EFECTO DEL TRATAMIENTO TÉRMICO Y DEL pH SOBRE LA

DETERMINACIÓN TOTAL DE LA PROTEÍNA MEDIANTE EL ENSAYO

BRADFORD: UN EXPERIMENTO FACTORIAL

Cid Ramón González González, Cruz Palacios Gerónimo, Yolanda Retama Ortíz,
Darlin Briggettte Martínez Bautista, Cristóbal Pimentel Hernández
Instituto Tecnológico Superior de Acayucan. Carretera Costera del Golfo Km
216.4, Acayucan Ver, México. C.P. 96100 cidgonzalez@itsacayucan.edu.mx

INTRODUCCION
El nombre Coomassie se usó por primera vez en el siglo XIX, adoptado de
la ciudad de Coomassie (hoy en día Kumasi en Ghana), como nombre comercial
del fabricante de tintas Levinstein Ltd. Dos colorantes derivados del trifenilmetano
utilizado como tintes de lana. Los dos tintes
azules fueron producidos por primera vez en
1913 por Max Weiler de Elberfeld, Alemania.
Hoy, el término 'CoomassieTM' es una marca
registrada de Imperial Chemistry Industries.

En general, hay aprox. 40 colorantes

llamados 'CoomassieTM xy', mientras que solo CoomassieTM G250 y
CoomassieTM R250 juega un papel crucial en los análisis bioquímicos. El término
"250" se usa para denotar la pureza del colorante. El sufijo 'G' en 'Brilliant Blue
G250' fue agregado para describir el color ligeramente verdoso del tinte azul.

G-250 puede usarse para cuantificar la cantidad de proteína en la solución

(ensayo de Bradford). Al unirse a las proteínas, el colorante (que tiene un color
pardusco en condiciones ácidas) producirá un tinte azulado. La absorbancia óptica
de la solución se mide a una longitud de onda de 595 nm y los datos resultantes
se pueden usar para determinar la concentración de proteína y la cantidad real de
proteína en una solución dada. (CarlRoth Technical, 2018)
Determinación de proteínas

Una de las determinaciones más usadas en biotecnología es la

cuantificación de proteínas. Existen muchos métodos para la determinación de
proteínas. El uso del método adecuado depende de cinco criterios: 1) la cantidad
total de proteína presente en la muestra, 2) la concentración de la proteína, 3) la
especificidad del método, 4) la presencia de otras sustancias que pudieran
interferir y 5) la facilidad y reproducibilidad del método. (Castro, 2015)

Comparación de reactivos para detectar y cuantificar proteínas en solución

Antecedentes de los cambios de color

El color de los dos tintes depende de la acidez de la solución y de su estado

de unión a aminoácidos o péptidos. A un pH inferior a 0, el colorante tiene un color
rojo con un máximo de absorción a una longitud de onda de 470 nm. Con un pH
de alrededor de 1, el tinte es verde con una máximo de absorción a 620 nm;
mientras pH arriba de 2 el tinte es azul brillante con un máximo de 595 nm.

Los diferentes colores son el resultado de lo diferente estados cargados de

la molécula de tinte, que corresponde a la cantidad de cargas positivas en los tres
átomos de nitrógeno presente, mientras que los dos grupos de ácido sulfónico
normalmente siempre están cargados negativamente.

• A un pH de alrededor de cero, los tres átomos de nitrógeno están

cargados positivamente, por lo que el tinte será un catión con un carga total
de +1, estando en forma roja.

• En la forma verde (pH de aproximadamente 1), el tinte no tendrá una

carga global neta (+2 y -2).

• Con un pH de 2 o más, hasta el pH neutro, solo un átomo de nitrógeno

tiene una carga positiva y la molécula de colorante es un anión azul con una
carga global de -1.

• Bajo condiciones alcalinas, el protón final se pierde y el tinte adquiere un

color rosado. Este estado, sin embargo, es de sin relevancia en los ensayos
bioquímicos. (CarlRoth Technical, 2018)

Mecanismo del ensayo bradford

Como se mencionó anteriormente, las moléculas de colorante se unen a las

proteínas para formar un complejo proteína-colorante. El ensayo de Bradford usa
las propiedades espectrales de Coomassie Brilliant Blue G-250 para estimar la
cantidad de proteína en una solución. (Bradford, Enero 29, 1976)

En las soluciones de Bradford, el colorante se mantiene a pH bajo en rojo o

verdoso; debido a esa mezcla, la solución de Bradford parece marrón.
Nuevamente, formación del complejo proteína / colorante estabiliza la forma
aniónica cargada negativamente del tinte produciendo el color azul. La
absorbancia óptica de la solución se mide a una longitud de onda de 595 nm.

Este proceso, sin embargo, se ve alterado por varios factores putativos. Los
colorantes coomassieTM son mucho más eficientes a aminoácidos ácidos. Por lo
tanto, la medición de proteínas con concentraciones idénticas pero cantidades
significativamente diferentes de aminoácidos básicos puede causar diferentes
datos. Además, de la unión a aminoácidos, así como la estabilización de la forma
catiónica y ácida obstaculizado por varios reactivos que pueden estar presentes
en el ensayo como detergentes, tampones biológicos, azúcares, etc. El colorante
también forma un complejo con el detergente aniónico dodecilsulfato de sodio que
estabiliza el verde neutro dela forma del colorante. Estos procesos resultan en un
cambio de señal durante la medición que bien puede prohibir por completo análisis
confiable de los datos. (CarlRoth Technical, 2018)

Gammaglobulina Bovina

La gammaglobulina bovina es una proteína presente en los productos

derivados de la vaca, presentes en la leche y carne de la misma. Esta proteína es
estudiada de manera concurrente en los laboratorios debido a que se presenta
como un alérgeno en ciertos productos alimenticios para los seres humanos.

También puede producir sensibilizaciones primarias por vía inhalatoria o

cutánea al estar presentes en los epitelios, saliva, orina y otros fluidos de los
animales, apareciendo a posteriori reacciones clínicas con la ingestión de la carne
poco cocinadas. (Socorro Coral, 2012 )
METODOLOGIA

Ensayo de Bradford
Para la construcción de la curva estándar de la determinación de proteínas
se utilizó un espectrofotómetro Spectometer BioRad. Se prepararon disoluciones
de una solución estándar de concentración conocida de gammaglobulina (IgG)
bovina BioRad a cinco diferentes concentraciones y por triplicado; las
concentraciones elegidas fueron 0,4, 8, 12, 16 y 20 mg/ml.
Posteriormente se tomaron alícuotas de 600µl, 1200µl, 1800µl, 2400µl y
3000µl respectivamente de cada una de las diferentes concentraciones y se les
añadió 2400 µl,1800µl, 1200µl, 600µl y 3000 µl de agua para obtener un volumen
total de 3000 µl debido a que la concentración inicial de la proteína es de 3 mg/ml.
Una vez listas todas las muestras con sus réplicas respectivamente se
prosiguió a la preparación del espectrofotómetro Spectrometer BioRad,
ajustándolo a una longitud de onda O.D 595nm iniciando con la colocación y toma
de lectura del blanco es decir la muestra de agua, utilizada como referencia para
la realización de las lecturas por separado de las diluciones para la construcción
de la curva de calibración. Este método es específico para medir la absorbancia
de la proteína y así realizar la comparación con los resultados obtenidos en el
experimento factorial con los cuales se determinará el factor que tiene mayor
efecto en la absorbancia de la proteína gammaglobulina (IgG) bovina BioRad .

Efecto del tratamiento térmico y del pH sobre la determinación total de la

proteína mediante el ensayo Bradford.

Se preparó la solución stock a una concentración de 20 µl, tomando en

cuenta la concentración descrita en la información de ensayo de Bradford, se
realizaron calibraciones del pH utilizando solución Buffer para ajustar dicho pH y
mantenerlo constante, obteniendo de esta manera 2 pH distintos uno menos ácido
de 5.6 y otro más ácido de 3.7.
 Se realizaron tres réplicas de cada muestra a las cuales se les aplicaría
tratamiento térmico (etiqueta A-H) y dos réplicas de cuyas muestras no recibirían
dicho tratamiento; debido a que su análisis se realizaría a 25ºC(Temperatura
ambiente) es decir aquellas muestras con las etiquetas I-J de las cuales la (I) tiene
un pH de 5.6 y la (J) un pH de 3.7 ,se agregó 200µl de reactivo colorante de
Bradford Vigorad a cada replica y se agito para mezclar dichas muestras,
posteriormente en el agitador magnético colocamos el baño maría para iniciar el
calentamiento del agua hasta que esta alcanzará la temperatura de 85ºC.Las
muestras se dividieron en 2 secciones; la primera se colocó con las etiquetas C y
G por 15 minutos y las muestras D y H por 30 minutos de las cuales C y D tienen
un pH de 5.6 por lo cual las otras dos restantes son correspondientes al pH de 3.7.

En la segunda sección de muestras se encuentran las muestras con las

etiquetas A y E las cuales se sometieron al tratamiento térmico a una temperatura
de 70ºC por 15 minutos ,teniendo así a las muestras B y F por 30 minutos,
respecto a esta sección las muestras con un pH de 5.6 son A-B y E-F son
pertenecientes al pH de 3.7.

Una vez terminada la etapa del tratamiento térmico se procedió a encender

y ajustar la longitud de onda O.D 596 nm en el espectrofotómetro SmartSPec
BioRad, se tomó el blanco en el espectrofotómetro para proceder a tomar lectura
de cada una de las muestras.

Experimento factorial
Para la elaboración del diseño experimental de tres factores se tomó en
cuenta la variación del tiempo de calentamiento, la temperatura de calentamiento y
el pH, en total se prepararon 8 tratamientos de forma no aleatorizada, los niveles
para cada factor fueron dos, que corresponden a 70 y 85 °C para la temperatura
de calentamiento; 15 y 30 min para el tiempo de calentamiento; 5.6 y 3.7 para el
pH. La variable respuesta es la concentración de 20 µl de muestra en 1 ml de
reactivo Bradford leído a 595 nm en el espectrofotómetro. Los resultados se
analizaron en el software R_Studio y Excel con la función de Diseño de
experimentos.
 Se ocupó el método de regresión lineal para comprobar los resultados
optenidos en el grafico a partir de la curva estándar, en el software Rstudio.

RESULTADOS

Curva de calibración

IGG ABS La siguiente tabla señala el resultado de la

0 0.212 absorbancia del microensayo. Se realizó el grafico de la
4 0.326
8 0.387 curva estándar para la detección de proteínas. En este
12 0.413 caso se trabajó con la proteína Gammaglobulina bovina y
16 0.476
con el reactivo azul brillante de Coomassie G250 por el
20 0.529
0 0.259 método de Bradford.
4 0.387
8 0.389 Se observa en el gráfico de la curva estándar que la
12 0.448 intersección tenemos el valor de 0.0152381, pendiente con
16 0.492 valor de 0.01375952 y coeficiente de correlación 0.9306.
20 0.551
0 0.299 Observamos que se puede predecir a un momento dado la
4 0.345 concentración de proteína en una muestra a partir de la
8 0.376 absorbancia.
12 0.404
16 0.502
20 0.576

Curva estandar
0.35
0.3 y = 0.0138x + 0.0152
0.25 R² = 0.9306

0.2
Absorbancia

0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
-0.05
-0.1
Concentracion ug/ml
Experimento Factorial

Se eliminaron algunos sesgos para evitar errores en el experimento, lo cual

se identificaron por medio de una desviación estándar. Muestras C, F y H fueron
modificados, por ello es importante realizar replicas.

PROMEDIO Se observa que

DESVIACION ESTANDAR DE ABS NETA
ABS NETA los resultados de
A 0.245 0.063814836 desviación estándar
B 0.209 0.041235098 son menores a ≤ 0.05
C 0.12322222 0.053033009 tras eliminar los
D 0.25966667 0.064220973 sesgos.
E 0.318 0.046704746
F 0.24222222 0.036769553
G 0.281 0.034501208
H 0.19655556 0.050204581
J 0.22488889 0.001414214

Desviacion estandar de ABSNETA

0.08
0.07
0.06
0.05
Absorbancia

0.04
0.03
0.02
0.01
0
-0.01 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Gráfico de barras de la desviación estándar con barras de error.

PRUEBA DE ANOVA

Se observa que el factor pH tiene mayor efecto sobre la proteína

Gammaglobulina Bovina puesto que la evaluación Fisher arrojó un resultado de
10.718, seguido de los factores temperatura: pH con un valor de 4.527.

PRUEBA DE POST - HOC

TEMPERATURA
diff lwr upr p adj
70-25 -0.03347727 -0.10497404 0.03801950 0.4621524
85-25 -0.05195000 -0.12439379 0.02049379 0.1837594
85-70 -0.01847273 -0.07197601 0.03503056 0.6504752

PH
diff lwr upr p adj
5.6-3.7 -0.06172057 -0.1019459 -0.02149527 0.0051625

TIEMPO
diff lwr upr p adj
15-0 -0.008766092 -0.08026286 0.06273068 0.9458255
30-0 0.009642701 -0.06280109 0.08208649 0.9365083
30-15 0.018408792 -0.03509449 0.07191207 0.6523538

TEMPERATURA:PH`
diff
70:5.6-70:3.7 -0.108680689 -0.20142723 -0.01593415 0.0174572
85:5.6-70:3.7 -0.106866361 -0.20373696 -0.00999576 0.0266818
70:5.6-25:5.6 -0.111293488 -0.23635290 0.01376592 0.0954680
85:5.6-25:5.6 -0.109479161 -0.23762692 0.01866860 0.1168017
 Se observa que la mayor diferencia que existe en el estudio de Host poc es
entre los factores temperatura y pH. Con esto se puede determinar que la
temperatura y el pH son los que mayormente afectan a dicha proteína, se observa
que si se trabaja la proteína a temperaturas mayores a 85°C y con pH ácidos,
menos a 3.7, se ve afectado la absorbancia y la concentración de dicha proteína
en la alícuota, dado que existe probabilidad a que la proteína se desnaturalice o
cambie su composición química
CONCLUSION

El ANOVA indica que el pH tuvo un mayor efecto sobre la respuesta de

absorbancia (p <0.01), seguido de la interacción de la temperatura del pH (p
<0.05). El rango de tiempo utilizado no pareció tener ningún efecto significativo. El
análisis post-hoc mostró un efecto importante del pH después de un tratamiento
térmico de 70 ° C y 85 ° C. Estos resultados indican que el resultado del ensayo
Bradford debe interpretarse cuidadosamente al determinar la proteína total en las
muestras que se han sometido a un tratamiento térmico severo, como la
pasteurización a alta temperatura. Además, dado que el ensayo depende del pH,
las muestras deben estar estandarizadas en pH antes de proceder a la
determinación de proteína total cuando se usa un ensayo de unión a proteína
colorante.

Con esto se puede decir que la proteína gammaglobulina bovina se puede trabajar
bajo las condiciones menores de 85 °C y pH mayores a 3.7.
Bibliografía
CarlRoth Technical. (2018). Recuperado el 27 de enero de 2018, de
https://www.carlroth.com/downloads/allgemein/en/Info_Brochure_Coomassi
eGelStainingAndBradford_EN.pdf

Bradford, M. M. (Enero 29, 1976). A Rapid and Sensitive Method for the
Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing thePrinciple of
Protein-Dye Binding . Universidad de Georgia : Departament of
biochemistry .

Castro, A. P. (16 de enero de 2015). Imforme final de residencia profesional.

PRODUCCIÓN DE PÉPTIDOS CON ACTIVIDAD ANTIHIPERTENSIVA
POR FERMENTACIÓN LÁCTICA MEDIANTE LACTOBACILLUS
HELVETICUS Y LACTOBACILLUS PLANTARUM A PARTIR DE
LACTOSUERO. Acayucan , Veracruz, México .

Socorro Coral, C. B. (2012 ). Patologias nutricionales en el siglo XXI: un problema

de la salud publica . Madrid : UNED .