UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL INGENIERÍA QUÍMICA

CURSO:INGENIERÍA DE BIOPROCESOS

INVESTIGACIÓN FORMATIVA:

EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO ANIMAL

Análisis de cantidad y calidad de ADN extraído en folículos pilosos y sangre de Cavia

porcellus (Cuy) mediante el método comercial

DOCENTE: DR. PAVEL DELGADO SARMIENTO

INTEGRANTES:

- Causa Ayala, Angelo

- Cordero Eguia, Heber
- León Villanueva, Aracelly
- Mullisaca, Mary
- Pinto Subia, Cinthya
- Vilcahuamán Churata, Flor
- Villafuerte Gonzales, Jonnathan
- Villalba Pari, Nathaly
- Yucra Chambilla, Erika

AREQUIPA – PERÚ

2018
 EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO ANIMAL

1. OBJETIVOS :

A. Objetivo general:

 Análisis de cantidad y calidad de ADN genómico extraído en sangre de Cavia

porcellus “cuyes”.

B. objetivos específicos:

 Extracción de ADN de tejido animal, usando como fuente Cavia porcellus (Cuy).
 Analizar y determinar la cantidad y calidad de ADN extraído sangre de Cavia porcellus
(Cuy).
 Analizar la calidad según la prueba estadística.
 Determinar la cantidad de ADN según el rendimiento

2. JUSTIFICACIÓN:

El presente trabajo se realiza con el objetivo de determinar cuál de las fuentes de

extracción de ADN: hígado y sangre se obtiene mayor cantidad y calidad del ADN en
Cavia porcellus (Cuy).

3. ANTECEDENTES:

 Resistencia antimicrobiana y genotipificación de cepas de Salmonella Typhimurium

aisladas de cuyes (Cavia porcellus) provenientes de granjas de producción intensiva
de la ciudad de Lima, Perú.

 Análisis de cantidad y calidad de ADN genómico extraído en folículos pilosos y sangre

de Cavia porcellus “cuyes” mediante el método comercial.

- http://dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/9657/Espinoza%20Blas%20
Magaly%20Evamaria.pdf?sequence=1&isAllowed=y

 Comparación de métodos para la extracción de ADN en cuyes (Cavia porcellus

Rodentia, caviidae).

- http://www.lrrd.cipav.org.co/lrrd22/4/burg22081.htm

 Diferenciación reproductiva, productiva y molecular de cuyes nativos de la región

Cajamarca.
 - http://repositorio.concytec.gob.pe/bitstream/CONCYTEC/84/1/Mantilla.pdf

 Análisis de cantidad y calidad de ADN genómico extraído en folículos pilosos y sangre

de vicuña pacos “alpacas” mediante el método comercial.

- https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UNIT_d651cead2ac0ece2bcbc3a5db7ff
011f

ANTECEDENTES HISTÓRICOS:

Las pruebas existentes demuestran que el cuy fue domesticado hace 2 500 a 3 600 años. En
los estudios estatigráficos hechos en el templo del Cerro Sechín (Perú), se encontraron
abundantes depósitos de excretas de cuy y en el primer periodo de la cultura Paracas?
denominado Cavernas (250 a 300 a.C.), ya se alimentaba con carne de cuy. Para el tercer
período de esta cultura (1400 d.C.), casi todas las casas tenían un cuyero (Tallo, citado por
Moreno, 1989). Se han encontrado cerámicas, como en los huacos Mochicas y Vicus, que
muestran la importancia que tenía este animal en la alimentación humana.

Se han extraído restos de cuyes en Ancón, ruinas de Huaycan, Cieneguilla y Mala. Allí se
encontraron cráneos más alargados y estrechos que los actuales, siendo además
abovedados y con la articulación naso-frontal irregular semejante al Cavia
aperea (Huckinghaus, 1961).

El hallazgo de pellejos y huesos de cuyes enterrados con restos humanos en las tumbas de
América del Sur son una muestra de la existencia y utilización de esta especie en épocas
precolombinas. Se refiere que la carne de cuyes conjuntamente con la de venado fue
utilizada por los ejércitos conquistadores en Colombia (Pulgar Vidal, 1952).

4. MARCO TEÓRICO:

4.1 Cuy

Es un pequeño mamífero del orden de los roedores originarios de la zona andina del
Perú y otros países sud americanos. Tiene el cuerpo compacto y mide entre 20 y 40
centímetros. El pelo de algunas especies es largo y la textura puede ser áspera o
suave. El color puede ser blanco, negro o leonado; también los hay de pelaje con
rayas o manchas de colores oscuros sobre fondo blanco.

El cuy por su rápida reproducción y por su crianza económica, ofrece las mejores
perspectivas para contribuir a elevar el estándar de vida de la población con
 el consumo de carne en la alimentación.

4.2 Sangre de cuy.

Los valores de Hemoglobina los valores determinados son similares, variando entre
14.07 y 14.68; los % de hematocritos en promedio varias entre 41.40 a 42.60. Los
machos registran valores (42.86) ligeramente superiores que las hembras (41.8). Los
resultados según el análisis estadístico nos deja notar que no existe diferencia
significativa entre los promedios de los diferentes tipos y sexos, a excepción del
recuento de eritocritos en el que es altamente significativa la diferencia, siendo
mayor en los machos. las ligeras variaciones pueden estar relacionadas a los factores
de altitud, edad, peso o sexo.
La sangre y la carne de cuy ayudarían a controlar la enfermedad, y evitan que la
asparagina se siga convirtiendo en tumor.
"La asparaginasa es una enzima que ataca a la asparagina, proteína que la convierte
en ácido aspártico, que es inocuo. La asparagina está, por ejemplo, en la leucemia, y
es una de las proteínas más comunes en dichas neoplasias que se reproducen de
manera
Rápida.

4.3 ADN

La biología molecular ha avanzado mucho en los cuarenta años siguientes al descubrimiento

de la estructura del ADN ya que es la que contiene la información genética. El primer paso
para realizar estudios es disponer de muestras de ADN con calidad y cantidad que permita su
análisis molecular. (De Jesús et al. 2005).

El ácido desoxirribonucleico (ADN) constituye el material genético de los organismos vivos,

la estructura del ADN es una pareja de largas cadenas de nucleótidos; cada nucleótido está
formado por un grupo fosfato, una desoxirribosa y una base nitrogenada. Existen cuatro
bases: dos purínicas (o púricas) denominadas adenina (A) y guanina (G) y dos pirimidínicas (o
pirimídicas) denominadas citosina (C) y timina (T) (Lodish et al. 2004).

Los ácidos son polímeros lineales de una unidad repetitiva llamada nucleótido el cual
está constituido por:

a) Una pentosa: ribosa o desoxirribosa

b) Una base nitrogenada: púrina o pirimidina
c) Ácido fosfórico (Ácido ortofosfórico)

La unión de las bases nitrogenadas con la pentosa constituye un nucleótido. Finalmente la

unión éster de un nucleósido con ácido fosfórico se conoce como nucleótido.

El DNA es el responsable de la transmisión de los caracteres hereditarios. El DNA está

formado por dos cadenas polinucleotidicas, enrolladas en espiral a lo largo de un eje común.
Las dos cadenas de la doble hélice corren en direcciones opuestas. El esqueleto azúcar
fosfato de cada una de las cadenas se encuentra hacia el exterior de la doble hélice y las
bases nitrogenadas están en el interior. Las dos cadenas están unidas por puentes de
hidrógeno establecidos entre las bases, se constituyen dos puentes de hidrógeno entre los
pares A-T y tres puentes hidrógeno entre los pares G-C.

La adenina siempre se unirá a la timina y la guanina siempre se unirá con la citosina. Los
puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y por agentes químicos, obteniéndose
un DNA desnaturalizado.

El aislamiento y purificación del DNA se puede realizar aprovechando su propiedad de

absorber luz a la longitud de onda 260 nm.

Figura n°1: Estructura helicoidal del DNA

La purificación del DNA es importante porque permite:
 Identificar mutaciones.
 Ver características propias de los tipos de DNA (Polimorfismo).
 Para clonar (Genes específicos, fragmentos de cromosomas o individuos).
 Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno.
 Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patogénicos.
 Identificar resistencia microbiana.
 Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos, imunológicos.
 Medicina forense para la identificación de personas.
 Para hacer tests de paternidad.

5. HIPÓTESIS:

Es posible extraer el ADN de Cavia porcellus “cuyes” de mayor calidad y cantidad a

través de su sangre e hígado.

6. METODOLOGÍA:

Cloruro de sodio

Las sales aumentan el poder iónico de la solución y ocasionan la precipitación del ADN

Tejidos: sangre - hígado

7. PARTE EXPERIMENTAL

7.1.- MATERIALES:

 6 tubos de ensayo con tapón rosca

 Vasos De PP
 3 Pipetas Pasteur
 1 Gotero
 1 bagueta
 3 placas petri
 Papel filtro
 Gradilla para tubos de ensayo.

7.2.-Reactivos

 Bicarbonato de Sodio
 Alcohol de 96 grados
 Jabón liquido o Detergente líquido
 Agua DESTILADA o Agua Mineral.
 NaCl.
 7.3.-MUESTRA

 Sangre.
 órganos (hígado).

7.4 PROCEDIMIENTO

SOLUCIÓN TAMPON LISIS.

Materiales:
 agua destilada o agua mineral.
 NaCl.
 Bicarbonato de Sodio (NaHCO3).
 Detergente líquido o jabón líquido.

Preparación:
1.-Mezclar en la secuencia anterior todos los ingredientes ya que al mover esta
mezcla neutraliza las cargas negativas.
2.-Tapar y agitar la mezcla.

SOLUCIÓN DE LISIS
PARA LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS SE EXTRAEN DEL CAVIA PORCELLUS

TEJIDO – HIGADO

1. Picar el hígado y Triturar el hígado con sal, solución de lisis y SDS hasta que la
muestra quede liquida.
  Filtrar y llevar a tubos de ensayo

2. Lisis de las membranas celulares con detergente, en solución salina para liberar los ácidos
nucleicos y las proteínas.

3. Digestión de las proteínas por acción enzimática de proteasas (Opcional).

4. Precipitación con etanol helado. El DNA es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en
presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. El
etanol formará una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa.

5. Observación de agregados moleculares, de consistencia mucoidea, en la interfase entre la

solución acuosa y el alcohol.

SANGRE

1.- Obtenemos la muestra colectada.

2.- Verter la muestra problema 10 ml. con gotero a un tubo de ensayo.

3.- Llevar a centrifugadora y separar el plasma por 10 min a 40000 RPM.

4.- Una vez separados el plasma y plaquetas, extraer el plasma.

5.- Verter 20 ml la solución LISIS O TAMPÓN agitada previamente hacia la solución de

sangre extraída en el paso 3.

6.- Agregar alcohol de 96 grados o 96 % “por los bordes del tubo e inclinándolos”
(tener en cuenta).

7.- Aparece Interfase banda blanquecina - rosacea que corresponde al ADN para
recoger, recogerlo con pipeta Pasteur.

8.- Reposar LA MUESTRA por unos cuantos minutos (5 min a más)

9.- Llevar a Centrifugación por 40000 RPM por 10 minutos.

10.- Lo que se observa como la muestra salpicada en el tubo de ensayo indica que es
el ADN.
TEJIDO - higado

Se realiza el mismo procedimiento que en la sangre.

6.- RESULTADOS:

Obtuvimos lo siguiente: para las muestras de sangre

La parte de encima es la muestra de ADN.
En el hígado se observa agregados moleculares, de consistencia mucoidea, en la interfase
entre la solución acuosa y el alcohol.
EXPLICACION
Muestra Al triturar el hígado
TEJIDO-higado
Se forma una masa semi-
líquida.
marrón
Esto muestra una ruptura total
del tejido, es decir, se separan
las células unas de otras.
Es la primera destrucción física
de la muestra para aislar al
ADN.
+Solución de detergente
OBSERVACIÓN:
Se origina una masa
parcialmente líquida.
COLOR :
Marrón suave
INTERPRETACIÓN:
El detergente al entrar en
contacto con las células, captura
los lípidos y las proteínas, que
forman parte de las membranas.
En este proceso la membrana
nuclear han sido destruidas.
Además el detergente permite
de las proteínas que acompañan
al ADN, que son de gran
tamaño, sean cadenas más
pequeñas y se puedan separar.
+Sal y agua destilada
Se vuelve una masa casi
completamente líquida.
Rojo oscuro
Los iones sodios (en la sal),
impiden que las cargas
negativas de los grupos
fosfatos (en el ADN),
interaccionen con las
moléculas de agua. Por ello,
la sal permite que el ADN se
vuelva insoluble, que las
cadenas de ADN no sean
cortadas y que favorezcan
en la precipitación de
solución de alcohol. En la
sal, la cual también ayuda a
que no se produzcan
uniones de las proteínas
(histonas) con el ADN.
Por otro lado el agua
destilada ayuda en gran
medida a la visualización
del ADN.
Por el contrario si hubiera
un cierto exceso no se
visualizarla el producto
final.
 Al ser sometido a un + Alcohol Después de algunos Al extraer el ADN
proceso de filtrado segundos

OBSERVACIÓN:
Después de este Poco a poco apareció Permanecieron las dos capas El ADN toma el aspecto de
proceso, la muestra una capa de fibras de iniciales pero con más una nube de algodón oscuro
liquida tiene 2cm de color marron , como intensidad. mojado, pequeño y
volumen. fragmentos de Aparecen pequeñas de ADN pegajoso.
algodón ocscuro, que que se han formado.
situaron sobre la
mezcla dehigado.

COLOR:
Marron opaco marron opaco en el Marron más opaco (parte Fibras marrones
inferior y claro en la inferior) y claro (parte
parte superior. superior).

INTERPRETACIÓN:
El proceso de filtrado ha El alcohol al ser menos El ADN se enrolla de El ADN ha sufrido cambios
permitido la eliminación denso que el agua se manera muy ajustada en su estructura, se ha
de restos celulares. El situó en la capa formando grumos dentro desenrollado y en
ADN pasa el tubo de superior. Precipitó al de las células. Y al ser consecuencia adopta esta
ensayo como líquido, ADN, y este al extraídas aún siguen estructura. Además puede
que no es retenido en el encontrarse con el permaneciendo ajustadas ser observado y por ende,
filtro. alcohol se desenrollo, formando grumos pero no extraído al estar en contacto
ya que el ADN no es como en un principio. con el alcohol.
soluble en este líquido. Cabe recordar que el ADN
Por otro lado, la parte obtenido es producto del
acuosa, que se ubicó rompimiento de muchas
en la parte inferior, células, entonces todo este
contiene proteínas, ADN puede también ser
lípidos, y otros visible debido a la cantidad
componentes de la de células que habían en el
celulares. higado.
De esta manera, el
alcohol aisló al ADN.

CÁLCULOS

Datos:

- Hígado de cuy=15 g (triturado)

- Agua destilada = 2ml
- NaCl = 4g
- NaHCO3=2g
- Detergente=3ml
 - Alcohol etanol= 10ml
- ADN obtenido (filamentos) = 0.03g
- Rendimiento del ADN en hígado:

0,05g ADN
∗ 100 = 0.33%
15g higado

Sangre:

- Datos:
- Sangre de cuy=10 ml(triturado)
- Agua destilada = 2ml
- NaCl = 4g
- NaHCO3=2g
- Detergente=3ml
- Alcohol etanol= 10ml
- ADN obtenido (filamentos) = 0.03g
- Rendimiento del ADN en hígado:

0,01g ADN
∗ 100 = 10%
0.10g higado

→Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN:

 Cantidad de material de partida

 Número de copias de las moléculas de ADN
 Cantidad de tejido.
 Condiciones en las que se encuentra el material de inicio(fresco, congelado, fijado)
 Contaminantes e interferentes en el material biológico
 EVALUACION COLOR

TEJIDO
ADN TEJIDO SANGRE HIGADO
OBSERVACION #1 5 5
OBSERVACION #2 5 5
OBSERVACION #3 5 5
OBSERVACION #4 4 4
OBSERVACION #5 4 4
OBSERVACION #6 3 4
OBSERVACION #7 3 4
OBSERVACION #8 5 2
OBSERVACION #9 5 2

EVALUACION OLOR

ADN tejido sangre tejido higado

OBSERVACION #1 5 5
OBSERVACION #2 5 5
OBSERVACION #3 5 5
OBSERVACION #4 5 4
OBSERVACION #5 4 4
OBSERVACION #6 4 4
OBSERVACION #7 4 3
OBSERVACION #8 3 3
OBSERVACION #9 3 2
CONCLUSIÓN

 Se logró extraer el ADN de la sangre y el hígado extraídos de cavia porcellus (cuy),

obteniendo pequeñas fibrillas de ADN, de un color rosado precipitado sobre el
alcohol (mezcla Heterogénea).
 Se logró determinar por observación en la extracción de ADN en Cavia porcellus
(Cuy), que la sangre es superior tanto en cantidad como en calidad, comparado con
lo obtenido en el hígado.
 Según la prueba de TUKEY nos da una semejanza entre el valor 0-0.5
 El rendimiento obtenido en la sangre es elevado, en comparación al rendimiento
obtenido en el hígado.

7.- DISCUSIONES:

Es necesario el uso de lisis de las membranas celulares con detergente, en solución salina
para liberar los ácidos nucléicos y las proteínas.

Digestión de las proteínas por acción enzimática de proteasas (Opcional).

Precipitación con etanol helado. El DNA es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en
presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. El
etanol formará una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa.

Observación de agregados moleculares, de consistencia mucoidea, en la interfase entre la

solución acuosa y el alcohol.

9.- BIBLIOGRAFIA:

http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/purelink_genomic_man.pdf (consultado
en agosto de 2010).

http://learn.genetics.utah.edu/es/units/activities/extraction/

http://www.joseacortes.com/practicas/extraccionADN.htm
http://www.jpimentel.com/ciencias_experimentales/pagwebciencias/pagweb/la_ciencia_a_
tu_alcance_II/quimica/Experiencias_quimica_extraccion_de_adn.htm

http://www.bioapuntes.cl/laboratorio/extrac-adn.htm

http://www.slideshare.net/marcia_karina/extraccion-adn