PRÁCTICA 3

PRODUCCIÓN Y DETERMINACIÓN DE BIOMAS

Autor: Dr. José Gavidia Valencia
I.- FUNDAMENTOS
Los microorganismos no tienen un ciclo de vida obligatorio, como las formas de vida
superiores. Cuando se les coloca en un medio nutricionalmente ideal o completo, una
célula microbiana crece más y se divide para formar dos células, esto continua con la
producción de una población de células vegetativas indiferenciadas.
El crecimiento bacteriano se basa en la habilidad de las cepas para multiplicarse. El
incremento en el número de organismos capaces de tener un crecimiento indefinido es
una importante consideración. Esta es la razón para el empleo y desarrollo de los métodos:
conteo de colonias y del número más probable.
Los estudios cuantitativos que se ocupan del crecimiento celular, distinguen entre la
concentración celular o el número de células por unidad de volumen de cultivo, y la
densidad microbiana, definida como el protoplasma total por unidad de volumen. En la
mayoría de estudios, la variable significativa es la densidad microbiana, aunque hay
estudios como temas sobre genética, en donde es necesario conocer la concentración
celular real.
Aunque hay varias técnicas en uso para la estimación de las densidades y las
concentraciones celulares, no hay ningún método único que determine la masa y la
cantidad en una sola operación.
Entre los procedimientos ejecutados tenemos:
- Recuento microscópico: cámara de Neubauer
- Recuento en Placa.
- Número más probable (NMP).
- Peso seco.
- Turbidimetría.
La cantidad de microorganismos presentes en un cultivo puede determinarse por:
recuento total directo y recuento viable indirecto. Los métodos directos permiten una
estimación aproximada del número de células y tienen el inconveniente de que
concentraciones demasiado altas o demasiado bajas disminuyen la precisión; aparte el
posible defecto de poder contabilizarse células muertas, puede hacerse empleando una
cámara de recuento, puede ser del tipo de Petroff-Hauser, mayormente bacterias, o la
cámara de Neubauer, donde conocido el volumen depositado se puede determinar el
número de organismos por mililitro. Métodos más sofisticados resultan los recuentos
obtenidos en filtros de membrana y el empleo de contadores eléctricos de Coulter
(Coulter-counter), en los que un par de electrodos, detecta el paso de una partícula por el
efecto que ésta produce, midiendo así la distribución de tamaños y cantidades en las
suspensiones microbianas. Esta técnica tiene el inconveniente de que cuenta no sólo las
células viables, sino las totales, por ejemplo, para bacterias que permanecen adheridas
(tipo estreptococcus) o en las que se agregan fácilmente, los resultados son poco fiables.
La determinación de la cantidad de células viables es la más empleada, donde se plaquea
una muestra del cultivo, la población microbiana se diluye en un diluyente no tóxico, y
una alícuota de la dilución se dispersa en un medio sólido en placa o se siembra sobre él
de manera que después de la incubación cada unidad viable forme una colonia. La
cantidad de unidades o grupos viables originalmente presente se determina a partir del
recuento de colonias y la dilución. El cálculo es muy preciso, pero es un método válido
sólo para cultivos poco densos.
La masa celular puede determinarse directamente en peso seco. Este método aunque lleva
algo de tiempo es especialmente útil como referencia en el trabajo de aislamiento y
purificación y en la calibración básica de otros métodos. El método más ampliamente
utilizado para la estimación del material microbiológico total en suspensión es la
medición de la densidad óptica de un caldo de cultivo en espectrofotómetro. Las técnicas
turbidimétricas son especialmente útiles para la determinación de la masa de células
mientras están creciendo, así como en la evaluación de la acción de drogas sobre los
microorganismos. Otros métodos como la determinación de nitrógeno y medición del
volumen celular después del centrifugado, son útiles cuando se encuentran problemas con
la aglutinación de las células o la absorción de luz por materiales coloreados en el estudio
turbidimétrico. En estudios de permeabilidad en microorganismos los datos que arroja la
medición del volumen de células centrifugadas resultan útiles.
Los métodos turbidimétricos por su rapidez, sencillez y fiabilidad son los más utilizados,
a pesar de tener muchos errores debidos a la variación de tamaño, densidad celular, etc.
los datos que se obtienen no se refieren al número de células de los microorganismos,
sino a incrementos o disminuciones de la masa celular microbiana.
1. RECUENTO MICROSCOPICO EN CAMARA DE NEUBAUER:
A. Fundamento. -
La cámara de Neubauer es una modificación de la cámara de Burker, la cual
originalmente fue empleada para contar glóbulos sanguíneos.
Esta cámara consiste en una lámina de vidrio grueso e incoloro, atravesada de
manera transversal por dos surcos que limitan tres porciones: una central en la
cual se encuentran los reticulados, y dos laterales donde se apoya el cubreobjetos.
La distancia entre el cubreobjetos y la base de la cuadrícula es de 0,1 mm
(profundidad). La cuadrícula es un cuadrado de 3 mm de lado, dividido en 9
cuadrados de 1mm cada uno, los cuatro cuadrados de las esquinas están a su vez
divididos en 16 cuadrados de 0,25 mm de lado cada uno (0,0625 mm2 de área). El
cuadrado central está dividido en 25 cuadrados de 0,2 mm de lado cada uno y
éstos a su vez divididos en 16 cuadraditos de 0,05 mm de lado cada uno (0,0023
mm2 de área). El volumen total de la cámara es de 0,9 mm3 ó 0,9 μL, El volumen
de cada cuadrado grande es de 0,1 mm3 ó 0,1 μL.
Se pueden utilizar, solo los cuatro cuadrados, ubicados en cada esquina, o solo el
cuadrado central dividido en 400 cuadraditos pequeños de 0,05 mm de lado.
 Si se utilizan los cuadrados de las esquinas, el número total de células contadas se
multiplica por 0,25 o se divide entre 4, para encontrar el promedio por cuadrado
grande, luego se multiplica por 10, puesto que el volumen de un cuadrado grande
solo es 0,1 mm3 y hay que llevarlo a 1 mm3 y por último se multiplica por la
inversa de la dilución utilizada en el recuento, y por 1 000 mm3 para llevarlo a 1
mL:

Cél./mL = N x 25 x 104 x factor Dilución

Donde:
N x 25: es el promedio de células contadas.
104: multiplicación de 10 x 1000, primero para llevarlo a 1 mm3 y luego para
llevarlo a 1 mL
Factor de dilución: la inversa de la dilución.
Si se emplea el cuadrado central, se pueden contar 5 cuadraditos de 0,2 mm de
lado (de las esquinas y central) de las 25 que contiene la cuadrícula central. Se
obtiene un promedio y se multiplica por 25 (total de cuadraditos) y como hasta
aquí corresponde a un volumen de 0,1 mm3 se multiplica por 10 para llevarlo a 1
mm3 y finalmente por 1000 para expresarlo en un mL. Además multiplicar por la
dilución utilizada en el recuento. Esta técnica es útil para el control del proceso de
producción de biomasas, proteínas unicelulares (PUC) y producción de
metabolitos (ácidos, etanol, enzimas, etc). Se aplica slo a substratos líquidos y no
aplicable a células inmovilizadas.
2. RECUENTO DE CELULAS VIABLES EN PLACA:
A. Fundamento. –
Se basa en la presunción que cada célula bacteriana, puede crecer en medios de
cultivo sólido formando colonias. Entonces el número de colonias desarrolladas
en medio de cultivo sólido, puede corresponder al número de células bacterianas
viables presentes en una cantidad determinada de muestra que haya sido
inoculada.
El número de bacterias encontradas para el caso de un determinado alimento, será
el indicador microbiano de la calidad de los mismos. Pero, para el caso de un
bioproceso, se realiza con la finalidad de controlar el crecimiento microbiano, o
para determinar la biomasa de microorganismos viables. Por ejemplo:
- Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfección, así como
también determinar la eficiencia del tratamiento industrial, transporte y
almacenamiento.
- Tener una idea sobre la alteración incipiente de los alimentos.
- Identificar fuentes de contaminación en el proceso de elaboración de alimentos.
El conteo en placa presenta, de manera general tres métodos usados comúnmente:
recuento estándar en placa por siembra en profundidad, el recuento en placa por
siembra en gotas en superficie, y el recuento en placa de siembra por extensión en
superficie. Ninguno de estos métodos es capaz de poner de manifiesto todos los
microorganismos presentes en una muestra. Existe la posibilidad de que no se
multipliquen muchas células bacterianas porque las condiciones de nutrición,
aireación, temperatura o tiempo de incubación no son favorables.
Siempre que se utilicen estos métodos debe especificarse la temperatura de
incubación. Por lo demás, pueden aplicarse al recuento de grupos distintos de
microorganismos con temperaturas de crecimiento variables: 0-5°C para los
psicrófilos, 30-35°C para los mesófilos y 55° para los termófilos. La elección de
la temperatura de incubación es tanto como decir del grupo de microorganismos
a enumerar, depende de la finalidad que se pretenda. En cualquier caso, es
necesario el control exacto de la temperatura de incubación. Sin embargo, debido
a que la temperatura de incubación. Sin embargo, debido a a que la temperatura
de crecimiento de los microorganismos no corresponde a un valor exacto, sino
que está comprendida entre límites amplios, ninguna temperatura de incubación
excluye absolutamente los microorganismos de otros grupos.
Por lo que se refiere a la escala mesófila (la más importante desde un punto de
vista sanitario), el número de colonias obtenidas disminuye sensiblemente a
medida que la temperatura de incubación se eleva de 35 a 40°C. por ello, es muy
importante el control de la temperatura en este intervalo, lo que pone de manifiesto
la necesidad de contar con estufas que pueden adquirirse en el comercio cumplen
estas exigencias. Es conveniente, también, comprobar y regular periódicamente
estos aparatos.
Al comparar los tres métodos, se reconoce la economía de los métodos de recuento
en placa de siembra por extensión en superficie y el de recuento en placa por
siembra en gotas en superficie: menor cantidad de medio, menor número de placas
de Petri y pipetas más baratas. Por esta razón, muchos laboratorios prefieren
utilizar estos métodos sobre todo en el análisis de muestras con fines
exploratorios.
En este procedimiento se introduce una cantidad medida del inóculo a una placa
Petri, después se adiciona un agar fundido, el cuál por agitación rotatoria de la
placa se mezcla con el inóculo, cuando el medio se solidifica, los
microorganismos quedan atrapados en el agar. Cada microorganismo se desarrolla
y se reproduce hasta formar una masa visible de organismos, una colonia, de tal
manera que la cuenta es más exacta, y la interferencia en el desarrollo entre un
microorganismo y otro es mínima, las cuentas se reportan como Unidades
formadores de colonias (UFC) por mililitro.
Este método es fácil de practicar y se puede adaptar a la medicina de poblaciones
de cualquier magnitud. Tiene la ventaja de su precisión para contar los organismos
cuando se están en muy pequeñas cantidades.
a) Ventajas del recuento en placa:
* No es esencial que el medio sea traslúcido.
* Cómo las colonias se desarrollan en la superficie del medio, se les identifican
y cuantifican fácilmente.
* Depositando varias diluciones sobre la superficie de placas, puede
comprobarse la exactitud del sistema de dilución.
* Los organismos termosensibles no son inactivados como puede ocurrir
cuando se mezclan con el agar, fundido a 45°C, en el recuento estándar en
placa.
* Placas preparadas de antemano con medios de cultivo pueden guardarse y
llevarse dentro del laboratorio o a laboratorios de campo para estudios “in
situ”.
 b) Desventajas del recuento en placa:
* Debido al pequeño volumen de muestra utilizado (0,02 ó 0,1 mL.), el
alimento suspendido podría tener efecto inhibidor sobre los
microorganismos; además existe la posibilidad de una confusión óptica entre
partículas de alimento y pequeñas colonias, especialmente en las diluciones
más bajas.
* Por ello, los métodos de recuento en placa por siembra por extensión en
superficie y por siembra en gotas en superficie no dan resultados
satisfactorios con muestras con pocos microorganismos (con menos de
500/g), siendo el limite 10 a 100 veces más alto que en el método de recuento
estándar en placa.
* El método de recuento en placa de siembra por extensión en superficie no
se usa muy ampliamente.
3. DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
A. Fundamento:
Proporciona un valor estimado del número de microorganismos presentes en una
muestra. Se fundamenta en pruebas bioquímicas y los medios que se usan
dependen del microorganismo que se evalúa y consiste en la realización de varias
réplicas de diluciones en un crecimiento en medio líquido y marcar las fracciones
de tubos que muestran desarrollo microbiano (tubos positivos). Los tubos que no
muestran desarrollo (tubos negativos), seguramente no han recibido un solo
microorganismo que fuera capaz de desarrollarse. Emplean varios tubos para
llegar a una enumeración aproximada. Si no se posee una estima presuntiva de la
población de la muestra es recomendable aumentar el número de diluciones
seriadas a efectos de permitir una correcta determinación de NMP. Obviamente
los límites de confianza son más precisos a medida que aumenta el número de
tubos por nivel. Sin embargo, es conveniente insistir que el NMP sólo estima a la
población de microorganismos contenidos en una muestra, pero no proporciona
una numeración precisa.
El Número Más Probable se constituye en un concepto estadístico derivado de la
teoría de probabilidades aplicable a la enumeración de microorganismos bajo
ciertas condiciones. Las condiciones imprescindibles para el uso de esta teoría
son:
* Los microorganismos se distribuyen de un modo homogéneo y al azar en el
medio que los contiene.
* Fracciones iguales (muestras) que puedan separarse del medio original
contendrán igual número de células.
* Las células se consideran como entidades independientes. El método perderá
exactitud si se presentan agrupaciones celulares.
* En el caso de que se encuentre una sola célula, el medio de cultivo empleado
permitirá detectarla en función de su crecimiento.
Este método es ventajoso, cuando la cinética de crecimiento es altamente variable,
supuestamente algunas células crecen rápidamente e inmediatamente y originan
una gran colonia sobre medios sólidos ocultando el desarrollo del microorganismo
de interés, cuando el microorganismo de interés es capaz de formar un producto
detectable en el medio adecuado (gas, metabolito coloreado, antibióticos),
 también cuando los medios sólidos pueden contener residuos que pueden alterar
la cuenta o interferir con el objetivo de un plan de experimentación y cuando no
hay manera de cultivar el microorganismo en medio sólido, cuando los microbios
tienden a aglomerarse, limitando por ejemplo el empleo del método de recuento
en placa.
El método del NMP puede ser relacionado en series de tres tubos por dilución o
en series de cinco tubos por dilución, generalmente se utilizan hasta tres
diluciones de 10, 1 y 0,1. Se toma 1 mililitro de cada dilución y se inocula en el
medio líquido deseado, y se incuban estos cultivos. Suele suponerse que la
dilución más elevada que permite el crecimiento en subcultivos contiene un
microorganismo por mililitro, el número de microorganismos de la muestra, en
consecuencia, es indicado por la recíproca de esta dilución. Estos
microorganismos se determinan en base a la capacidad que tienen de producir gas,
debido al metabolismo que presentan.
Para mencionar el índice de recuento de número más probable, se debe tener en
cuenta los límites de confianza para las diferentes combinaciones de resultados
positivos y negativos, el volumen usado en los tubos al realizar la prueba y las
diluciones respectivas. Estos datos se encuentran establecidos en tablas
estandarizadas.
a) Ventajas del número más probable:
* Se distribuye de un modo homogéneo y al azar.
* Puede ser usado cuando las muestras orgánicas no se pueden sembrar en
medio sólido.
* Las células se consideran como entidades independientes.
* Permite el análisis de muestras de un tamaño significativo.
b) Desventajas del número más probable:
* Elección de una dilución adecuada de la muestra problema.
* Solo es una estimación pero no proporciona una numeración precisa.
* Es un método ineficiente.
4. DETERMINACION DE PESO SECO:
A. Fundamento:
El método más usado para medir el crecimiento microbiano (producción
unicelular, biomasa y de metabolitos) secando volúmenes conocidos de cultivo
celular hasta obtener un peso constante. Es el método más directo para las
mediciones cuantitativas de la masa celular y probablemente el más fácilmente
realizable y reproducible, aunque se debe aplicar sólo en suspensiones celulares
muy densas y las células deben ser lavados muy bien para quitarles todo el
material extraño (medio de cultivo).
Cuando se trata de células que sedimentan rápidamente, como las levaduras, esto
usualmente implica centrifugación (4-6 x 103 rpm) de muestras del cultivo en
tubos de centrífuga prepesados y el lavado de la pastilla celular concentrado con
solución salina isotónica seguida por recentrifugación a 4-6 x 103 rpm. Luego, las
células concentradas se colocan en horno a 90° C durante unas 20 horas o a 105°C
durante 6 a 10 horas, hasta que hayan alcanzado un peso constante.
Para células bacterianas difíciles de concentrar por centrifugación, las muestras
de cultivo se filtran a través de membranas hidrofílicas con un tamaño de poro de
 0,2 μm. Las células, retenidas en el filtro, se lavan con solución salina isotónica y
los filtros se colocan en un horno a 90° C o a 105° C hasta obtener un peso
constante.
El peso de las células secas usualmente se expresa en términos de g/L.
Al determinar peso seco existen fuentes de error importantes debido a la absorción
de humedad atmosférica por las células secas, sobre todo en el momento de la
pesada por lo que se recomienda hacer uso de una balanza con lámpara infrarroja,
y los tubos de centrífuga o las membranas durante el enfriamiento. Esto se puede
evitar al enfriar en un desecador o mediante la determinación de la cantidad de
agua absorbida por las membranas o tubos y con la corrección adecuada del peso
seco medido. La presencia de sólidos en el medio, los cuales se encuentran
frecuentemente en muchos medios industriales importantes, requiere que el peso
seco medido sea corregido con respecto al peso de los sólidos. La desventaja
principal de estos métodos es que son lentos y requieren muestras relativamente
grandes del cultivo.
5. DETERMINACION DE BIOMASA POR TURBIDIMETRIA:
A. Fundamento:
Conviene relacionar las medidas de desarrollo obtenidas mediante métodos
indirectos. Esto se puede hacer convenientemente midiendo la suspensión
bacteriana simultáneamente con dos métodos y estableciendo relación entre
valores obtenidos. Se toman muestras de una suspensión de células, se secan, y
determinan el peso de las células por mililitro. De la misma suspensión celular se
preparan diluciones, y efectúan mediciones turbidimétricas. Se puede calcular el
peso de las bacterias en cada dilución, ya que el peso de las células por mililitro
de la muestra original ya ha sido determinado. Se obtienen dos grupos de datos,
que son representados gráficamente (peso de las células contra turbidez) para
obtener la curva estándar.
A menudo se saca ventaja que en una celda espectrofotométrica, las células
microbianas desvían la luz de modo que la cantidad de ésta que llega al detector
del espectrofotómetro, se relaciona directamente con el número de células
presentes en la muestra del cultivo según la Ley de Beer. Generalmente se
emplean longitudes de onda de 600 nm. Es importante entender que como la
absorbancia es afectada por el tamaño y forma de las células, la relación entre
absorbancia y número de células cambia si el tamaño o forma de éstas cambia
durante el crecimiento del cultivo.
Es común que la absorción de luz por una suspensión se relacione con el peso seco
celular. Esto se lleva a cabo midiendo la absorbancia y el peso seco de muestras
del cultivo y graficar uno contra el otro. La pendiente de esta gráfica producirá un
coeficiente que relacione absorbancia con peso seco celular que puede usarse para
experimentos posteriores con el mismo organismo criado en condiciones
similares.
Básicamente el fenómeno es que la luz interactúa con el sistema electrónico
molecular dipolo, aun cuando la luz no se absorbida. La interacción es tal que la
luz es disipada a igual longitud de onda. Los detalles de la interacción de la luz
con un átomo o molécula pequeña fueron estudiados por Lord Rayleigh en 1981.
Un aspecto importante de esta ley es que la intensidad de la luz disipada depende
inversamente a la cuarta parte de la potencia de la longitud de onda.
En la turbidimetría (turbidus= confuso), la suspensión se coloca en la celda o
cubeta de un espectrofotómetro y la absorbancia se mide con un
espectrofotómetro ordinario. La luz no es realmente absorbida por la solución,
sino que se dispersa en todas las direcciones y no llega al detector.
La absorción aparente suele obedecer a una ecuación análoga a la ley de Beer en
algún intervalo limitado de concentraciones:
Po
“A” = log10---------------- = kbc
P
Donde “A” es la absorbancia aparente, Po es la potencia radiante del haz de luz
incidente, P es la potencia de haz de luz emergente, k es una constante, b es la
longitud del trayecto óptico y c es la “concentración” del precipitado. El valor de
k se determina empíricamente con una serie de patrones. La transmitancia “T” es
igual a: “T” = 1/A
Un haz de luz que toca una partícula polarizada los átomos y las moléculas de esa
partícula induciendo dipolos que actúan como fuentes secundarias y reemiten luz
débil de la misma longitud de onda que la luz incidente. Este fenómeno se llama
dispersión de la luz. La radiación dispersa se propaga en todas las direcciones
alejándose de la partícula.
Los microorganismos son comparados a la longitud de onda de luz visible en
tamaño. Consecuentemente su disipación de la luz se encuentra entre las teorías
descriptivas por los físicos para objetos más pequeños (átomos y moléculas) y de
los objetos grandes (lentes, prismas). Ellos ocupan una región intermedia
denominada región Rayleigh-Gans. Ellos son especiales no solo por su tamaño
sino también porque ellos principalmente están construidos de agua, como es su
medio de desarrollo, y así el índice de la diferencia de refracción es pequeña. La
región de Rayleigh-Gans es generalmente aplicada a bacterias o microbios con
división normal que se separan después de la división y no para las formas
filamentosas o en cadenas. La forma de disipación de la luz depende del tamaño,
forma y del índice de refracción del objeto. Existe una significante desviación de
la ley de Lambert-Beer a altas concentraciones celulares, esto ocurre
particularmente a baja longitud de onda. Una curva estándar es esencial para
corregir estas desviaciones, como las imperfecciones instrumentales y las lecturas.
La cantidad de luz transmitida hacia el cultivo es reducido a causa de la disipación
de la luz. Aparentemente corresponde a una absorbancia como medida en un
ordinario espectrofotómetro o colorímetro. Pero la luz no es absorbida por las
células, es disipada en diferentes direcciones. La turbidez refleja la suma de toda
la luz disipada. Una solución patrón debe ser preparada para cada microorganismo
y en una sola fase (vegetativa o espurulada). El protoplasma de un microbio es
transparente, refrigerantes (granos de reserva), esporas y membranas (opacos).
Complicaciones biológicas adicionales pueden intervenir y la simple teoría no da
resultados válidos. Con bacterias que tienden a agruparse, las determinaciones
turbidimétricas son difíciles de repetir e imposibles de interpretar en términos de
biomasa. Las formas filamentosas también dan dificultades en medición
turbidimétrica.
La cuantificación de biomasa de células grandes o de filamentos o células
filamentosas por turbidimetría puede ser evaluable con una apropiada curva de
calibración. El mecanismo por el cual se disipa la luz o refracta es que los fotones
chocan con las moléculas y luego rebotan y chocan con otra u así se disipa.
El instrumental requerido para las determinaciones de turbidimetría va desde un
simple espectrofotómetro manual disponible en la mayor parte de los laboratorios
hasta los elaborados analizadores discretos de alta velocidad. La sensibilidad de
la turbidimetría depende principalmente de la exactitud fotométrica y la
sensibilidad del instrumento. Estos instrumentos pueden ser utilizados para
calcular otros ensayos como determinaciones enzimáticas o los basados en el
desarrollo de color.
 II.- OBJETIVOS
 Producir biomasa a partir de la fermentación de Saccharomyces cerevisiae.
 Determinar la biomasa celular empleando diversos métodos, tanto directos como
indirectos a partir de una población de Saccharomyces cerevisiae.

III.- MATERIALES

PRÁCTICA Material Medio de Material Equipos Otros

biológico cultivo de vidrio
Recuento Cultivo de Pipeta Microsco- Cámara de
microscópico levaduras pio Neubauer
en cámara de (Saccharo-
Neubauer myces
cerevisiae)
diluido a 10-1
Recuento de Suspensión de Medio - Placas - Mechero de
células viables Saccharo- Sabouraud a Petri vidrio.
en placa myces 45°C. estériles - Asas de
cerevisiae vacías de siembra.
diluido. 100x 15
mm.
- Pipetas
bacterio-
lógicas de 1
mL, 5 mL y
10 mL.
- Tubos de
ensayo.
Determinación Suspensión de Caldo seca- - Tubos de Espectro- - Diluyente:
del número Saccharo- rosado (de ensayo. fotómetro solución
más probable myces concentra- - Pipetas SPEC- salina
cerevisiae. ción normal bacterio- TRONIC fisiológica
y doble lógicas de 1 20 D. peptonada.
concentrado) mL y 10 - Asa
mL. bacteriológica.
- Mechero.
- Campana de
Durham.
Determinación Suspensión de - Tubos de - Estufa.
de peso seco Saccharomyces prueba de - Balanza
cerevisiae en 16 x 150 analítica
un medio mm.
Sabouraud. - Pipeta de
10 mL.
Determinación Suspensión de - Tubo de Espectro-
de biomasa Saccharomyces ensayo de fotómetro
por cerevisiae. 16 x 150. SPEC-
turbidimetría - Vaso de TRONIC
precipitados 20 D.
de 250 mL,
 IV.- PROCEDIMIENTOS
1. RECUENTO MICROSCOPICO EN CAMARA DE NEUBAUER:
* Tomar con una pipeta o gotero una alícuota de la dilución y desechar las primeras
gotas.
* Una vez que el cubreobjetos y la cámara de Neubauer está limpia se coloca una
pequeña gota entre el cubre y la cámara (cargado de cámara), la cual debe estar bien
limpia, así como también el cubreobjetos el cual se debe adherir perfectamente a las
bandas longitudinales de apoyo, lo cual se comprueba por la aparición de los anillos
de Newton.
* Colocar la cámara en la platina del microscopio y observar con poco aumento para
verificar la uniformidad de las células: en caso contrario, limpiar y cargar
nuevamente.
* Contar al microscopio en la cuadrícula central. Dependiendo del tamaño de las células
a contabilizar, se escogerá el cuadrante más adecuado. Así por ejemplo se tiene la
referencia que, en el caso de glóbulos rojos en 80 cuadrados pequeños; como estos
se encuentran separados en grupos de 16, se debe computar en 5 de esos grupos. No
debe contarse las células que se hallan sobre las líneas inferior y derecha pero si los
que están sobre la líneas superior e izquierda. Al resultado se le añaden cuatro ceros.
En el caso de ser células más grandes se usa un objetivo de poco aumento y se cuentan
todos los elementos en toda la superficie de la cámara de Thoma (1mm2), o en caso de
trabajar con la cámara de Neubauer, se cuentan los elementos distribuidos en los cuatro
cuadrados adicionales (4 mm2). Se debe obtener el promedio de elementos por mm2 y
se multiplica por 10, para calcular así la cantidad por m3 de la dilución.
Cálculos:
Cél./mL = N x 25 x 104 x factor de Dilución
Cél./mL = 5 x 25 x 104 x 1/10-1
Cél./mL = 1,2 x 17 levaduras/mL.
2. RECUENTO DE CELULAS VIABLES EN PLACA:
* Diluir el cultivo de levaduras (Saccharomyces cerevisiae).
* Colocar 0,1 mL de las diluciones en placas que contienen agar Sabouraud.
* Extender la muestra sobre la superficie del medio con el aza de Ortiz estéril.
* Incubar a 37°C por 24 a 48 horas.
* Reportar los resultados en U.F.C./mL.
Cálculos:
Área de la placa
 Radio de la placa 4,9 cm.
A = πr2 = 3,14 x (4,9 cm)2 = 63,8 cm2 aprox 64 cm2
Rcto m.o./mL = Promedio x Area x Dilución
Rcto m.o./mL = 33 x 64 x 1/10-1 = 21120 U.F.L./mL
Rcto m.o./mL = 21 x 103 U.F.L./mL
3. DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP):
* Se utilizará la técnica de tres diluciones con tres tubos por dilución.
* Colocar 10 mL del medio de dilución en 9 tubos de prueba, los 3 primeros
corresponderán a la serie de 10 mL, los 3 siguientes a la dilución o segunda serie de 1
mL y los tres últimos a la serie de 0,1 mL. (diluciones de 100, 10-1 y 10-2). Homogenizar
e incubar a 37° C por 24 a 48 horas.
* Realizar la lectura para saber si hay o no producción de gas en la campanita de Durham
y comparar con tablas.
* El número de tubos encontrados positivos, indica el NMP que debe buscarse en la
tabla correspondiente.
* Para obtener el NMP se procede de la siguiente manera:
NMP (tabla) x fact. Dilución intermed. = NMP/mL O NMP/g
100
* Si se desea identificar la especie de la cepa o cepas que componen la biomasa se
pueden hacer otras pruebas.
Cálculos:
* 1ra. dilución - + - =1
* 2da. dilución - + - =1
* 3ra. dilución + + + =3
En las tablas la relación 1 1 3 equivale a 19
Entonces 19 x 10 = 190 levaduras/mL
4. DETERMINACION DE PESO SECO:
* Se pesa dos tubos de prueba vacíos y secos.
* Se toma 40 mL del cultivo de Saccharomyces cerevisiae y colocarlo en tubos.
* Centrifugar a 3 500 rpm por 15 minutos. Eliminar el sobrenadante. Lavar el
precipitado con agua destilada estéril.
* Repite el procedimiento una vez.
* El sedimento se lleva a pesar, para determinación el peso húmedo de la más
microbiana.
* La solución obtenida se colocará en placas secas y taradas.
* Secar con aire caliente a 55 grados centígrados hasta peso constante.
* El resultado se expresa en mg/Litro.
Peso húmedo – Peso seco = Peso de la biomasa.
* El resultado indica el peso de la biomasa de los microorganismos (levadura).
Cálculos:
Peso húmedo – Peso seco = Peso de biomasa.
1,2 mg – 0,3 mg = 0,9 mg.
0,9 mg ------------ 40mg de dilución
X -------------- 1 000 mL
X = 22,5 mg levadura/Litro.
5. DETERMINACION DE BIOMASA POR TURBIDIMETRIA:
* Se realizan diluciones a Saccharomyces cerevisiae, obteniéndose concentraciones de
1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 y 1/128.
* Se procede a calibrar el Spectronic para lo cual debe encenderse por 5 minutos para
que caliente.
* Calibrar el equipo con un tubo de ensayo conteniendo agua destilada llevando a
CERO de absorbancia (100% de transmitancia).
* Terminada esta operación se coloca una por una las muestras diluidas para la lectura
correspondiente en transmitancia.
* Este procedimiento se repetirá con diferentes longitudes de onda (500, 550 y 600
nm).