Laboratorio 6

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Determinación de Teofilina en

una muestra problema
Objetivos
1. Conocer y manejar un equipo HPLC.
2. Determinar el contenido de Teofilina en una muestra problema.

Introducción
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un tipo de cromatografía en
columna utilizada frecuentemente en Bioquímica y Química Analítica.
Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en
diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica.
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de
la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con
ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil)
a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas
cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones
químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.
El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del
compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda
un compuesto para ser eluído de la columna se denomina tiempo de retención y se considera
una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y
estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad
lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna
mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el
metanol y el acetonitrilo.
El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético,
que ayudan a la separación de los compuestos.
Un estándar interno (IS) es una sustancia que se añade a todas las muestras en una
cantidad constante. La calibración supone representar la razón entre la señal del analito y la
del estándar interno como una función de la concentración del analito.
El estándar interno puede compensar distintos tipos de errores indeterminados y
sistemáticos. Si el IS y el analito responden proporcionalmente a los errores instrumentales
y fluctuaciones del método, la razón entre las señales es independiente de las fluctuaciones.
La mayor dificultad es encontrar un IS adecuado, con señal reproducible y que genere
una señal similar a la del analito.

Parte experimental
Materiales y reactivos:
ü Cromatógrafo HPLC
ü Fase móvil (30:70 = Metanol:Agua)
ü Patrón de cafeína 1000 µg/mL
ü Patrón de Teobromina (Estándar interno) 10 µg/mL
ü Metanol Calidad HPLC
ü Agua Milli-Q o Nanopure
 ü Viales o tubos eppendorf 2 mL
ü Jeringuilla de 25 µL
ü Muestra problema de teofilina

Procedimiento experimental
Determinación de la concentración de cafeína, en una muestra problema
Trabajando con una fase móvil isocrática (15:85 = Metanol:Agua), a un flujo de 1 mL/min
(20 µL de volumen inyectado) y utilizando una longitud de onda de detección de 271 nm, se
determinará la concentración de cafeína en una muestra problema, utilizando el método de
estándar interno), por interpolación en una curva de calibración, previamente medida usando
patrones de cafeína

Tabla de datos
Patrón Patrón Masa Masa Área Área
inyectado de interno inyectada inyectada cafeína teobromina
Cafeína inyectado de Cafeína Teobromina
(µg/µL) Teobromina (µg) (µg)
(µg/µL)
1,0 · 10-3 1,0 · 10-2 0,02 0,2
2,0 · 10-3 1,0 · 10-2 0,04 0,2
4,0 · 10-3 1,0 · 10-2 0,08 0,2
6,0 · 10-3 1,0 · 10-2 0,12 0,2
8,0 · 10-3 1,0 · 10-2 0,16 0,2
1,0 · 10-2 1,0 · 10-2 0,2 0,2
2,0 · 10-2 1,0 · 10-2 0,4 0,2
4,0 · 10-2 1,0 · 10-2 0,8 0,2
6,0 · 10-2 1,0 · 10-2 1,2 0,2

Preparación de muestras de bebidas

Coca-cola Normal y Coca-cola Light: 1 mL de bebida diluida y aforado en 25 mL

Té y Café: 1 mL de bebida diluida y aforado en 50 mL
Bebida energética: 1 mL de bebida diluida y aforado en 50 mL
Cafiaspirina: 0,6544g. de tableta diluido y aforado a 100 mL, a partir de esa dilución tomar
100 µL y diluir y llevar a un volumen total de 2 mL.