RESIDUOS DE LA PRODUCCIÓN DE ACEITE DE SEMILLA DE UVA

(Vitis Vinifera L.) COMO UNA VALIOSA FUENTE DE ANTIOXIDANTES

FENÓLICOS

PRODUCTOS QUÍMICOS

Todos los reactivos y disolventes eran de calidad analítica o de HPLC y se compraron de

VWR (Darmstadt, Alemania). Los cartuchos de fase inversa C18 (Chromabond, 1000
mg) eran de Macherey-Nagel (Düren, Alemania). Los siguientes estándares se usaron con
fines de identificación y cuantificación con HPLC espectrometría de masas (MS) y
detección de matriz de diodos HPLC (DAD): (+) - catequina, ácido p-cumárico (-) -
epicatequina, ácido ferúlico, ácido gálico, cafeico ácido, ácido protocatecúico, quercetina
(Roth, Karlsruhe, Alemania); quercetina 3-O-galactósido, quercetina 3-O-glucósido,
procianidina B1, procianidina B2 (Extrasynthèse, Lyon, Francia); galato de epicatequina,
trans-resveratrol (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.); trans-resveratrol 3-O-glucósido
(trans-polydatin) (Sequoia Research Products, Oxford, Reino Unido). ABTS [2,20-azino-
bis (3-etilbenzotiazolin-6 sulfonato)], trolox [6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-
carboxílico ácido], ABAP [2,20-azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro] y TPTZ-Fe
(II) [2,4,6-tri (2-piridil) -s-triazina] se usaron para la determinación de la actividad
antioxidante y el ensayo de Folin-Ciocalteu, respectivamente. Estos reactivos se
compraron en Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.).

Producción de aceite de semilla de uva

El orujo de uva congelado se separó manualmente en pieles y semillas usando un tamiz

(tamaño de malla 5,6 mm). Las semillas se sellaron en bolsas de polietileno al vacío y se
mantuvieron a 20ºC hasta que se analizaron. Antes de la producción de aceite, las semillas
se secaron en un secador de gabinete durante 8 h (60ºC) y se prensaron usando una prensa
de extrusión de tornillo (KOMET S 87 G, IBG Monforts, Mönchengladbach, Alemania).
El prensado de semilla de uva se realizó sin calentamiento, sin embargo, la temperatura
aumentó a 60-68ºC debido a la disipación de energía mecánica. Los residuos de prensado
resultantes se enfriaron, se sellaron en bolsas de polietileno a vacío y se mantuvieron a
20ºC hasta que se analizaron.

Extracción de compuestos fenólicos

Para la extracción de compuestos fenólicos, las semillas integrales y los residuos de

prensa procedentes de la producción de aceite se liofilizaron y se molieron finamente
usando un molino de bolas S 1/2 (Retsch, Haan, Alemania). Se extrajeron alícuotas de 5
g de las muestras pulverizadas y se determinaron los compuestos fenólicos individuales
de acuerdo con un método publicado previamente (Kammerer, Claus, Carle y Schieber,
2004). Antes de la identificación y cuantificación de compuestos fenólicos por HPLC y
la determinación de los contenidos fenólicos totales (ensayo de Folin-Ciocalteu) y de la
actividad antioxidante usando ensayos TEAC y FRAP (véase a continuación), los
extractos brutos se fraccionaron usando cartuchos RP18 Sep-Pak. Brevemente, 5 ml de
los extractos crudos polifenólicos se ajustaron a pH 7 y se aplicaron a los cartuchos
preacondicionados. Los ácidos fenólicos se eluyeron con 10 ml de agua desionizada y 10
ml de HCl al 0,01% (v / v). Posteriormente, los flavonoides se recuperaron con 20 ml de
acetato de etilo (Kammerer et al., 2004).

Para evaluar los efectos de la composición del disolvente sobre los rendimientos de
extracción y el perfil fenólico de los extractos, los residuos de prensa de las semillas
'Lemberger' se extrajeron con etanol, una mezcla de etanol y agua (3: 1; v: v), agua
bidestilada (75 C) y metanol / HCl al 0,1% (v: v), respectivamente. Se pesaron alícuotas
de 5 g de las muestras pulverizadas en matraces Erlenmeyer y se extrajeron con

100 ml de los disolventes antes mencionados durante 2 h bajo agitación después de

enjuagar con nitrógeno para evitar la oxidación. Los extractos se centrifugaron (10 min,
5366 g) y los sólidos se volvieron a extraer con 100 ml del disolvente respectivo (60 min).

Determinación fotométrica de fenoles totales y antioxidantes actividad

Contenido fenólico total (TPC): ensayo de Folin-Ciocalteu. Los fenoles totales se

determinaron usando el reactivo Folin Ciocalteu de acuerdo con Singleton, Orthofer y
Lamuela-Raventós (1999). La absorción se determinó después de 60 minutos a 720 nm
con un fotómetro Cary 100 (Varian, Darmstadt, Alemania). Los resultados se expresaron
como equivalentes de ácido gálico (mg GAE / 100 g de semillas desgrasadas y mg GAE
/ 100 g de residuo de prensa desgrasada, respectivamente).

Actividad antioxidante: ensayo FRAP. Este método se basa en un aumento de la

absorbancia a 593 nm debido a la formación de complejos de tripiridil-S-triazina con Fe2
+ [TPTZ-Fe (II)] en presencia de un agente reductor (Benzie & Strain, 1996; Benzie &
amp; Szeto, 1999). El reactivo FRAP se preparó a partir de 2,5 ml de una solución de
TPTZ (10 mmol / l) en ácido clorhídrico (40 mmol / l) y 2,5 ml de una solución de FeCl3
(20 mmol / l) mezclada con 25 ml de un tampón de acetato (0.3 mol / L, pH 3,6). Para la
determinación de la capacidad antioxidante, se mezcló el reactivo FRAP (1,5 ml) con 100
l de agua y 100 l de la muestra diluida apropiadamente. La mezcla se dejó reposar durante
4 minutos a temperatura ambiente antes de medir la absorción a 593 nm (fotómetro Cary
100, Varian, Darmstadt, Alemania). La calibración se realizó con Trolox como se
describió anteriormente.
Efectos de la composición del solvente en los rendimientos de compuestos fenólicos

Los resultados antes mencionados demuestran que las semillas de uva y los residuos de
prensado de la recuperación de aceite de semilla de uva son una rica fuente de compuestos
fenólicos con altas actividades antioxidantes. La extracción de estos compuestos se
realizó a escala de laboratorio utilizando metanol / HCl al 0,1% (v: v), que es desfavorable
para la extracción de polifenoles a gran escala. Por lo tanto, nuevas investigaciones se
realizaron para optimizar las extracciones de solventes en condiciones que también
podrían aplicarse para recuperar ingredientes alimentarios a escala industrial. El uso de
etanol / agua (3: 1; v: v) y agua caliente (75 C) mostró rendimientos de extracción óptimos
de 99.8% y 98.2%, respectivamente. En contraste, las recuperaciones fueron malas
(49.4%) cuando se usó etanol puro. El uso de disolventes orgánicos requeriría recauciones
de seguridad rigurosas. Además, se debe prestar atención para garantizar el máximo
cantidades de nivel de traza de los solventes orgánicos en el producto final. Por lo tanto,
el agua como disolvente es una excelente alternativa para la recuperación de los
ingredientes alimentarios. Sin embargo, Shi et al. (2003) describieron que cuando se usa
agua, las proteínas y los polisacáridos también se extraen a alta presión y a altas
temperaturas. Estos hallazgos no pudieron ser confirmados en el presente estudio. Los
extractos de agua caliente no contienen altas cantidades de compuestos no deseados. Por
consiguiente, la concentración del extracto acuoso por evaporación a sequedad al vacío
no causó ningún problema. Los resultados presentados en este estudio demuestran que
los residuos de prensado de la producción de aceite de semilla de uva siguen siendo ricos
en compuestos fenólicos y que sus extractos tienen una alta actividad antioxidante, por lo
que su utilización vale la pena y, por lo tanto, respaldan la producción agrícola sostenible.
Finalmente, estos nutracéuticos se pueden extraer de manera eficiente usando agua
caliente en lugar de solventes orgánicos.

TÍTULO: RECUPERACIÓN DEL VALOR DE LOS MATERIALES DE

DESECHO ORGÁNICO: EXTRACCIÓN DE FLUIDO SUPERCRÍTICO DE
ACEITE DE UVA INDUSTRIAL

SemillasEl aceite de las semillas de uva fue aislado por extracciones Soxhlet. Se
extrajeron 20 g de semillas molidas con 250 ml de n-hexano (Sigma Aldrich) durante 4 h
en el punto de ebullición del disolvente, sifonando al menos cinco veces por hora. El
extracto se filtró y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente fue eliminado por
reducción evaporación de presión (rotavapor) y el residuo se secó hasta peso constante,
para obtener un rendimiento total de uva aceite de semilla (12.28 ± 0.35)% p / p, que se
almacenó en un congelador a 253 K.
 EXTRACCIÓN DE POLIFENOLES DE PIELES DE UVA Y SEMILLAS DE
UVA DESGRASADAS UTILIZANDO AGUA SUBCRÍTICA: EXPERIMENTOS
Y MODELADO

preparación de la muestra

Las muestras de orujo de uva Pinot Nero fueron obtenidas por enólogos ubicados en el
norte de Italia (región de Piamonte). En la bodega, los tallos se separaron de las semillas
y las pieles. La mezcla de semillas y pieles se llevó al laboratorio y se almacenó a -20 °
C antes de secar. Las muestras se secaron a 55 ° C durante 48 h, y luego las pieles y las
semillas se separaron por medio de vibratingsieves y posteriormente se limpiaron
manualmente y se almacenaron en un vacío bajo oscuro a temperatura ambiente. Las
pieles secas y las semillas se molieron con un molino (Sunbeam Osterizer Blender, Boca
Raton, EE. UU.) Justo antes de la extracción. Para evitar el sobrecalentamiento, la
muestra se descascarilló durante 10 s, luego se detuvo la molienda y la muestra se agitó
durante otros 10 s, y se continuó el proceso de molienda.

COMPARACIÓN DE EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDO CON

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN CONVENCIONALES DE ACEITE Y
POLIFENOLES DE SEMILLAS DE UVA (VITIS VINIFERA L.)

Extracción de aceite de semillas de uva

Las semillas de uva (variedad Raboso Piave) fueron provistas por Azienda Agricola
Armando Ronco (Lorenzaga, TV, Italia). El contenido de humedad de las semillas fue de
aproximadamente 8.3 ± 0.2% (p / p). Antes de la extracción de aceite, se trituraron hasta
convertirlos en polvo en una trituradora de acero durante 30 segundos hasta un tamaño
de partícula de menos de 0,5 mm.

2.2.1. Extracción Soxhlet (S)

El polvo de semilla de uva triturada (25 g) se extrajo continuamente con 300 ml de n-

hexano durante 6 horas a una temperatura máxima de 70ºC en un aparato Soxhlet.
Después de que se completó la extracción, se eliminó el n-hexano a 50 ° C a presión
reducida usando un evaporador rotativo (Rotavapor R210, Buchi, Flawil, Suiza).
Posteriormente, el matraz se colocó en una cámara desecante durante 1 h para eliminar el
n-hexano residual. El aceite obtenido se pesó y se calculó el rendimiento. La
determinación se realizó por triplicado.

Extracción asistida por ultrasonido (U: S)

Para los experimentos U: S, se utilizó un sonificador ultrasónico (Sonoplus modelo HD
2200, Bandelin, Berlín) equipado con una punta de aleación de titanio de punta plana (13
mm de diámetro) (TT13, Bandelin, Berlín). La harina de semilla de uva (25 g) se mezcló
con 200 ml de n-hexano en un vaso de precipitados de 250 ml. El vaso de precipitados y
su contenido se sumergieron en un vaso de precipitados de 500 ml que contenía baño de
hielo. La sonda, sumergida unos 4 cm debajo de la superficie de la mezcla, trabajó a una
frecuencia de 20 kHz y 50 (US50), 100 (US100) y 150W (US150) (configurada y
mostrada en% en la escala de 10-100) durante 30 min. Durante la extracción, el hielo se
reemplazó cuando se fundió para garantizar una disipación rápida del calentamiento y
una temperatura inferior a 30ºC. Después de extraerse, la mezcla se filtró a vacío a través
de papel Whatman Nº 1, y el disolvente se eliminó con un evaporador rotatorio a vacío a
50ºC. Cada extracción se realizó por triplicado utilizando tres diferentes muestras.

Extracción asistida por ultrasonido (EAU)

Se mezclaron alícuotas de 10 g de harinas de semilla de uva desgrasadas mediante

extracción Soxhlet (S) y mediante extracción asistida por ultrasonido (EE. UU.) Con 100
ml de metanol y se sonicaron mediante la sonda ultrasónica. (Elettrofor Sonoplus modelo
HD2200 con sonda TT13, Bandelin, Berlín) a 20 kHz de frecuencia y 150 W durante 15
minutos a una temperatura inferior a 30 C.

Determinación de taninos totales

Total de taninos flavonoides (TT) en los extractos metanólicos, expresados en miligramos

de catequina equivalente por gramo de harina (mg CAT / g de harina) se determinaron
usando el método colorimétrico descrito por Bordiga et al. [18]. Las medidas se llevaron
a cabo a 500 nm con el mismo espectrofotómetro que anteriormente. La curva de
calibración se realizó con soluciones estándar de catequina en el rango 1-10 mg mL 1 (R2
= 0,99).

Determinación total de antocianinas

Antocianinas totales (TA) en los extractos metanólicos, expresados en miligramos de

malvidina equivalente por gramo de harina (mg MAL / g de harina) se determinó usando
el método descrito por Bordiga et al. [18]. Las medidas se llevaron a cabo a 540 nm con
el mismo espectrofotómetro que anteriormente.

Determinación de ácidos cinámicos.

Ácidos cinámicos (CA) en el extractos metanólicos expresados en miligramos de

equivalente cafeico el ácido por gramo de harina (mg de CAF / g de harina) se determinó
usando el método informado por Spigno et al. [19] y descrito por Di Stefano y Cravero
[20] Las medidas se llevaron a cabo a 320 nm con el mismo espectrofotómetro que el
anterior. La curva de calibración se realizó con soluciones estándar de catequina en el
rango 50-500 lgmL 1. (R2 = 0,99).

Determinación de flavonoles

Los flavonoles (F) en los extractos metanólicos expresados en miligramos de quercetina

por gramo de harina (mg QUE / g de harina) se determinaron usando el método informado
por Spigno et al. [19] y descrito por Di Stefano y Cravero [20]. Las medidas se llevaron
a cabo a 370 nm con el mismo espectrofotómetro que anteriormente. La curva de
calibración se realizó con soluciones estándar de catequina en el rango de 50-500 lg mL1
(R2 = 0,99).

muestra los resultados para la extracción de compuestos fenólicos llevados a cabo por
maceración (M) y extracción por ultrasonido asistente (UAE) de semillas de uva
desgrasadas por U: S y S. T-Test demostró que el efecto de maceración en semillas de
uva desgrasadas por ultrasonido (US -M) tuvo un efecto significativo en el

contenido de polifenoles totales, taninos totales, antocianinas totales, ácidos cinámicos,

flavonoles y actividad antioxidante (p <0.05). Esto podría atribuirse a la asociación de
dos métodos de extracción suaves: la extracción de aceite, llevada a cabo por U: S a una
temperatura inferior a 30ºC durante un período corto (aproximadamente 30 min) y la de
polifenoles realizados en atmósfera de nitrógeno, a evite la oxidación, por un largo tiempo
(12 h) a temperatura ambiente. En comparación con U: S-M, S-M fue significativamente
menor para compuestos fenólicos totales, taninos totales, ácidos cinámicos y no
significativamente diferente tanto para antocianinas totales como para flavonoles.
Comparado con US-M, S UAE no fue significativamente diferente para el contenido total
de polifenoles y taninos totales y significativamente menor para las otras fracciones
polifenólicas y para la actividad antioxidante. Esto podría deberse al hecho de que durante
los Emiratos Árabes Unidos, el colapso de las burbujas de cavitación generan puntos
calientes localizados de corta duración con temperaturas y presiones locales
extremadamente altas [31] que pueden influir en la estabilidad de los compuestos
fenólicos, lo que también depende de su estructura química [14, 32, 33]. Comparado con
S-UAE, USUAE fue significativamente menor solo para el contenido total de polifenoles.
Estos resultados indican que el efecto de una doble extracción asistida por ultrasonido de
semillas de uva no fue efectivo para la recuperación de compuestos fenólicos. Puede ser
que la aplicación demasiado larga de ultrasonidos a la misma matriz (semilla de uva)
cause la degradación de sus compuestos [34].