RAMIREZ GUTIERREZ ANA MELVA

I. ANEXOS:

Anexo 1: CÁLCULO DE LA COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE ACTIVACIÓN Y

FERMENTACIÓN

CUADRO 01: Cálculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado para la
preparación de 15 ml de un medio de activación.

 Sacarosa:
10g ------- 1000 ml
X -------- 15ml
X = 0.15 g

 Extracto de levadura:
3g ------- 1000 ml
X -------- 15 ml
X = 0.045 g

 Peptona

5g ------- 1000 ml
X -------- 15 ml
X = 0.075 g

 MgSO4 7H2O (sigma):

0.65ml ------- 1000 ml
X -------- 90 ml
X = 0.00975 ml

CUADRO 02: Cálculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado para la
preparación de 90ml de un inoculo de medio de fermentación.

 Extracto de yacón:
26.2g ------- 1000 ml
X -------- 90ml
X = 52.4 g

 Extracto de levadura:
10g ------- 1000 ml
X -------- 90 ml
X = 20 g

 KH2PO4:

1g ------- 1000 ml
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X -------- 90 ml
X=2g

 (NH4)2SO4:

10g ------- 1000 ml

X -------- 90 ml
X = 20 g

 MgSO4 7H2O:

0.386g ------- 1000 ml

X -------- 90 ml
X = 0.772 g

CUADRO 03: Cálculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado para la
preparación de 2000 ml de un medio de fermentación.

 Extracto de yacón:
26.2g ------- 1000 ml
X -------- 2000ml
X = 52.4 g

 Extracto de levadura:
10g ------- 1000 ml
X -------- 90 ml
X = 0.9 g

 KH2PO4:

1g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.09 g

 (NH4)2SO4:

10g ------- 1000 ml

X -------- 200 ml
X = 0.9 g

 MgSO4 7H2O:

0.386g ------- 1000 ml

X -------- 200 ml
X = 0.0353 g
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Anexo 2: TABLA N°01: Detalle técnica experimental para determinación de

parámetros cinéticos.
Sol. A: Buffer Citrato-fosfato 0,05 M, pH 5 Sol. B: Concentración enzimático inulinasa. Sol.
C: Solución sustrato sacarosa 20 g/L
Tabla 01: Técnica experimental para determinación de parámetros cinéticos:

Nº muestra Solución (A) Solución (B) Solución (C) Concentración

ml ml ml (g/l)

1 26 1 3

2 23 1 6

3 20 1 9

4 18 1 11

5 15 1 14

6 12 1 17

7 9 1 20

8 6 1 23

9 3 1 26

10 0 1 29

Anexo 3: Tabla 02: Datos experimentales azucares DNS

DNS
min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0
2
6
10
15
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Anexo 4: OBTENCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRADO DE PROTEÍNAS

0.1 gr de azul de Coomassie

DISOLVER G-250 en 50 ml de etanol al
95 % + 100 ml de ácido
fosfórico al 85%.

AFORAR A un litro

100 µL de muestra a un
AGREGAR
tubo de ensayo

5 ml de reactivo de Bradford
AÑADIR

La absorbancia a una longitud de

LEER onda de 595 nm. (Con blanco de
agua destilada de 100 µL)
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Anexo 5: OBTENCIÓN DE UN CALDO CRUDO DE KLUVEYROMYCES

MARXIANUS NRRL Y-7571 PRODUCIDO POR FERMENTACIÓN DE UN MEDIO
OPTIMIZADO, EN EL BIORREACTOR BIOSTAT

20g de caldo crudo desecada con

MEZCLAR 60 ml de pirofosfato de sodio a
0.066M en una fiola de un litro

TAPAR El frasco con un tapón de

algodón

En un baño de agua
COLOCAR manteniendo la temperatura
entre 40º a 45ºC

REPOSAR La preparación por 24 horas.

La mezcla a 150 r.p.m. durante

CENTRIFUGAR 15 minutos a temperatura
ambiente.

El líquido sobrenadante claro y

DECANTAR
de color ámbar en una probeta

VERTIR La solución en un vaso

PONER Entre 0º y 2º C en baño de hielo.

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Anexo 6: DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA (ACTIVIDADES VOLUMÉTRICAS Y ESPECÍFICA) DE LA ENZIMA
EN EL CALDO CRUDO Y CONCENTRADO.

PREPARAR En 5 tubos de ensayo.

AGREGAR En cada tubo de 2.9 ml de

solución de sacarosa a pH 5.

COLOCAR En baño maría a 55°C durante

3 minutos.

0.1 ml de caldo crudo enzimático

AGREGAR
a c/u de los tubos de ensayo.

En reacción el tiempo requerido

DEJAR por el experimento: 0.5, 10, 15,
20 min. respectivamente.

DETENER La reacción introduciendo c/tubo

en agua a 100°C por 3 minutos.

RETIRAR Los tubos del agua hirviendo y

ponerlos en hielo.

Azúcares reductores.
DETERMINAR

Los blancos para sustrato y para

PREPARAR
la enzima simultáneamente.

Azúcares (g/L) vs. tiempo (min.).

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