Técnicas básicas de

Biología Molecular
  Técnicas que se utilizan para
caracterizar, aislar y manipular los
ácidos nucleicos celulares
1. METODOS BASADOS EN LA MANIPULACION ENZIMATICA DE LOS 
ACIDOS NUCLEICOS
• Enzimas asociadas a la manipulación de ADN
• Técnicas de manipulación de genes y organismos
(clonación, transgénesis)

2. METODOS BASADOS EN HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS
• Hibridación en soportes solidos (Blots)
• Hibridación masiva (microarrays)

3. METODOS BASADOS EN LA SINTESIS Y AMPLIFICACION DE ACIDOS 
NUCLEICOS
• Amplificación de ADN por Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
• Secuenciación de ADN ( Secuenciación Sanger y Secuenciación
Masiva)
 ENZIMAS UTILIZADAS EN BIOLOGIA
MOLECULAR

MODIFICACION DE SINTESIS DE ACIDOS

ACIDOS NUCLEICOS NUCLEICOS
• Nucleasas
– Enzimas de • ADN Polimerasas
Restricción – Taq Polimerasa
– DNAsas – Klenow (Pol I)
– RNAsas • Transcriptasas
• ADN Ligasas Reversas
• Otras enzimas • RNA Polimerasas
– Polinucleótido
kinasa
– fosfatasa alcalina
 ENZIMAS DE RESTRICCION
• Las enzimas de restricción clivan el ADN cuando reconocen
secuencias cortas específicas (palíndromes), produciendo fragmentos
de ADN de diferentes longitudes.
Reconocimiento y corte de EcoRI

EcoRI
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:

AluI y HaeIII producen extremos romos

BamHI, HindIII y EcoRI producen
extremos cohesivos
ENZIMAS EcoRI HindIII EcoRI
DE
RESTRICCI Fragmento de ADN
ÓN: 0 80 380 480

Fragmentos de ADN
generados por el
corte con las
enzimas indicadas.

Como visualizar los productos de digestión

enzimática?
 Electroforesis de ácidos nucleicos
Separación de fragmentos de ADN/ ARN en un gel de
agarosa utilizando un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño
y la carga
1-Preparacion eléctrica
de la solución neta de la cuba y carga de las muestras
3. Armado
de gel
5. Visualización de los
fragmentos separados

2. Armado del gel

4. Separación de los fragmentos
ENZIMAS EcoRI HindIII EcoRI
DE
RESTRICCI Fragmento de ADN
ÓN: 0 80 380 480

Fragmentos de ADN
generados por el
corte con las
enzimas indicadas.

MAPAS DE
RESTRICCI
ÓN Perfil de migración
electroforética
producida por los
fragmentos de ADN
generados por el corte
con las enzimas
indicadas.
 ADN recombinante
Union de fragmentos de ADN de distinto origen por acción
de la ligasa
LIGASA:
Transformación de bacterias con el
plásmido recombinante
• Plásmido = vector
 Clonación
rción de un gen de interés en un vector para su propagación o exp
 Expresión del gen de interés
Un vector de expresión es una construcción genética que 
permite la introducción de un gen exógeno en una célula
huésped (ej. una bacteria) que sea capaz de expresar la
proteína que codifica en forma eficiente.

Aplicaciones: producción de proteínas recombinantes de uso

farmacéutico (ej. insulina, factores de crecimiento)

Expresa NO expresa
proteína de proteína de
interés interés
Como detectar productos de digestión de 
moléculas de ADN grandes ?
Hibridación de ADN en soporte:
Southern blot
RFLP (polimorfismo de los fragmentos
de restriccion)
 RFLPs pueden estar asociados a
una enfermedad genetica

Aplicaciones

• Marcador
molecular
• Mapeo genómico
• Análisis de
enfermedades
genéticas
• Búsqueda de
mutaciones que
inserten o quiten un
sitio de restricción

RFLP (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción)

Hibridación de Ácidos Nucleicos en soporte
(“blot”)

En soportes sólidos
Southern Blot ADN
Northern Blot ARN
Dot blot
Micro-arrays
Hibridación en soporte (blot): 

ADN: Southern blot

ARN: Northern  blot

Proteína: western blot

ARN

Proteína

ADN
 Técnicas de localización cromosómicas por
hibridación
FISH
Hibridación in situ sobre cromosomas con
sondas fluorescentes

Cariotipo Espectral
Múltiple FISH con sondas específicas
de cada cromosoma marcadas con un
fluorocromo diferente.
 Hibridación MASIVA de ácidos nucleicos
(“microarrays”)

• Sondas de
porciones de todos
los genes pegadas a
soporte solido
• Muestras de dos
condiciones
marcadas
fluorescentemente
compiten por la
asociación

Affymetrix U133
> 6 millones sondas
47.000 transcriptos
Síntesis in vitro
de ADN

1. Generación y
marcado de
sondas
de ADN
DNA Polimerasa I
(Fragmento Klenow de la
DNAPol I)

EXO 
POL 3’5’  EXO 
(5’3’) 5’3’ 
AMPLIFICACION DE ADN
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
PCR
 Métodos de estudio de la
secuencia del ADN

INDIRECTOS:

Cambios en la movilidad electroforética

• Fragmentos de digestión con enzimas de

restricción
• Fragmentos Productos de PCR

DIRECTOS:

Secuenciación
Secuenciación: método de Sanger

H
Secuenciación: método de Sanger
Secuenciación de Sanger
 Secuenciació
n: técnicas
masivas
• Permiten:

• Aumentar velocidad de
secuenciado
• Disminuir los tiempos
• Disminuir los costos
• Secuenciación de
genomas completos

• Plataformas:
• Pirosecuenciación
(Roche)
• Illumina/ Solexa
• SOLiD (Applied
Biosystems)
• Helicos Heliscope y
Pacific Biosciences
SMRT (secuenciadores
de moléculas únicas)
Secuenciación Illumina
Secuenciación de tercera generacion