 MÉTODOS INDIRECTOS:

Son métodos que miden el número de bacterias viables (que no equivale al de totales).

Método del número más probable: Su fundamento estriba en la distribución de

Poisson: una distribución aleatoria de partículas en una serie de muestras iguales, en
función del número medio de partículas presentes en una suspensión.

PX = mX · e-m/x!

donde x = número real de partículas en cada muestra y m = concentración (no

partículas/volumen)

La técnica consiste en sembrar alícuotas de la suspensión original problema sobre un

medio líquido o sólido adecuado; tras el tiempo de incubación adecuado se anota la
proporción obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P0 (x = 0).
Entonces, según la distribución de Poisson:

P0= e--m

y por lo tanto es fácil calcular el valor de m:

m = -lnP0

Recuento de viables en placa: Como esta técnica será explicada al alumno en clase,
y además la realizará en las prácticas, remitimos a las pertinentes explicaciones "en vivo".
Es una de las técnicas de recuento más usadas en la rutina del laboratorio de
Microbiología.

Precauciones:

para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5

placas de cada dilución;
hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;
contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.

Determinación de la proporción células viables/células totales: Si se está

interesado en conocer esa proporción se recurre a una técnica de microcultivos en
cubreobjetos: hay que seguir periódicamente la evolución del crecimiento de células
individuales y determinar la proporción de aquellas células no viables (visibles al
microscopio, pero incapaces de crecer).

Recuento sobre filtros de nitrocelulosa: Se usa para suspensiones diluidas de

bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de
nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la
superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro y se
cuentan, deduciéndose la concentración original en función del volumen de suspensión
que se hizo pasar por el filtro.
Referencias apa:

1.- NEIDHART, F.C., J.L. INGRAHAM, M. SCHAECHTER (1990): Physiology of the

bacterial cell: a molecular approach. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.
Consultar el capítulo 7. (referencia de libro)

2.- MADIGAN et al. (2003)." Brock: Biología de los microorganismos". (10ª edición). Ed. Pearson-
Prentice-Hall, Madrid.

PRESCOTT et al. (2004). "Microbiología". McGraw-Hill Interamericana, Madrid

3.- Anonimo. (26 de marza de 2001). cuantificacion de microorganismos. martes, 15 de febrero de

2005 , de scribd Sitio web: http://www2.cbm.uam.es/jlsanz/Docencia/archivos/02.pdf
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm#_Toc58934317http://www.salud.g
ob.mx/unidades/cdi/nom/181ssa18.html
  MÉTODOS INDIRECTOS

1) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que

hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En
muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer
mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colacada en
un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de
lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original
sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una
colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias
visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota
utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. (Para
esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la práctica
correspondiente, que se suele realizar en la 3ª tanda).

Mientras tanto, y para luego repasar esa práctica, puedes realizar un experimento on-line
sobre crecimiento bacteriano

Precauciones:

para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas

de cada dilución;
hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;
contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un indiviudo (y
esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más
células), el recuento se refiere no a “células viables reales” sino a “unidades formadoras
de colonia” (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una bacteria,
pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembr en placa
infravalora el número real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o
más individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa.

2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace

pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de
nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito
de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de
cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas.
Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función
del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.
 Métodos Indirectos
1) Recuento de viables en placa:

Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (losdirectos)
no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células
vivas, y estoen laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se
define como viable cuando,colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar
descendencia). El método habitual de lograr estoes sembrar pequeñas alícuotas de
diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con mediosólido (con
agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado
deincubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que
proceden y el volumen dealícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables
en la suspensión original.Precauciones: para minimizar los errores estadísticos de
muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cadadilución; hay que usar pipetas nuevas
en cada dilución; contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.Como no
podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un individuo (y esto es
especialmentecierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células), el
recuento se refiere no a “células viablesreales” sino a “unidades formadoras de colonia”
(UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a unabacteria, pero sobre todo
en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el númeroreal
de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban
juntos al ser sembrados en la placa.

2) Recuento sobre filtros:

Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen

desuspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un
diámetro de poro que retienelas bacterias pero permite el tránsito de sustancias).
Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de unmedio de cultivo sólido. Las
colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias
secuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de
suspensión que se hizopasar por el filtro.