Enzimas3los catalízadores
de la vida
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T'r
.Ún el Capítulo5 hicimosreferenciaa AG', la variación
de energíalibre,y vimos su importanciacomo indicador
de la espontaneidad termodinámica.Concretamente, el
signode AG' nos dicesi una reacciónesposibleen la di-
recciónindicada,yla magnitudde A,G'indicala cantidad
de energíaquepuedeserliberada(o quedebesersuminis-
trada),mientrasque la reaccióntienelugar en esadirec-
ción,bajolascondiciones paralascualessecalculóAG'. Al
mismo tiempo,pusimoscuidadoen señalarque el pará-
metro termodinámicoAG' no puede proporcionarnos
ningunapista.encuantoa si una reacciónfactibletendrá
lugarrealmente, y a quévelocidad.En otraspalabras, AG'
nos dice si una reacciónpuedetener lugar pero no dice
nadaen absolutosobresi realmentetendrálugar.Paraesta
distinción,necesitamos conocer,no sólo la direccióny la
energlade la reacción,sino tambiénalgoacercadel meca-
nismoy la velocidad.
Esto nos lleva al tema de la cat¡ílisisenzimática, por-
queprácticamente todaslasreacciones o procesos celulares
son mediadospor proteínas(o, en ciertoscasos, ARN) ca-
talizadorasllamadasenzimas.Las únicas reaccionesque
ocurrena unavelocidadapreciable en una célulasonaque-
llasparalascualeslasenzimasapropiadasestánpresentes y pel sobre el cual estánimpresasestaspalabras,es otro
activas.Así,las enzimascasisiempresignificanla diferen-
cia entre<puedetenerlugar>y <tendrálugao en lasreac-
cionescelulares.Sólo cuandoexploramosla naturalezade
las enzimasy suspropiedades catalizadoras,comenzamos
a entenderpor quélasreacciones quesonfactiblesenergé-
ticamente,tienen lugar realmenteen las célulasy cómo se
controlala velocidadde talesreacciones.
En estecapítulo,consideraremosprimero por qué las
reaccionestermodinámicamente espontáneas no tienen
lugar normalmentea velocidadesapreciables sin un catali-
zador,y despuésveremos el papel delas enzimascomo ca-
talizadoresbiológicos específicos.Thmbién veremos cómo
Ia velocidad de una reacción catalizadaenzimáticamente se
ve afectada por la concentración del sustrato disponible
para la reacción. Asimismo, se analizarán algunas de las
formas de regulación de la tasade reaccionesencaminadas
a satisfacerlas necesidadesde la célula.
Energía de activación y el estado
metaestable
Si se detienea pensarlo,ustedya estáfamiliarizadocon
muchasreaccionesque son termodinámicamente facti-
bles,aunqueno ocurranmuy a menudo.Un ejemploevi-
dente,consideradoen eI Capítulo5, esla oxidaciónde la
glucosa(véaseReaccíón 5.9).Estareacción(realmente, se-
rie de reacciones) es altamenteexergónica(AG'= -686
kcal/mol)¡ sin embargo,no ocurrepor sí misma.De he-
cho,la glucosaen forma cristalinao en solución,sepuede
exponeral oxígenodel aire indefinidamente,y la oxida-
ción serámínima o inclusoinexistente. La celulosadel pa-
ejemplo,como lo es ustedmismo, que estáformado por
un conjuntocomplejode moléculastermodinámicamen-
te inestables.
No tan cercanas,pero igualmenteimportantespara la
química celular,son muchasreaccionestermodinámica-
mentefactibles,pero que no tienenlugarpor sí mismasa
una velocidadapreciable.Como ejemplo,consideremosa
la moléculade alta energíaadenosinatrifosfato(AIP),la
cual tiene una AG' altamentefavorable(-7,3 kcal/mol)
para la hidrólisis de su grupo fosfatoterminal, durante la
Energía y el estadometaestable
deactivación r39
 formación del correspondientedifosfato (ADP) y fosfato moléculasdeATPI HzO alcancenel estadode transición.
inorgánico(P'): AG" mide la diferenciaen la energíalibre entrelos reac-
tivosy los productos(-7,3 kcal/molpara estareacción
AIP + HrO: ADP + Pi (6.1)
en particular),mientrasEo indica el mínimo de energía
Estareacciónesmuy exergónica bajo condicioneses- requeridapara que los reactivosalcancenel estadode
tándare inclusolo esmás en las condicionesque prevale- transicióny, por tanto, seancapacesde dar lugar a los
cenen lascélulas.Sin embargo,a pesarde quela variación productos.
de energíalibre esmuy alta,estareaccióntienelugarpor sí La velocidadreal de una reacciónes siemprepropor-
mismasólolentamente, de maneraqueel ATP permanece cional a la fracción de moléculasque tienen una energía
establedurante varios días cuando se disuelveen agua igualo mayorqueEo.Cuandoen una solucióna tempera-
pura. Estapropiedadpareceser compartidapor muchas tura ambiente,lasmoléculasde ATP y aguasemuevenli-
moléculasy reacciones biológicas. bremente,cadauna poseeuna ciertacantidadde energía
en un momentodado.Como semuestraen la Figura6.ib,
La barrerade aetivaciónenergéticadebeser superada la distribuciónde energíaentrelasmoléculastieneforma
antesde quese puedaverificarunareacciónquimica de campana;algunasmoléculastendránpocaenergía,al-
gunaspodrán tenermucha,y la mayoríaestarácercadel
Lasmoléculasque deberíanreaccionarentresí,a menudo promedio.El hechoa destacares que sólo las moléculas
no lo hacenporquecarecen de energíasuficiente.
Paratoda capacesde reaccionaren un instantedado,son las que tie-
reacción,hay una energíade activación específica(.Eo), nensuficienteenergíaparasuperarla barrerade energíade
definidacomo la cantidadmínima de energíaque los reac- activación(Figura6.1b,líneadiscontinua).
tivos debentener antesde que la colisiónentre ellostenga
éxito,dandoorigena los productos.Más específicamente,
los reactivosnecesitana).canzarun estadocuímico inter-
Elestado metaestable eseilesultado dela barera
medio llamado estadode transiciór, .tryi energíalibre
de activación
es mayor que la de los reactivosiniciales.La Figura6.la La energíade activación es,para la mayoría de las reaccio-
muestrala energíade activaciónrequeridapara que las nes biológicas a temperaturas celularesnormales, lo sufi-

Estado Figura6.1 Efectode la catálisisen la

de transición (Ú
@ ener$a de activacióny en el númerode
t\ f moléculascapacesde reaccionar.
O
c)
'q) (a) La energíade activación E, esIa
_o
(Ú
1T: o
E cantidad mínima de energíacinética que

o)
c)
t
A flo'
o
o
o
deben poseerlos reactivos(aquí, ATP y
HrO) para permitir ias colisionesque
c)
c
LU V
I ADP+l E conducen a la formación del producto.
.l
z Cuando los reactivosrebasanla barrera
de energiade activacióny reaccionan,
los productos tienen una energíalibre
(a) Secuenciade reacción
Fnornia ¡inÁtina
/v1 reducidaen una cantidadAG". (b) El
de as moléculas número de moléculasN1,que son lo
N2 suficientementeenergéticaspara
sobrepasarla barrerade energíade
(b) Activacióntermal
activacióny chocarsatisfactoriamente,
sepuede incrementar a N2, elevandola
temperatura de T, a Tr. (c) La energíade
a activación también puede disminuirse
t\ 5 por un catalizador,(d) incrementándose
o
.c) así el número de moléculasde \ a Nr',
E sin que cambie la temperatura.
c c)
c) c
-c) o
q)
c)
LL E
.l
z

Fnarníe ninÁti¡a ,A' /1

(c) Secuenciade reaccióncon catalizador
de las moléculas\-.J
N;

(d) Activacióncatalítica

-.--\-
40 Gapítulo
6 Enzimas:
loscatal¡zadores
delavida
cientemente alta para que la proporción de moléculas que
posean mucha energía en un instante dado, sea extrema-
damente pequeña. Por consiguiente, la velocidad de las
reacciones no catalizadasen las células es müy baja, y la
mayoría de las moléculas parecen ser estables,pese a ser
reactivos potenciales en reaccionesfavorecidas termodiná-
micamente. Son, en otras palabras, termodinámicamente
inestables,pero no tienen la energía suficiente para sobre-
pasar la barrera de la energía de activación.
Talesmoléculas, aparentemente estables,se dice que es-
tán en un estado metaestable._P*arp las célgljts¿los- biológi-
cos celulares,
-'- Ia
-{PGf'?YfFffi-
enereí
gíg de acti-vggióg3lta -y_el..estado las seansuficientementeenergéticaspara experimentarla
' - . - . . . . stabT-e
rn-etae cler loi'b6fi
.-:+,¡:,...-_"^,-..:,,' íftluEt6 cel
ulare s, son cru ciales, reacción sin suministrode calor (Figura6.1d).Una carac-
r, i-e _-_-
porque Ia ?ida, pdr sb'plopia naturaleza,es un sistema terísticaprimordialde un catalizadoresoueno semodifi-
mantenidoen un estadoestacionario lejosdel equilibrio. capermanente_nqeIte.nisg__g9nsl¿rng.¡nienjrailalga$tqr-r
Si no fuerapor el estadometaestable, todaslasreacciones t iene lugatSim plene¡te,plo poLsr! na_u¡ amb_i
tenderíanrápidamenteal equilibrio y la vida seríaimposi-
ble tal comola conocemos. La vida,por lo tanto,depende
de quelasenergíasde activaciónseanaltas,evitandoque la
mayoríade las reaccionescelularesocurran a velocidades tálisis:
apreciables en ausenciade un catalizadorapropiado.
superanla banerade la energ¡la
Loscatalizadores
de activación
La energíade activaciónno es sólo importante para el,
mantenimientodel estadometaestable, sino que es taml
bién una barreraquesedebesuperar,paraquelasreaccio-
nesdeseables tenganIugara velocidades adecuadas.Dado
que el contenidoenergéticode una moléculadadadebe
superarEoantesde que la moléculaseacapazde reaccio-
nar, la única manerade que puedaverificarseuna reac-
ción basadaen reactivosmetaestables, a una velocidad
adecuada, es aumentarla proporción de moléculassufi-
cientemente energéticas.Estosepuedeconseguir, bien au-
mentandoel contenidomedio de energíade todaslasmo-
léculas,o bien reduciendoel requerimientode energíade
activación.
Una manerade incrementarel contenidode energíadel
sistemaes suministrandocalor.Como muestraIa Figura
6.lb, simplernente incrementandola temperaturadel sis-
tema desdeT, a T, seaumentarála energiacinéticade las
moléculas,asegurando, por tanto, que hayaun mayor nú-
merode moléculasreactivas(N, lugarde {). Así,lahi-
"r
drólisis de AIP podría ser facilitada calentandola solu-
ción, esdecir,confiriendo a cadamoléculade ATP y agtJa
másenergía.EI problemade usaruna temperaturaelevada
es que es incornpatiblecon la vida, porque los sistemas
biológicosrequierenuna temperaturarelativamentecons-
tante. Las célulasson esencialmentesistemasisotérmicos
(temperaturaconstante)y requierenmétodosisotérmicos
para resolverel problemade la activación.
La alternativaa un incrementode la temperaturaesre-
ducir el requerilqlelQ_dcll-ilqlg1a_d9_aclivaqaa.Dc,ese
r-nodo,nos aseguramosde que una proporción mayor de
Si los reactivospueden
agruparsesobrealgúntipo de superficieque facilitequelas
porcionespotencialmentereactivasde lasmoléculasadya-
centesse yuxtaponganapropiadamente,la interacciónse
veráfavorecidaenormementey la energíade activaciónre-
ducida de maneraeficaz.
Latareadeproveerde tal superficiereactivaesla propia
de un catalizador,agenteque aumentalavelocidadde una
reacción,disminuyendola energíade activación (Figura
6.lc) y asegurandoque una proporción mayorde molécu-
rnle j-d-e-
cuado pa¡a Q_c-i!!1adq ¡949qió_q,
Podemosconsiderarla descomposición del peróxido
de hidrógenoen aguay oxígeno,como un ejemplode ca-
(6.2)
2 H 2 O 2- - 2 H2O + 02
Éstaesuna reaccióntermodinámicamentefavorecida,pese
a que el peróxido de hidrógeno existaen un estadome-
taestabledebido a la alta energíade activaciónde la reac-
ción.Sinembargo,si añadimosun númeropequeñodeio-
nes de hierro (Fe") a una solución de peróxido de
hidrógeno,la reacciónde descomposición tienelugarunas
30.000vecesmás úpida quesin los ionesde hierro.Clara-
mente,el ion Fe'- esel catalizadoren estareacción,redu-
ciendola energíade activación(comosemuestraen la Fi-
gura 6.1c)y, por tanto, asegurandoque una proporción
significativamentemayor de moléculasde peróxido de hi-
drógeno(30.000vecesmás) poseanIa energíaadecuada
paradescomponerse a la temperaturadada,sin necesidad
de aporteenergético adicional.
En las células,la soluciónpara la descomposición del
peróxidode hidrógenono esla adiciónde ionesférricos,
sino la enzimacatalasa,una proteínaque contienehierro.
En presenciade Ia catalasaIa reacciónes 100.000.000 de
vecesmásrápidaque en ausenciade catalizador.La catala-
sacontieneátomosde hierro retenidosen estructuras quí-
micasllamadasporfirinas.Así,la ventajade la catálisisin-
orgánicaseincorporadentro del contextode una molécula
proteica.Estacombinaciónda lugar a un catalizadormu-
cho más eficazparaladescomposicióndel peróxido de hi-
drógenoque los ionesde hierro aislados.El incrementode
la velocidadde, aproximadamente,108vecespanla cata-
lasa,no es un valor atípico en absoluto;los aumentosde
velocidad de las reaccionescatalizadasenzimáticamente
estánen el rangocomprendidoentre107y 1014, en coÍlpa-
ración con las reaccionesno catalizadas. Estosvaloressu-
brayanla importanciaextraordinariade lasenzimascomo
catalizadoresy nos llevan hastael tema principal de este
capítulo.
y el estadometaestable 1 4 t
Ener$adeactivación
 Enzimas como catalizadores mamosenzimasfue eldefermentos.Sinembargo,hubo que
biológicos esperarhasta\926 para obtenerla primera enzimacristali-
zada,laureasa(apartir delasalubias,por famesB. Sumner),
Independientemente de su naturaleza química, todos los demostrándoseque era una proteína. Incluso, entonces,
catalizadorescomparten tres propiedades básicas:
pasóun tiempo hastaque los bioquímicosy enzimólogos
apreciaranque los <fermentos>que estabanestudiando
1. Un catalizador incrementa la velocidad de una reac- eran,de hecho,proteínascatalíticas,
y queparasu completa
ción disminuyendo el requerimiento de la energíade comprensiónse requeríaentendersu estructuray función
activación y permitiendo que una reacción termodi- comoproteínas, (Enlosprimerosañosde 1980,losbiólogos
námicamente factible, tenga lugar a una velocidad descubrieronque,ademásdelasproteínas,ciertasmoléculas
razonable, sin necesidadde activación térmica. deARN, llamadasr.ubp:wras,tienen tambiénactividadcata-
2. Un catalizador funciona formando complejos tran- lítica.Lasribozimasserándiscutidasen una secciónpróxi-
sitorios con las moléculas de sustrato, ligándolas de ma. Aquí, consideraremos las enzimascomo proteínas,las
manera que se facilite su interacción. cualesson,realmente,la mayoría.)
3. Uncutiliffiad a l a q u es e
consigueeI equilibrio; no tiene efectosobrela posi- El sitio activo. Uno de los conceptosmás importantes
cióndelequilibrio.Esdecir,un catalizador puedein- paraentenderlasenzimascomoproteínas, esel de sitio ac-
crementarIa velocidadde las reacciones exergóni- tivo. Cadaenzima,indepe
cas,perono puede,de ningunamanera,servircomo cataliceo de su estructuraparticular,contienedentro de
motor energéticode una reacciónendergónica. En algunapartede su estructuraterciariaun grupocaracterís-
otraspalabras,los catalizadores no son genioster- tico de aminoácidos queformanel sitio activo,dondeocu-
modinámicos. rre el eventocatalíticodel cual esaenzimaesresponsablg.
Estaspropiedades son comunesa todoslos catalizado- Normalmente, el sitio activoesun surcoo bolsillo real con
res,seanorgánicoso inorgánicos. Refiriéndonos a nuestro propiedades químicas y estructurales quepermitenla aco-
ejemplo,estoseaplicaigualmentea los ionesde hierroy a modación adecua9_tyespeclfica. del sustrato. La Figura6.2
lasmoléculasde catalasa. Sin embargo,los sistemas bioló- muestra los modelos obtenidos por ordenador de lasenzi-
gicosraramenteusancatalizadores inorgánicos.En vezde mas lisozima y carboxipeptidasa A, que ilustran bien el
eso,fundamentalmente todaslas catálisisen las célulasse ajuste preciso de la molécula de sustrato en los bolsillos
llevana cabopor moléculasorgánicas(pr.otelnas en la ma- producidospor el plieguecaracterístico de las cadenasde
yorla de los ce.s_o!)-llamadgs-e¡zimas.
Debido a que las en- polipéptidos. La lisozima es una enzimaque rompe las
zimassonmoléculasorgánicas, sonmuchomásespecíficas qniones glicosídicas en los peptidoglicanos de las paredes
quelos catalizadores inorgánicos, y susactividades sepue- bacterianas. conduciendoa la lisis (ruptura) y muertede
den regularcon muchomáscuidado. las bacterias.La carboxipeptidasa A es una enzima que
modificalos polipéptidoseliminandoun aminoácidocada
vezdesdeel extremoC-terminal del polipéptido.
La mayoríade las enzimasson proteínas
El sitio activode una enzimatípica comprendeun nú-
La capacidadde los extractoscelularespara catalizarreac- mero determinadode aminoácidos, que normalmenteno
cionesquímicasseha conocidodesdelos estudiosde la fer- soncontiguos,a io largodela secuencia primariadela pro-
mentaciónde Eduardy HansBuchneren 1897.De hecho, teína.En todo caso,se mantienenjuntos,en una confor-
uno de los primerosnombresaplicadosa lo que ahoralla- macióncorrecta,graciasal plegamiento tridimensionalca-

Figura6,2 Estructurasmoleculares
Sustrato Sustrato de la lisozimay la caÉoxipeptidasa A.
u n i d oa l u n i d oa l
centroactivo Modelo tridimensional compacto
centroactivo generadopor ordenador de las enzimas
(a) Iisozima y (b) carboxipeptidasaA,
con las respectivasmoléculasde sustrato
unidas a sus sitios activos,un segmento
¡ corto de un peptidoglicano bacteriano,
tr
en el casode la lisozima y un péptido
artificial, en el casode la
carboxipeptidasaA.

(a) Lisozima (b) Carboxipeptidasa

A

142 Capitulo6 Enzimas:

loscatalizadores
de la vida
racterístico dela cadenapolipeptídica. Porejemplo,lamo- Esta reacción se puede llevar a cabo en el laboratorio
lécula carboxipeptidasa A, que se muestraen la Figura usando un catalizador de platino (Pt) o de níquel (Ni),
6.2b, consisteen un único polipéptido de 307 residuos como se indica. Estos catalizadoresinorgánicos son muy
amoinoacílicos, delos quesóloseisestánpresentes en el si- poco específicos,pudiendo catalizarIa hidrogenación de
tio activo: los residuos de histidinaen las posiciones 69 y una amplia variedad de componentes insaturados.De he-
196,losde glutamato en lasposicionesT2y 270, el de argi- cho, el níquel o el platino se usan comercialmente para hi-
nina en la posición145,y el de tirosinaen la posición248. drogenar aceitesvegetalespoliinsaturados, en la fabrica-
Estarelaciónde aminoácidossituadosa lo largo de Ia ca- ción de manteca para guisar o de manteca vegetal. Se
dena,subrayala importanciade la estructuraterciariatotal pueden hidrogenar eficazmenteen presenciade níquel o
de la molécula enzímática.Sólocuandola moléculaalcan- platino, con independencia de cuál sea la estructura del
za su conformacióntridimensionalestablese reúnenlos componente insaturado.
aminoácidosespecíficos para constituir el sitio activo. Comparémoslo con el ejemplo biológico de la hidroge-
En realidadsólounospocosde los 20 aminoácidosdife- nación que tiene lugar en la conversión de fumarato en
rentesque forman las proteínas,estánpresentesen el sitio succinato,reacciónque consideraremosde nuevo en el Ca-
pítulo 10:
activode la mayoríade las proteínasque han sido estudia-
das.Casisiempreaparecenlos aminoácidoscisteína,histidi-
na, serina,aspartato,glutamatoy lisina.Ib4gs etlospugden o HO
parficiparen la únión del sustratoal sitio activoduranteel -O-C lll
H H-C-C-O
procesocatalítico,v Ia histidina,el aspartato.y el glutamato' \,/ ^l
C UI
sirventambiéncomodonanteso aceptores de protones. it l +2H*+2e-: il | (6.4)
Algunasenzimas,ademásde estarformadaspor una o
-o-c-c-H
máscadenas polipeptídicas, Puedenportar tambiéncom- ,/\ I
ponentesno proteicos.! stoscomponente H C-O_ H
lt ll
pg!_plgstéticg! normalmente son moléculasorgánicas o
f'equeñas olonesmetálicos'talescomoel hierro dela enzi- Fumarato Succinato
ma catalasa.Frecue_nteme!8, funcjqn4njolqo-gcqplqres
deélectrones, porquenlngu¡o delosaminoácido Estareacciónescatalizada
s en lascélulaspor Ia enzima
de Ia.cadenaesun buen3qgplal-d-9-el9Ell9nes' Los grupos
succinato deshidrogenasa (llamadaasíporquenormalmen-
prostéticos, en los casosen queestánpresentes, te funcionaen el metabolismoenergéticoen la dirección
selocalizan
en el sitio activoy son indispensables para la opuesta).Estadeshidrogenasa,
actividad ca- como muchasenzimas'es
talítica de la enzima.La carboxipeptidasa A es un altamenteespecífica.
ejemplo No puedeañadiro quitarhidrógenos
de una enzirhacon un grupoprostético;tieneun átomode desdeningún compuesto,exceptolos que semuestranen
zinc estrechamente unido a dos residuosde histidina y a
la Reacción 6.4.Dehecho,estaenzimaestan específica que
uno de los glutamatos'en su sitio activo. inclusono puedereconoceral maleato,una isoformadel
fumarato(Figura6.3).
Especificidadenzimática.Una consecuencia dela estructu- No todaslasenzimassontan específicas; algunasreco-
ra del sitio activo es que las enzimasmanifiestanun alto nocenun número muy concreto de substratos, y otrasre-
grado de especificidadpor el sustrato, puesto de mani- conocenuna categoría amplia de sustancias' siempre que
fiesto por su habilidad para discriminar entre moléculas poseancaracterísticas estructuralescomunes. Esta especi-
muy similares.La especificidad esuna de las propiedades ficidad por grupos esmás frecuenteen enzimasimplica-
máscaracterísticas delosseresvivos,y precisamente lasen- dasen la síntesisy degradaciónde polímeros.El objetivo
zirnasson unos de los ejemplosmásespectaculares de es- de la carboxipeptidasa A esdegradarlos enlaces polipeptí-
pecificidadbiológica. dicosdesdeel grupo carboxilo terminal; así,la función de
Podemosmostrar estaespecificidadcomparandolas
enzimascon los catalizadoresinorgánicos.La mayotiade o o
los catalizadores inorgánicosson muy pocosespecíficos y
-o-c H - o - c H
por ello puedenactuarsobreuna variedadde componen- \^/ \^./
tes que compartenalgunacaracterística químicageneral. U

(incorpota- tl
Considere,por ejemplo,la hidrogenación n a
,/ "\ ,,,"\
ción de hidrógenoa un enlaceinsaturadoC:C): ! r
N
^
U-U \J-\, n

HH HH o ó
tl tl
R-C:C-R' + Hz ---------) R-Q-q-R (6.3) (a) Fumarato (b) Maleato
PtoNi I I
HH (a) fumaratoy (b) maleato'
Figura6.3 Losestereoisómeros

biológicos t43
comocatalizadores
Enzimas
estaenzimaesaceptaruna gran variedadde polipéptidos ratura no esproblemáticaparalasenzimasde lascélulasde
como sustratos,ya que la utilización de enzimasdistintas mamíferoso aves,porque estosorganismosson homeoter-
paratodoslos enlacespéptidicosdiferentesque tienen que mos,capaces de regularla temperaturacorporal indepen-
serhidrolizadosen la degradaciónpolipeptídica,represen- dientementedel medioambiente.Sinembargo,losanimales
tarla un gastoinnecesariopara la célula. inferiores,lasplantas,los protistasy lasbacterias,funcionan
Sin embargo,las enzimasson generalmentede alta es- a la temperaturade su medio ambiente,la cualpuedevariar
pecificidadcon relación al sustrato,tanto que una célula mucho.Paraestosorganismos,la dependenciade la activi-
puedeposeercasitantasenzimasdiferentes,como reaccio- dadenzimáticade la temperaturaesmuy significativa.
nestiene qtoecatalizar.Parauna célulatípica, son necesa- La velocidad de una reacción cata[zada enzimática-
rias miles de enzimasdiferentespara cumplir con todo su mente aumentacon la temperatura,dentro de unos lími-
programametabólico.En principio, pareceun gastosuper- tes,porque el incrementoen la energíacinéticade las mo-
fluo tener que sintetizartantasproteínas,almacenartanta léculasde la enzimay del sustrato,conducea una mayor
información genéticay tener siemprea mano tantasenzi- frecuenciaen lascolisiones,facilitandola unión correctaal
mas en la célula.Peroestoimplica enormesposibilidades sustrato.Sin embargo.seIlegaa un punto en el que el au-
de regulación,como veremosmás adelante. mento de la temperaturaes contraproducente,porque la
molécula enzimática comienza a desnaturalizarse.Los
Divetsidad enzimát¡ca y nomenclatura,No essorprendente puentesde hidrógenoserompen,las interacciones hidró-
que hayansido identificadasmiles de enzimas,dadasu es- fobascambian.v la integridadestructuraldel sitio activose
pecificidady el amplio número de reaccionesque ocurren interrumpe,causandola pérdidade la actividad.
dentro de una célula.Estaenormediversidadde enzimasy El rangode la temperaturapor encimadel cual una en-
funcionesenzimáticasha dado lugar a una gran variedad zima sedesnaturalizavariamucho de una enzimaa otra y
de combinacionespara nombrarlas,a medida que eran deun organismoa otro.En la Figura6.4asecomparala de-
descubiertas y descritas.Algunassedenominaronsegúnel pendenciade la temperatura de una enzima típica del
sustrato,comopor ejemploribonucleasa, proteasayamila- cuerpo humano, con una enzimatípica de una bacteria
sa.Otras,cbmo la succinatodeshidrogenasayla fosfoglucoi-termófiIa.La velocidadde reacciónde una enzimahuma-
someresa,se nombraronsegúnsusfunciones.Sinembargo, na esm¡íximaalrededorde los 37 oC,que esla temperatu-
otrasenzimastienennombresqueno estánen absolutore- ra corporalnormal.A partir de ahí el descenso bruscoen
lacionadoscon sussustratoso sus funciones.La tripsina, su actividad reflejala progresivadesnaturalizaciónde las
catalasa,y lisozimason enzimasde estaúltima categoria. moléculasenzimáticas.La mavorla de las enzimasde los
La proliferaciónde nombrescomunesparalas enzimas sereshomeotermosse inactivan por la temperatura,por
y la confusiónresultante,hizo que la Unión Internacional nzimas,la inactivación
de Bioquímicadesignarauna ComisiónEnzimática(EC), @ómeno de laboratorio.Sin embar-
encargadade idear un sistemaracional para nombiar las go, algunasenzimasson extraordinariamentesensiblesal
enzimas.El sistemaEC estárepresentado en la Tabla6.1. calor y se desnaturalizane inactivan a temperaturasmás
Lasenzimassedividen dentro de seisclasesprincipalesba- bajas,en algunoscasos,inclusoa temperaturas corporales
sadasen susfuncionesgenerales, con subgruposparadefi- en personascon fiebrealta.
nir susfuncionesmás precisas. Lasseisclasesprincipales En el otro extremodel espectro,algunasenzimascon-
son oxidoreduct*sts,transferasas,hidrolasas,liasas,isome- servanla actividada temperaturasexcepcionalmente altas.
rasasy ligasas.La Tabla 6.1 proporciona un ejemplo de La curvaverdeen la Figura6.4arepresentala dependencia
cadaclase,usandoenzimasque catalizanreaccionessetra- de la temperaturade una enzimapropia de lasarqueaster-
tarán mástarde en el texto. mófilas,ya mencionadasen el Capítulo 4. ¡Estosorganis,
El sistemaCE designatodaslasenzimasconocidascon mos crecenen manantialescalientesácidosa temperaturas
un número separadoen cuatro partes.Por ejemplo,EC tan altascomo 80 oC!Evidentemente, cadauna de lasmiles
3.4.17.I,esel códigode la carboxipeptidasa A. Losprime- de enzimasque estosorganismosnecesitanpara la activi-
ros tresnúmerosdefinenla clase,subclase y sub-subclase, dad celularnormal, debensercapacesde funcionar a tem-
y el número final esel número de serieasignadoala enzi- peraturasa las que sedesnaturalizanlamayorlade las en-
ma cuandofue añadidaa la lista.Así,la carboxipeptidasa A, zimasen las célulasde otros organismos,incluido usted.
esla primera entradaenla 17.usub-subclase de la cuarta
subclase de la clase3 (hidrolasas).
La listade enzimasque al pH. Las enzimastambiénson sensibles
Sensibilidad al
han sido clasificadasde estaforma, crececontinuamente pH. Muchassólo son activasdentro de un rango de pH de
con las quevan siendodescubiertas y caracterizadas. 3-4 unidades.Estadependencia del pH se debe,normal-
mente,a la presenciade uno o más aminoácidoscargados
Sensibilidad a la temperatura.Ademásde por su especifici- en el sitio activo o en el propio sustrato.La actividadde-
dady diverSidad, lasenzimassecaracterízan tambiénpor su pendede cómo esténestosgrupos,cargadoso sin carga.
sensibilidada la temperatura.Estadependencia dela tempe- Por ejemplo, en el sitio activo de la carboxipeptidasaA,

r44 6 Enzimas:
Capítulo loscatalizadores
delavida
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comocatalizadores
Enzimas bioló$cos
 Temperatura
c óptimapara
'o unaenzimahumana típica
(U
c)
c)
! rangode casi4 unidadesde pH, pero difierenmucho en su
ñ(g
p pH óptimo, consecuentecon las condicionespropias de
q)
60
("C)
Temperatura
C tarde en el capítulo.En el casode enzimascon especifici-
'o
(g
a)
E
c)
c
(Ú
'o
q)
(b) pH
Figura6.4 Efectode la temperatulay el pH en la velocidadde las
reaccionescqtalizadasenzimáticamente. (a) Efecto de la
temperatura eh la velocidad de una reacción catalizadapor una
-bacteria
enzimahumana típica (en negro) y una enzima de una
termófila (en verde). La tasade reacción esmiíxima a la
temperatura óptima, unos 37 oC en el casohumano (la
temperatura de cuerpo) y unos 75 "C en la bacteria (la temperatura
de un manantial termal). El incremento inicial de la actividad con
la temperatura, es debido al aumento de la energíacinética en las
moléculas de enzima y sustrato.Sin embargo,un aumento excesivo
de la temperatura inactiva la reacción,pues la proteína de la enzima
se desnaturaliza.(b) Efecto del pH en la velocidad de una reacción
catalizadapor Ia enzima gástricapepsina (en negro) y Ia enzima
intestinal tripsina (en rojo). La tasade reacción es miíxima al pH
óptimo, aproximadamerLte2,0 para la pepsinay 8,0 para la tripsina.
EI pH óptimo para una enzima se correspondecon la
concentración de protones a la cual los grupos ionizables,tanto de
la enzima,como del sustrato,estánen la configuraciónmás
favorablepara reaccionar.Los valoresde pH lejos del óptimo
producen, en general,modificaciones en Ios grupos cargadosde la
enzima, el sustrato o ambos. El grado óptimo pH de una enzima
sueleser el mismo que el del compartimiento celular,o el medio
externo, en el que la enzima esactiva.
aparecenlos gruposcarboxilosde dos residuosglutamato.
Estosgrupos carboxilosdebenestarpresentesen la forma
cargada(ionizados),de forma que la enzimaseinactivasi
el pH disminuyehastael valor en el cual los gruposcarbo-
xilo del glutamatoen la mayoríade las moléculasenzimá-
ticas,estánprotonados¡ por tanto,sin carga.
Como sepodríaesperar, la dependencia de pH de una
enzimanormalmentereflejael medio ambienteen el cual
la enzimaestáactiva.La Figura6.4bmuestrala dependen-
cia de pH de dosenzimasque degradanproteínas,encon-
tradasen el tracto digestivohumano.La pepsina(líneane-
t46 Capitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
gra) estápresenteen el estómago,donde el pH normal-
mentetiene valoresen torno a 2, mientrasque la tripsina
(línearoja) essecretada en el intestinodelgado,el cualtie-
ne un pH en torno a 8. Ambas enzimasson activasen un
susrespectivas localizacionesdentro del cuerpo.
Sensibilidad a otrosfactores. Otra de lascaracterísticas
de
las enzimasessu sensibilidada otros factores,ademásde a
la temperaturay pH, como lassustancias inhibidoraso ac-
tivadorasde la enzima,un aspectoal cual volveremosmás
dadpor determinados grupos,laactividadtambiénsepue-
de ver afectadapor la presenciade sustratosalternativos.
La mayoríade las enzimasson sensiblesal medio ambien-
te iónico, el cual esprobablementeel que afectaa la con-
formación total de la enzima,debido a que los puentesde
hidrógenodependende é1.El medio ambienteiónico pue-
de afectartambién a las uniones del sustratoporque las
interaccionesiónicasestána menudo involucradasen las
unionesentreel sustratoy el sitio activo.
La unióndelsustrato,la activacióny la reacciónse
producen en elsitio act¡vo
Las enzimasson catalizadoresmuy eficaces,graciasa que
los sustratosencajande forma precisacon el sitio activode
las enzimas.Estaeficaciase puedeobservaren toda su
extensión,si comparamosla catálisisenzimáticacon la
catálisisinorgánica.Como apuntamosanteriormente, las
reaccionescatalizadasenzimáticamenteprogresana una
velocidadde 107a 10ravecesmásrápidoquelasreacciones
no catalizadas,mientrasque las que utilizan catalizadores
inorgánicos, sonde 103a l0avecesmásrápido.Comousted
puedeadivinar,la mayor parte del interéspor las enzimas,
secentraen el sitio activo,dondeocurrenla unión, activa-
ción y transformaciónqulmicadel sustrato.
Launióndelsustrato. El contactoinicial entreel sitio acti-
vo deuna enzimayunamoléculade sustratopotencial,de-
pendede colisionesaleatorias.Srnembargo.una vez eú
hendidura o bolsillo del sitio activo,las moléculasde sus-
trato seunen temporalmentea la superficiede la enzima.
con la orientaciónapropiadapara interaccionarentre sí y
con.gruposcatalíticosqspecíficos de la enzima,lo cual faci-
lita la reacción.La unión delffi
vésde aminoácidoscargados,por medio de puentesde hi-
drógenoo enlaces iónicos(o ambos).Estáiüñion'esson,en
general,débiles,pero la sumade variasde ellasessuficien-
te para mantenera la molécula en su lugar. La fuerzade
unión entre una enzimay una moléculade sustrato,suele
encontrarse en el rangode 3-I2 kcal/mol,menosde un dé-
cimo dela fuerzade un enlacecovalente(téaseFigra2.2).
Por tanto,la unión al sustratoesfácilmentereversible.
 Durante muchos años,los enzimólogosconsideraronel
sitio activo como una estructura rigida. Comparaban el
ajuste de un sustrato dentro del sitio activo a una llave den-
tro de una cerradura,analogíasugeridaen 1894por el bio-
químico alemán Emil Fischer.Esle modelo de cerraduray
llaye, mostrado en la Figura 6.5a, explicó la especificidad
enzimáticapero hizo poco para acrecentarnuestro conoci-
miento del evento catalítico. Un punto de vista más útil
acercade la interacción enzima-sustrato es el provisto por
el modelo de ajuste inducido, propuesto en 1985 por Da-
niel Koshland.Como ilustra la Figura 6.5b,estemodelo su-
pone que la unión inicial de la(s) molécula(s) de sustratoal
sitio activo deforma la enzima y el sustrato,estabilizandoa
las moléculas de sustrato en su estadode transición y per-
mitiendo que los enlacescríticos sean más susceptiblesa
ataquescatalíticos.
La distorsión de ia enzima implica un cambio confor-
macional en la misma ¡ por tanto, en la configuración del
sitio activo. Este cambio posiciona de forma óptima a los
grupos reactivosapropiados de la enzima, para la reacción
catalíticaen la cual intervienen, aumentando asíla proba-
bilidad de que la reacción se produzca. EI cambio confor-
macional aceÍcaal sitio activo a las cadenaslateralesde los
aminoácidos que son críticos para el proceso catalítico,
pero {.ue no estánen las proximidades del sitio activo en la
conformación no inducida. En muchos casos'estascade-
q'Yc*e*(.8
(a) Modelode cerraduray llave
Enlace(s)
desestabilizado(s)
Sitio / 1. El cambio en la conformación enzimática inducida
.Y*\U/-
aCtlVO
- F)-[,(:)/
/ /a\ /
@ por Ia unión del inicial sustrato al sitio activo, no
v,,é\
(b) Modelode ajustelnducldo
Figura6.5 Dosmodelosde interacciónenzima-susttato'
(a) El modelo de cerraduray llave.En estemodelo clásico,la
molécula enzimárica(E) era consideradauna estructura rígida, con
un sitio activo, donde encajabael sustrato (S), análogamentea
como 1ohace una llave en una cerradura. La reacción en el sitio
activo, convierte a las moléculasde sustrato en moléculasde
producto (Pr y Pz).(b) El modelo de ajusteinducido. Segúneste
modelo, la unión de una molécula de sustrato al sitio activo de una
enzima,induce un cambio conformacional en ésta,que sitúa en el
sitio activo a los grupos reactivosadecuados,de manera óptima
para la reacción catalizada.Además,el aiuste estrechoentre la
ánzimay el sustrato desestabilizauno o más de los enlacesdel
sustrato,haciendo que seanmás susceptiblesa un ataquecatalítico.
nas lateralesson grupos ácidos o básicos,que promueven
la catálisis.En el casode la carboxipeptidasaA, la unión del
sustrato atrae a tres residuos aminoacílicos críticos al sitio
activo (una arginina, un glutamato y una tirosina).
Los estudiosde difracción de rayosx de proteínas cris-
talizadashan confirmado que realmentese producen estos
cambios, durante Ia unión del sustrato. La cristalografía
con rayos X se usa para determinar la forma de una molé-
cula enzimática con o sin sustrato unido al sitio activo. La
Figura 6.6 ilustra los cambios conformacionalesque tienen
lugar tras la unión del sustrato ala lisozima,la enzima ya
mostrada en la Figura 6.2a,y parala hexoquinasa,una en-
zima que podremos encontrar de nuevo más adelante en
estecapítulo. En ambos casosse produce un cambio noto-
rio en la conformación de la molécula proteica, como res-
puesta a la unión del sustrato.En el casode la hexoquina-
,u, po. ejemplo, la unión del sustrato (una molécula de
D-glucosa) provoca que dos de los dominios de la enzima
se doblen el uno hacia el otro, cerrando el pliegue del sitio
de unión alrededor del sustrato (Figura 6.6b).
El cambio conformacional al producirse la unión del
sustrato, puede resultar en un desplazamientoextensode
grupos de aminoácidos dentro de la molécula proteica.
¡En el casode la carboxipeptidasaA, por ejemplo, la unión
del sustrato hace que el residuo de tirosina de la posición
248 se mueva a I,2 nm, ¡una distancia aproximadamente
igual a una cuarta parte del diámetro de la molécula enzi-
mática!
Activacióndel sustrato. El papel del sitio activo no es sólo
reconocer y unir el sustrato apropiado sino también acfl-
varlo, sumergiéndoloen el medio químico necesariopara
la catálisis.Una determinada reacción cafalizadaenzimáti-
camente,puede involucrar a uno o más recursosde activa-
ción del sustrato. Los tres mecanismosmás comunes son
Ios siguientes:
sólo causauna mejor complementariedady un ajus-
te más estrechoenzima-sustrato,sino que también
deforma uno o más de sus enlaces,debilitando así
dichos enlaces,haciéndolos más susceptibleal ata-
que catalítico.
2. La enzimatambién puede aceptaro donar protones
incrementando, por tanto, la reactividad química
del sustrato.Esto da cuenta de la importancia de los
aminoácidos cargadosen la química del sitio activo,
lo cual, a su vez, explica por qué la actividad de la
enzimasueleser tan dependientedel pH.
3. Como forma adicional para la activación del sustra-
to, las enzimas también pueden aceptar o donar
electrones,formando de esemodo enlacescovalen-
tes temporales entre la enzima y su sustrato.El me-
canismo necesitaque el sustrato tenga una región
Enzimas biológicos t47
comocatalizadores
 Sustrato
(peptidoglicano)
V \r.
(a) Lisozima
(b) Hexoquinasa
que seaelectropositiva (deficienteen electrones;o
electronegativa (ricaen electrones)y queel sitio ac-
tivo de la enzimatengauno o másgruposde polari-
dad opuesta.
El acontecimiento catalitico. La secuenciade aconteci-
mientos que tienen lugar en el sitio activo,seilustra en la
Figura6.7,tomandocomo ejemploala enzimasacarasa.
La sacarasa hidrolizael disacáridosacarosa en glucosay
fructosa.Hastael momento,hemosvisto que la colisión
inicialaleatoriade una moléculade sustrato-sacarosa,en
ssfs 6¿s6- con el sitio activo, tiene como resultado su
unión a residuosaminoacílicos que estánposicionados es-
tratégicamente allí (Paso1). La unión del sustratoinduce
un cambioen la conformaciónenzimáticaque intensifica
el ajusteentre la moléculasustratoy el sitio activo,facili-
tando de esemodo la conversióndel sustratoen los pro-
ductos,en estecasoglucosay fructosa(paso2). Después,
estosproductosse liberan desdeel sitio activo (paso3),
permitiendo que la moléculaenzimáticaregresea su con-
formación original, quedandoel sitio activo ahora dispo-
nible para admitir otra moléculade sustrato(paso4). ¡La
148 Capítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
Figura6.6 Cambioconformacionalen la estluctura
de la enzima,inducidopu la unióndel sustrato,
Aquí semuestran los modelos compactosde las
enzimas:(a) lisozimay (b) hexoquinasay sus
sustratos(un peptidoglicano artificial y una
molécula de o-glucosa,respectivamente).En
ambos casos,la unión del sustrato induce un
cambio conformacional en la enzima, detectable
por análisisde difracción con rayos-X.
secuencia completade acontecimientostienelugar en un
tiempolo suficientemente cortoparapermitir queen el si-
tio activo de una solamolécula enzimáticaocurran cien-
tos,o inclusomiles,de talesreacciones
por segundo!
Cinética enzimática
Hasta el momento, nuestra exposición acercade las enzi-
mas ha sido básicamentedescriptiva. Hemos hablado del
requerimiento de energía de activación que evita que las
reaccionestermodinámicamente factibles ocurran, y de los
catalizadores como medio de reducir la energía de activa-
ción y de esemodo facilitar dichasreacciones.Thmbién he-
mos consideradoa las enzimascomo catalizadoresbiológi-
cos y hemos examinado su estructura y función .ot -á,
detalle.Además,nos hemos dado cuenta de que las únicas
reacciones que probablemente ocurren en las células a ve-
locidades razonables, son aquellas para las cuales las enzi-
mas específicasestán al alcance de la mano, de manera que
la capacidad metabólica de una célula, está especificáda
por las enzimas que estánpresentes.

Complejo
enzima-
sustrato
@ Elsitioacrivo
o<1¡ dicn^nrh é
paraotra
moiecula
de sustrato.
O L o sp r c c l L r c t o s
5 0 ni o e f a t o s
Fructosa
Figuta6.7 Cfclocatalíticode unaenzima, En esteejemplo,la enzimasacarasa
Inclusocuandofaltanlas enzimasDodemosservirnos
de su ausenciaparacalcular,por com¡aración,la veloci-
dad real a la cual tiene lugar una reaccióncatalizadaenzi-
máticamentey cuálesel efectoejercidopor determinados
factoresen la velocidadde reacción.La simplepresencia
de la enzimaapropiadaen Ia célulano aseguraque una
determinadareacciónpuedaocurrir a una velocidadade-
cuada,a menosque también podamosestarsegurosde
quelascondicionescelularessonfavorables parala activi-
dad enzimática.Yahemosvisto que hay factoresque pue-
den influir en la actividadenzimática.talescomo la tem-
peraturao el pH. Ahora estamospreparadosparavalorar
cómo la actividad enzimáticatambiéndependede la con-
centraciónde los sustratos, de los produciosy de los inhi-
bidorespresentes en la célula.Además,veremoscómo,al
menos algunos de estos efectos,pueden ser definidos
cuantitativamente.
Cuando dirigimos nuestra atención a estosaspectos
cuantitativosde la catálisisenzimática,nos encontraremos
en el campbde la cinética enzimática.I,a palabracinética
es de origen griego (Klnetlkos,siqnifica<movimiento>).
Aplicadaa lasreacciones químicas.la cinéticaconciernea
Q E I s u s t r a t oc o l i s i o ncao n e l
s r t i oa c t i v o d, o n d ee s m a n t e n i d o
p o ' e n l a c e ds e b r i e cs o r ^i o sg , u p o sR
d e o s a r i r o ¿ cr c o so e s i t i oa c t i v o .
L a u n i o nd e l s u s t r a t op r o v o c au n c a m b i o
contorr¡ao c n a e n l a e n z i m a r, e s p o n s a b l e
d e q u e e l s u s t r a t os e au n i d om á s
firmemente ( a l u s t ei n d u c r d o t
:t+ HrO
@ Sustrato
e5 colrverti0L)
e¡ pfocjuctos
t
catalizalahidrólisis
de sacarosa
en glucosay fructosa.
lasvelocidades de reaccióny la maneraen que esasveloci-
dadesestáninfluidaspor varios factores,pero especial-
mentepor la concentración delsustrato.delosproductosy
de los inhibidores,Aquí nos centraremos,mayoritaria-
mente,en los efectosde la concentración del sustratoen la
cinética de las reaccionescatalizadasenzimáticamente.
Nuestroestudioestarálimitado alasvelocidades inicialesde
reacción, medidasalrededorde un periodode tiempoen el
cual la concentraciónde sustratotodavíano ha disminui-
do lo suficientepara afectara la velocidad,y la acumula-
ción de producto es todavíapequeñapara provocaruna
reacciónapreciable,en sentido contrario.Aunque esto es
una simplificaciónde lo queocurrerealmente, nospermi-
tirá entenderalgunosprincipiosimportantesdela cinética
enzimática.
La cinéticaenzimáticapuedeparecerbastantecomple-
ja al principio. Paraa¡rdarle a entenderlos conceptosbá-
sicos,en el Anexo6A seplanteaun símil, en el cual,lasep-
zimas que actúan sobre las moléculas de sustrato, se
comparancon una habitaciónllena de monos pelando
cacahuetes. Puederesultarleútil recurrira la analogíaaho-
ra y regresardespués a estasección.
Cinética
enzimática 149
 Anexo

MoNos Y CACAHUETES
Si le parecióde utilidad el ejemplode los frijoles saltarines la puertay permitimos que los ansiososmonos pasena la
mejicanos,para entenderel conceptode energíalibre del Galeríade Cacahuetes.
Capltulo 5, qraá apreciela aproximacióna la cinética
enzimáticabasadaen la analogíacon una habitaciónrepletade el peladode cacahuetes
Comienza
monos (<enzimas>) y una cantidadvariablede cacahuetes Yaestamoslistospara nuestroprimer análisis.Comenzamos
pelados(<sustratos>). Tiate de entendercadapaso,primero en con una concentracióninicial de un cacahuetepor metro
términos de monos pelandocacahuetes, y luegocomo una cuadrado,y asumimosque,con estaconcentración,un mono
'
auténticareacción,catalizadaenzimáticamente. tarda como media9 segundosen encontrarun cacahuete yI
segundoen pelarlo.Estosignificaque cadamono necesita10
LaGaleríadelCacahuete segundospor cacahuete y por tanto puedepelarlosa una
Paranuestromodelo,necesitamosuna tropa de diez monos, velocidadde 0,1 cacahuetes por segundo.Como hay l0 monos
todos igualmenteexpertosen encontrary pelar cacahuetes, en la galería,la velocidadv de peladode cacahuetes para el total
Suponemostambién que los monos son incapacesde comeü de los monos esde 1 cacahuetepor segundo,con esta
siquiera,uno solo de los cacahuetes que pelan,pero pesea concentraciónde cacahuetes (la cual llamanos[S] para recordar
todo, sufrenuna necesidadcompulsivade seguirpelando. que los cacahuetes son el sustratode la acciónde pelar).Todo
(Parahacerel modelo algo más riguroso,podemosinsistir estosepuedetabular como sigue:
que los cacahuetes son una nuevavariedadhíbrida, que se
puederecomponerfácilmente,y que los monos,lo mismo [S] : concentraciónde cacahuetes I

estáncolocandolos cacahuetes dentro de suscáscaras, que (cacahuetes/m2)

pelándolos.Peroestasconsideraciones no nos preocupan
\ Tiempo requeridopor cacahuete:
aqul; sólo estamosinteresadosen las condicionesiniciales
en las cualestodos los cacahuetesestándentro de sus Paraencontrarlo(segundo/cacahuete) 9
cáscaras.) Parapelarlo (segundo/cacahuete) 1
Necesitaremos tambiénla Galeríade Cacahuetes, una Total (segundo/cacahuete) 10
habitaciónde superficieconociday en la cual los cacahuetes se Velocidadde pelado:
distribuyenhomogéneamente en el suelo.EI número de
Por mono (cacahuete/segundo) 0,10
cacahuetes variaráa medidaque avancemos, pero en todo
que Total (r) 1,0
momento,en Ia habitaciónhabrámuchosmáscacahuetes
monos.Además,dado que conocemosel número de cacahuetes
y la superficiedel suelo,podremoscalcular<laconcentración> Aumenta
el númerode cacahuetes
(parasermásexactos,Ia densidad)de cacahuetes en la Paranuestrosegundoensayo,llevamosa todoslos monos de
habitación.En cadacaso,los monos comienzanen una salade y
vueltaa la salade espera,barremoslos desperdicios,
esperacontigua.Paraempezarel ensayo,simplementeabrimos empezamosahoracon una concentraciónde 3 cacahuetes por

La mayofa de las enzimass¡guenla cinética
de Michaelis-Menten
Desdehacemucho tiempo sesabeque la velocidadde una
reaccióncatahtafiá;éMffiá'fíiáfoénti.aumentacon la con-
centraciónde sustrato,pero de tal forma, que cadaincre-
mento adicional de sustrato,da como resultadoun au-
mento menor de la velocidadde reacción.De maneramás
precisa,sepuedeobservarexperimentalmenteque la rela-
ción entre la velocidad inicial de reacción yy la concen-
tración de sustrato[S] es una hipérbole,.oÁo ,. ilustra
en la Figura6.8.Una propiedadimportantede estarela-
ciónhiperbólicaesquea medidaque [S]tiendehaciael in-
finito, y tiende hacia un valor miíximo, que dependedel
número de moléculasenzimáticas¡ por tanto, sólo puede
incrementarseañadiendomásenzima.
La incapacidadpara aumentarla velocidadde reac-
ción más allá de un valor finito máximo a concentracio-
nes de sustrato cadavez más altas,se llama saturación.
Estaes una característica fundamentalde las reacciones
catalizadasenzimáticamente. Las reaccionescatalizadas
siemprellegan a saturacióna concentraciones altas de
sustrato,mientrasqueestono ocurreen lasreacciones no
catalizadas.
Gran parte de nuestracomprensiónde la relaciónhi-
perbólicaentre [S] y l sedebea los trabajospionerosde
dos enzimólogosalemanes,Leonor Michaelisy Maud
Menten.En 1913,postularonuna teorlageneralde la ac-
ción enzimática,que ha resultadoserla basepara el análi-
siscuantitativode casitodoslos aspectosde la cinéticaen-
zimática.Paraentendersu enfoque,considereuna de las
posiblesreaccionescatalizadas enzimáticamentemás sim-
ples,en la cual un único sustratoS seconvierteen un úni-
co producto P.
S ---------+ P
Enzlma \El
(6.s)

150 Gapitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
metro cuadrado.Como la cantidadde cacahuetes seha
triplicado,cadamono podrá encontrarun cacahuetetresveces
másrápidamenteque antes,esdecir,que el tiempo que emplean
en encontrarel cacahuete,ahoraesde sólo 3 segundos.Dado
que sesigueempleandoI segundoen pelar cadacacahuete, el
tiempo total por cacahueteesahorade 4 segundosy la
velocidadde peladoes0,25cacahuetes por segundoy mono, es
decír,2,5cacahuetes por segundopara el total de los de monos.
Estogeneraotra columnade entradaspara nuestratabla de
datos:
lSl = concentraciónde cacahuetes 1 quéla curvacontinúandoblándose,a medidaque [S]
(cacahuetes/m2)
Tiempo requeridopor cacahuete:
Paraencontrarlo(segundo/cacahuete) 9
3
Parapelarlo (segundo/cacahuete) 1 I
Total (segundo/cacahuete) l0 4 encontrarlo,escadavezmenor.Esprecisamente
Velocidadde pelado:
Por mono (cacahuete/segundo) 0,10
Total (/) 1,0
óQuéocuresi v y [S]cont¡núan
aumentando?
Paradescubrirqué ocurre finalmentecon la velocidadde
peladosi Ia concentraciónde cacahuetesen la galeríaescada
vez mayor,lo único que hay que haceresampliar la tabla de
datos,suponiendoun incrementode los valoresde [S] V
calculandola correspondientey. Por ejemplo,una
concentración triplicadade cacahuetes(de 3 a 9
cacahuetes/m2) conducea una reduccióndel tiempo-necesario
por cacahuete,que ahoraseráde 2 segundos( 1 segundopara
encontrarloy otro segundoparapelarlo),con una velocidadde
Segúnla hipótesisde Michaelis-Menten,la enzima E
qloecatalizaestareacciónreaccionaprimero con el sustrato
S, formando un complejoenzima-sustrato transitorio,ES,
que sufreluegola reaccióncatalíticareal,paraformar la en-
zima libre y el productoR como semuestraen la secuencia
Er+s * tt {ie,+r (6.6)
donde E¡ es la forma libre de lu .rrri-u, S es el sustrato,ES
es el complejo enzima-sustrato,P es el produ cto,y k1,k2,k3
y knson las constantesde velocidad para las reaccionesin-
dicadas.
Comenzando con este modelo y suponiendo varias
simplificaciones, Michaelis y Menten llegaron a la siguien-
te relación entre la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamentey la concentración de sustrato:
y^""Is]
v: -=------.^: (6.7)
K- + LSl
peladode 0,5 cacahuetes por segundoy mono, o 5 cacahuetes
por segundoen total.
Ya seempiezaa ver una tendencia.El primer triplicado
de la concentraciónde cacahuetes aumentóla velocidad
2,5veces,pero el siguientetriplicadosólola dobla.Esdecir,
que Ia progresiónno eslineal.Puedever estoclaramentesi
eligeuna concentraciónalgo mayor de cacahuetes y representa
v en el eje/ (escalasugerida:0- 10 cacahuetes/segundo) y [S]
en el ejer (escalasugerida:0-100cacahuetes/m2.¡. Como verá,
los datosgeneranuna curvahiperbólicamuy parecidaa la de
Ia Figura6.8,y si observacuidadosamente susdatos,verápor
incrementa(esdecir,porquela velocidadincrementa
progresivamentemenosconforme aumentael número de
cacahuetes): el tiempo de peladoesfijo y por tanto llegaa ser
un componentecadavezmás importante del total del tiempo
empleadopor cacahuete mientrasque el tiempo para
estetiempo
fijo de peladoel que establece el límite superioren la velocidad
de procesamiento del cacahuete,porqueinclusosi [S] fuera
infinita (o sea,en un mundo repletode cacahuetes), todavíase
precisaríaun tiempo finito de I segundoparaprocesarcada
cacahuete.
Por último, ustedpuededarsecuentade que hay algo
especialen la concentraciónde cacahuetes a la cual,el tiempo
para encontrarlos,esexactamenteigual al tiempo de pelado
(éstaresultaserde 9 cacahuetes/m'). Esteesel punto de Ia curva
en el cual la velocidadde procesamientodel cacahuetees
exactamentela mitad de Ia velocidadmáxima.De hecho,esuna
referenciatan importante en la escalade concentración,que
ustedpodría estartentadode darleun nombre especial,sobre
todo si sellamaraMichaelisy ¡estuvierahaciendoel mono con
enzimasen vezde con cacahuetes!
Aquí, IS] esla concentracióninicial de sustrato,y esla velo-
cidad inicial de reaccióna esaconcentraciónde sustrato,y
V-o y K- sonparámetroscinéticosimportantesque consi-
deraremos enla próximasección. Éstaesla ecuaciónMichae-
lis-Menten, la principal de la cinéticaenzimática.(El Pro-
blema6.11al finaldelcapítulole daráunaoportunidadpara
deducirpor sí mismo la ecuaciónde Michaelis-Menten.)
¿Cuáles ef significado
de V^,y K^?
Paravalorarlasconsecuencias de la relaciónentrevy [S] y
examinarel significadodelos parámetrosV-u*y K-, pode-
mos considerartres casosespeciales de concentraciónde
sustrato:concentraciónde sustratomuy baja, concentra-
ción de sustratomuy altay el casoespecial de [S] : K-.
de sustratomuyba¡a([S]< K,). A
Caso1: concentración
concentraciónde sustratomuy baja, [S] es despreciable
Cinética
enzimática 1 5 1
 Esto nos proporciona una definición de V-*, uno de
los dos parámetros cinéticos de la ecuación de Michaelis-
Menten. V-u" es la velocidad máxima, o el valor límite su-
s perior, al cual tiende la velocidad de reacción inicial v
E cuando la concentracióndel sustrato [S] seacercaal infini-
.O
-c to. En otras palabras,V-",es la velocidad a concentración
ñ 7\/
p
o 2'max saturante de sustrato.En estascondiciones,toda molécula
O
enzímática está ocupada, casi todo el tiempo, en el proceso
a)
real de la catálisis,puesto que Ia concentración de sustrato
es tan alta que, casi alavez que se libera una molécula de
producto, llega otra molécula de sustrato al sitio activo.
Por tanto, el límite superior de V-u, se determina por
Concentración
de sustratoLSI 1) el tiempo necesariopara la reaccióncatalíticareal más la
K
m
liberación subsiguientedel producto desdela superficiede
cadamolécula de enzima,y2) eInúmero de moléculaspre-
Figura6.8 Relaciónentre la velocidadde leaccióny la
sentes.Debido a que la velocidad real de la reacción es li-
concentlaciónde susttato, Parauna ¡eacción catalizada
enzimáticamente, que siguela cinéticade Michaelis-Menten,la mitada, la única manera de que la V-", pueda aumentar es
velocidad inicial tiende hacia un límite superior de velocidad V*u* incrementando la concentración de la enzima. De hecho,
a medida que la concentraciónde sustrato[S] tiende hacia V-u* es linealmente proporcional a la cantidad de enzima
el infinito. La constantede Michaelis-MentenK- corresponde presente,como se muestra en la Figura 6.9.
a la concentraciónde sustratopara la cual la reaccióntiene lugar a
la mitad de la velocidadmáxima.
Caso3: ([S] = l(r). Hasta el momento, hemos visto Ia ra-
zón para Ia cinética de las reaccionesde primer orden a
comparada con Ia constante K. del denominador de Ia concentracionesde sustratobajasy para cinéticasde orden
ecuación de Michaelis-Menten, por lo que podemos es- cero a concentracionesaltas.También hemos formulado la
cribir definición para V-u*, pero todavía tenemos que descubrir
el significado del segundo parámetro cinético, K-. Fíjese
,,_ v."*[S].- v."*[s]
' - (6.8) que con independenciade su significado, K- parecetener
K-+lsl K- algo que ver con la determinación de cuánto de baja debe
Por tanto, a concentración de sustratomuy baja, la ve- ser la concentración de sustrato,para asegurarla cinética
locidad inicial de reacción es más o menos proporcional a de primer orden, o bien, cuánto de alta debe ser,para ase-
la concentración de sustrato.Éstaes,por tanto, la regiónde gurar la cinética de orden cero.De estamanera, K- parece
primer orden de la gráfrcade Michaelis-Menten. Mientras ser un punto de referencia en la escalade concentración
la concentración del sustrato sea mucho más baja que el que determina cuánto de alto es alto y cuánto de bajo es
valor de K-, la velocidad de una reacción catalízada enzi- bajo. Para explorar su significado de manera más precisa,
máticamente, aumenta casi linealmente con la concentra- considere el caso especial en el que [S] es exactamente
ción de sustrato.

Gaso 2: Concentraciónde sustrato muy alta ([S] > ,(,). A

concentracionesde sustrato muy altas,K- se vuelve insig-
nificante comparada con [S] en el denominador de Ia
ecuación de Michaelis-Menten,y podremos escribir:

V.o*[Sl - V.r*[Sl -r,

,' , - - 'max' (6.e)
K- + LSI LSI
Estarelación significa que, a concentracionesde sustra-
to muy altas, la velocidad de una reacción catalizada enzi-
máticamente, es esencialmenteindependiente de Lavaria-
ción de la IS], volviéndosecasiconstante.Éstaconstituyela
región de orden cero de la representación de Michaelis- Concentración
de la enzima[E]
Menten. Mientras la concentración de sustrato seamucho
Figura6.9 Relaciónlinealentre V,"" y la concentración enzimática.
mayor que el valor de K*, la velocidad no seve afectadapor
EI incremento iineal en la velocidad de reacción en función de la
los cambios en la concentraciónde sustrato,permanecien- concentración dela enztma,proporciona la basepara determinar,
do casi constante,con valorespróximos a V^u,. experimentalmente,las concentracionesde enzima.

r52 Capitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
iguala K^. Bajoestascondiciones,
la ecuaciónde Michae- V-* también puede usarse para determinar otro pará-
lis-Mentensepuedeescribircomo metro útil llamado número de recambio (K."J, que expre-
y-*[s] sa la velocidad a la cual las moléculas de sustrato se con-
Y: : v_u"[s]: v-* (6.r0) vierten en producto por una única molécula de enzima,
K*+tsl ,rsl 2 cuando ésta está funcionando a su máxima velocidad. La
Estaecuaciónnos proporciona la definición que hemos constante (u, se expresa en unidades de tiempo inverso
(s-', por ejemplo) y se calcula como el cocienteentre V-*
estadobuscando: K- es la concentración de sustrato para
la cual la reacción tiene lugar a la mitad de su velocidad y [E,], la concentración de la enzima en moles/litro:
máxima. Esta concentración es un valor fijo para cada en- t' /m u
r
zima que cataliza una reacción determinada bajo unas '-cat
fl !Ff l I
(6.u)
condiciones específicasy se denomina constante de Mi-
chaelis (de ahí su abreviaturaK-) en honor al enzimólogo El número de recambio varía mucho entre enzimas,
que dilucidó su significado.La Figura 6.8 ilustra el signifi- como se apreciaen los ejemplos dados enlaTabla 6.2.
cado de V-u,y de K-.

La gálicadoblerecíproca
es unaformaútil
¿Porquéson importantesVr.* y Kmpa¡alos Biólogos de representar
losdatoscinéticos
celulares?
La gráfi,ca
clásicade Michaelis-Menten de y frentea [S],tal
Ahora que entendemos lo que significaDV-* y K-, debe-
y como semuestraen Ia Figura6.8,esuna representación
mos preguntarnos por qué estosparámetroscinéticosson
fiel de cómo Ia velocidaddependede la concentración de
importantesparalos biólogoscelulares. El valor de K. es
sustrato,pero no es una herramientaespecialmente útil
útil, porquenos permitecalcularen quéparteen la repre-
paraladeterminacióncuantitativade los parámetrosciné-
sentaciónde Michaelis-Menten de Ia Figura6.9, estáfun-
ticosclavesK^y V^u*.Suforma hiperbólicahacedifícil ex-
cionandouna enzima(suponiendo,por supuesto,que la
trapolarconprecisiónel parámetrocrítico V^^*,a concen-
concentración de sustratoen la célulaesconocida).Pode-
tración infinita de sustrato,y si V.u* no es conocidacon
mos entonces calculara quefracciónde Ia velocidadmáxi-
precisión,K- no se puededeterminar.Esteproblemase
ma esprobableque Ia reaccióncatalizadaenzimáticamen-
apreciaen la Figura6.9,en la que seríadifícil calcularV-u*
te tengalugaren la célula.Además,K- sepuedeconsiderar
si no estuvieraya dibujada,y sin V-u*,K- tampocopuede
como un cálculoaproximadode la <calidad> esuna enzi-
sercalculadafácilmente.
ma, en el sentidode que,cuantomásbajo esel valor K-,
Parasolucionaresteproblemay proporcionarun enfo-
más bajo es el rango de concentraciónde sustratoen el
que gráfico más útil, Hans Lineweavery Dean Burk con-
cual la enzimaeseficaz*.Losvaloresde K- paravariasen-
virtieronla relaciónhiperbólicade la ecuaciónde Michae-
zimasaparecen en la Tabla6.2.
lis-Mentenen una función linealinvirtiendoamboslados
La V-"* de una reacciónparticularnos proporciona
de la Ecuación6.7y simplificandola expresiónresultante
una medidadela tasade reacción.Realmente sonpocaslas
con la forma de una ecuaciónparauna línearecta:
enzimasque se encuentran,in vivo, con concentraciones
saturantesde sustrato,de maneraque las enzimasrara- 1_ K.+[S] K* [S]
_ _,
mentevan a funcionarlejosde susvelocidades miíximas, v V-o[S] Y-*[S] Y.".[S]
en condicionescelulares. Sin embargo,conociendolos va-
lores de V-",, K-, y la concentraciónde sustratoen vivo, 'l
podremosal menosestimarla velocidadprobablede la - K^ lf * I (6.r2)
reacción,en dichascondiciones celulares. v^* \lsl / v_*

del(, y k r, paraalgunas
Tabla6.2 Valores enzimas
Nombre
de la enzima Sustrato ,(' (M) k n(s-")
Acetilcolinesterasa Acetilcolina g x 10-s 1 , 4 9x 1 0 4
Anidrasacarbónica Cot 1 X 10-2 1 X106
Fumarasa Fumarato 5 X 10-Ó g xl02
Triosafosfatoisomerasa Gliceraldehído3-fosfato 5 X 10-4 4,3 x 103
B-lactamasa Bencilpenicilina 2 X 10-s 2 Xl03

* K- se considera a menudo como una medida de la afinidad de una enzima por sus sustratos,es decir, como la constantede disociación para ES.
Sin embargo,
es una relación de las constantesde velocidades:K^ : (k, + k) I h, Para conocer las consecuenciasde estarelación, véaseelPrcblema 6.I I a1final del capítulo.

Cinética
enzimática 1 5 3
 La Ecuación6.12 esla ecuaciónde Lineweaver-Burk.
Cuandoéstaserepresentacomo Ilv frentea l/[S], como
en la Figura 6.10,la gráfrcadoble recíprocaresultante es
lineal,con una intersecciónde IIV^^ con el ejey, otra de
-llK^,con el ejex,yunapendienteK^lV^o. (Puedecon-
vencersea sí mismo de estosvaloresde intersecciónesta-
bleciendoprimero 1/[S],igualandollv a ceroen la Ecua-
ción 6.12y resolviendoluegoel otro valor.) Por tanto, una
vez que seha dibujado la representacióndoble recíproca,
V-* se puede determinar directamentea partir del recí-
proco de la interseccióncon el ejey,y K- a partir del re-
cíproconegativode la interseccióncon el ejex. Además,la
pendientesepuedeusar para comprobarambosvalores.
De estamanera,la representaciónde Lineweaver-Burk
esútil porqueconfirma mediantesu linealidadquela reac-
ción en cuestiónestásiguiendola cinéticaMichaelis-Men-
ten, y permite determinarlos parámetrosV-o y K- sin la
complicación de una curva hiperbólica. Thmbién sirve
comoun diagnósticoútil en el análisisde la inhibiciónen-
zimática,porquela forma de la representación seve afecta-
da de forma característica, por varias tipos diferentesde
inhibidoresreversibles.
Sin embargo,la ecuaciónde Lineweaver-Burktiene al-
gunaslimitaciones.El principalproblemaesque,a menu-
do, seprecisauna extrapolaciónelevadapara determinar
K-, por lo queel resultadopuedeserpocofiable.Además,
los datosmáscrucialesen Ia determinaciónde la pendien-
te de la curvasuelenserlos másalejadosdel eje¡ éstosse
corresponden conlasconcentraciones másbajasde sustra-
to y los nivelesbajosde la actividad enzimática,y por tan-
to, con los valoresmásinciertos.
Parasortearestasdesventajas, sehan propuestovarias
alternativas a la ecuaciónde Lineweaver-Burk. Una de ellas
es la ecuaciónde Eadie-Hofstee,que se representacomo
una gráficade v/[S] frentea v. Como seilustraen la Figu-
ra 6.1I, V-o sedeterminapor la intersección con el ejexy
K- a partir de la pendiente.(Paraexplorarla representa-
,*,(tJ.t'*
Intersección .j
C O ne l e J ex = - v Intersección
Km 1
con el eJeY =;-
v^^*
1/[S]
Figura 6.10 Representacióndoble reciprocade Lineweaver-Burk.
El recíproco de la velocidad inicial Uv, serepresentacomo una
función del recíproco de la concentración de sustrato, 1/[S]. K-
puede calcularsepor la interseccióncon el eje xy V-o, coneleje y.
154 Gapítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
Intersección
con el eje y = V^
*l K^
vV^uv -
=
ra1 ,K K
Lvl .m '.m
v/[S]
Figura
6.11 Representación de EadieHofstee. La relaciónv/lSl se
comounafunciónde r;.K- puededeterminarse
representa desdela
pendientey V-o por la intersección
con el ejex.
ción de Eadie-Hofsteey otra alternativamás a la represen-
tación Lineweaver-Burk,vea el Problema 6.12. al final de
estecapítulo.)
de K^y V^u*
Unejemplode determinación
Considereun ejemplo específicopara determinar V** y
K-, a partir de la representacióndoblerecíproca,que im-
plique a la enzimahexoquinasa,como seilustra en las Fi-
guras6.12y 6.13.La hexoquinasa esuna enzimaesencial
en el metabolismoenergéticocelular,porque cataliza\a
primerareaccióndela glucolisis, la cualsediscutiráen de-
talle en el Capítulo 9. La hexoquinasacatalizala fosforila-
ción de la glucosaen el átomo de carbono6, usandoATP
comofuente,tantode fosfato,comodela energíanecesaria
parala reacción:
Glucosa+ AIP -----------)
Glucosa-6-fosfatof ADP (6.13)
Hexoquinasa
Para analizar cinéticamente esta reacción, debemos
determinar la velocidad inicial en cada una de las diversas
concentraciones de sustrato. Cuando una enzima tiene
dos sustratos,el enfoque habitual es variar la concentra-
ción de un sustrato en un momento dado. mientras se
mantiene la del otro constante, a un nivel suficientemente
alto (cercade la saturación), para asegurarque no llegue a
ser un factor limitante de la velocidad. Debemos también
tener cuidado de asegurarnosde que la determinación de
la velocidad se haga antes de que el producto se acumule
hasta los valores que hagan que la reacción contraria pue-
da tener lugar.
En el enfoque experimental que se muestra en la Figu-
ra 6.I2,la glucosa es el sustrato variable, con el AIP pre-
sente a una concentración saturante en cada tubo. De las
nueve reaccionesde mezcla programadaspara esteexperi-
mento, una se toma como blanco (B), porque no contiene
glucosa.Los otros ocho tubos tienen concentracionesgra-
duales de glucosaque van desde0,05 a0,40 mM.Unavez
 naspropiedades especialesque la alejende la cinéticade

püüwwwffiwry
I-'t |--t |-1 t-1 t-1 t-T t-T |-1 t-1
Númerode tubo:
lBll 1ll2ll3ll4ll5ll6ll rllsl Michaelis-Menten.
La curvahiperbólicade Ia Figura6.12ilustrala necesi-
[S]= lglucosal
(mM):
dad de recurrir a un análisislineal, porque no se pueden
v (pmol/min):
obtener,ni V-*, ni K-, a partir de los valoresde la repre-
sentaciónhiperbólica,aunquese dispongade los datos
Bliiii para construir la curva.Sin embargo,la representaciónli-
f
a
nealdoblerecíprocade la Figura6.13,sí lo permite.Para
OE
obtenerlos datosmostradosaquí,se calcularonlos recí-
procosde cadavalorde [S]y v dela Figura6.12.Asi,losva-
-tr loresde [S] de0,05-0,40 mM, generanrecíprocos de20-2,5
'6*
mlullt, y los valoresde v de 2,5-7,3¡.rmol/min,arrojanre-
¡O
,, - /t"" [S] cíprocosde 0,4-0,14min/¡rmol.Dadoquesonvaloresrecí-
K* + [S] procos>el dato del tubo I es el más alejadodel origen,
-oOcA)
mientras que cadatubo sucesivo,alcanzaráun valor más
próximo al origen.
o
- 0: Cuandoestosdatossevan uniendo por medio de una
0,10 0,20 0,30 0,40 línearecta,la interseccióncon el eje7 coincidgcon el valor
[S]= Concentración
de glucosa
(mM) '.
0,1min/mmol, y la del ejex" con -6,7 mluf Desdeestas
Figwa 6.L2 Estudioexpeilmentalde la cinética de la reacciónde la intersecciones con los ejes,podemoscalcularque V-o :
hexoquinasa. Seincubó una seriede tubos de ensayocon 1/0,1 10 prmol/miny K- : -(ll-6,7) : 0,15mM. Si
:
concentracionescrecientesde glucosay una concentración saturada ahora volvemosa la representaciónde Michaelis-Menten
de ATR añadiendo una cantidad estándarde hexoquinasa.La
de la Figura6.12,podremosver queambosvaloressonra-
velocidad inicial de la aparición del producto, v, se representócomo
una función de la concentración del sustrato [S]. La curva es zonablesporquepodemosimaginarfácilmenteque la re-
hiperbólica, acercándosea V-*, a medida que la concentración de presentaciónestá creciendohiperbólicamentehasta un
sustrato escadavez mayor. Parala representacióndoble recíproca miíximo de l0 nmollmin. Más aún, Ia gráfrcaalcanzala
derivadade estosdatos,véaselaFigura 6.13. mitad de su valor a una concentración de sustratode 0,15

preparados los tubosy mantenidosa una temperaturafa-

vorable (generalmente, 25 oC),se inicia la reacción,me- Número Itll ;l I;l Itl |;l
detubo: I,I
diantela adiciónde una cantidadfija de hexoquinasa.
La velocidadde formacióndel productosepuedede-
terminar,bien mediantemonitorizaciónespectofotomé-
trica continuade Ia reacciónde mezcla(suponiendoque
rlr.r$ffi|
1/v(min/pmol)
|B
uu|8|ffiu 4 0 , 1 50 , 1 80 , 2 00 , 2 5
uno de los reactivoso productosabsorbenluz de una de-
terminadalongitud de onda),bien permitiendoque cada
reacciónde mezclaprogreseduranteun periodode tiempo
corto y fijo, seguidode un ensayoquímico de la desapari-
-o
ción del sustratoo de la acumulacióndel producto.En el
E
casode la reaccióncon hexoquinasa,seusael último pro-
.c 0 ,2
cedimiento,porque no hay manerade medir fotométrica- E
menteni los productosni los reactivos. 1 l(ml1l 1
Como se indica en la Figura6.12,la velocidadinicial =
0, n v* [ts]l-v*
paralos tubos 1-8 oscilódesde2,5 a 7,3 ¡.rmolde glucosa
consumidapor minuto, sin reacciónen el blanco.(Si la
glucosaconsumidahubierasidodetectada en el blanco,los
valoresdel resto de los tubos tendrían que normarlizarse 1/[S]= 1/[glucosa](ml1z|1)
con relacióna estareacciónno enzimática.)Cuandolasve- Figura6.13 Representacióndoble recíprocade los datos de la
locidadesde reacciónserepresentancomo una función de hexoquinasa de la Figura6.12. Los valoresde l/vy 1/[S] de cada
la concentraciónde glucosa,los ocho puntos generanla tubo de ensayose calcularon a partir de los datos de la Figura 6.12.
curvahiperbólicaque semuestraen Ia Figura6.12.Aun- Despuésserepresentól/v como función de 1/ [S]. La intersección
que los datosde la Figura6.12sehan corregidoparailus- con el eje7 en el punto 0,1,correspondea llV^*, por lo que V-o es
10 zmollmin. La intersección con el eje x en elvalor '6,7 ,
trar mejor el ejemplo,lo cierto esque la mayoríade los da- correspondea -llK^,y así,{, es0,15 mM. (Note que,por falta de
tos cinéticosobtenidospor estemétodo encajanbien en espacio,no semuestran aquí algunos de los tubos representadosen
una curva hiperbólica,a menosque la enzimatengaalgu- la Figura 6.12.)

Cinética
enzimática 1 5 5
 mM que esel datodel tubo 3. Éstaes,por supuesto,
la K-
de la hexoquinasapara la glucosa,generalmenteescrita
como K-,r1u.oru.
Además, la enzima tiene una K- para el otro sustrato,
Km,Arp,quesepodría calcularvariando la concentraciónde
ATP mientras se mantiene la concentración de glucosa a
un valor alto y fijo. Curiosamente, la hexoquinasa fosfori-
la, no sólo a la glucosa,sino también a otras hexosas,te-
niendo un valor distinto para cadauna. La K^para fructo-
sa,por ejemplo, es 1,5mM 1ocual significa que necesita10
vecesmás de fructosa que de glucosa, para mantener la
reacción a la mitad de su velocidad miíxima.
Aunque ligeramente simplificada e idealizada,esta es la
manera en que los enzimólogos abordan el estudio de las
reacciones catalizadasenzimáticamente. Sus análisis son a
menudo más complicadosy casisiempreprecisande un or-
denador para calculary trazar los datos doblesrecíprocosy
determinar los valores de K- y de,V-o, pero el enfoque bá-
sico es el mismo que el ilustrado en las Figuras6.12y 6.13.
Losinhibidores actúanirreversible
enz¡máticos o
fevefsiblemente
Hastaaquí,hemosasumidoquelasúnicassustancias enlas
célulasque afectana las actividadesde lasenzimasson sus
sustratos.Sin embarso,las enzimastambiénestáninflui-
'
daspor productos,sustratosalternativos, sustratosanálo-
gos,drogas,toxinasy una claseimportantede reguladores
I^ ^aot 4rrtofgt-olgltérir^. Muchas de estassustancias
-tienen un efectoinhibidor en la actividad enzimátíca,re-
duciendo(o incluso anulando)la velocidadde reacción
con el sustratodeseado.
Ebtainliiliiiió:n dé la actividadde la enzimaesimpor-
tantepor variasrazones.La primeray principal,esque Ia
inhibiciónenzimáticadesempeña un papelvital comomé-
canismode controlen lascélulas.Comodiscutiremos en el
próximo apartado,muchasenzimasse sometena regula-
ción por moléculaspequeñasespecíficas distintasde sus
sustratos.La inhibición enzimáticatambiénesimportante
en la acciónde drogasy toxinas,Iascualesejercenfrecuen-
tementesusefectosinhibiendoenzimasespecíficas. Losin-
hibidorestambiénson útilespara los enzimólogoscomo
herramientaspara el estudiode los mecanismosde reac-
ción. Son especialmente importantesen esteúltimo caso,
los análogosde sustratos,compuestosque se asemejanal
sustratorealpero que son químicamenteincapaces de IIe-
var a cabola reacción.
Losinhibidorespuedense¡reversibles o irreyersíbles.Un
inhibidor irreversibleseune a la enzimaconvalentemente,
causandouna pérdidairrevocablede la actividadcatalítica.
No sorprendeque los inhibidoresirreversibles seannor-
malmentetóxicosparalascélulas.Losionesde metalgspe-
sadosson,a menudo,inhibidoresirreversibles, al igual que
suelenserlolos agentesalquilantesy los gasestóxicosner-
viosos.Éstaes,de hecho,larazónde quemuchosinsectici-
156 6 Enzimas:
Capitulo loscatalizadores
delavida
dasy gasesnerviososseantan tóxicos.Estassustanciasse
unen irreversiblemente a la acetiLcolinesterasa,
una enzima
queesfundamentalparala transmisióndel impuso nervio-
so (véaseCapítulo 13).La inhibición de la actividadacetil-
colinesterasa llevaa una parálisisrápidadelasfuncionesvi-
tales¡ por tanto, a la muerte.Uno de talesgasesnerviosos
esel di-isopropilofluorofosfafo,el cualseune covalentemen-
te al grupo hidroxilo de una serinacríticadel sitio activode
la enzima,a la cualinactivapermanentemente.
Muchastoxinasnaturalessontambiéninhibidoresen-
zimáticosirreversibles. Por ejemplo,el alcaloidefsostigmi-
na,un componente del habade Calabar(Nigeria),estóxi-
co paralos animalesporqueinhibe irreversiblemente a la
acetilcolinesterasa.El antibióticoDenicilinqesun inhibidor
irreversibled. tut
de la paredcelularbacteriana. La penicilina,por tanto,es
eficazen el tratamientode infecciones bacterianas, porque
impide la formaciónde las paredescelularesde bacterias.
Por contra,un inhibidor reversibleseune a una enzi-
ma de forma disociable, no covalente, de maneraqni lut
formas libres y unidas del inhibidor existenen equilibrio
las unascon las otras.Podemosreplesentartalesuniones
E + Ii-EI (6.14)
siendoE la enzimalibrey activa,Iel inhibidor,y EI el com-
plejo inactivo enzima-inhibidor.Evidentemente, la frac-
ción de la enzimaqueestádisponibleen la célulaen forma
activa,dependede la concentracióndel inhibidor y de la
estabilidad del complejoenzima-inhibidor.
Lasdosformasmáscomunesde inhibidoresreversibles
seclasificancomo inhibidorescompetitivos e inhibidoresno
competitivos.
vo de la ertzimay por lo tanto compite directamentecon
las moléculasde sustratopor el mismo sitio de la enzima
(Figura6.14a),reduciendosu actividad,-hasta el punto de
quelossitiosactivosdelasmoléculasde enzimapuedente-
ner unidas,en cuálquiermomento,moléculasdel inhibi-
dor,en lugarde moléculasdel sustrato.
Un inhibidor no competitivo po-r-g1lglgdq,se une a la
sgegsr"aell sl4ry stlffi{iiió dél-
sitio
por
áai ro. talió,nó6lo?frea "Tiñ;Aie
fa;ñiónelsustñió 6iéiin
embargoinhibe la actividadde la enzimaporque la unión
del inhibidor con su sitio específico,reduceenormemente
o incluso suprime la actividad cataliticaen el sitio activo
(Figura6.14b)
Regulación enzimática
Para entender el papel de las enzimas en la función celular,
debemos saber que es muy infrecuente, que la mejor op-
ción para una célula,seapermitir funcionar a éstasa velo-
cidades indiscriminadamente altas. En su lugar, las veloci-
dades de las reacciones catalizadas enzimáticamente y las
 .. Sustrato Productos Productos
.i.l':3l),H"
tí trb
/^\

&\, ,s,
[/ {-t
1lrra,nn,o,oo,,
I -lb Ausenc¡a
r Fr oe rormaoon
\ E J deproductos
\=/
(a) lnnibicióncompetitiva.Tantoei inhibidor,como el sustrato, (b) Inhibiciónno competitiva.El inhibidory el sustratose unen
se unenal sitioactivode la enzima,La uniónde un inhibidor La uniónde un inhibidordeformala
a sitiosdiferentes.
impldeque el sustratose una,inhibiendo,por tanto,la enzima,disminuyendo la probabilidadde la unióndel
actlvidadenzimática. SUSTTAIO.

F¡gura 6.14 Modosdeaccióndelosinhibidores y nocompetitivos.Tantolosinhibidores

competitivos (a),comolosno
competitivos
competitivos a la enzima(E)inhibiendo,
(b) (enrojo)seunenreversiblemente Losdostiposdeinhibidores
por tanto,su actividad. difieren
oor el sitiodeia enzimaal queseunen.

rutas bioquímicas de las que forman parte, deben ajustarse
continuamente, para mantenerlas sintonizadas,de forma
precisa,con las necesidadesde la célula.Un aspectoimpor-
tante de ese ajuste reside en la capacidad de la célula de
controlar las actividadesde la enzima con especificidady
precisión.
Ya hemos visto una variedad de mecanismosregulado-
res,incluyendo cambios en las concentracionesde sustrato
(y de producto), alteracionesen el pH, y la presenciade in-
hibidores. ta ¡cgulación que depende directamente de las
interaccionesentre lg! t@
zima, se llama reg¡la_c_iQn pqr el sustrato..Tal y como se
desprendede la ecuación de Michaelis-Menten, los incre-
mentos en la concentración de sustrato tienen como
resultado un aumento en la velocidad de reacción (véase
Figura 6.8). Por el contrario, los incrementos en la concen-
tración de producto reducen la velocidad a la cual el sus-
lrato se convie la
concentración de producto es porque vtiene que ser iden-
tificado como la velocidad de reacción inicial en Ia ecua-
ción de Michaelis-Menten, tal y como viene dado por la
Ecuación 6.7. Si una cantidad significativa de producto
esfáya presente,o se acumula durante el curso de Ia reac-
ción, la ecuaciónsemelve más compleja que ia forma sim-
ple en que la hemos considerado.)
La regulación por el sustrato es un importante meca-
nismo de control en las células,pero no es suficiente para
la regulación de]a mayoría de las reacciones o secuencias
de reacciones.En la mayoria de las rutas, Ias enzimas se re-
gulan también mediante otros mecanismos. Dos de los
más importantes sonla regulación alostéricav la modirtca'
ción,covalente.Estosmecanismospermiten a las célulasco-
nectar o desconectara las enzimas o aiustar susvelocidades
de reacción, modulando apropiadamente las actividades
de las enzimas.
Casi invariablemente,una enzima que se regula por tal
mecanismo, catalizael primer paso de una ruta de múl-
tiples etapas. La secuencia completa se controla, incre-
mentando o reduciendo Ia velocidad a la cual funciona la
primera etapa. Entre las rutas que se regulan así, se en-
cuentran las de ruptura de moléculas grandes (como azú-
cares,grasaso aminoácidos) y las que conducen a la sínte-
sis de sustancias necesarias para la célula (como
aminoácidosy nucleótidos).Ahora discutiremosla regula-
ción alostéricayla modificación covalentede una manera
introductoria. con Ia intención de volver a estosmecanis-
mos a medida que encontremos ejemplos específicosen
capítulosposteriores.
Lasenzimas se regulan
alostéricas pormoléculas
delosreactivos
diferentes y losproductos
La regulaciónolostéricaes el único mecanismo importante
de control, por el cual Ia tasa de las reaccionescatalizadas
enzimáticamente,se aiustaa las necesidadescelulares.Para
entender este-modo áé ieguiaciOn,considerela vía por la
cual una célula convierte un precursor A en un producto
final R mediante una serie de intermediarios B, C y D, en
una secuenciade reaccionescatalizadasrespectivamente,
por las enzimasE1,E2,E3y Ea:
A --;-t l B --;-F t C --;-L , D --;-+
rc
P (6.1s)
El productoP podríaser,por ejemplo,un aminoácido
quela célulanecesitaparala síntesisde proteínas,y A po-

Regulación
enzimática t57
l-

dría ser algún componente celular común que sirve como

punto de partida parala secuenciade reacción específica o
que conduce a P.
^v - ^v -
I
Rettoinhibición, Si se permite progresar constantementea H.+N-C-H
la ruta 6-15, con una tasano limitada, se convertirán gran-
"l
des cantidadesde A en R con los posiblesefectosadversos H-C-OH

.-v;;;;:.
de la reducción de A o una excesivaacumulación de P (o
I
cH.
ambos). Estáclaro que los interesescelularesquedan mejor
satisfechoscuando la ruta no estáfuncionando a su miíxi-
ma velocidad o incluso a una velocidad constante,sino a
-'1
i-
una velocidad,cuidadosamentedeterminadapor la necesi-
dad de P. De alguna manera, las enzimas de estavía deben
ser sensiblesal nivel celular del producto P,al igual que una
calderanecesitaser sensiblea la temperatura de Iashabita-
lntermeo¡a¡á
Á-l
cionesque pretendecalentar.En el último caso,un termos-
I
tato proporciona el vínculo regulador necesario entre la Enzima2
I
calderay su <producto>,el calor. En nuestro ejemplo de la -o V
enzima,la regulación deseadaesposible porque el produc- Intermediario
B
)Qr cú
to P es un inhibidor específicode E,,la enzima que catali- .o.E E
zalaprimera reacción de la secuencia. I E n z i m a3
Este fenómeno es llamado retroinhibición (o inhibi-
' có@

lri
o uc ú

6 c)
t
ción por el producto final) y se representapor la flecha de Intermediarlo
C
;vñE Y
líneasdiscontinuas que conectael producto P con la enzi- v
II
.. 1) -
Enzima 4
ma E1,en la siguientevía: fxx V
A -;- S C -E- D (6.16) oo
-q)
lntermediarlo
D
l- I'P
II E n z i m a5
Retroinhibiciónde El medianteP v
De manera más general, una retroinhibición sucede
o
cadavez que un producto metabólico inhibe a una de las c-o-
enzimasimplicada en la vía por la cual eseproducto sesin- I Productofinal
H -?l+ N - C - H (isoleucina)
tetiza. La retroinhibición es uno de los mecanismos más
comúnmente usadospor las célulaspara asegurarque las H-C-CH"
actividades de las secuenciasde reacción se aiustan a las t"
CH,
necesidadescelulares. t-
La Figura 6. l5 proporciona un ejemplo específicode tal CH^
secuencia-la ruta de cinco pasosen la que el aminoácido
isoleucinase sintetiza a partir del aminoácido treonina-.
En estecaso,la primera enzima en la vía, la treonina des- Figura6.15 Regulación alostéricadela actividadenzimática.La
rutadesíntesisdelaminoácido isoleucinaa partirdetreonlna,es
aminasa,seregulamediante la concentraciónde isoleucina
un buenejemplode retroinhibición. Laprimeraenzimadela
en la célula. Si se estáconsumiendo isoleucina (por ejem- secuencia,
la treorrina
deaminasa, esinhibidaalostéricamente por la
plo, en la síntesisde proteínas),su concentraciónserábaja. isoleucina,
Ia cualseunea la enzimaen un sitio diferente
d,elsitío
En estascondiciones,la treonina desaminasaestá activa y actlvo.
la vía funcionapara producir más isoleucina, de manera
que se satisfacela necesidadreal de esteaminoácido. Si los ción 6.16) ser sensiblea la concentración de una sustancia
requerimientos de isoleucina decrecen, ésta empezará a P que no es ni su sustrato ni su producto inmediato? O,
acumularse en la célula y el incremento de su concentra- volviendo a la Figura 6.15, ¿cómo puede la actividad de la
ción conducirá a una reducción de la actividad de la treo- treonina desaminasaser sensiblea la concentraciónde iso-
nina desaminasay, por ende,de Ia velocidad de síntesisdel leucina, cuando su estructura difiere tanto de la de la treo-
aminoácido. nina, que es improbable que seareconocida por el centro
activo de la treonina deaminasa?
Regülación alostédca. ¿Cómo puede la primera enzima en Esta pregunta fue respondida por primera vez en 1963
una vía (por ejemplo, la enzima E, en Ia secuenciade Reac- por |acquesMonod, Jean-PierreChangeux y Frangois Ja-

158 Capítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
cob. Aunque basadainicialmente en datos incompletos, su
modelo fue rápidamente tenido en consideracióny se de-
sarrolló hastallegar a ser la basede nuestro entendimiento
de Ia regulación alostérica. El término alostéricoderiva del
griego <otra forma (o estado)>,indicando, por lo tanto,
que todas las enzimascon capacidadde regulación alosté-
rica, pueden existir en dos estadosdiferentes. En una de las
dos formas, la enzima tiene una afinidad alta por su(s) sus-
trato(s), mientras que en la otra, tiene poca o ninguna afi-
nidad. Las enzimas con estapropiedad se llaman enzimas
alostéricas. Las dos fognas dife:e-ntes-deuna en-ima alq,s-
térica qqq fácilmp-q1elntelga¡lyqrtlbl€Ey€sté!-de¡scha.qn
equilibrio una con otra. Obviamente, la velocidad de reac-
ción es alta cuando la enzima está en la forma de alta afini-
dadybaja,o incluso nula, cuando Ia enzima estáen su for-
ma de baja afinidad.
El que se favorezcala forma activa o inactiva de una en-
zima alostérica depende de la concentración celular de la
sustanciareguladora apropiada, llamada efector alostérico.
En el casode la síntesisde isoleucina,la enzima alostéricaes
la treonina desaminasay el efector alostéricoes la isoleuci-
na. De manera más general,un efectoralostéricoes una pe-
queña moléculaorgánica que regula Ia actividad de una enzi-
m6 para Ia cual no esni el sustrato,ni eIproductoinmediato.
Un efector alostérico influye én la actividad de la enzima
uniéndose a una de las dos formas interconvertibles de ésta,
estabilizándolaen eseestado.En otras palabras,una enzima
Sitio
activo
",":i:?."
ffsustrato -¿
,.--.t'oxto'
L¡ \
al*'h
\--,\-:/
\ -_(jr.-?
r't1x Y
Formade altaafinidad
de la enzima
fflI
il.--lnnroroor
arostérico
lt Escasao nula
formación
de producto
Formade bajaafinidad
de la enzima
(a) tnnibiciónalostérica.Una enzimasusceptiblede
inhibiclónalostéricaes act¡vaen la formalibre,la cual
tieneuna altaafinidadpor sus sustratos(S).La uniónde
un inhibidoralostérico(en rojo)estabilizala enzimaen su
formade baja afinidad,resultando en poca o nula
actividad.
Figura6.16 Mecanismos de inhibicióno activaciónalostéticas, Una enzimaalostéricaestáconstituidapor una o más subunidades
catalíticas(C) y una o más subunidadesreguladoras(R), cada una de las cualescon un sitio activo y un sitio alostérico,respectivamente.La
enzimaexisteen dos formas, una con alta afinidad por el sustrato (¡ por tanto, con una probabilidad alta de formación de producto) y otra
con una baja afinidad (y la correspondienteprobabilidad baja de formación de producto). La forma que adquiere una enzima es
dependientede la concentracióndel efector(es)alostérico(s)para esaenzima.
alostérica puede existir en una forma compleja o simple,
dependiendo de si tiene una molécula efectora unida a ella
o no. El efector se une a la enzima debido a la presencia en
la superficie de ésta de un sitio alostérico (o regulador),
que es distinto del sitio activo en el cual tiene lugar el even-
to catalítico. Así, una característica distintiva de todas las
enzimas alostéricas(y otras proteínas alostéricas) es la pre-
senciaen la enzima dew sitio activo al que se une el sustra-
to y un sitio alostéricoal que se une el efector. De hecho,
algunas enzimas alostéricastienen multiples sitios alostéri-
cos, cada uno capaz de reconocer un efector diferente.
Un efector puede ser, o bien un inhibidor alostérico o
bien un activador alostérico, dependiendo del efecto que
ejerza cuando se una al sitio alostérico de la enzima, es
decir, dependiendo de si la forma compleja es el estadode
baja afinidad o alta afinidad de la enzima (Figura 6,16).La
unión de un inhibidor alostéricocambia el equilibrio entre
las dos formas de la enzima para favorecerel estadode baja
afinidad (Figura 6.16a).La unión de una activador alosté-
rico, por otra parte, cambia el equilibrio a favor del estado
de alta afinidad (Figura 6.16b). En cada caso,la unión del
efector al sitio alostéricoestabilizala enzima en una de sus
dos formas, incrementando o disminuyendo de esemodo
la probabilidad de unión al sustrato.
La mayoría de las enzimas alostéricas son proteínas
grandes,multiméricas y con un sitio activo o un sitio alos-
térico en cada subunidad. De hecho, los sitios activosy los
Sitlo
Sitio activo
alostérico
Escasao nula
formación
de producto
Formade bajaafinidad
de laenzima
n lk c-mg:l;;
"\l productos
^
pl^fl"b.€-.4
\-/\-:/
-
[\1/ V
Formade altaafinidad
de la enzima
(b) Activac¡ón alostérica. Una enzimasusceptiblede
activaciónalostéricaes inactlvaen su formalibre,la cual
tieneuna afinidadbaja por su sustrato.La uniónde un
activadoralostérico(en verde)estabilizala enzimaen su
formade baja afinidad,activandoa la enzima.
Resulación
enzimática L59
sitiosalostéricosestánnormalmenteen diferentessubuni-
dadesde la proteína,a lasque denominamossubunidades
catalíticas y subunidades reguladoras, respectivamente
(fijeseen lassubunidadesC y R de lasmoléculasde la enzi-
ma que semuestranen la Figura6.16).Estosignifica,con-
secuentemente, quela unión delasmoléculasefectorasa los
sitiosalostéricos,
no sólo afectaa la forma de lassubunida-
desreguladoras, sino tambiéna lassubunidadescatalíticas.
Lasenzimasalostéricasman¡f¡estan
interacciones
cooperativas
entresubun¡dades
Muchasenzimasalostéricasposeenuna propiedadconoci-
da'comocooperatividad.Estosignificaque,a medidaque
los múltiples sitios catalíticosunen moléculasde sustrato,
la enzimasufrecambiosconformacionales, queafectana la
afinidad de los restantessitiosde unión del sustrato.Algu-
nasenzimasmuestrancooperatfuidad positiva,en la cual la
unión de una moléculasustratoa una subunidadcatalítica
incrementala afinidadde otrassubunidadescatalíticaspor
el sustrato.Otrasenzimasmuestrancooperativad negativa,
en la cual el sustratounido a una subunidadcatalíticare-
duce la afinidad de otros sitios catalíticospor el sustrato.
El efectocooperativopermite a las célulasproducir en-
zimasque son más o menossensiblesa los cambiosen la
concentraciónde sustrato,lo que por otra parte,seríapre-
deciblepor la cinéticade Michaelis-Menten.La cooperati-
vidad positivahaceque la actividad cataliticade la enzima
se incrementemás rápido de lo normal a medida que la
concentracióndel sustratoaumenta,mientrasque la coo-
peratividadnegativasignificaque la actividad enzimática
aumentamáslentamentede lo esperado.
Lasenzimastambiénse puedenregularpor la adiclón
o eliminaciónde gruposquím¡cos
Muchasenzimas,adernásde la regulaciónalostérica,están
sometidasa control mediantemodificacionescovalentes.
En estamanerade regulación,la actividadde una enzima
seve afectadapor la adición o eliminaciónde gruposquí-
micosespecíficos. Lasmodificacionescomunesincluyenla
adición de gruposfosfato,gruposmetilo, gruposacetilo,o
derivadosde nucleótidos.Algunasde estasmodificaciones
pueden ser reversibles,mientras que otras no. En cada
caso,el efectode la modificaciónesla activacióno la inac-
tivación de la enzima,o por lo menosla modulación,hacia
arriba o haciaabajo,de su actividad.
Fosfodlación/defosforilación.La adición reversiblede gru-
pos fosfatoesuna de las modificacionesmás frecuentesy
mejor entendidas.La adición de gruposfosfato,esdecir,la
fosforilación suele producirse por transferenciade un
grupo fosfatodesdeel ATP al grupo hidroxilo de un resi-
duo de serina,treonina o tirosina de la proteína enzimáti-
ca.Lasenzimasque catalizanla fosforilaciónde otrasenzi-
mas (o de otrasproteínas)sellaman proteín-quinasas.El
160 Capítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
de lavida
procesoinverso,la defosforilación,estácatalizadopor en-
zimas llamadasproteín-fosfatasase implica la elimina-
ción de un grupo fosfatodesdela proteínafosforilada.
Estaforma de regulaciónesla de la glucógeno fosforila-
sa,rrna enzimaque seencuentraen las célulasmusculares
esqueléticas (Figura6.I7).La enzimahidrolizael glucóge-
no por eliminacionessucesivas de unidadesde glucosa,en
forma de glucosa-1-fosfato (Figura6.I7a). La regulación
de esta enzimadimérica se consigueen parte por la pre-
senciaen lascélulasmuscularesde dosformasinterconver-
tiblesde la enzima,una forma activallamadafosforilasaay
otra inactiva,llamadafosforilasab (Figura6.17b).Cuando
senecesitahidrolizar glucógenoen las célulasmusculares,
la forma inactiva b de la enzimapasaa la forma activaa,
por adición de un grupo fosfatoen una serinaespecífica,
en cadauna de las dos subunidadesde la fosforilasa.Esta
reacciónsecatalizapor la fosforilasaquinasayel resultado
esun cambioconformacionalen la fosforilasa.Cuandono
senecesitahidrolizar más glucógeno,los gruposfosfatola
fosforilasaa son éliminadospor la enzimafosforilasafosfa-
tasa.(La glucógenosintasa,la enzima que añadenueyas
unidadesde glucosaa la cadenade glucógeno,respondede
forma opuesta;esinactivaen la forma fosforiladay seacti-
va por defosforilación.)
Ademásde la regulaciónpor los mecanismosde fosfo-
rilación/defosforilación dela Figura6.l7,la glucógenofos-
forilasa es también una enzima alostérica,que se inhibe
por glucosay ATR y seactivapor AMP. Si una señalhor-
monal provocala fosforilación¡ por tanto,activaciónde la
fosforilasaen una célulamuscular,que aún poseesuficien-
te de glucosa,ésta inhibirá alostéricamentea la enzima,
hastaque searealmentenecesaria. Por otra parte,las célu-
lasmuscularesquetengannivelesbajosde glucosa,podrán
beneficiarseinmediatamentedela conversióndela fosfori-
lasaa la forma activa.
La existenciade dosnivelesde regulaciónparala glucó-
genofosforilasa,ilustraun aspectoimportantede la regula-
ción enzimática.Muchasenzimasse controlan por dos o
másmecanismosreguladores, y de esemodo,permitena la
célularesponderadecuadamente frentea variassituaciones.
Ruptutaprcteolítica. Un tipo diferentede activacióncova-
lente de enzimasconsisteen la eliminaciónirreversiblede
un fragmento de la cadenapolipeptídica,mediante una
enzima proteolítica (que degrada proteínas) adecuada.
Estetipo de modificación,llamado ruptura proteolltica,
esel que tiene lugar en las enzimasproteolíticasdel pán-
creas,tripsina, quimiotripsina y carboxipeptidasa.Estas
enzimas,sintetizadasen el páncreas,son secretadas al duo-
deno,en respuestaa una señalhormonal. Estasproteasas,
junto con la pepsinadel estómagoy otras enzimaspro-
teolíticassecretadaspor las célulasdel intestino, pueden
digerir casi todas las proteínasingeridas,rindiendo ami-
noácidoslibres,que sepuedenabsorberpor lascélulasepi-
telialesdel intestino.
 cH2oH cH2oH CH2OH Figura6.17 Regulación de la glucógeno
fosfodlasapu fosforilación, (a) La

,.#t"#'"-,{}'"-
OH OH OH
glucógeno fosforilasa esuna enzima
dimérica en las célulasmusculares,que
libera unidades de glucosaa partir del
glucógeno,en forma de glucosa-l fosfato,
utilizable por Ia célula muscular, como
fuente de energía.(b) La glucógeno
Cadenade glucógeno
Restode glucosa fosforilasaestáregulada,en parte, por un
del extremode la mecanismo de fosforilación/defosforilación.
cadenade glucógeno
t99 La forma inactiva de la enzima, la fosforilasa

loo
@ á, puede ser convertida a la forma activa,
fosforilasa a,porla transferenciade grupos
fosfato desdeel AIP a una serina
determinada,en cada una de las dos

|,sii"T:::: subunidadesde la enzima, La reacción de

fosforilación escatalizadapor la enzima
fosforilasa quinasa.La eliminación de los
i cH,oH cH,oH grupos fosfato por la fosforilasa fosfatasa,
devuelvea la fosforilasa a la forma b inactiva.

o-eo.+ * -"ó"rót o -..

OH OH OH
Glucosa-1-fosfato Cadenade glucógeno
con
restode glucosa
menos
(a) Reaccióncatalizadapor la glucógenofosforilasa

'¿ry:RÉ
--slN4.''xl
'@
OH OH
-' qutnasa
FOSrOllasa

w Fosforilasafosfatasa

Glucógeno
fosforilasab
(inactiva)
H2 @ ,@
Glucógeno
fosforilasaa
(activa)

(b) Regulación
de la glucógenofosforilasa

Lasproteasas pancreáticasno sonsintetizadasen su for- Ribozimas: moléculas de RNA

ma activa;probablementeesopodría causarproblemasen
las célulasdel páncreas,la cualesdebenprotegersede sus
propiasenzimasproteolíticas.En cambio,cadauna de estas
enzimasse sintetizacomo una moléculaligeramentemás
grandey catalíticamente inactivallamadazimógeno. Loszi-
mógenosdebenautodigerirseproteolíticamentepara pro-
ducir lasenzimasactivas.Variosde estosacontecimientos se
muestranen la Figura6.18.Por ejemplo,la tripsinasesin-
tetizainicialmentecomo un zimógenollamadotripsinóge-
no. Cuando el tripsinógenoalcanzael duodeno,se activa
por la eliminaciónde un hexapéptido(una cadenade seis
aminoácidos)desdesu extremoN-terminal, por la acción
dela enteroquinasa, una proteasade membrana,producida
por las célulasdel duodeno.La tripsina activaluego a los
otros zimógenos,medianteproteolisisespecíficas.
con actividad enzimática
Antesde los primerosañosde Ladécadade 1980,sepensa-
ba quetodaslasenzimaseranproteínas.De hecho,esaafir-
mación seconsiderócomo una de lasverdadesfundamen-
tales de la biología celular y se encontrabaen todos los
libros de texto.Los biólogoscelularesllegarona estarcon-
vencidosde que todaslas enzimaseran proteínas,porque
todaslasenzimasaisladasen los 55 añosque siguierona la
purificación de la ureasapor Sumneren 1926,resultaron
ser proteínas.Pero Ia biología está llena de sorpresas,y
ahora sabemosque la afirmación necesitaser revisada,
para incluir a los catalizadores
constituidospor ARN y de-
nominadosribozimas.

Ribozimas:
moléculas
de RNAconactividad
enzimática 1 6 1
 del nucleótidoguanosina- erannecesarias para que
tuvieralugar la reacción.Paranuestrasorpresa, no era
necesarioel extractonuclearqueconteníalasenzimas.
Nosvimosobligadosa concluirque,o Ia actividad
enzimáticaproyeníade unaproteínaunida tan
estrechamente al RNAqueéramosincapaces de
separarlade é1,o queel RNAestabacatalizandosu
propioayuste.Dado lo arraigadaqueestabala ideade
quetodosloscatalizadores eranproteínas,Ia
biológicos
hipótesisde Ia católisispor RNAno erafácil de aceptar.
Procarboxioeotidasa Carboxioeotidasa
/ i ^¡^o^u+ui ,v, a^ ,\ , -->
\il (activa)
t Pesea todo, Ios experimentosadicionalesapuntaron
QuimiotripsinÓoeno-P Quimiotripsina haciala conclusióninicial:la eliminaciónde un intrón de
(inactiva (acriva)
t 4 13-nucleótidosdel pre-rRNA de Tetrahymenaestácatali-
zadaporla propiamoléculade pre-rRNA,siendo,por tan-
to, un ejemplode autocatalisis.
La Figura6.19muestrael procesode escisión,el cual
Células
epiteliales implica O el plegamientode la moléculade pre-RNArno
a¡rstadaparaformar un bucle,@ el ataquepor un grupo
Figura6.18 Activaciónde los zimógenospancreáticospor hidroxilo de una de guanosinaque actúa como cofactor,
ptoteolisis. Lasproteasaspancreáticas son sintetizadas y @ cortey ayustede la moléculade rRNA con la liberación
secretadasen el intestino deigado,como precursoresinactivos del intrón, y @ rotura adicionalautocatalítica del intrón
llamadoszimógenos.La procarboxipeptidasa, el tripsinógenoy el paralaeliminaciónde 19nucleótidosmás.El intrón com-
quimiotripsinógenoson zimógenos.La activacióndel tripsinógeno
pletamenteprocesado esuna ribozima,capazde acortaro
a tripsina requiere la eliminación de un segmentohexapeptídico
por la enteroquinasa, una enzimaduodenalde membrana.La alar garoligonucleótidos pequeños.
tripsina activaluego a otros zimógenos,por ruptura proteolítica.La Sepodría argumentarque la moléculade rRNA de la
procarboxipeptidasa esactivadaen una proteolisisúnica, mientras Figura6.19 no satisface la definiciónde catalizador, que
que la activaciónde quimiotripsinógenoesun procesoalgo más suponeque el propio cafalizadorno sedebealterarduran-
complicado,en dos etapas,cuyosdetallesno semuestranaquí.
te el procesode reacción.Sin embargo,dosañosmástarde
sedescubrióotro catalizador constituidopor RNA en el la-
La primera evidenciallegó en 1981,cuandoThomas boratorio de Sydney Altman en Ia UniversidaddeYale,que
Cechy suscolegasde la Universidadde Coloradodescu- supera esta restricción. La enzima, llamadaribonucleasa P,
rompe precursores de RNA de transferencia (pre-tRNAs)
brieron una excepciónaparentea la regla(todaslasenzi-
mas son proteínas)). Estabanestudiandoel a¡rster de un para producir moléculasde RNA funcionales.(En este
segmentointerno de un precursorde un RNA específico caso,se eliminaun segmentoterminal de la moléculade
(pre-rRNA) in Tetrahymena thermophila,un organismo RNA, en lugar de un intrón, como ocurríaen el procesa-
eucariotaunicelular.(Como veremosen el Capítulo21, mientodel pre-rRNA.)
muchosde los RNAsde eucariotas requierenque seelimi- Sesabíadesdehacíatiempo que la ribonucleasaP tenía
un componente proteicoy otro de RNA,y sesuponíaqueel
nen uno o mássegmentos internosllamadosintrones,an-
tesde quelleguena serfuncionalesen Ia célula.El proceso sitio activo estaba en el componenteproteico.Sin embargo,
Altman y sus colaboradores demostraroninequívocamente,
de corteimplicala escisióndel intrón y la unión de lasdos
partesde la moléculaoriginalen el sitio de escisión.) mediante el aislamiento de los componentesy su estudio
En el
por separado, que eI componenteproteicoaisladoeracom-
cursode su trabajo,los investigadores hicieronla observa-
pletamenteinactivo,mientrasque el componenteribonu-
ción notable de que el procesoiaparentementeavanzaba
cleotídicosi eracapazde catalizarlarupturaespecífica delos
sin la presenciade proteínas!Describiendosu intento de
precursoresdel IRNR y, además,no se alterabadurante el
estudiarla escisiónde intronesin vitro. Ceahescribió:
proceso.Además,la reaccióncatalizadamedianteRNA se-
pequeñas guíala cinéticade Michaelis-Menten, una evidenciamásde
Resultóquealgunasdelasmoléculas
-principalmente ionesde magnesio que erael RNA quien estabaactuandocomo una auténtica
y variasformas
enzima.(El componenteproteicoaumentaIa actividadpero
no esnecesarioparala unión del sustratoo su ruptura.)
t
N. del Z: siguiendo la recomendación de Biólogos Moleculares hispanoha- La trascendencia de estoshallazgos sereconociócon el
blantes,traduciremos como ayusteeI término inglés splicing que hace refe- PremioNobel que Cechy Altman compartieronen 1989
rencia al procesamientode1RNA, consistenteen el corte y empalme de cier-
tos sectoresdel mismo. Segrin el DRAI, a)'uste es un término náutico que por susdescubrimientos de lasribozimas.A partir de estos
refiere a la (costura o unión de dos caboso. descubrimientos iniciales,sehan descritomásejemplosde

r62 Capítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
 Figura6.19 La autocatálisisy el ayuste del intÉn del Pre-rRNAde
Tetrahymena. La molécula precursora del RNA ribosomal (pre-rRNA)
5' r UpCpUpApApAp- r
GPUPAPAP 3' de Tetrahymenacontiene un intrón que es capazde catalizarsu propia
Pre-rRNA escisión.La escisióny el a)'usteocurren en cuatro etapas.O Formación
o de un bucle en la región intrónica de la molécula de pre-rRNA. @ El
bucle del intrón es atacadopor un grupo hidroxilo de un nucleótido de
guanina libre, pG, que funciona como cofactor.@ La molécula de pre-
rRNA esrota en el extremo 5'terminal del segmentodel intrón, con Ia
upcpupoooooo\ GpupApAp- 3, adición de G al intrón. La uridina en el extremo 3' de otro fragmento de
s,-
rRNA atacaluego al extremo 3'del intrón, liberándolo y empalmando

,.)fo las dos piezasde rRNA para formar el rRNA procesado.@ El intrón
sufre una subsiguienteruPtura autocatalítica,eliminando otros 19
nucleótidos en dos etapas,primero libera un segmentode 15
nucleótidos y luego otro de 4.
S'oGon0A0n01

g'rUpCpUor 3' \6PUPAPAP-3'

5'PGPAPAPAP-Go" 3'
eliminado
lntrÓn

lo
t
l\

N,u nucleótidos
t\
\ o nucleótidos
I
procesado
Intrón

ribozimas.De especialrelevancia esel ejemplode un paso actividadpeptidil transferasa, responsable de un pasocru-

esencial en la sínlesisde proteínas en los ribosomas.Éstos cial en la síntesisde proteínas,esuna ribozima.
puedenserconsiderados como enzimasmuy grandes,que Aunque muchos biólogos se quedaron inicialmente
iatalizanla formacióndelos enlaces peptldicos,añadiendo asombradospor el descubrimientode las ribozomas'no
aminoácidos a una cadena polipeptídica ctecíente(véase hay razón para pensarque las moléculasde RNA no pue-
Figura 4.8). Más específicamente,la subunidad ribosomal dan ser capacesde funcionar como enzimas.Al igual que
grandees el lugar de Ia actividad peptidil transferasa,que las proteínas,las moléculasde RNA puedenadoptar una
catalizalaformación del enlacepeptídico. estructuraterciariacompleja,que es la condiciónprevia
Durantemucho tiempo seha supuestoque el sitio acti- paralafunción catalizadoraen amboscasos.
vo de la peptidil transferasaestabalocalizadoen una de las El descubrimientode las ribozomasha cambiadocon-
moléculasproteicasde la subunidadgrande.Sin embargo, siderablemente la manerade pensarsobreel orilen de la
Harry Noller y suscolaboradores de la Universidadde San- vida en la tierra. Durante muchosaños,los científicosha-
ta Cruz en California, centraron su atenciónen una de las bían pensadoque las primeras macromoléculascataliza-
moléculasderRNA. Este trabajo les llevó a la demostración, dorasdebíanhabersido polímerosde aminoácidos,seme-
publicadaen 1992,de que a pesar de la eliminación de por jantesa las proteínas.Sin embargo,estasuposiciónchoca
io -.not el 95o/ode la proteína de la subunidad ribosomal con la dificultad de que no hay una forma sencillade ex-
grandede una bacteria,el rRNA manteníaintactael 800/o de plicar cómo una protelnaprimitiva puedeportar informa-
la actividadpeptidil transferasa de la subunidad. Además,la ción o replicarsepor sí misma,que son dos atributosvita-
actividaddesaparecía por el tratamientocon ribonucleasa' les básicos.Sin embargo,si el primer catalizadorfuera
una enzimaque degradaRNA,pero no seafectabapor pro- RNA en vez de moléculasproteicas,es conceptualmente
teinasaK, una enzima que degradaproteínas(de hecho, más fácil de asumir un sistemade moléculasde RNA que
éstafue uno de los agentesusadospara eliminar lasproteí- actúesirviendo,tanto a la catálisis,como a la replicación,
nas de la subunidad).Así pues,quedó demostradoque la pudiendo transferir la información a otras generaciones.

moléculas
Ribozimas: enzimática 163
de RNAconactividad
 Cerrando el círculo, volvemos al tema
planteadoen la introducción de esteca-
pítulo -a saber,que la termodinámica
nos permite valorarla factibilidadde una
reacción,pero no dice nada sobrela pro-
babilidadde que esareacciónocurra real-
mente en Ia célula,a una velocidadapre-
ciable-. Serequiereun catalizador, que
siempre es una enzima en los sistemas
biológicos,para asegurarque secumplen
los requerimientosde energía de acti-
vacíóny que sealcanzael estadode tran-
sición. Todaslas enzimasproteicasson
polímerosde aminoácidoscon una se-
cuencia programada genéticamente,y
son sensiblesa la temperaturay el pH.
Thmbiénson exquisitamenteespecíficas,
paraun únicosustratoo paraun conjun-
to de compuestosestrechamente relacio-
nados.El procesocatalíticotiene lugar en
el sitio activo, un grupo crítico de ami-
noácidosresponsables de la unión y la ac-
tivación del sustratoy de la auténticare-
acciónquímica.La unión de un sustrato
apropiadoen el sitio de activo,induce un
acoplamientomás.eficazentre la enzima
y el sustrato,facilitando de esemodo Ia
activacióndel sustrato.
Las reaccionescatalizadasenzimátí-
camentetienenlugar a travésde un in-
termediario enzima-sustrato.Muchas
enzimassiguenIa cinéticade Michaelis-
Menten, caracterizadapor una relación
hiperbólicaentre la velocidadde reac-
ción inicial v y la concentracióndel
sustratoIS].El límite superiorde la velo-
cidad se denominaV^*, y Ia concentra-
ción de sustratonecesariapara alcanzar
la mitad de la velocidadmáxima,se ex-
presa como la constantede Michaelis,
(. La relaciónhiperbólicaenrrey y [S]
se puede convertir en lineal, mediante
una ecuacióndoble recíproca,en la que
V-* I K- sepuedendeterminar gráfica-
mente o analizaren un ordenador.
La actividad enzimátícaestáinfluida,
no sólopor la disponibilidaddel sustrato,
sinotambiénpor los productos,suStratos
alternativos,sustratosanálogos,drogasy
toxinas,muchasde las cualestienen un
efectoinhibidor. La inhibición puedeser
reversible o irreversible,
implicandoestas
últimas la formación de unionescovalen-
tesdel inhibidor a la superficiede la enzi-
ma. Por otra parte, un inhibidor reversi-
ble seune a la enzimade forma reversible.
ya seaen el sitio activo (inhibición com-
petitiva) o en otro lugar de la superficie
de la enzima(inhibiciónno competitiva).
Las enzimasse pueden regular para
ajustarsusnivelesde actividada lasnece-
sidadesde la célula.La regulaciónpor el
sustratosebasaen los efectosque tienen
Ias concentraciones del sustratoy de los
productos,en la velocidadde reacción.
Los mecanismosde control adicionales
incluyenla regulaciónalostéricay lasmo-
dificacionescovalentes. La mayoríade las
enzimasreguladasalostéricamente catali-
zan el primer pasoen una secuencia de
reaccionesy son proteínasmultiméricas
con variassubunidadescatalíticasy varias
subunidadesreguladoras.Cadauna de Ia
subunidadescatalíticastieneun sitio acti-
vo que reconocea los sustratosy a los
productos,mientras que cadasubunidad
reguladoratiene uno o más sitios alosté-
ricos,que reconocena lasmoléculasefec-
toras específicas.Un determinadoefector
puedeinhibir o activarla enzima,depen-
diendode cuálde lasformasde la enzima
estéfavorecidapor la unión del efector.
Las modificacionescovalentesmás co-
munessonla fosforilacióny la desfosfori-
lación,como ocurre,por ejemploen la
glucógenofosforilasa,y la ruptura pro-
teolítica,como ocurre en la activaciónde
los zimógenosde las enzimasproteolíti-
cassecretadas por el páncreas.
Aunque durante mucho tiempo se
pensóque todaslasenzimaseranproteí-
nas,ahorareconocemos las propiedades
catalizadorasde ciertas moléculas de
RNA llamadasribozimas.Éstasincluyen
algunasmoléculasde rRNA, que son ca-
pacesde catalizarIa eliminación de sus
propiosintrones,de eliminarlos compo-
nentesRNA de enzimasribonucleopro-
teicasy quizásinclusopartedel nNÁ de
ribosomasya ensamblados. El descubri-
miento de las ribozomasha cambiadoel
pensamientosobreel origen de la vida en
la tierra porque las moléculasde RNA, a
diferenciade lasproteínas,son capaces de
replicarse a sí mismas.

Problemas
Losproblemas
demayor
dificultad
están conun ..
marcados (c) Una solución alternativa es reducir Ia energía de activación.
6,1 La necesidadde las enzimas.Nos encontramosahoraen ¿Qué significa en términos moleculares decir que un
cataLzador disminuye la energía de activación de una
disposiciónde apreciarla diferenciaentrela factibilidad
reacción?
termodinámicade una reaccióny la probabilidadde que
realmentevayaa tenerlugar. (d) Los químicos orgánicos usan a menudo en sus reacciones,
catalizadores inorgánicos tales como el níquel, el platino, o
(a) Muchasreaccionesque son posiblestermodinámicamente
ciertos cationes,mientras que las célulasusan proteínas
no ocurrena una velocidadapreciable,debido a las denominadas enzimas.¿Cuálesson las ventalasdel uso de
necesidades energéticas
de los reactivospara superarel las enzimas?¿Ylas desventajas?
estadode transición.¿Quésignificaestoen términos
6,2 Energía de activación. Como se muestra en la Reacción
moleculares?
6.2, el peróxido de hidrógeno,H2O2, se descomponeen HrO y
(b) Una forma de cumplir esterequerimientoesmediante Or. La energía de activación, E¡, para la reacción no cataljzadaa
aportaciónde calor,que en algunoscasos,sólo esprecisoal 20'C es de 18 kcal/mol. La reacción se puede catalizarpor iones
inicio. Dé un ejemplo,y expliquelo que significaen de hierro (E¡ : i3 kcal/mol) o por Ia enzima catalasa
términos moleculares. (4: 7 kcal/mol).

r64 Capítulo
6 Enzrmas:
loscatalizadores
delavjda
(a) Dibuje un diagramade energíade activaciónpara esta
reacciónbajo condicionesde catalizacióny no catalización,
y expliquelo que significaque la energíade activaciónbaje E
de 18a 13kcal/mol,cuandoseusanionesde hierroy de 18 .o
.g
a7 kcallmol en presenciade Ia catalasa. c
(s
(b) Sugieradospropiedadesde la catalasaque hagande ella un 'ó
!

catalizadorintracelularmás apropiadoque los ionesde a)

hierro.
(c) Sugierauna forma másde acelerarla tasade la
Concentración
de sustratofSl
descomposicióndel peróxido de hidrógeno.¿Esésteun
medio apropiadode incrementarlasvelocidadesde 6.20 Análisis
Figura de la representación
de Michaelis-Menten.
reaccióndentro de lascélulas?¿Porqué o por qué no? Veáse 6.5.
el Problema
(d) Recuerdedel Capítulo4 que Ia catalasapresenteen las
célulaseucariotasselocalizadentro de los peroxisomas, regiones,mediantelasletrasA, B y C. Paracadauna de las
junto con cualquierade lasdiversasenzimasgeneradoras
afirmacionesque siguen,indique con una única letra cuál de las
de HrOr. Debido a la toxicidaddel peróxido de hidrógeno, 3 regionesde la curvaseajustamejor a la afirmación.
expliqueen términosde cinéticaenzimáticapor qué es
(a) El sitio activode una moléculade enzimaestáocupadopor
ventajosotenera lasenzimasgeneradoras de HrO, y Ia
catalasajuntas dentro de un mismo orgánulo. el sustratoIa mayorparte del tiempo.
(b) El sitio activode una moléculade enzimaestálibre la
6.3 Incremento de la velocidadmediantela cat¿íüsis. La
descomposición de HrO, en HrO y O, mostradaen la Reacción mayorpartedel tiempo.
6.2sepuedecatalizar,bien por un catalizador inorgánico(iones (c) El rangode concentracióndel sustratoen el cual la mayoría
de hierro),bien por la enzima Esta
catalasa. reaccióntienelugar de lasenzimasfuncionan en lascélulasnormales.
unas30.000vecesmásrápidaen presencia de ionesde hierro, (d) Incluya el punto (K^, V^u*12).
quecuandono haycatalizador, perohasta100.000.000 veces
(e) La velocidadde la reacciónestálimitada,principalmente,
másrápidaen presencia una enzimaquecontiene
de la catalasa,
por el númerode moléculasde enzimapresentes.
hierro. Contestea lassiguientespreguntas,asumiendoque I ¡.rg
una cantidaddadade HrO, en 1 (0 La velocidadde la reacciónestálimitada,principalmente,
de catalasadescompone
minuto a 25 'C y quetodaslasreacciones sellevana caboen por el númerode moléculasde sustratopresentes.
condiciones estériles. 6.6 Cinética enzimática.La enzimaB-galactosidasacafalizala
(a) ¿Cuántotiemposenecesitaría paradescomponer la misma hidrólisisdel disacáridolactosaen suscomDonentes
cantidadde HrO, en presencia de una cantidadde ionesde monosacáridos:
hierro equivalenteal contenidoen hierro de I ¡rg de Lactosa+ H2O
-
# Glucosaf Galactosa (6.L7)
d-salactosidasa
catalasa?
(b) ¿Cuántotardariaen descomponerse la misma cantidadde ParadeterminarV^*y K- de Ia B-galactosidasa parala lactosa,
HrO, en ausencia de un catalizador? seincubóla mismacantidadde enzima(1 ¡lg por tubo) con una
(c) Expliquecómo éstosilustrancálculosla necesidad de los seriede concentraciones de lactosa,en condicionesen lasque
catalizadoresy la superioridadde lasenzimassobrelos lasconcentraciones de productoerandespreciables. La
catalizadoresinorgánicos. velocidadde la reaccióninicial sedeterminó para cada
concentraciónde lactosa,valorandola cantidadde este
6.4 Efectosde la temperaturay el pH. La Figura6.4 muestra
disacáridoque permaneceal final del ensayo.Seobtuvieronlos
las actividadesde las enzimasen función de la temperaturay el
siguientesdatos:
pH. En general,la actividadde una enzimaespecíficaesmásalta
Velocidad
a la temperaturay el pH que son característicos del ambienteen Concentración del consumo
el cual funciona normalmente. de lactosa de lactosa
(mM) (¡rmollmin)
(a) Expliquelasformasde lascurvasde la Figura6.4 en basea
los factoresquímicoso ffsicosmásdeterminantesen la I 10,0
actividadde la enzima. 2 16,7
(b) Paracadaenzimade la Figura6.4,sugieraIa ventaja 4 25,0
adaptativade tenerel perfil de actividadenzimática I 33,3
mostradoen la figura. i6 40,0
(c) Algunasenzimastienenun perfil de pH plano,esdecir, )z 44,4
tienen esencialmenteIa misma actividadsobreun rango
ampliode pH. ¿Cómopodríaexplicarestaobservación? (a) ¿Por qué es necesario especificar que las concentraciones de
6,5 Cinética de Michaelis-Menten.La Figura6.20representa producto eran insignificantes durante el curso de la
Ia gráñcade Michaelis-Mentende una enzimatípica,con una reacción?
velocidadinicial de reacciónexpresadacomo una función de la (b) Represente v (velocidad del consumo de lactosa) frente a
concentraciónde sustrato.En la curva seidentificantres [S] (concentración de lactosa).¿Porqué cuando se doblala

Problemas 165
 concentraciónde lactosa,el incrementode la velocidades Estareacciónes,como descubriremosen el Capítulo 8, básica
siempremenor que el doble? en el transportedel dióxido de carbonoen los glóbulosrojos,
(c) CalculeIlvy ll[S] para cadaentradaen la tabla de datosy desdelos tejidosdel cuerpoa los pulmones.La anhidrasa
tracellv frentel/[S]. carbónicatiene un pesomolecularde 30.000y un número de
recambio(valorft.",)de I X 106sec-r.SupongaqueseIe da
(d) DetermineK- y V-* a partir de Ia representación
1 mL de una soluciónque contiene2,0 pgde anhidrasa
doble recíproca.
carbónicapura.
(e) En la misma gráficade la parte b, representelos resultados
(a) ¿Aqué velocidad(milimoles de CO, consumidospor
que esperaríasi cadatubo contuvierasólo 0,5 ¡.rgde
segundo)tendrálugar estareacciónen condiciones
enzima.Expliqueel gráfico.
óptimas?
6.7 Más cinéticaenzimática.La galactosaformada en la
(b) Suponiendonormalesla temperaturay la presión,¿cuáles
Reacción6.17sepuedefosforilar mediantela transferenciade
el consumode CO, en mL por segundo?
un grupo fosfatodesdeel AIfl reacciónque escatalizadapor la
enzimagalactoquinasa: 6.9 Inhibidores devarias clases.Conteste,razonandoen cada
caso,cuálesde lassiguientesafirmacionesson verdaderas(V) o
Galactosa* AIP ----------------+
Galactosa-l-fosfato* ADP (6.1S) falsas(F).
galacquinasa (a) El di-isopropil fluorofosfatoseune covalentemente
al
grupo hidroxilo del residuode un aminoácidoespecífico
Supongaque ha aisladola enzimagalactoquinasa y ha de Ia enzimaproblema,siendo,por tanto, casicon toda
determinadosusparámetroscinéticos,variandola certeza,un efectoralostérico.
concentraciónde galactosaen presenciade una concentración
de AIP constantey alta (esdecir,en saturación).La (b) La enzimahexoquinasaseinhibe por su propio producto,
doble recíproca(Lineweaver-Burk)de los datos
representación la glucosa-6-fostato
y, por tanto,esun ejemplode
semuestraen la Figura6.21. retroinhibición.
(a) ¿Cuálesla K. de la galactosidasa,
para la galactosa, (c) La glucógenosintasa,como la glucógenofosforilasa,es
en estas
condicionesde experimentación? activaen la forma fosforiladae inactivaen la forma
¿Quénos dice la K-
acercade la enzima? defosforilada.
(b) ¿Cuálesla V-o de la enzimaen estascondicionesde (d) Esmuy probableque una enzimaque estásujetaa la
experimentación? activaciónalostérica,catalicela primera reacciónde una
¿Quénos dicela V-o acercade la
enzima? vía biosintética.
(c) Supongaque repite el experimento,pero variandoIa (e) Si los investigadores
sostienenque una enzimaesactivada
concentraciónde ATP y manteniendoa la galactosaen alostéricamente por el compuestoA e inhibida
nivelesaltosy constantes. alostéricamente por el compuestoB, una de estas
Asumiendoque lasdemás
condiciones semantienencomoantes,¿esperaría afirmacionesdebeestarequivocada.
obtenerla
misma V-o que en el apartadob? ¿Porqué o por qué no? (0 La tioredoxinaesuna proteina reguladoracon dos grupos
(d) En el experimentodescritoen el apartadoc, el valor de K* sulfhidrilo (-SH) que sepuedenoxidar de manera
esmuy diferenteal del apartadob. ¿Puedeexplicarpor qué? reversible,formando un enlacedisulfuro (-S-S-).
Probablementeafectea la actividadde una enzima
6.8 El número de recambio.La anhidrasacarbónicacatalíza a la que seuna,reduciendolos puentesdisulfurode la
Ia hidrataciónreversibledel dióxido de carbonopara formar enzimaa grupossulfhidrilo,haciendoque la enzima
ion bicarbonato: experimenteun cambio conformacionalque conduzcaa
CO2+ H2O;- HCO; + H- (6.1e) su activación.
.6.10 Relevanciabiológica. Expliquela relevanciabiológica
de cadauna de lassiguientesobservacionesrelativaa la
regulaciónde enzimas.
ñA (a) Cuandoustednecesitaun aportede energía,lashormonas
o adrenalinay glucagónsesecretanhaciasu torrente
-'"
sanguíneoy sedirigen a suscélulasmusculares,donde
C

E inician una cascadade reaccionesque conducena la

r1> o2
fosforilaciónde la forma inactiva (b) delaglucosa
fosforilasa,que pasaa Ia forma activa(a).
(b) Incluso en la forma a, la glucosafosforilasade lascélulas
musculares,seinhibe alostéricamente por glucosao AIP,
en concentraciones elevadas.
10 20 30 40
(c) Su páncreassintetizay secretaIa enzimaproteolítica
(mM-1)
1/lgalactosa]
carboxipeptidasaen forma de precursorinactivo,llamado
Figura6.21 Representación
doblereciproca
de la enzima procarboxipeptidasa,que seactivacomo resultadode la
galactoquinasa.Veáse
el Problema6.7. proteolisis,mediantetripsina,en el duodeno.

t66 Capitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
.6.11 Consecuencias de la ecuaciónde Michaelis-Menten.
ParaIa reaccióncatalizadaporla enzimaen la cual el sustratoS
seconvierteen un producto P (véaseReacción 6.5),la velocidad
sepuede definir como la desaparicióndel sustratoo la aparición
del producto por unidad de tiempo:
dtst dlPl
y:----:---:-:+--- (6.20)
elt rlt
Partiendode estadefinicióny restringiéndonosa Ia etapainicial
de reacción,cuando [P] esprácticamentecero,derivela
(véaselaEcuación6.7).Los
ecuaciónde Michaelis-Menten
siguientesapartadospueden ayudarle en su derivación:
(a) ComienceexpresandoIa ecuaciónde la velocidadpara
dlS)ldt, dlp)ldt,y dlBS)ldter términos de concentraciones
y velocidadesconstantes.
(b) Supongaun estadoestacionarioen el cual el complejo
enzima-sustrato de la Reacción6.6desaparece a la misma
velocidada la que seforma, de forma que Ia tasanetadel
cambio,d[ES]ldt, escero.
(c) Desecuentade que la cantidadtotal de la enzimapresente,
E, esla sumade la enzimalibre E¡másla queestáen el
complejoenzimaES:E : Er + ES.
(d) En su debido momento, se dará cuenta de que la V-* y la
K- se pueden definir como sigue:
h* ot
v-*: kr[E] *^: (6.2t)
k1
.6.1Íl La ecuaciónde Michaelis-Mentenen forma lineal.
Ademásde la representación de Lineweaver-Burk(Figura6.10)'
a vecesseempleanotrasdos formaslinealesde la ecuaciónde
Michaelis-Menten.La representaciónde Eadie-Hofsteeesuna
gráficade v/ [ S] frentea v (véaseFigura6.I I ), y la representación
de Hanes-Woolfenfrentaa [S]/vya [S].
(a) Demuestre,en amboscasos,que la ecuaciónque se
representagráficamentesepuedeobtenera partir Ia
ecuaciónde Michaelis-Menten,con una simple
manipulaciónaritmética.
(b) En amboscasos,indique cómo sepuedendeterminarK- y
V-o desdeel gráficoresultante.
(c) Hagauna representación de Hanes-Woolf,señalandolos
puntos de interseccióny la pendientecomo en las
de Lineweaver-Burky de Eadie-Hofstee
representaciones
(véanseFiguras 6.10y 6.11).¿Puede sugerirpor quéla
representación Hanes-Woolfesla mássatisfactoria,desde
el punto de vista estadístico,de lastres?

Bibliografía recomendada
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recomendada t67
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