INSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE TÉCNICO DE LABORATORIO 1

PRÁCTICA DE LABORATORIO IV (R.M. 5905/07) 2do. Año 3er. cuatrimestre

SEROLOGÍA

La interacción de un anticuerpo (Ac) con su antígeno (Ag) homólogo, se puede considerar que ocurre en dos
etapas. La primera se refiere a la interacción química entre las moléculas de anticuerpo y antígeno, y la
segunda a la manifestación visible de dicha interacción (la formación de precipitados inmunes o aglutinación
de partículas).

CINÉTICA DE LAS REACCIONES Ag-Ac

Parece que existen indicios que durante la maduración de la respuesta humoral de producción de anticuerpos
se produce no sólo una selección de anticuerpos con mayor afinidad (selección termodinámico), sino con
mayor rapidez (selección cinética).

INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO IN VITRO.

En la interacción in vitro de un Ag con su correspondiente Ac, se distinguen 2 etapas:

1º Interacción primaria: es la mera unión de un Ag y su correspondiente Ac. No es visualizable
directamente y no es demasiado influenciada por la temperatura, la concentración salina o la fuerza iónica ni
la agitación. Sólo depende de la complementariedad ya que cuando mayor sea ésta, mayores serán las
fuerzas de unión (afinidad) y menores serán las fuerzas de repulsión (ej. repulsión estérica). Los ensayos
inmunológicos basados en la interacción primaria son, por ej. ELISA, RIA (radioinmunoensayo), IF
(inmunoflorescencia). En estos ensayos la visualización del complejo se hace marcando uno de los reactivos
(Ag o Ac), con alguna sustancia detectable.
2º Interacción secundaria: sigue a la anterior, los complejos iniciales que se forman rápidamente y sobre los
cuales la temperatura y la concentración salina tienen influencia, se agregan para dar diferentes fenómenos
visibles cuya característica dependerá principalmente de la naturaleza del antígeno. Esta etapa se acelera con
la temperatura, la agitación y es dependiente de la concentración de electrolitos. Las reacciones de
interacción secundarias son:
 Para Ag. solubles: precipitación:
Precipitación en medio líquido (cualitativa, semicuantitativo, cuantitativa)
Precipitación en medio sólido (gel):
Cualitativa (método de Oudin, método de Oakley Fulthorpe, método de Oüchterlony)
Semicuantitativa
Cuantitativa (método de difusión radial simple de Mancini)
 Para antígenos particulados: aglutinación (cualitativa, semicuantitativa, cuantitativa)
3º Interacción terciaria: La unión Ag-Ac desencadena un fenómeno biológico visible in vitro (ej: lisis de
glóbulos rojos en la prueba de fijación del complemento) o in vivo (ej: reacción intradérmica) gracias a la
acción de otros efectores solubles o celulares.
- Fijación de complemento
- Pruebas intradérmicas.

PRIMERA ETAPA

Los inmunoensayos con reactivos marcados que tienen la ventaja de poseer especificidad dada por la
reaccoión antígeno anticuerpo y sensibilidad dada por el sistema marcador que amplifica la reacción.

Marcador del
Técnica Lectura de la prueba
conjugado
ELISA Espectrofotómetro o a simple vista
EIA Inmunohistoquímica Enzima Microscopio óptico
Inmunocitoquímica Microscopio óptico
Radioinmunoensayo Radioisótopo Contador de radiactividad
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Inmunofluorescencia Fluorocromo Microscopio de fluorescencia

Inmunoensayo Enzimático
Inmunoensayo
enzimático es una
técnica en la cual
uno de los
reactantes, el
anticuerpo o el
antígeno, se fija a
un soporte sólido
previamente a su
interacción con el
reactante
complementario. Debido a esta característica de la
técnica, ésta se describe comúnmente como ELISA
(enzyme-linked inmunosorbent assay). La técnica es
muy versátil y por esto existen múltiples variantes de
la misma. Se clasifican en homogéneos (no requieren
fase sólida ni lavados para retirar el excedente del conjugado – EMIT: técnica inmunoensayo modulado por
enzimas) y heterogéneos (son los que requieren fase sólida para separar al conjugado, siendo indispensables
los pasos de lavados). En la más común, el antígeno es el reactante que se absorbe sobre la fase sólida (en la
actualidad se usan placas de un plástico especial con 96 receptáculos o cubetas). Las etapas generales para la
búsqueda de anticuerpos en este sistema incluyen las siguientes: 1) cubrimiento de los cubetas en las placas
para ELISA con una cantidad apropiada del antígeno para poder determinar los anticuerpos del suero (de
nanogramos a microgramos, dependiendo del antígeno) (o en su defecto se tapiza con el anticuerpo
específico frente al antígeno que se desea determinar), 2) la eliminación del exceso de antígeno por lavado
de las cubetas, con un regulador fisiológico adicionado de un detergente (comúnmente se utiliza solución
salina-fosfatos, PBS, pH 7,4, con Tween-20), 3) el bloqueo de los sitios de las cubetas no ocupadas por el
antígeno (o anticuerpo), con una proteína inmunológicamente irrelevante para el sistema de prueba
(albúmina, gelatina, caseína o leche descremada); 4) la adición de los sueros problema apropiadamente
diluidos en PBS (la dilución se establece experimentalmente), e incubación del sistema; 5) La eliminación
del exceso de suero por lavado con solución PBS-Tween; 6) la incubación del sistema con un segundo
anticuerpo conjugado a una enzima (la más usada es la peroxidasa de rábano) (o antígeno conjugado) a la
dilución conveniente; 7) la eliminación del exceso de anticuerpo (o antígeno) conjugado por lavado con
PBS-Tween; 8) la adición de una mezcla del sustrato y un cromógeno (cuando el segundo anticuerpo está
conjugado a peroxidasa, se utiliza una mezcla de peróxido de hidrógeno y de orto-fenilendiamina); 9) la
incubación de las placas a temperatura ambiente; 10) La detención de la reacción por adición de H 2SO4
diluido y 11) la lectura de las absorbancias a 492 nm. Aquellas cubetas que den las absorbancias más altas
corresponderán a los sueros con mayores cantidades de anticuerpos dirigidos contra el antígeno usado en el
sistema. Existe una zona de superposición de muestras positivas y negativas llamada zona gris (cut off: valor
de corte), que es la región indeterminada. Todo valor que cae dentro de esta zona debe repetirse con pruebas
confirmatorias.

Negativas Cut off Positivas

Entonces una variante es el test en fase sólida y está orientada a la determinación de anticuerpos frente a un
determinado antígeno, y es el antígeno el que se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plástico)
como se ha desarrollado anterioremente. Al añadir la muestra con el posible anticuerpo se unirá y podrá ser
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detectado añadiendo anti-inmunoglobulinas marcadas con el enzima.

ELISA directo.
En un soporte sólido de plástico, se pega en el fondo el antígeno que se desea analizar. Se bloquean los
huecos con proteína (albúmina bovina normalmente). Se añade anticuerpo que reconoce el antígeno, ya
marcado con un enzima. Se incuba un tiempo y se realizan lavados para quitar todo el anticuerpo que no se
ha pegado. La fracción libre se tira. La cantidad de anticuerpo con enzima que tenga es proporcional a la
cantidad de antígeno. Se añade un sustrato que en presencia de la enzima marcada, pasa a tomar un color
específico (sustancia cromógena). Por ejemplo, la peroxidasa utiliza aminobendicina, que en presencia de
agua oxigenada pasa a agua y oxígeno, que oxida al DAB, produciendo un color marrón. Ese color lo
podemos leer en un espectrofotómetro con los filtros adecuados.

ELISA indirecto.
En este caso el primer anticuerpo no está unido con el enzima de marcaje, sino que se necesita un anticuerpo
secundario marcado que reconozca al primero. Pasos:
 Pegar el antígeno.
 Bloquear con proteína.
 Añadir el suero del enfermo (si hay anticuerpos frente al antígeno, se pegan).
 Lavar. Separar fracciones. Tirar la libre.
 Añadir el anticuerpo secundario marcado con un enzima. Suelen ser anticuerpos frente a
inmunoglobulinas humanas.
 Incubar.
 Lavado para eliminar anticuerpos libres.
 Añadir el cromógeno, a mas color mas anticuerpo y mas antígeno.
Se permite cuantificar, al comparar con un control. Realizar previamente una curva patrón específica para
cada ensayo. Es necesario además establecer rangos de positivo y negativo.
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SEGUNDA ETAPA

REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN

La interacción de un antígeno particulado con su anticuerpo correspondiente se visualiza por la formación de

aglutinados. Cuando la partícula es el antígeno mismo se habla de una reacción de aglutinación directa. Si el
antígeno es soluble y se adsorbe física o químicamente sobre una partícula, entonces se habla de una
reacción de aglutinación indirecta o pasiva. En el caso de que los antígenos particulados sean los eritrocitos,
la reacción se describe como hemaglutinación, y como hemaglutinación pasiva cuando los eritrocitos se
utilizan sólo como soporte de antígenos solubles. La aglutinación pasiva es más sensible que la directa debido
a la posibilidad de regular la densidad de los determinantes sobre la superficie de la partícula.

Placa de hemoaglutinación

Sedimentación Aglutinación

La reacción de aglutinación tiene lugar en dos estadios: primero se une el anticuerpo con el antígeno, y
luego se produce la aglutinación; el anticuerpo recibe la denominación de completo. Si el anticuerpo se une
a un antígeno específico de los hematíes sin producir aglutinación, se trata de un anticuerpo incompleto. Un
anticuerpo incompleto se demuestra por la prueba de la antiglobulina. Algunos anticuerpos incompletos sólo
producen aglutinación de los eritrocitos en solución salina cuando la mezcla contiene 20 a 30% de
concentración de albúmina o las células rojas han sido tratadas con ciertas enzimas proteolíticas.

Cualitativa
Es la típica reacción de determinación de grupo sanguíneo, donde se ponen en contacto la sangre a
determinar con sueros de distintos grupos, y se considera la producción o no de aglutinación.

Cuantitativa
No es muy usada, al igual que en la precipitación cuantitativa, consiste en medir proteínas en el aglutinado;
se puede utilizar por ejemplo para determinar los miligramos de anticuerpo contra un Ag particulado,
presente en un suero inmune. Para esto, se determina por micro Kjeldahl, el nitrógeno proteico
correspondiente a un volumen determinado de antígeno puesto en contacto con el suero inmune y por otro
lado, el nitrógeno correspondiente al mismo volumen de Ag puesto en contacto con un suero normal de la
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misma especie animal. La cantidad de proteína correspondiente al Ac específico será la diferencia entre
ambas mediciones multiplicada por el factor de conversión 6,25. Como en el caso de la precipitación, previo
a la medición de N, hay que lavar el aglutinado para eliminar toda proteína no fijada específicamente y
además, como se trata de células se coloca EDTA para inhibir la fijación de complemento.

Semicuantitaviva
Esta técnica se realiza normalmente en microtubos o placas de fondo en U y consiste, al igual que en el caso
de la precipitación, en colocar concentraciones constantes de uno de los reactivos en contacto con
concentraciones variables del reactivo a determinar. Así, se obtiene el título, que será, igual que en todo
ensayo semicuantitativo, la inversa de la mayor dilución que da un resultado positivo. Se trata de una
medición relativa y no absoluta, por lo cual puede variar de laboratorio en laboratorio y siempre debe ir
acompañada de un control positivo y otro negativo, realizado en el mismo laboratorio y por el mismo
método. Es una técnica muy útil, rápida y económica para determinar Ag bacterianos y de hecho, se la usó
para clasificar serológicamente enterobacterias.

En todos los pocillos se coloca la suspensión bacteriana a concentración constante y a continuación en las
filas A,B,C, etc. Se colocan diluciones crecientes al medio de los antisueros anti bacteria que se quieren
dosar. Se debe colocar como control negativo un suero normal (no inmune) de la misma especie en la que se
hizo el antisuero para comprobar que la reacción que se produce no es una aglutinación inespecífica. (Fila
E). El antisuero de la fila A da reacción de aglutinación hasta el pocillo Nº7, si se comienza en el 1 con
concentración tal cual, el 7 seria 1/64, es decir que el título sería 64. El antisuero B da un título de 4 y el C,
de 8. El antisuero D no tiene anticuerpos contra dicha bacteria.
En conclusión los usos son: En las llamadas pruebas febriles para buscar anticuerpos contra bacterias se
utilizan como antígenos las suspensiones de las bacterias mismas y las reacciones de aglutinación son
directas. En la tipificación de los grupos sanguíneos se utilizan los eritrocitos como antígenos particulados y
los antisueros correspondientes; se trata de reacciones de hemaglutinación directa. Cuando se pretende,
buscar anticuerpos en el suero dirigidos contra drogas se recurre a las reacciones de hemaglutinación
indirecta. En este caso los eritrocitos, generalmente de carnero, se acoplan químicamente con la droga en
cuestión antes de hacerse reaccionar con los sueros problema. La formación de hemaglutinados indica la
presencia de anticuerpos contra la droga. Una forma de diagnóstico precoz del embarazo utiliza también
una reacción de hemaglutinación pasiva. Aquí, los eritrocitos de carnero se recubren químicamente con
gonadotrofina coriónica humana (GCH). La interacción de los eritrocitos recubiertos con GCH con un
anticuerpo dirigido contra la hormona conducirá a la formación de un hemoaglutinado. La preincubación del
anticuerpo con la orina de una mujer embarazada conducirá a la neutralización del anticuerpo por su
combinación con la GCH presente en la orina. El anticuerpo así neutralizado será ahora incapaz de
reaccionar con la hormona acoplada a los eritrocitos de carnero y no habrá hemaglutinación; en este caso se
confirma el embarazo. La ausencia de la hormona en la orina problema dejará libre al anticuerpo anti-GCH y
este podrá así reaccionar con los eritrocitos recubiertos con la hormona. Una reacción positiva de
hemaglutinación descarta el embarazo.
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Métodos indirectos o Serológicos

A -Basados en antígenos no treponémicos.

En el comienzo de la infección, el Treponema pallidum provoca lesiones tisulares que liberan sustancias
lipídicas que se asocian a proteínas de la espiroqueta resultando antigénicas en conjunto, pudiendo incluso
considerar como haptenos a los lípidos y como moléculas transportadoras a las proteínas. Se generan así
productos inespecíficos conocidos como reaginas con actividad anticuerpo hacia lípidos hísticos y no hacia
componentes treponémicos específicos. Son anticuerpos anti fosfolípidos a veces denominados globalmente
como anticuerpos anti-cardiolipinas (difosfatidilglicerol). Las reaginas sifilíticas se detectan por reacciones
de floculación con sustratos antigénicos no treponémicos constituidos por emulsiones de naturaleza coloidal.
Todas las pruebas no treponémicas usan como antígeno base mezclas combinadas de cardiolipina y lecitina
purificadas de tejido cardíaco bovino y colesterol. Pueden variar en los estabilizadores, conservantes o
agentes agregados para mejorar la visualización. Su utilidad es para screening de sífilis (banco de sangre,
embarazadas, pre-laborales, prenupciales, etc.), seguimiento terapéutico, seguimiento de recién nacidos de
madres infectadas, diagnóstico de neurosífilis.
 VDRL (venereal disease research laboratory): la técnica actual es en realidad, una modificada
respecto de la original, en la cual era imprescindible la inactivación por calor de la muestra para la
eliminación de sustancias interferentes. La
VDRL reactiva VDRL no reactiva
VDRL de hoy pertenece a la categoría de
técnicas USR (unheated serum reagins
-reaginas en sueros no calentados) en las
cuales las interferencias se evitan por el
agregado del inhibidor cloruro de colina a la
mezcla antigénica sin necesidad de inactivar
la muestra. Por igual razón las técnicas que
no requieren de inactivación de la muestra se
denominan en conjunto RPR (reacción rápida para reaginas). Composición del antígeno: suspensión
acuosa o alcohólica de cardiolipina, lecitina y colesterol en proporciones equilibradas. EDTA como
agente estabilizante (inhiben al complemento), cloruro de colina como inhibidor, iones fosfato y
thimerosal como conservante. Muestra: suero, plasma o LCR. La reacción se efectúa sobre placas de
vidrio transparentes. Puede hacerse una lectura al microscopio, en especial para las reacciones más
débiles.

Aglutinación :
(++) Aglutinacion : (+) ó Aglutinación : (+) Aglutinación : (-)
En una celdilla de una policubeta de vidrio de fondo plano se coloca 50 μl de suero puro y diluido 1/10 en
solución fisiológica. Se deja caer una gota de la suspensión antigénica que tenga un volumen de 1/60 parte
del ml. Agitar en forma rotatoria durante 5 minutos a 180 rpm. Leer inmediatamente en microscopio
utilizando 100 aumentos. Si se observa floculación será reactivo, sino será no reactivo. La dilución 1/10 se
realiza por el efecto de prozona que pudieran presentarse. Si la muestra resulta reactiva deberá realizarse la
reacción en forma semicuantitativa sobre diluciones sucesivas al medio en solución fisiológica. El título será
la inversa de la última dilución que presenta floculación. El resultado se informa en unidades reaginas (UR)
o diluciones (dils).
Para LCR se favorece la sensibilidad usando el antígeno (reactivo de VDRL) diluido al medio en ClNa 10%,
se prepara y se deja reposar entre 10 min y 2 horas (no usar transcurrido ese tiempo). Colocar en el pocillo
de una policubeta 50 μl del LCR más 10 μl antígeno. Agitar 8 minutos a 180 rpm y leer utilizando aumento
de 100.
 RPR: se conoce tradicionalmente así a la reacción rápida con igual antígeno que
la VDRL pero en el cual se incorporan partículas de carbón para mejorar la
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visualización de los flóculos. La reacción se hace sobre tarjetas con fondo

blanco. No requiere lectura microscópica.
Control Control
Negativo Positivo

Muestra del
paciente

Test RPR test en la 1ra. visita Test RPR después de 6 meses

Son técnicas muy económicas, sencillas, rápidas y reproducibles aunque inespecíficas. Sus primeras virtudes
la transforman en ideales para el screening masivo de muestras en el laboratorio de banco de sangre o para el
control de embarazadas. Los posibles falsos positivos tanto técnicos como biológicos, sobre todo a títulos
bajos, requieren de un método adicional y confirmatorio para establecer diagnóstico de sífilis. Las
reacciones positivas deben semicuantificarse por diluciones seriadas de la muestra informando el título
como la inversa de la máxima dilución reactiva al que, por costumbre, se le adiciona el término dils. El
tratamiento adecuado provoca disminución de sus títulos por lo que son los test que deben ser utilizados para
el seguimiento de pacientes infectados. Un bajo porcentaje de individuos puede permanecer con títulos
reactivos bajos situación conocida como cicatriz inmunológica. Ambas reacciones ya han sido adaptadas
para su procesamiento en microplacas de titulación de fondo plano. La principal característica de la reacción
de floculación reside en que los complejos antígeno–anticuerpo se agregan y sedimentan en un rango muy
estrecho de la relación de concentraciones entre anticuerpo y antígeno, permaneciendo como complejos
solubles en los alrededores del mismo, a diferencia de las reacciones de precipitación o aglutinación. Por lo
tanto, deben mantenerse estrictamente las proporciones de reacción con dispensados exactamente medidos
de antígeno y de muestra. Ello justifica la utilización de agujas calibradas para las suspensiones antigénicas
y de micropipetas de precisión para las muestras. La causa fundamental de ocurrencia de falsos negativos
obedece a errores técnicos en la ejecución de la metódica (temperatura, muestras, tiempo de rotación, exceso
o defecto en el dispensado de antígeno o muestra, etc.). El fenómeno de prozona también puede darse en
estas reacciones por lo cual se aconseja el procesamiento de muestras sin diluir y, paralelamente, en una
dilución 1/5 ó 1/10. La VDRL – RPR se positiviza aproximadamente a los 7-10 días de la infección primaria
por lo cual le confiere ese período ventana serológico a la detección de infectados por estos métodos. Puede,
por lo tanto, no ser útil en esos primeros días de la sífilis primaria. También resulta generalmente negativa en
la presentación cardiovascular de la patología. Los falsos positivos de la VDRL – RPR pueden ser tanto
técnicos como biológicos. Los primeros son aquellos en los cuales la falsa positividad desaparece al repetir
la determinación debiendo ser atribuidos a errores de ejecución en primera instancia (por los mismos
factores enunciados al consignar los falsos negativos). Los segundos se deben a reacciones cruzadas con
sueros de individuos con diversas patologías tanto agudas (mononucleosis, neumonías, etc.) como crónicas
(lepra, TBC, enfermedades autoinmunes, etc.) y no desaparecen en la reiteración del ensayo.
Otras técnicas:
 RST (reagin screen test) y TRUST (toluidine red unheated serum test): utilizan sudán black y rojo de
toluidina respectivamente, para mejorar la observación final.
 Fijación de complemento (reacción de Wasserman): una de las pioneras pero ya no utilizada.
 ELISA: algunos enzimoinmunoensayos con fase sólida sensibilizada con antígenos no treponémicos
están siendo desarrollados con el fin de contribuir a una mejor detección de reaginas. Son reactivos
comerciales pero son muy poco utilizados en el país.
Significado clínico: Los anticuerpos anti-cardiolipina aparecen siempre durante el curso de la infección por
Treponema pero pueden presentarse en otras patologías como enfermedades infecciosas crónicas y
enfermedades autoinmunes, también en condiciones fisiológicas como pacientes de edad avanzada. Puede
aparecer también en forma transitoria en algunas infecciones virales agudas, durante el embarazo o después
de algunas vacunaciones.