Tabella 6.5 riporta le tappe principali di
FIGURA 6.10 • Inibizione irreversibile. La reazione della chlmotrlpsina con II questi meccanismi per ogni enzima.
diisopropilfluorofosfato (DIFP), che modificando la Ser195 Inibisce
Irreversibilmente l’enzima. Questa osservazione ha condotto alia conclusione Ogni enzima accelera la reazione che catalizza utilizzando
che la Ser195 è II residuo di Ser fondamentale nel sito attivo della chlmotrlpsina. un programma specifico codificato nella sua struttura.
9 0 1 CAPITOLO B Gli enzimi ©978-88-08-06413-4

TABELLA 6.5 Tappe significative del meccanismo d’azione di chimotripsina, esochinasi, enolasi e lisozima
Enzima Classe Meccanismo d’azione

Chimotripsina Idrolisi (proteasi) Catalisi acido basica, catalisi covalente


Esochinasi Trasforasi (chinasi ) Adattamento indotto
Enolasi \ : / Liasi ■' Catalisi da ioni metallici :
Lisozima , Idrolaai - Catalisi acido basica, catalisi covalente

Nota: tutti gli enzimi sfruttano l’energia di legame liberata dall’associazione al substrato e la stabilizzazione dello stato di transizione.

6.5 Enzimi regolatori -> Gli e n z im i a llo s te ric i le g a n o m o d u la to ri


Come si è visto nel Capitolo 5, le proteine allosteriche
Nel metabolismo cellulare, gruppi di enzimi catalizzano rea­ hanno “forme diverse” o conformazioni indotte dal legame
zioni sequenziali per far procedere processi metabolici, dei modulatori. Lo stesso concetto è applicabile a certi en­
come la demolizione a molte tappe del glucosio in lattato o zimi regolatori nei quali le variazioni conformazionali, in­
la sintesi di un amminoacido da un precursore semplice. In dotte da uno o più modulatori, interconvertono form e
questi sistemi multienzimatiei il prodotto di reazione di un meno attive e form e più attive dell’enzima. I modulatori
enzima diventa il substrato della reazione successiva. degli enzimi allosterici possono agire da inibitori o da sti­
La maggior parte degli enzimi di una data via metabolica ob­ molatori. Spesso il modulatore è lo stesso substrato. I mo­
bedisce alla cinetica di Michaelis già descritta. Ciascuna via, dulatori allosterici non devono essere confusi con gli inibi­
però, include uno o più enzimi che hanno un notevole effet­ tori incompetitivi e misti.
to sulla velocità delTintera sequenza di reazioni. L’attività ca­ Le proprietà degli enzimi allosterici differiscono notevol­
talitica di questi enzimi regolatori aumenta o diminuisce mente da quelle degli enzimi non regolatori. Alcune diffe­
in risposta a determinati segnali. La modulazione della ve­ renze sono strutturali. Oltre ai siti attivi, gli enzimi alloste­
locità delle reazioni catalizzate dagli enzimi regolatori, e rici in genere possiedono uno o più siti regolatori, o allo­
quindi della velocità dell’intera sequenza metabolica, per­ sterici, cioè siti per il legame del modulatore (Figura 6.12).
mette alla cellula di adeguarsi alle richieste di energia e di Così come il sito attivo di un enzima è specifico per il suo
biomolecole necessarie per la crescita e per la riparazione substrato, così ciascun sito regolatore è specifico per il suo
dei darmi subiti. modulatore. Gli enzimi che interagiscono con diversi mo­
Nella maggioranza dei sistemi multienzimatiei, il primo enzi­ dulatori in genere possiedono siti di legame specifici per
ma della sequenza è un enzima regolatore. Per un enzima è ognuno di essi.
questa la giusta posizione per regolare il flusso della via me­
tabolica; se venissero catalizzate anche poche reazioni ini­
[s > Substrato
ziali della sequenza, verrebbe consumata inutilmente ener­
@ Modulatore positivo
gia o verrebbero prodotti metaboliti inutili.
Le attività degli enzimi regolatori possono essere modulate
in vari modi. Il funzionamento degli enzimi allosterici si Enzima meno attivo
basa sul legame reversibile, non covalente di composti re­
golatori, chiamati modulatori allosterici o effettori al­
losterici; in genere si tratta di piccoli metaboliti o coiattoli.
A ltri enzimi sono regolati per modificazione covalente
reversibile. Entrambe le classi di enzimi regolatori sono
costituite per lo più da proteine con molte subunità. In al­ Enzima più attivo
cuni casi il sito (o i siti) regolatore ed il sito attivo si trovano
su subunità distinte.
La crescita e la sopravvivenza cellulare dipendono dall’uso
efficiente delle risorse energetiche, reso possibile dagli en­
zimi regolatori. Non esiste una regola generale che governi Complesso
enzima
i differenti tipi di regolazione nei diversi sistemi biologici. attivo-substrato
La regolazione allosterica (non covalente) perm ette una
precisa modulazione delle vie metaboliche, che devono es­ FIGURA 6.12 • Interazioni tra le subunità In un enzima allosterico e
sere continuamente operative, ma a differenti livelli di at­ interazioni con inibitori e attivatori. In molti enzimi allosterici il sito di
tività in base alle richieste cellulari. La regolazione per mo­ legame del substrato e il sito (o i siti) di legame del modulatore (dei modulatori)
sono su subunità diverse, quella catalitica (C) e quella regolatrice (R),
dificazione covalente può essere del tipo “tutto o niente”, rispettivamente, il legame di un modulatore (M) positivo (stimolatorio) a un sito
come nel caso della scissione proteolitica, oppure può per­ specifico sulla subunità regolatrice è comunicato ai sito attivo mediante una
m ettere sottili variazioni dell’attività enzimatica. In uno modificazione conformazionale, Questa modificazione rende la subunità
catalìtica attiva e capace di legare il substrato (S) con un'affinità più elevata. In
stesso enzima regolatore possono coesistere diversi tipi di seguito alia dissociazione del modulatore dalla subunità regolatrice, l’enzima
regolazione. ritorna alla forma inattiva o meno attiva.
«9 9/8 !Ì8 08-06413 -'! CAPITOLO 6 Gli enzimi 191

Gli enzimi allosterici sono in genere di maggiori dimensioni via anabolica. Si tratta di un esempio di inibizione allosteri-
e più complessi degù enzimi non allosterici. La maggior ca. Nessun altro intermedio della via metabolica inibisce la
parte contiene due o più subunità. treonina deidratasi, e nessun altro enzima è inibito dall’iso-
leucina.
-> In m o lte vie m e ta b o lich e le ta p p e re g o la te
sono ca ta lizz a te d a e n z im i a llo s te ric i -> Gli e n zim i a llo s te ric i non seguono il co m p o rta m e n to
In alcuni sistemi multienzimatiei, gli enzimi regolatori sono d e s c ritto d a lla cin e tic a d i M ic h a e lis -M e n te n
specificamente inibiti dai prodotti terminali della via meta­ La relazione tra Vqed [S] degli enzimi allosterici non obbe­
bolica, se la concentrazione di questi ultimi è più elevata ri­ disce alla cinetica di Michaelis-Menten. Gli enzimi allosteri­
spetto al fabbisogno cellulare. Quando la velocità dell’enzi­ ci mostrano curve di saturazione con il substrato quando la
ma regolatore diminuisce, gli enzimi successivi funzioneran­ [S] è sufficientemente elevata, però per alcuni di essi la
no a velocità ridotte, perché la concentrazione dei loro sub­ curva di V0in funzione di [S] (Figura 6.14) ha una forma si­
strati è drasticamente diminuita. Quindi la velocità di forma­ gmoide, invece che iperbolica, come si osserva negli enzimi
zione del prodotto finale della via metabolica sarà conforme non regolatori. Dalla curva sigmoide di saturazione si può ri­
alle necessità cellulari. Questo tipo di regolazione è detto in i­ cavare il valore di [S], corrispondente ad una V0 pari alla
bizion e re tro a ttiv a (a feedback). L’aumento della concen­ metà della velocità massima, ma non possiamo equipararla
trazione del prodotto terminale rallenta la velocità dell’inte­ alia .Érm, perché l’enzima non segue la cinetica di Michaelis-
ro processo. Menten. Viene allora usato il simbolo [S]0,5o Ko$ per indica­
Uno degli esempi più noti di inibizione retroattiva è quello re la concentrazione del substrato corrispondente alla metà
del sistema enzimatico batterico che catalizza la conversio­ della velocità massima di una reazione catalizzata da un en­
ne della L-treonina in L-isoleucina in 5 tappe (Figura 6.13). zima allosterico (Figura 6.14).
In questo sistema il primo enzima, la treonina deidratasi, è La cinetica sigmoide in genere riflette la presenza di intera­
inibito dalFisoleucina, il prodotto dell’ultima reazione della zioni cooperative fra le subunità della proteina enzimatica.
In altre parole, la variazione della struttura di una subunità
COO“ viene tradotta in variazioni strutturali delle subunità adia­
+ I centi. Questo effetto è mediato da interazioni non covalenti
H gN — C—H
I L-Treonina che si verificano all’interfaccia tra diverse subunità. Il princi­
H— C— OH pio è ben illustrato dal legame dell’ossigeno con una protei­
I
CHo na non enzimatica, remoglobina.
Gli enzimi allosterici om otropici, cioè quelli in cui il substra­
to e il modulatore sono identici, generalmente sono proteine
con più subunità in cui lo stesso sito funge da sito attivo e da
sito regolatore. Il substrato è un modulatore positivo (attiva­
tore) e il legame di una molecola di substrato ad un sito di le­
game variala conformazione dell’enzima e favorisce il legame
di altre molecole di substrato. Ciò è in linea con la curva si­
gmoide, invece che iperbolica, che mette in relazione V0 con
concentrazioni crescenti del substrato.
Per gli enzimi allosterici e terotro p ici, i cui modulatori sono
metaboliti diversi dal substrato, è difficile formulare genera­
lizzazioni sull’andamento delle curve di saturazione. Un atti­
vatore può cambiare la curva, facendola assomigliare di più a
D una curva iperbolica, facendo diminuire nel contempo /f0,6.
ma senza variare Vmax. Ne risulta un aumento della velocità
di reazione ad una concentrazione fissa di substrato (il valo­
re di Vt) è più elevato ad ogni valore di [S] ; Figura 6.14b, curva
i COO"
1 + I superiore). Altri enzimi allosterici eterotropici rispondono
! h 3n - c - h all’attivatore con un aumento della Vmax, ma variando di poco
i I
v — H — C — C H 3 L-Isoleucina la isT0,6 (Figura 6.14c).

CH2
-> A lc u n i e n zim i so n o re g o la ti da m o d ific a z io n i co va le n ti
c h 3 re v e rs ib ili
In un’altra importante classe di enzimi regolatori l’attività è
FIGURA 6.13 • Inibizione a feerfbac/i (inibizione retroattiva).
modulata da modificazioni covalenti di uno o più residui am-
La conversione della L-treonlna In L-isoleucina è catalizzata da una sequenza
di cinque enzimi (da E, a E5). La treonina deidratasi (Ei) viene inibita minoacidici della molecola enzimatica. Nelle proteine sono
allosterlcamente e In modo specifico dalla L-isoleucina, Il prodotto finale della state descritte più di 500 diverse modificazioni covalenti.
sequenza, ma non dagli altri quattro intermedi (da A a D). L’Inibizione retroattiva
Per modificare le proteine vengono utilizzati i gruppi fosfo-
è Indicata dalla freccia tratteggiata posta in senso contrario alle altre e dal
simbolo ® a livello della freccia di reazione della treonina deidratasi, una rilico, acetiiico, adenilico, uridilico, metilico, ammidico, car-
convenzione adottata In tutto il volume, bossilico, miristoilico, palmitoilico, preniiico, ossidrilico, sol-
9 2 1 CAPÌTOLO B Gli enzimi : ©:97è-88-08-064Ì3#i

K$ 1 Z o ,5

[S] ( ium) [S] Orni)

FIGURA 6.14 • Curve della velocità in funzione della concentrazione del


substrato per alcuni tip! di enzimi allosterici rappresentativi. Tre esempi
di risposte complesse degli enzimi allosterici ai loro modulatori, (a) Curva
sigmoide di un enzima omotropico, In cui il substrato funge anche da
modulatore positivo (stimolatore), o attivatore, SI noti la somiglianza con la curva
di saturazione dell’ossigeno dell’emoglobina (vedi la Figura 5.10). (b) Effetti del
modulatore positivo (+ ) e negativo (-) su un enzima allosterico in cui varia % ,
senza variazioni di l/max. La curva centrale corrisponde alla relazione tra velocità
e concentrazione del substrato in assenza di modulatori, (c) Un tipo meno
[S] (imi) comune di modulazione, in cui varia ma % rimane pressoché costante.

forico e l’adenosina difosfato ribosio (Figura 6.15). La mo­ che sono poi riconosciuti da specifiche proteina chinasi.
dificazione covalente di alcune proteine può avvenire anche La regolazione mediante fosforilazione è spesso piuttosto
mediante il legame di altre proteine. Questi gruppi vengono complicata. Alcune proteine hanno più sequenze consenso.
inseriti o rimossi dagli enzimi regolatori ad opera di altri en­ riconosciute da diverse proteina chinasi, ognuna delle quali
zimi. Quando viene modificato un suo residuo amminoacidi- può fosforilare la proteina e alterare la sua attività enzimati­
co, l’enzima acquista così un nuovo amminoacido, con pro­ ca; ogni modificazione si riflette poi sull’attività dell’enzima.
prietà diverse. L’introduzione di una carica può alterare le Queste fosforilazioni multiple rappresentano un meccani­
proprietà locali dell’enzima e indurre un cambiamento di smo estremamente efficace per la regolazione dell’attività
conformazione. L’introduzione di un gruppo idrofobico può enzimatica.
favorire l’associazione con una membrana. Alcune volte le Affinché la fosforilazione sia un meccanismo di regolazio­
variazioni strutturali sono considerevoli e possono essere ne realm ente utile, deve essere reversibile. In genere i
determinanti per la funzione dell’enzima modificato. gruppi fosforici sono aggiunti e rimossi da enzimi diversi e
Il numero, nonché il tipo, di modificazioni a cui vanno incon­ i due processi possono quindi essere regolati l’uno indi­
tro gli enzimi è molto elevato, e quindi non è possibile consi­ pendentem ente dall’altro. Le cellule contengono una fa­
derarle in dettaglio. miglia di fosfoproteina fosfatasi che idrolizzano specifici
La fosforilazione è il tipo più importante di modificazione re- esteri fosforici Ser-(P), Thr-(P) e TVr-(P), rilasciando fosfa­
golatoria. È probabile che un terzo di tutte le proteine euca- to inorganico. Le fosfoproteina fosfatasi oggi note agiscono
riotiche siano fosforilate, e che quindi uno (o anche più di solo su un sottogruppo di proteine fosforilate e mostrano
uno) di questi eventi di fosforilazione abbia luogo durante un una specificità di substrato inferiore a quella delle proteina
processo regolatorio. Alcune proteine hanno un solo residuo chinasi.
fosforilato, altre ne hanno diversi, alcune possono arrivare ad
avere addirittura dozzine di gruppi fosforilati. Questo tipo di -> Alcuni enzimi e altre proteine sono regolati
modificazione covalente è fondamentale per un gran numero per scissione proteolitica di un precursore enzimatico
di vie di regolazione. Nel processo di attivazione di alcuni enzimi proteolitici, un
precursore inattivo, chiamato z im o ge n o , viene scisso in
-> Le fosforilazioni multiple permettono modo da generare l’enzima attivo. Molti enzimi proteolitici
un accurato controllo della regolazione (proteasi) dello stomaco e del pancreas sono regolati attra­
I siti fosforilabili all’interno delle proteine sono localizzati verso questo meccanismo. La chimotripsina e la tripsina
in motivi strutturali comuni, chiamati sequenze consenso, vengono inizialmente sintetizzate sotto forma di zimogeno
«9/«-8cì~08-C6413-4 CAPITOLO fi Gli enzimi ,\

Modificazione covalente
(residui bersaglio)

Fosforilazione Ubiquitinazione
Ciyr, Ser, Thr, His)
^ HS- 0
ATP ADP 0
V / II
—P — 0 ~
Ubiquitina attivata
I
0“
Adenililazione
OVr)
Ubiquitina attivata 0
ATP PP[

— P — 0 — GH

ADP-ribosilazione
(Arg, Gin, Cys, diftamide: una His modificata)

Acetilazione
(Lys, a-ammino gruppo [amminoterminale])

Acetil-CoA HS-CoA q

Miristoilazione
(a-ammino gruppo [amminoterminale])

Miristoil-CoA HS-CoA 0
II Metilazione
-C (CH2) 1: -CHa
(G iu )
5-adenosil- 5-adenosil-
metionina omocisteina

FIGURA 6.15 • Alcune reazioni di modificazione di enzimi, -CH3

chimotripsinogeno e tripsinogeno (Figura 6.16). La rottu­ ca, che hanno un’elevata affinità per il sito attivo dell’enzi­
ra di specifici legami peptidici produce una modificazione ma.
strutturale e conformazionale, che espone il sito attivo del­
Le proteasi non sono le sole proteine che vengono attivate
l’enzima. Poiché questo tipo di attivazione è irreversibile,
per proteolisi. Negli altri casi, però, i precursori non sono
sono necessari altri meccanismi per inattivare questi enzi­ detti zimogeni, ma più generalmente p r o p r o t e in e o p r o -
mi. Le proteasi sono inattivate da inibitori di natura protei­ enzim i.

Chimotripsinogeno Tripsinogeno
(inattivo) (inattivo)
1
■4 i r 1
Val-(Asp ) 4 -Lys - Ile -

Tr-Chimotripsina 4.^V al-(A sp ) 4 -Lys


(attiva)
Tripsina
1 16 16 (attiva)
Arg Ilo 7 245
t
Ile
(autolisi)
FIGURA 6.16 • Attivazione proteolitica degli zimogeni.
C Ser 14-A rg 15 La figura mostra la formazione della chlmotrlpslna e della tripsina
+ Thr 147-Asn 148 dai loro zimogeni, il chimotripsinogeno e II tripsinogeno. Le barre rappresentano
le sequenze amminoacldlche delle catene polipeptidiche, con i numeri che
a-Chimotripsina indicano le posizioni dei residui coinvolti nel processo (il residuo
(attiva) amminoterminale corrisponde ai numero 1). I residui situati alle estremità dei
1 1-3 16 146 149 245 polipeptidi generati per proteolisi sono indicati sotto le barre. Si noti però che
nelle forme attive finali mancano i numeri corrispondenti ad alcuni residui,
Leu Ile Tyr A^a
Le tre catene polipeptidiche della chimotripslna, generate dalla proteolisi (A, B e
A B C C) sono unite tra loro da ponti disolfuro,
9 4 1 CAPITOLO 6 Gli enzimi •O 97ÍV 88 08-06413-1

- Una interessante discussione sull’origine dell’energia di lega­


TERMINI CHIAVE
me, e su come viene utilizzata.
I termini in grassetto sono definiti nel glossario. Hansen, D.E. e Raines, R.T. (1990) Binding energy and enzyma­
tic catalysis. J. Chem. Edite. 6 7 , 483-489.
adattamento indotto 84 Un buon punto di partenza per uno studente per approfondire
apoenzima 80 lo studio dei principi.
apoproteina 80 ...__ Kirby, A.J. (2001) The lysozyme mechanism sorted - after 50
catalisi acido-base generale 84 years. Nat. Struct. Biol. 8, 737-739.
catalisi acido-base specifica 84 "~~UnaÙQteressante discussione sul potere catalitico degli enzimi,
catalisi covalente 85 e sui principi che li governano.
cinetica enzimatica 85 Kraut, D.A., Carroll, K.S., e Herschlag, D. (2003) Challenges
coenzima 80 in enzyme mechanism and energetics. Annu. Rev. Biochem. 72,
cofattore 80 517-571.
costante di equilibrio (TTea) 83 ■ Un buon sommario sui principi della catalisi enzimatica, su
energia di attivazione (A G * ) 82 quello che sappiamo attualmente e su quello che non è anco­
energia di legame (A G b ) 83 ra ben chiaro.
enzima 80 Monod, J., Changeux, J.-P., e Jacob, F. (1963) Allosteric pro­
enzima allosterico 90 teins and cellular control systems. J. Mol. Biol. 6 ,306-329.
enzima regolatore 90 ■ * Un classico lavoro che introduce il concetto di regolazione al-
equazione di Michaelis-Menten 86 losterica.
gruppo prostético 80
inattivatore suicida 89
inibitore competitivo 88 PR0RLEM I
inibitore incompetitivo 88
inibitore misto 89 1. Aumento della velocità determinato daU’ureasi.
inibizione irreversibile 89 L’enzima ureasi aumenta la velocità di idrolisi dell’urea
inibizione non competitiva 89
a pH 8,0 e a 20 °C di un fattore pari a IO14. Se una data
quantità di ureasi può idrolizzare completamente ima
inibizione retroattiva 91
certa quantità di urea in 5 minuti a 20 °C e a pH 8,0,
inibizione reversibile 88
quanto tempo impiegherà l’urea a idrolizzarsi comple­
intermedio di reazione 82
tamente nelle stesse condizioni in assenza di ureasi?
modulatore allosterico 90
Supponete che entrambe le reazioni abbiano luogo in
oloenzìma 80
ambienti sterili in modo che non sia possibile la scissio­
sito attivo 81
ne dell’urea da parte dei batteri.
specificità 83
stato basale 82 2. Necessità dei siti attivi degli enzimi. La carbossi-
stato di transizione 82 peptidasi, che stacca uno dopo l’altro i residui ammi-
stato stazionario 86 noacidici carbossiterminali dai suoi substrati peptidici,
substrato 81 è costituita da una singola catena polipeptidica di 307
tappa che limita la velocità 82 residui. I due gruppi catalitici essenziali del sito attivo
variazione di energia libera standard (A G ° ) 82 sono le catene laterali dell’Arg 145 e del Giu270.
velocità iniziale, V0 85 (a ) Se la carbossipeptidasi fosse u ria elica perfetta, quanto
Fmajt 86 (listerebbero (in angstrom) l’A rg 146 e il Giu270? (Sugge­
zimogeno 93 rimento: vedi la Figura 4.2a.)
(b ) Potete spiegare perché questi due amminoacidi posso­
no catalizzare una reazione che avviene in uno spazio di
pochi angstrom?
ULTERIORI LETTURE
3. Effetto degli enzimi sulle reazioni catalizzate.
Babbitt, P.C. e Gerlt, J.A. (1997) Understanding enzyme super- Quali dei seguenti effetti sarebbero prodotti da un en­
families: chemistry as the fundamental determinant in the evolu­ zima che catalizza la reazione semplice
tion of new catalytic activities. J. Biol. Chem. 27, 30591-30594.
'< Una interessante discussione sull’evoluzione degli enzimi con ki 1P1
S P dove K' = — ?
differenti specificità catalitiche, e sull’uso di un limitato reper­ fc, q [S]
torio di motivi strutturali proteici.
(a ) Diminuzione del valore d i i f 'eq; (b ) aumento di kg,
Evolution of Catalytic Function. (1987) Cold Spring Harb. Symp.
(c ) aumento di -fiT'eq.; (d ) aumento di AG*; (e ) diminu­
Quant. Biol. 52
zione di AG*; ( f ) A G '0più negativo; (g ) aumento di k2.
BBS Una raccolta di eccellenti lavori sui fondamenti dell’enzimolo­
gia. Utile ancora oggi. 4. Relazione tra velocità della reazione e concentra­
Friedmann, H. ( a cura d i) (1981) Benchmark Papers in Bio­ zione del substrato: equazione di Michaelis-Men­
chemistry, Voi. 1: Enzymes, Hutchinson Ross Publishing Company, ten.
Stroudsburg, PA. (a) A quale concentrazione di substrato un enzima che ha
Una raccolta di lavori classici sulla chimica degli enzimi, com­ una fecat di 30 s_1 e unaifmdi 0,005 m esprimerà un quar­
mentati dal curatore. Estremamente interessante. to della sua velocità massima?
Gutteridge, A. e Thornton, J.M. (2005) Understanding nature’s (b ) Determinate la frazione di Umax che avrete quando [S] è
catalytic toolkit. Trends Biochem. Sci. 30, 622-629. 1/2 Km, 2 ATme 10 Km.
:à i 9 7 8 -8 8 -0 8 -0 6 4 1 3 -4 CAPITOLO 6 Gli enzimi 195

(c ) Un enzima che catalizza la reazione X Y viene isola­ 8. In ib iz io n e ir r e v e r s ib ile di u n enzim a. Molti enzimi
to da due specie batteriche. Gli enzimi raggiungono la sono inibiti irreversibilmente dagli ioni di metalli pesan­
stessa velocità massima, ma hanno diverse Kmper il sub­ ti come Hg2+, Cu2+ o A g +, che possono reagire con
strato X. L’enzima A ha unalYmpari a 2,0 ¡jcM, mentre l’en­ gruppi sulfidrilici essenziali formando mercapturi:
zima B ha una Kmpari a 0,5 pM. La figura che segue mo­
stra la cinetica delle reazioni condotte a pari concentra­ Enz— SH + A g + -> Enz-S-Ag + H +
zioni dei due enzimi, e a [X] pari a 1 pM. Quale curva cor­
risponde all’enzima A, e quale all’enzima B? L’affinità dell’A g + per i gruppi sulfidrilici è così grande
che A g + può essere usato per titolare quantitativamen­
te i gruppi sulfidrilici. A 10 mL di una soluzione conte­
nente 1,0 mg/mL di un enzima puro è stato aggiunto ab­
bastanza A g N 0 3da inattivare completamente l’enzima.
Sono state necessarie 0,342 pmoli di A gN 0 3. Calcolate
il peso molecolare m inim o dell’enzima. Perché il valo­
re ottenuto in questo modo si riferisce solo al peso mo­
lecolare minimo?

7. p H o ttim a le d e l liso z im a. Il sito attivo del lisozima


contiene due residui amminoacidici essenziali per la ca­
talisi: il Giu35 e l’Asp52.1 valori del pfsTa delle catene late­
rali carbossiliche di questi due residui sono rispettiva­
mente 5,9 e 4,5. Qual è lo stato di ionizzazione (proto­
nato o deprotonato) di ogni residuo, a pH 5,2, il pH otti­
male del lisozima? Come possono gli stati di ionizzazio­
ne di questi due residui amminoacidici spiegare l’anda­
S. V a lu tazion e d e lla F max e d e lla K m. Anche se sono di­ mento, mostrato sotto, della curva dell’attività catalitica
sponibili metodi grafici per una determinazione accura­ del lisozima in funzione del pH?
ta dei valori di Fmax e Kmdi una reazione catalizzata da
un enzima, questi valori possono essere ricavati facil­
mente osservando l ’andamento della F 0 in funzione
della [S] crescente. Determinate i valori approssimati di
Umax e di Kmdi una reazione catalizzata da un enzima
per la quale sono stati ottenuti i seguenti dati.

[S] ( m) Vq(pM/min)

2,5 X IO“ 6 28
4,0 X IO“ 6 40
1 X IO “ 6 70
2 X IO “ 6 95
4 X io - 5 112
1 X IO “ 4 128
2 X IO “ 3 139 pH
1 X IO“ 2 140
i5:"v; v

Mi sentirei più ottimista sul suo futuro se l’uomo passasse


meno tempo a cercare di dimostrare che può sottomettere la
natura e più tempo a gustarne la bellezza e a rispettarne
l’anzianità.
E.B.White, “Coon Tree", 1977

Carboidrati
e glicobiologia
saccaridi più comuni terminano con il suffisso “-osio”. Nelle
7.1 Monosaccaridi e disaccaridi 96
cellule la maggioranza degli oligosaccaridi che contengono
7.2 Polisaccaridi 101
tre o più unità non esistono isolati, ma sono legati a moleco­
7.3 Glicoconiugati: proteoglicani, glicoproteine le non glucidiche (lipidi e proteine) nei glicoconiugati.
e glicolipidi 103 I p o lis a c c a r id i sono polimeri di zuccheri che contengono
7.4 1carboidrati come molecole informazionali: più di venti unità monosaccaridiche; alcuni ne contengono
il codice saccaridico 104 centinaia o migliaia. I polisaccaridi come la cellulosa sono
catene lineari, altri come il glicogeno sono invece ramificati.
carboidrati sono le molecole più abbondanti sulla Terra. II glicogeno e la cellulosa sono costituiti esclusivamente da

I Ogni anno la fotosintesi converte più di 100 miliardi di


tonnellate di CO2e di H20 in cellulosa e in altri prodotti
delle piante. Alcuni carboidrati (zucchero e amido) sono
unità di D-glucosio, ma differiscono per il tipo di legame gli-
cosidico, e di conseguenza hanno proprietà e ruoli biologici
diversi.
elementi fondamentali della dieta in molte parti del mondo,
e l’ossidazione dei carboidrati è la via principale di produ­
zione di energia nella maggioranza delle cellule non fotosin-
7.1 Monosaccaridi e disaccaridi
tetiche. I polimeri saccaridici (chiamati anche glicani) ser­
vono come elementi strutturali e protettivi nelle pareti dei -» Le due fa m ig lie d ei m o n o s a c ca rid i: g li ald o si
batteri e delle piante e nei tessuti connettivi degli animali. e i ch e to si
I carboidrati sono poliidrossi aldeidi 0 poliidrossi chetoni, 0 I monosaccaridi sono solidi cristallini e incolori, facilmente
sostanze che per idrolisi generano questi composti. Molti solubili in acqua, ma insolubili nei solventi non polari. La
carboidrati, ma non tutti, hanno la formula empirica maggior parte ha un sapore dolce. Lo scheletro dei mono­
(CH 20 ) m; alcuni contengono anche azoto, fosforo o zolfo. saccaridi è costituito da una catena di atomi di carbonio non
I carboidrati possono essere suddivisi in tre classi principa­ ramificata in cui tutti gli atomi di carbonio sono uniti da le­
li: i monosaccaridi, gli oligosaccaridi e i polisaccaridi (il ter­ gami singoli. Nella forma a catena aperta, uno degli atomi di
mine “saccaride” deriva dal greco sakcharon, “zucchero”) . carbonio è legato con un doppio legame a un atomo di ossi­
I m o n o s a c c a rid i, o zuccheri semplici, sono costituiti da geno, formando un gruppo carbonilico; tutti gli altri atomi di
una sola unità di poliidrossi aldeide o di poliidrossi chetone. carbonio invece hanno come sostituente un gruppo ossidri-
Il monosaccaride più abbondante in natura è uno zucchero a lico. Se il gruppo carbonilico è a una delle estremità della ca­
sei atomi di carbonio, il D-glucosio, qualche volta chiamato tena carboniosa (cioè in un gruppo aldeidico) il monosacca­
anche destrosio. I monosaccaridi a quattro o più atomi di ride viene detto a ld o sio , se il gruppo carbonilico è in qua­
carbonio tendono a formare strutture cicliche. lunque altra posizione, cioè in un gruppo chetonico, il mo­
Gli o lig o sa c c a rid i sono formati da una catena corta di unità nosaccaride viene detto chetosio. I monosaccaridi più sem­
monosaccaridiche o residui, uniti tra loro da caratteristici le­ plici sono due zuccheri a tre atomi di carbonio, detti triosi: la
gami detti glicosidici. I più abbondanti sono i disa c c arid i, gliceraldeide (un aldotriosio) e il diidrossiacetone (un che-
formati da due unità monosaccaridiche. Il più comune è il totriosio) (Figura 7.la ).
saccarosio, formato dagli zuccheri a sei atomi di carbonio I monosaccaridi con uno scheletro covalente a quattro,