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I. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos constituyen el grupo de organismos más

diverso de nuestro planeta dando lugar a comunidades muy dinámicas y con

capacidades metabólicas extraordinarias (BROCK et al., 2000). Además, los

microorganismos también tienen la capacidad de adaptarse rápidamente a

nuevas condiciones (CASES y DE LORENZO, 2002). Sin embargo, hoy en día

se considera que sólo se conoce un mínimo porcentaje del total de las especies

microbianas existentes (CURTIS et al., 2002).

Las cuevas con temperatura relativamente constante y humedad

elevada, son un hábitat favorable para el desarrollo de numerosos

microorganismos (AGAROSSI et al., 1985). En este sentido la investigación se

ha centrado en el estudio de la Cueva de las Lechuzas ubicada en el Parque

Nacional Tingo María.

Esta cueva se encuentra ubicada en las faldas de la cordillera de

“La Bella Durmiente” en Tingo Maria, Huánuco, es una gran gruta de piedra

caliza en donde habitan colonias de aves, murciélagos, reptiles e insectos. Este

ecosistema pertenece al Parque Nacional Tingo Maria.

Al ser la “Cueva de las Lechuzas” el centro de atención al visitar el

PNTM ya que presenta un paisaje espectacular y un sistema de cavernas


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parcialmente estudiado, por lo cual es necesario conocer la composición

microbiológica presente en el aire y cuáles de estos podrían ser perjudiciales

para la salud humana, para así dar seguridad a los visitantes; la relación que

guarda esta investigación con la ingenieria ambiental se fundamenta en el

principio de prevención para la salud pública.

En la presente práctica pre profesional se determinó básicamente

la presencia de bacterias y hongos en el circuito turístico “Cueva de las

Lechuzas” los resultados a obtener tendrán un carácter preventivo ante la

presencia de microorganismos patógenos, para así disminuir el riesgo y

proteger la salud del turista.


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1.1. Objetivos

1.1.1. General

- Determinar la composición microbiológica del aire en el

circuito turístico Cueva de las Lechuzas del Parque Nacional

Tingo Maria.

1.1.2. Específicos

- Determinar los parámetros físicos relevantes (temperatura y

humedad) en la identificación de bacterias y hongos.

- Identificar las bacterias y hongos que se encuentran presentes

en el aire de la Cueva de las Lechuzas.

- Determinar la variedad de especies bacterianas y géneros

fúngicos existentes en el aire de la Cueva de las Lechuzas.

- Determinar que microorganismos de los identificados son

patógenos para el hombre.

- Sugerir medidas de prevención para el ingreso a la Cueva de


las Lechuzas del Parque Nacional Tingo Maria.
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II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Conceptos generales

2.1.1. Definición de una cueva

Una cueva o caverna es una cavidad natural del terreno causada

por algún tipo de erosión de corrientes de agua, hielo o lava, o menos común,

una combinación de varios de estos factores. En el más común de los casos,

las cuevas se forman por la disolución de la roca caliza por parte del agua

ligeramente ácida.

Existen muchas definiciones para el término karst. Según

JENNINGS (1985), es un terreno con morfología e hidrología distintiva

resultado de la combinación de una alta solubilidad de la roca y una porosidad

secundaria bien desarrollada, que dan lugar a rasgos morfológicos y

sedimentológicos superficiales (exokarst), y presenta una serie de rasgos

subterráneos (endokarst) resultantes de la disolución, siendo las cavidades las

unidades más características y esenciales de las morfologías endokársticas.

Según WHITE (1988) karst es un tipo de terreno con una

geomorfología particular caracterizada por depresiones cerradas (poljes, úvalas

y dolinas), una red de drenaje subterránea y en muchos casos cavidades.


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2.1.2. Características de una cueva

En general, las cuevas son ecosistemas con bajo contenido en

nutrientes, estables en las condiciones ambientales, con temperaturas similares

a las medias externas anuales y elevada humedad próxima a la saturación.

Según CHELIUS et al., (2009), las comunidades bióticas que

aparecen en las cuevas son poco diversas, con una estructura simple y

sensibles a los cambios, como la introducción de materia orgánica proveniente

del exterior.

Las cuevas son estructuras geológicamente estables, por lo que

es posible identificar, medir y modelizar cómo los nutrientes y otras fuentes de

energía penetran en ellas. Existen tres rutas principales de entrada de energía

y nutrientes en estos ambientes subterráneos, permitiendo el crecimiento de los

microorganismos (BARTON y JURADO, 2007):

- Gases atmosféricos (nitrógeno, CO2 y compuestos orgánicos volátiles);

- Compuestos aromáticos y poliaromáticos derivados del suelo que llegan

al sistema subterráneo por percolación.

- Iones metálicos reducidos (Mn2+ y Fe2+) de la propia roca que movilizan

los microorganismos. Algunas especies microbianas que aparecen en

cuevas son capaces de movilizar fosfato inorgánico, oxidar metano e

hidrógeno. (BARTON y JURADO, 2007)

El suelo actúa como primera membrana o filtro de las oscilaciones

externas. Su espesor, composición y textura (porosidad‐permeabilidad) son

fundamentales ya que actúa como zona de captación y transmisión del agua


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meteórica, y en él tienen lugar numerosos procesos micro y macrobiológicos

con generación y consumo de CO2, condicionando, por tanto, la calidad y

cantidad de agua que llega al sistema interno (CUEZVA et al., 2004).

Los espeleotemas, tales como estalactitas y estalagmitas, que

aparecen en las cuevas son el resultado de la precipitación de los

carbonatos presentes en el agua que circula sobre el suelo que está

encima de la cavidad. Esta agua se filtra a través de las pequeñas

grietas del terreno y se va cargando en CO2, originándose ácido

carbónico que reacciona con la roca y disuelve el carbonato cálcico.

Cuando esta agua cargada de carbonato cálcico entra en contacto

con la atmósfera de la cueva, precipita. Algunas de las formaciones

minerales están asociadas al desarrollo de bacterias heterotróficas

(BARTON y JURADO, 2007).

En el interior de las cavidades hay variaciones ambientales de unas

zonas a otras en función principalmente de la distancia a la entrada y

del espesor de roca suprayacente en cada punto. Las entradas de las

cuevas son regiones en las que las variables ambientales están bajo

influencia del ambiente externo. Desde un punto de vista ecológico

esta zona de transición entre sistemas epigeos e hipogeos constituye

el ecotono (zona de transición entre sistemas ecológicos adyacentes) (PROUS

et al., 2004).

Proporciona un incremento en la disponibilidad de recursos, al

tiempo que resulta una zona en la que pueden coexistir especies de ambos

ambientes vecinos (epigeo e hipogeo) con aquellas otras específicas del


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ecotono mismo, lo que puede llegar a favorecer una mayor diversidad en el

área de transición que en los ambientes contiguos (PROUS et al., 2004).

2.2. Cueva de las Lechuzas

Esta caverna es la abertura principal de lo que parece ser un

vastísimo y complejo sistema subterráneo en los cerros de la Bella Durmiente.

Existen, en efecto, otras aberturas en el mismo sector, más arriba y a la

derecha de la Cueva de las Lechuzas, pero son de muy difícil acceso y al

parecer mucho más pequeñas. En una de ellas, por lo menos, también anidan

los guacharos. Al nivel del río Monzón, a la derecha de la Cueva de las

Lechuzas, emerge un río subterráneo bastante caudaloso que sería el

responsable de la formación de las grutas. Se le conoce como Quebrada de las

Lechuzas. La Cueva de las Lechuzas, en la parte habitada por los guacharos,

consta de tres grandes' salas con techos en forma de cúpulas, dispuestas una

detrás de la otra, en línea recta. La primera sala, la que más luz recibe, mide 65

m. (DOUROJEANNI y TOVAR, 1974).

El guácharo se alimenta de los frutos de 24 especies de árboles y

palmeras, constituyendo éstas cerca del 70% de sus alimentos (pijuayo o

chonta el 42%).En el piso de las cuevas se acumula una gran cantidad de

semillas y restos de los frutos, que constituyen la base de la red trófica en las

mismas. Todo el delicado equilibrio de la fauna se basa en el aporte de restos

orgánicos que las aves transportan a la cueva (excrementos y animales

muertos). Cerca de 50 especies de artrópodos (32 de insectos, 13 de arañas)


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viven directa o indirectamente a expensas de las semillas y restos orgánicos,

que son descompuestos en fases sucesivas, en cada una de las cuales

intervienen artrópodos diferentes. En la transformación de las semillas a

detritos gruesos intervienen especialmente coleópteros. En el proceso de

detritos gruesos a detritos finos intervienen cucarachas (Blattidae) y

coleópteros. Para la transformación de detritos finos a humus intervienen

cucarachas, milpiés, moscas, coleópteros y otros. Finalmente, para transformar

el humus en suelo húmico intervienen colémbolos, ácaros e isópodos (BRACK,

2000).

2.2.1. Número de visitantes a la Cueva de las Lechuzas

Para el año 2015 se tuvo un total de 83583 visitantes durante todo

el año del cual se muestra el siguiente cuadro para cada mes del año 2015, de

los cuales Enero, Julio, Agosto y Octubre son los meses de mayor flujo

turístico, hasta el mes de Junio del año 2016 se tuvo un total de 34564

visitantes entre nacionales e internacionales.


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Cuadro 1. Número de visitas a la Cueva de las Lechuzas por mes durante el

año 2015

MES TOTAL VISITANTES


Enero 9127
Febrero 5953
Marzo 3257
Abril 4218
Mayo 4785
Junio 6114
Julio 11211
Agosto 10615
Septiembre 6275
Octubre 9859
Noviembre 7413
Diciembre 4756
TOTAL 83583
Fuente. Servicio Nacional de Áreas Naturales Protegidas – Sede Tingo Maria – Parque Nacional Tingo
Maria.

FLUJO TURISTICO POR MES DEL AÑO 2015

12000
10000
Número de visitas

8000
6000
4000
2000
0

Meses

Figura 1. Flujo turístico por mes del año 2015.


Fuente. Servicio Nacional de Áreas Naturales Protegidas – Sede Tingo Maria – Parque Nacional Tingo
Maria.
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Cuadro 2. Número de visitas a la Cueva de las Lechuzas hasta el mes de

Junio durante el año 2016.

MES Número de visitantes

ENERO 11829
FEBRERO 7367
MARZO 6064
ABRIL 3049
MAYO 485
JUNIO 5770
TOTAL 34564
Fuente. Servicio Nacional de Áreas Naturales Protegidas – Sede Tingo Maria – Parque Nacional Tingo
Maria.

NÚMERO DE VISITAS 2016 HASTA EL MES DE JUNIO

12000

10000
Número de visitantes

8000

6000

4000

2000

0
ENERO FEBRERO MARZO ABRIL MAYO JUNIO
Meses

Figura 2. Flujo turístico hasta Junio del 2016


Fuente. Servicio Nacional de Áreas Naturales Protegidas – Sede Tingo Maria – Parque Nacional Tingo
Maria.
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2.3. Estudios realizados sobre la composición microbiológica del aire

en otras cuevas.

La dispersión aérea de los microorganismos es uno de los

principales mecanismos mediante los cuales estos penetran en las cuevas y se

dispersan a través de las distintas salas (DOMINGUEZ, 2014).

Se han realizado muy pocos estudios sobre la dispersión aérea de

microorganismos en cuevas, y los resultados obtenidos son difícilmente

comparables debido al empleo de 0diferentes metodologías (DOMINGUEZ,

2014).

Los trabajos sobre la aerobiología en las Cuevas de Mogao

(Dunghuang, China) mostraron la influencia de la temperatura, la humedad

relativa y la actividad antropogénica sobre la concentración y la distribución de

las bacterias y hongos (WANG et al., 2010).

Los estudios del aire de la Cueva de Nerja (Malaga, España),

pusieron de manifiesto la entrada de esporas fúngicas y granos de polen desde

el exterior, y el drástico incremento de las esporas de los géneros

Aspergillus/Penicillium como consecuencia del festival de música y danza que

se celebra en verano (DOCAMPO et al, 2010, 2011).

En cuevas como las de Altamira (Santillana del Mar, España) y

Lascaux (Dordoña, Francia), el turismo masivo ocasionó graves problemas de

colonización por microorganismos, por lo que fueron cerradas al público y las

visitas se desviaron a las réplicas. Para hacer el seguimiento de los brotes


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microbianos en estas dos cuevas y en la de Castañar de Ibor se llevó a cabo

un estudio aerobiológico (PORCA et al., 2011).

En el año 1955 se realizó un estudio en la Cueva de las Lechuzas

para determinar la presencia del hongo Histoplasma capsulatum en muestras

de suelo provenientes de la cueva, esto se llevó a cabo debido a la relación de

este hongo con casos de histoplasmosis. (ALFRED, 1955)

En el año 2000 se realizó otro estudio en la Cueva de las Lechuzas

en el cual se volvió a encontrar la presencia de Histoplasma capsulatum el cual

representa un potencial patógeno moderado, se realizaron pruebas de

resistencia a antimicóticos, resultado de esto se determinó que dicho hongo es

resistente ante diferentes antimicóticos (MAZABEL, et al, 2000).

2.4. Diversidad microbiana en cuevas

Los microorganismos constituyen el grupo de organismos más

diverso de nuestro planeta dando lugar a comunidades muy

dinámicas y con capacidades metabólicas extraordinarias (BROCK et al.,

2000).

Además, los microorganismos también tienen la capacidad de

adaptarse rápidamente a nuevas condiciones (CASES y DE LORENZO., 2002).

Sin embargo, hoy en día se considera que sólo se

conoce un mínimo porcentaje del total de las especies microbianas

existentes (CURTIS et al., 2002). Esto se atribuye a que una proporción

extremadamente baja de microorganismos se puede cultivar


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empleando medios de cultivo tradicionales (FRY, 1990). Por otro lado,

se considera que es prácticamente imposible conocer la totalidad de

la diversidad microbiana de una comunidad natural, debido a los

límites de los métodos de detección y a la elevada cantidad de

microorganismos existentes (POMMIER et al., 2005; CURTIS et al., 2002).

2.5. Papel de los microorganismos en las cuevas

Las cuevas con temperatura relativamente constante y humedad

elevada, son un hábitat favorable para el desarrollo de numerosos

microorganismos (AGAROSSI et al., 1985).

Los microorganismos juegan un papel importante en los sistemas

hipogeos, puesto que son capaces de colonizar las superficies de las rocas,

utilizando como fuentes de energía una amplia gama de

compuestos orgánicos e inorgánicos, desarrollándose prácticamente

en cualquier hábitat y además participando y regulando los ciclos

biogeoquímicos de los elementos.

Los microorganismos están implicados en diferentes procesos:

- Destructivos: causando la desintegración parcial o total del

sustrato, como roca, espeleotemas o pigmentos.

- Constructivos: provocando la alteración del sustrato, originando

depósitos de sales, entre otros. El crecimiento microbiano

concentrado en puntos determinados da lugar a colonizaciones.

Por tanto la colonización biológica se presenta como uno de los

grandes problemas que afecta a la conservación de las cuevas


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con pinturas rupestres. Su crecimiento y desarrollo está

favorecido por el aporte de materia orgánica disuelta en las aguas

de infiltración, así como posibles desequilibrios en el sistema por

efecto de las visitas (CAÑAVERAS et al., 1999, 2001).

2.6. Microorganismos

2.6.1. Bacterias

2.6.1.1. Género Enterobacter

Los microorganismos que pertenecen a este género raras veces

causan infecciones en huéspedes sanos, pero son aislados nosocomiales

frecuentes. Tres especies de Enterobacter, E. cloacae, E. aerogenes y E.

sakazakii, son responsables de la amplia mayoría de infecciones por

Enterobacter. Pantoea agglomerans, hasta hace poco conocida como Pantoea

agglomerans, es también un aislado frecuente que puede causar una amplia

variedad de infecciones, entre ellas neumonía. Estas bacterias fermentan la

lactosa, son móviles y forman colonias mucoides (MANDELL, 2006).

2.6.1.2. Género Pseudomona

Las Pseudomonas y los microorganismos del género Acinetobacter

tienen una amplia distribución en el suelo y el agua. Pseudomonas aeruginosa

a veces coloniza al ser humano y es el principal microorganismo patógeno

humano del grupo. P. aeruginosa es invasiva y toxígena, produce infecciones

en pacientes con defensas anormales y es un microorganismo patógeno

importante en los hospitales (JAWETZ, 2011).


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2.6.1.3. Género Staphylococcus

El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos,

con un diámetro de 0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares,

tétradas, cadenas cortas o formando racimos de uvas. Son bacterias no

móviles, no esporuladas, no poseen cápsula, aunque existen algunas cepas

que desarrollan una cápsula de limo, son anaerobias facultativas. La mayoría

de los estafilococos producen catalasa (enzima capaz de desdoblar el peróxido

de hidrógeno en agua y oxígeno libre); característica que se utiliza para

diferenciar el género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y

Enterococcus que son catalasa negativos. (KURODA et al, 2001; KLOSS et al,

1992).

2.6.1.4. Género Klebsiella

Los microorganismos del género Klebsiella son bacilos

gramnegativos inmóviles que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. K.

pneumoniae está presente en el sistema respiratorio y en las heces de casi 5%

de las personas sanas. Produce una pequeña proporción (alrededor de 1%) de

las neumonías bacterianas. K. pneumoniae puede producir una consolidación

pulmonar necrosante por hemorragia extensa. Produce infecciones urinarias y

bacteriemia con lesiones focales en pacientes débiles. Otros microorganismos

entéricos también producen neumonía. Las bacterias del género Klebsiella

figuran entre las 10 principales bacterias patógenas que ocasionan infecciones

hospitalarias (JAWETZ, 2011).


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2.6.2. Hongos

Los hongos poseen una distribución cosmopolita y poseen un

amplio rango de hábitats, que incluyen ambientes extremos como los desiertos,

áreas de extremada salinidad (VAUPOTIC et al., 2008).

2.6.2.1. Género Histoplasma

La especie representativa Histoplasma capsulatum es un hongo

dimórfico termo dependiente: crece en forma filamentosa a 25°C y en forma de

levadura a 37°C provoca una micosis sistémica llamada histoplasmosis, este

hongo se encuentra presente en excretas de murciélagos y algunas aves. Se

adquiere por inhalación y generalmente es asintomática en áreas endémicas.

En 95% de los afectados es subclínica o benigna y, en una proporción baja, es

pulmonar progresiva o cutánea crónica; en los histiocitos se encuentran

levaduras pequeñas (ARENAS, 2008).

Histoplasma capsulatum es un hongo dimorfo con fase saprofítica

micelial que produce macroconidios de naturaleza polisacárida y que vive sobre

todo en climas tropicales y subtropicales; los nichos abiertos son suelos con

alto contenido de nitrógeno y guano de pájaros, pollos, murciélagos, así como

de algunas aves. La temperatura promedio es de 22 a 29°C, la precipitación

pluvial de 100 mm y la humedad relativa, de 67 a 87%; los nichos cerrados son

cuevas que tienen condiciones ambientales similares (ARENAS, 2008).

2.6.2.2. Género Aspergillus

Los hongos del género Aspergillus son omnipresentes y

oportunistas que viven como saprófitos en el suelo, vegetales en


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descomposición, cualquier tipo de materia orgánica, como pintura fresca,

alimentos enlatados abiertos, ropa vieja, recipientes con agua sin usar,

reactivos químicos, paredes de refrigeradores, sistemas de ventilación, cuartos

de hospital, bolsas de diálisis e incluso lentes de contacto blandas (ARENAS,

2008).

Las especies que actúan como patógenas son termotolerantes; A.

fumigatus puede crecer a temperaturas de 20 a 50°C. Los conidios penetran

por inhalación dados su tamaño y sus propiedades aerodinámicas y llegan a

las partes distales del pulmón; su crecimiento incontrolado en el pulmón los

convierte en una forma potencial angioinvasora. Las modalidades clínicas

dependen de la transformación del hongo de saprófito en parásito. Al parecer

los bronquios constituyen un nicho ecológico, debido a la presencia de

nutrimentos y condiciones de temperatura. La invasión sólo ocurre cuando las

defensas fagocíticas del huésped se debilitan por la inmunosupresión

(ARENAS, 2008).

2.6.2.3. Género Penicillium

Los miembros del género Penicillium son hongos filamentosos. Las

especies de Penicillium están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se

hallan en el suelo, la vegetación caída, el aire y el suelo. Es un hongo de

crecimiento rápido dando colonias blancas aterciopeladas inicialmente, las

cuales se cubren con los esporos y van tomando diferentes colores según la

especie; al final quedan completamente cubiertas de esporas con un aspecto

pulverulento (GUZMAN, 1977)


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2.6.2.4. Género Botrytis

Es un hongo ampliamente distribuido con una extensa gama de

huéspedes. En cítricos causa enfermedades en brotes, hojas, madera y frutos.

Vive como saprofito de la materia orgánica en descomposición y también ha

sido aislado del suelo. Los conidios pueden ser transportados hasta el huésped

por el viento, agua, insectos u otros medios. Si el inóculo potencial es

suficientemente grande, el hongo puede penetrar directamente, pero

comúnmente lo hace a través de heridas. Botrytis cinerea es un agente causal

de la “podredumbre gris”, infecta más de 200 especies vegetales distintas,

determinando serias pérdidas económicas antes y después de la recolección

(JARVIS, 1977).

2.6.2.5. Género Trichophyton

El género Trichophyton es uno de los agentes etiológicos

principales de las dermatomicosis, capaces de invadir el pelo, la piel y las uñas.

Los dermatofitos degradan y utilizan la queratina como una fuente de nitrógeno

pero suelen ser incapaces de penetrar en el tejido subcutáneo, salvo que el

huésped esté inmunodeprimido. Los miembros de este género están

ampliamente distribuidos y son las causas más importantes y comunes de

infecciones de los pies y las uñas; son los causantes de la tiña del cuerpo,

cuero cabelludo, uñas, entre otros (FORBES, 2009).


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2.6.2.6. Género Geotrichum

Geotrichum sp es un hongo de distribución mundial, se ha aislado de tierra,

detritus vegetales, frutas y quesos. Es parte de la flora normal de la piel y las

mucosas, y se ha cultivado en muestras de expectoración, heces, orina y

secreción vaginal, con una frecuencia reportada en las diferentes series de 18

a 31%. Se ha descrito como patógeno en pacientes con inmunocompromiso y

se consideran factores predisponentes la diabetes mellitus, el linfoma, la

leucemia, la tuberculosis, la terapéutica con inmunosupresores y la infección

por el virus de la inmunodeficiencia humana. Se localiza principalmente en los

pulmones, aunque algunos informes dan cuenta también de geotricosis

bronquial, intestinal, oral y cutánea. Incluso hay reportes aislados de casos con

infección de las articulaciones, los tejidos blandos y el peritoneo (CORNEJO et

al., 2000).
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III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Lugar de ejecución

3.1.1. Ubicación del área de estudio

El área de estudio fue el circuito turístico “Cueva de las Lechuzas”

del Parque Nacional Tingo Maria perteneciente al distrito de Mariano Damaso

Beraún de la Provincia de Leoncio Prado en la Región Huánuco, del cual se

obtuvieron muestras de aire en 4 puntos estratégicos en el curso del circuito.

Figura 3. Mapa de ubicación de la Cueva de las Lechuzas.

Cuadro 3. División política de la ubicación de la Cueva de las Lechuzas.


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DEPARTAMENTO HUÁNUCO

PROVINCIA LEONCIO PRADO

DISTRITO MARIANO DAMASO BERAÚN

3.1.2. Ubicación del área de procesamiento de muestras

El aislamiento e identificación de microorganismos se realizó en el

Laboratorio de Microbiologia de la Universidad Nacional Agraria de la Selva.

Cuadro 4. División política de la ubicación del Laboratorio de Microbiología

DEPARTAMENTO HUÁNUCO

PROVINCIA LEONCIO PRADO

DISTRITO RUPA - RUPA

3.2. Materiales

3.2.1. Medios de cultivo

Los medios de cultivos utilizados en la presente práctica pre

profesional fueron los siguientes:

- Caldo BHI (Brain Heart Infussion), caldo peptona, agar CLED (Cistina

lactosa deficiente de electrolitos), agar Mac Conkey, agar Manitol

Salado, agar M77, agar glucosa al 4 % según Sabouraud, agar Plate

Count.
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3.2.2. Para realizar las pruebas bioquímicas

Para la realización de las pruebas bioquímicas se utilizó los

siguientes caldos y agares:

- Caldos: Caldo peptona 0.1 %, caldo Rojo de Metilo y Voges Proskauer

(RMVP), caldo malonato.

- Agares: Agar TSI (Hierro Triple Azúcar), agar LIA (Lisina – Hierro), agar

citrato según Simmons, agar urea.

3.2.3. Reactivos

- Reactivo del Indol según KOVACS

- Rojo de metilo, hidróxido de sodio al 4% (NaOH)

- Alfa naftol

- Azul lacto glicerol.

3.2.4. Materiales de laboratorio

- Matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo, vasos precipitados, termómetro,

jeringas de 20 ml, algodón, placas Petri, pipetas, pinzas, porta objetos,

varillas de vidrio, gradillas, mechero de Bunsen, asa de siembra, ansa

micológica, agitadores, termo higrómetro, micropipeta graduada.

3.2.5. Equipos

- Autoclave, baño María, balanza, microscopio, estufas, contador de

colonias, termo higrómetro ANTON AN - 2602.


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3.3. Identificación del área de estudio

Se realizó una visita previa al muestreo, para establecer los puntos

estratégicos para la toma de muestras en el circuito turístico de la Cueva de las

Lechuzas, el cual constó de 4 puntos en función de la zonificación de la misma,

la parte externa de la cueva correspondiente al comienzo de la escalera, la

entrada de la cueva (Inicio de la zona vestibular), parte intermedia del circuito

(Término de la zona vestibular e inicio de la zona media) y la parte donde

termina el circuito (Término de la zona media) la distancia aproximada desde la

zona vestibular hasta el final de la zona media es de 125 m.

Se estableció como tamaño muestral 4 puntos debido a que el

muestreo se tenía que realizar en un tiempo corto de aproximadamente 1 h a 1

h y media, y en días donde no haya mucha afluencia de turistas para evitar

generar especulaciones negativas en los visitantes respecto a la actividad de

muestreo del aire, es por eso que los puntos fueron distribuidos como ya se

mencionó, las cuales abarcaron desde la parte externa hasta el término de la

zona media en la cueva, todos los puntos en dirección del camino construido .

Para determinar la muestra de la presente práctica pre profesional

se empleó el muestreo no probabilístico sin normas o circunstancial. Según

SANCHEZ (1998), dice que el muestreo es circunstancial o sin normas cuando

los elementos de la muestra se toman de cualquier manera, generalmente

atendiendo razones de comodidad, circunstancias, eventualidades,

necesidades, e intereses de la investigación o el investigador.


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Fuente. (DOUROJEANNI y TOVAR, 1972)

Figura 4. Perfil de la zonificación de la Cueva de las Lechuzas.

Cuadro 5. Puntos de muestreo

PUNTOS DE
LUGAR
MUESTREO
PUNTO 1 Inicio de la escalera
PUNTO 2 Entrada de la cueva
PUNTO 3 Parte media del circuito
PUNTO 4 Parte final del circuito
25

1 2

3 4

Figura 5. Puntos de muestreo en el circuito Cueva de las Lechuzas.


3.4. Metodología

3.4.1. Determinación de parámetros físicos en la cueva

La temperatura y humedad relativa fueron determinadas con un

termohigrómetro ANTON AN – 2602. Se determinó en cada punto de muestreo,

las consideraciones que se tomaron en cuenta fue; la protección del sensor con

plástico al momento de transportarlo hacia el lugar del muestreo, en el mismo

punto se quitó el plástico y se esperó unos minutos a que el sensor determine

tanto la temperatura y humedad del ambiente.


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3.4.2. Para la identificación de microorganismos

presentes en el aire.

3.4.2.1. Identificación de bacterias

a) Muestreo por método de la jeringa. (Método

IMPINGER modificado por LÓPEZ, 2004)

Para el respectivo muestreo se preparó 4 matraces con caldo BHI

el cual es un caldo para cultivo de gran variedad de microorganismos, la cual

está constituida de 90 mL de agua destilada con 3.3 gr de BHI granulado.

Para muestrear el aire se utilizó una jeringa de 60 ml, en el cual se

aspiró el aire, cada una debidamente esterilizada, seguidamente se procedió a

introducir la muestra de aire al matraz con el caldo BHI, este procedimiento se

realizó unas 20 veces, para asegurarnos de obtener una muestra adecuada,

siempre tomando las precauciones del caso.

b) Incubación de muestras con BHI (LÓPEZ, 2004).

Los matraces con medio BHI del muestreo fueron llevados a

incubación a una temperatura de 37 ºC por un tiempo de 48 horas.

c) Recuento de microorganismos por el método de

Recuento en placas (LÓPEZ, 2004).

Para el recuento de microorganismos se realizó el método de

Recuento en placa, para ello se preparó 4 matraces conteniendo cada uno 90

mL de caldo peptona, de cada frasco con BHI después de haber sido incubado

por 48 horas se retiró con una pipeta 10 mL, los cuales obedeciendo al método

de diluciones seriadas, se adicionan a su respectivo matraz con caldo peptona


27

(10-1); se homogenizó el resultado para luego realizar dos diluciones más,

sacando 1 mL de la muestra y adicionándolo a un tubo de ensayo con 9 mL de

caldo peptona (10-2), se homogeniza y se repite el procedimiento (10 -3), de ésta

última dilución, se realiza el método de placa vertida, para el cual se retira 1 mL

de la última dilución y se vertió en una placa Petri vacía y esterilizada para

luego agregar 10 mL de Agar Plate Count, se deja solidificar por unos 10

minutos para posteriormente llevar las placas a la estufa a 37 ºC por 48 horas.

Después de este tiempo se puede realizar el conteo de microorganismos

utilizando el contador de colonias manual. La fórmula para el conteo de

microorganismos (m.o.) es la siguiente:

𝑚. 𝑜./𝑐𝑚3 𝑎𝑖𝑟𝑒 = 𝑁º 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 × 𝐼𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜 × 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

d) Preparación de medios de cultivo

Los agares necesarios para el crecimiento de bacterias son los

siguientes y se preparan de esta manera:

- Agar CLED: 500 mL de agua destilada con 18 g del agar.

- Agar MacConkey: 500 mL de agua destilada con 25.8 g del agar.

- Agar Manitol Salado: 400 mL de agua destilada, 4 gr de peptona


especial, 0.4 gr de extracto de carne, 30 gr de NaCl, 4 gr de D (-) manita,

0.01 gr de rojo de fenol y 4.8 gr de agar - agar.

- Agar M//: 400 mL de agua destilada con 2 gr de peptona, 0.2 gr de


K2HPO4, 0.08 gr de MgSO4 7H2O, 0.08 gr de NaCl, trazas de MnSO4,,

trazas FeCl3 6 H2O, 6 gr de manitol, 2 gr de extracto de levadura y 4 gr

de agar – agar.
28

- Agar Plate Count 300 mL de agua destilada con 7.05 g del agar. Todos
los matraces se mezclan bien y son llevados a baño Maria, para luego

pasarlo a la autoclave para el proceso de esterilización a 15 lb de

presión por 15 minutos, se deja enfriar hasta 45 ºC para plaquear.

Para el crecimiento de hongos se utilizaron:

- Agar glucosa 4% según Sabouraud para el primer muestreo: 500 mL de


agua destilada con 32.5 g del agar. Para el recuento de

microorganismos se utilizaron los siguientes medios:

- Caldo peptona: 100 mL de agua destilada con 0.1 g de peptona.


e) Siembra en las placas Petri con medios

enriquecedores (LÓPEZ, 2004).

De los matraces con BHI y muestras de aire incubados a 37 ºC por

48 horas se retirará mediante un asa de siembra, un inóculo para luego

sembrar en las placas Petri. El método de siembra se realizará por estrías.

Seguidamente las placas Petri ya sembradas se llevarán a incubación por 48

horas a una temperatura de 37 ºC.

f) Diferenciación bioquímica

La batería de pruebas bioquímicas que se utilizarán para la

identificación de bacterias está constituida por las siguientes pruebas: Indol,

rojo de metilo, Voges-Proskauer, TSI, LIA, citrato de Simmons, caldo malonato,

urea, SIM (BRADSHAW, 1999). La metodología es la siguiente:


29

Después de haber incubado las placas Petri para el crecimiento de

bacterias, se realizaron las pruebas bioquímicas:

- Indol: Se vierte aproximadamente 9 mL de caldo peptona al 0.1% a un

tubo de ensayo, se realiza la siembra de bacterias con el anza de

siembra por el método de enjuague. Se incuba por 48 horas, para la

determinación se usa el reactivo de Kovacs, de 2 – 3 gotas.

- SIM: Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad,

producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo, se

vierte en cada tubo aproximadamente 9 mL la siembra se realiza por

método de puntura se deja incubar por 48 horas luego se usará el

reactivo de Kovacs para observar la reacción.

- Rojo de metilo: Se utiliza el caldo rojo de metilo y Voges- Proskauer

(RMVP), aproximadamente 9 mL en cada tubo de ensayo, se siembra

mediante el método de enjuague; se incuba por 48 horas y como

reactivo se adiciona el rojo de metilo de 2 -3 gotas.

- Voges-Proskauer: Se vierte en el tubo de ensayo el caldo RMVP, se

siembra mediante el método de enjuague y se incuba por 48 horas;

como reactivo se utiliza hidróxido de sodio (NaOH) al 4% de 2 - 3 gotas

y se adiciona el reactivo de alfa naftol de 2 – 3 gotas y se espera 15

minutos para observar la reacción.

- TSI: Se vierte el agar a 45 ºC hasta la tercera parte de los tubos de

ensayo, se deja enfriar en pico de flauta, luego se siembra con puntura y

estrías, se incuba a 37 ºC por 48 horas; el tipo de reacción positivo o

negativo se conoce por el cambio de color.


30

- LIA: Se vierte el agar a los tubos de ensayo a una temperatura de 45 º C

y se deja enfriar en pico de flauta, para proceder a sembrar la colonia de

bacterias seleccionada mediante el método de puntura y estrías; la

reacción se muestra mediante el cambio de color.

- Citrato de Simmons: Se vierte el agar en los tubos de ensayo y se deja

enfriar en modo inclinado para luego sembrar por el método de estrías.

Pasada las 48 horas de incubación, el cambio a color azul indica

reacción positiva.

- Caldo Malonato: Se vierte el caldo en los tubos de ensayo y se realiza la

siembra por el método de enjuague, después de incubar por 48 horas se

observa si hubo o no reacción, es positivo si cambia a color azul.

- Úrea: Se distribuye el agar en tubos de ensayo, se siembra la colonia de


bacterias por el método de puntura, al cabo de las 48 horas el cambio de

color nos dirá si hubo reacción positiva.

- Con los datos obtenidos se hizo la comparación con la tabla de pruebas


bioquímicas (Ver Anexo B).

3.4.2.2. Identificación de hongos

a) Muestreo por método de la jeringa (Método

IMPINGER modificado por LÓPEZ, 2004)

Para el muestreo del aire para la identificación de hongos se preparó 4

matraces con BHI más antibióticos (Ceftriaxona), el respectivo muestreo se

realizó en los mismos puntos antes mencionados.


31

b) Incubación de las muestras de matraces con

BHI mas antibióticos (LÓPEZ, 2004).

A diferencia de los matraces para la muestra de bacterias, los

matraces con medio BHI más antibióticos usados para el crecimiento de

hongos se llevaron a incubar a temperatura ambiente por un tiempo de 5 – 8

días.

c) Siembra de hongos (Siembra por el método de

puntura) (LÓPEZ, 2004).

Para la siembra de hongos, se retiró un inóculo de cada caldo BHI

más antibiótico y se sembró por el método de puntura en Agar Sabouraud para

el primer muestreo y segundo muestreo. Las placas se incubarán a

temperatura ambiente por un tiempo de 5 – 8 días.

d) Microcultivo (LÓPEZ, 2004).

Se esterilizaron las placas Petri conteniendo: un soporte de vidrio

en forma de herradura, un porta y un cubre objeto.

Luego se preparó una placa Petri con medio agar de Sabouraud

glucosa 4%, dividido en cubitos de aproximadamente 20 × 20 × 10 mm.

Cada cubito se colocó sobre el porta objeto dentro de la placa de

microcultivo y sobre la varilla de vidrio. De los cultivos aislados de fungi se

eligió diferentes tipos de colonias por cada placa de microcultivo.

Luego de elegir la colonia de fungi, con la ayuda de un anza

micológica, se tomó un inóculo de la misma y se trasladó sobre el cubito de


32

medio de Sabouraud que se colocó sobre el porta objeto dentro de la placa de

microcultivo.

Se colocó el cubre sobre el cubito de agar, luego se puso dentro de

la placa un algodón húmedo para asegurar la humedad y el crecimiento del

hongo.

La placa de microcultivo se llevó a incubación a temperatura

ambiente por un tiempo de 5 – 8 días.

e) Tinción de fungi con azul de AMANN (LÓPEZ,

2004).

Al término de la incubación, se retiró suavemente con ayuda de

una pinza el cubre objeto de la placa de microcultivo y se colocó sobre un porta

objeto limpio y desengrasado al que se colocó previamente 1 – 2 gotas de azul

de lactofenol. Con la ayuda de papel secante, se absorbió el exceso de

colorante. Luego se eliminó el cubito de medio Sabouraud llevándolo a un

recipiente conteniendo lejía diluida al 10 %, se retiró el porta objeto de la placa

de microcultivo y se le agregó de 1 – 2 gotas de azul lactofenol, se añadió un

cubre limpio y desengrasado.

f) Reconocimiento en el microscopio

Las muestras obtenidas se observaron al microscopio utilizando un

lente ocular de 10x y un lente objetivo de 40x, así el aumento total será de 10 x

40 = 400 aumentos, se utilizó el manual Ilustrated Genera of Imperfect Fungi

(BARNETT, 1960), y también se contó con la ayuda del Dr. César Samuel

López López y el Ing. Richar Siaz Rodríguez para el respectivo reconocimiento.


33

IV. RESULTADOS

4.1. Parámetros físicos en la Cueva de las Lechuzas

En cada uno de los muestreos se realizaron medidas tanto de

temperatura y humedad relativa para así ver las interacciones entre estas dos

variables. El primer muestreo se realizó el 16 de febrero de 2016 a horas 11:00

am, el segundo muestreo se realizó el 22 de marzo de 2016 a horas 11:00 am.

Cuadro 6. Humedad relativa en los puntos de muestreo en la Cueva de las

Lechuzas del Parque Nacional de Tingo Maria.

Humedad (%) - Primer Humedad (%) - Segundo


Punto de muestreo
muestreo muestreo
1 58 59
2 66 67
3 72 66
4 76 69

Cuadro 7. Temperatura de los puntos de muestreo en la Cueva de las

Lechuzas del Parque Nacional de Tingo Maria.

Punto de Temperatura (C°) - Primer Temperatura (C°) - Segundo


muestreo muestreo muestreo
1 29.3 33.3
2 29 27.8
3 25.1 28
4 25 26.5
34

Comportamiento de la temperatura y humedad en la


Cueva de las Lechuzas
30 80

PORCENTAJE DE HUMEDAD (%)


29 70
TEMPERATURA (°C)

60
28 50
27 40
26 30
20
25 10
24 0
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
PUNTO DE MUESTREO

HUMEDAD (%) TEMPERATURA

Figura 6. Interacción de la temperatura y humedad relativa en la Cueva de las

Lechuzas - Primer muestreo

Comportamiento de la temperatura y humedad en la


Cueva de las Lechuzas
35 70 PORCENTAJE DE HUMEDAD (%)

30
TEMPERATURA (°C)

25
20
60
15
10
5
0 50
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
PUNTO DE MUESTREO

HUMEDAD RELATIVA (%) TEMPERATURA (C°)

Figura 7. Interacción de la temperatura y humedad relativa en la Cueva de las

Lechuzas - Segundo muestreo


35

4.2. Reconocimiento de microorganismos

4.2.1. Conteo de microorganismos

Cuadro 8. Número de microorganismos por punto de muestreo.

N° de microorganismos
Punto de
muestreo Primer muestreo Segundo muestreo
1 38 x 103 m.o/cm3 31 x 103 m.o/ cm3
2 2 x 103 m.o/ cm3 32 x 103 m.o/ cm3
3 300 x 103 m.o/ cm3 46x 103 m.o/ cm3
4 255 x 103 m.o/ cm3 56 x 103 m.o/ cm3

Como se aprecia en el cuadro anterior, se registra una mayor

cantidad de microorganismos por cm3 de aire en los puntos 3 y 4

pertenecientes a la zona vestibular y zona media esto puede estar relacionado

con la mayor humedad presente en estos puntos, ya que este parámetro fisico

beneficia más a las bacterias.

4.2.2. Determinación de la presencia o ausencia de bacterias

en el aire de la cueva de las Lechuzas.

Cuadro 9. Determinación de la ausencia o presencia de bacterias en los 4

diferentes medios de cultivo usados en el primer muestreo.

Medios de Puntos de muestreo


cultivo 1 2 3 4
Mc Conkey - - + +
M77 - + + +
CLED - + + +
Baird Parker - - - +
36

Cuadro 10. Determinación de ausencia o presencia de bacterias en los 4

diferentes medios de cultivo usados en el segundo muestreo.

Puntos de muestreo
Medios de cultivo
1 2 3 4
Mc Conkey + + + +
M77 + + + +
CLED + + + +
Manitol Salado + + + +
+ : Presencia - : Ausencia

Del cuadro 7 y 8 se observa que el medio Baird Parker no fue el

adecuado para el aislamiento de microorganismos por lo cual para el segundo

muestreo se procedió a utilizar el agar Manitol Salado.

4.2.3. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias

4.2.3.1. Resultados del primer muestreo

En el primer muestreo no se registró crecimiento de bacterias en

ninguno de los 4 medios utilizados correspondientes al primer punto. Pero en el

recuento si se registró crecimiento esto se puede deber a que en el medio Plate

Count puede haber crecido hongos ya que este no es un medio selectivo y

permite el crecimiento de todo tipo de microorganismos.


37

Cuadro 11. Resultados de las pruebas bioquímicas del segundo punto de

muestreo (Entrada a la Cueva de las Lechuzas).

Medios de Cultivo
PRUEBAS BIOQUIMICAS
M77 CLED
INDOL - -
SIM - -
RM - -
VP + +
LIA + +
TSI (Lactosa) + +
TSI (Sacarosa) + +
TSI (Glucosa) + +
TSI (H2S) - -
TSI (GAS) - -
CITRATO - -
MALONATO - -
A. UREA - -

Nombre de bacteria Serratia rubidaea Serratia rubidaea


38

Cuadro 12. Resultados de las pruebas bioquímicas del tercer punto de

muestreo (Termino de la zona vestibular de la Cueva de las Lechuzas.)

Medio cultivo
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Mc Conkey
INDOL -
SIM -
RM -
VP +
LIA +
TSI (Lactosa) -
TSI (Sacarosa) +
TSI (Glucosa) +
TSI (H2S) -
TSI (GAS) -
CITRATO +
MALONATO -
A. UREA -

Nombre de bacteria Pantoea agglomerans

En el medio 77 (M77) se reconoció el crecimiento de bacterias del

genero Bacillus sp, asimismo en el medio CLED se registró crecimiento del

género Bacillus sp.

Pantoea agglomerans anteriormente fue llamada Enterobacter

agglomerans, el género Pantoea actualmente es otro género diferente al

género Enterobacter pero ambas pertenecen a la familia Enterobacteriaceae.


39

Cuadro 13. Resultados de las pruebas bioquímicas del cuarto punto de

muestreo (Termino de la zona media de la Cueva de las Lechuzas.)

Medios de Cultivo
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Mc Conkey CLED
INDOL - -
SIM - -
RM - -
VP + +
LIA - +
TSI (Lactosa) - +
TSI (Sacarosa) - +
TSI (Glucosa) - +
TSI (H2S) - -
TSI (GAS) - -
CITRATO + +
MALONATO - +
A. UREA - -

Nombre de bacteria Pantoea agglomerans Klebsiella pneumoniae

Al igual que el punto de muestreo anterior también se registró

crecimiento del género Bacillus sp en el medio 77, asimismo en el medio Baird

Parker se identificó la presencia de Staphyloccocus aureus de un crecimiento

característico color negruzco, para la identificación en este medio se realizó de

manera directa ya que es un medio selectivo para este tipo de bacterias, y a la

vez el crecimiento de esta especie es característico.


40

4.2.3.2. Resultados del segundo muestreo

Cuadro 14. . Resultados de las pruebas bioquímicas del primer punto de

muestreo (Comienzo de las escaleras en la Cueva de las Lechuzas.)

Medios de Cultivo
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CLED MC CONKEY
INDOL - -
SIM - -
RM + +
VP - -
LIA + +
TSI (Lactosa) - -
TSI (Sacarosa) - -
TSI (Glucosa) - -
TSI (H2S) - -
TSI (GAS) - -
CITRATO + +
MALONATO + +
A. UREA - -

Nombre de bacteria Pantoea agglomerans Pantoea agglomerans

En el medio 77 se registró el crecimiento de Micrococcus sp, de

igual manera también hubo crecimiento de Staphylococcus aureus en el medio

Manitol Salado con colonia características de un color amarillento.


41

Cuadro 15. Resultados de las pruebas bioquímicas del segundo punto de

muestreo (Entrada de la Cueva de las Lechuzas.)

Medios de Cultivo
PRUEBAS M77 M77
BIOQUIMICAS Colonia Mc Conkey CLED Colonia
morada mucosa
INDOL - - - -
SIM H2S + - - -
RM - + + -
VP + - - +
LIA H2S + + + H2S +
TSI (Lactosa) - - - -
TSI (Sacarosa) - - - -
TSI (Glucosa) - - - -
TSI (H2S) + - - -
TSI (GAS) - + - +
CITRATO + + + +
MALONATO + + + +
A. UREA + + + +
Nombre de Pantoea Pantoea Klebsiella
Hafnia alvei
bacteria agglomerans agglomerans pneumoniae

Presencia de Staphylococcus aureus en manitol salado, presentando colonias

de un color amarillento.

Hafnia alvei anteriormente fue llamada Enterobacter hafniae, el

género Hafnia actualmente es otro género diferente al género Enterobacter

pero ambas pertenecen a la familia Enterobacteriaceae.


42

Cuadro 16. Resultados de las pruebas bioquímicas del tercer punto de

muestreo (Termino de la zona vestibular de la Cueva de las Lechuzas.)

Medios de Cultivo
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CLED Mc Conkey
INDOL - -
SIM - -
RM - +
VP + -
LIA + -
TSI (Lactosa) - -
TSI (Sacarosa) - -
TSI (Glucosa) - -
TSI (H2S) - -
TSI (GAS) - -
CITRATO + +
MALONATO - +
A. UREA + +
Pantoea agglomerans Morganella morganii
Nombre de bacteria

Crecimiento del género Bacillus sp., en M77, presencia de

Staphylococcus aureus en manitol salado.


43

Cuadro 17. Resultados de las pruebas bioquímicas del cuarto punto de

muestreo (Termino de la zona media de la Cueva de las Lechuzas).

Medios de Cultivo
PRUEBAS
BIOQUIMICAS Mc M77
CLED M77 Colonia gruesa
Conkey Colonia B
INDOL - + - -
SIM H2S + - - -
RM + - + +
VP - + - -
LIA - + + -
TSI (Lactosa) - - - -
TSI (Sacarosa) - - - -
TSI (Glucosa) - - - -
TSI (H2S) + - - -
TSI (GAS) - - - -
CITRATO + + + +
MALONATO + + + +
A. UREA + - - -
Nombre de Arizona Pantoea
Pantoea agglomerans Shigella sp.
bacteria sp agglomerans

Presencia de Staphylococcus aureus en manitol salado.


44

4.2.4. Identificación de hongos

4.2.4.1. Resultados del primer muestreo

Cuadro 18. Resultados de la identificación de hongos del primer muestreo en

el circuito Cueva de las Lechuzas.

Punto de muestreo –
Hongo identificado
Colonia
1–A Geotrichum sp.
1–B Fusarium sp
Oídium sp
1–C
2–A Monilia sp.
Aspergillus sp.
2–B
Patógeno
2–C Monilia sp.
3–A Aspergillus sp.
3–B Oídium sp.
3–C Trichophyton sp.
3–D Botrytis sp.
4–A Hormodemdrum sp.
Hormodemdrum sp.
4–B
4–C Streptomyces sp.(Actinomiceto)
4–D Botrytis sp.
4–E Fusarium sp.
45

4.2.4.2. Resultados del segundo muestreo.

Cuadro 19. Resultados de la identificación de hongos del segundo muestreo

en el circuito Cueva de las Lechuzas.

Punto de muestreo – Hongo identificado


Colonia
1–A Penicillium sp

1–B Phytophtora sp.


1–C Phytophtora sp.
1–D Aspergillus sp.
1–E Aspergillus sp.
1–F Aspergillus sp.
2–A Aspergillus sp.
2–B Aspergillus sp.
2–C Aspergillus sp.
2–D Aspergillus sp.
2–E Aspergillus sp.
2–F Aspergillus sp.
3–A Monilia sp.
3–B Fusarium sp.
3–C Aspergillus sp.
3–D Aspergillus sp.
(Otro tipo)
3–E Aspergillus sp.
3–F Aspergillus sp.
3–G Monilia sp.
3–H Monocillium sp
.
4–A Monocillium sp.
4–B Oídium sp.
4–C Aspergillus sp.
4–D Phytophtora sp.
46

4.3. Determinación de la variedad de microorganismos

4.3.1. Variedad de especies microbianas en la “Cueva de las

Lechuzas”

El los 4 puntos muestreados se encontró un total de 12 especies bacterianas.

Cuadro 20. Especies de bacterias identificadas en el circuito Cueva de las


Lechuzas en ambos muestreos.

Punto de N° de especies
Especies identificadas
muestreo identificadas
Punto 1
Pantoea agglomerans, Staphyloccocus
(Comienzo de 3
aureus, Micrococcus sp.
las escaleras)
Punto 2
Serratia rubidaea, Pantoea agglomerans,
(Entrada a la
Klebsiella pneumoniae, Enterobacter 5
Cueva de las
hafniae, Staphyloccocus aureus
Lechuzas)
Punto 3
(Termino de Pantoea agglomerans, Bacillus sp,
4
la zona Morganella morgani, Staphyloccocus aureus
vestibular)
Punto 4
Bacillus sp, Pantoea agglomerans, Klebsiella
(Termino de
pneumoniae, Staphyloccocus aureus, 7
la zona
Arizona sp, Shigella sp., Streptomyces sp.
media)

Número de especies bacterianas identificadas por punto de


muestreo
8
Número de especies

6
identificadas

4
2
0
Punto 1 (Comienzo de Punto 2 (Entrada a la Punto 3 (Termino de la Punto 4 (Termino de la
las escaleras) Cueva de las Lechuzas) zona vestibular) zona media)

Figura 8. Cantidad de microorganismos encontrados por punto de muestreo.


47

4.3.2. Variedad de géneros fúngicos en la “Cueva de las

Lechuzas.”

En los 4 puntos muestreados se encontró un total de 10 géneros de fungi.

Cuadro 21. Hongos identificados en ambos muestreos.


Número de géneros
Punto de muestreo Hongos identificados
encontrados por punto

Geotrichum sp, Fusarium sp, Oidium


1 sp, Penicillium sp, Phytophtora sp., 6
Aspergillus sp.

2 Monilia sp. Aspergillus sp. 2

Aspergillus sp. Oidium sp.


3 Trichophyton sp. Botrytis sp. Monilia 6
sp. Fusarium sp.

Hormodemdrum sp, Botrytis sp.


Fusarium sp. Monocillium sp.
4 7
Aspergillus sp. Oidium sp.
Phytophtora sp.
48

4.4. Microorganismos patógenos para el hombre


4.4.1. Especies bacterianas patógenas
Cuadro 22. Especies bacterianas patógenos para el hombre.

Especies
Patogenecidad Afecciones o enfermedades
identificadas

Infecciones cutáneas o mucosas,


Staphylococcus foliculitis abscesos profundos,
Patógeno
aureus meningitis, neumonía entre otras
afecciones.
Enfermedades infecciosas oportunistas,
Klebsiella
Patógeno infecciones del tracto urinario,
pneumoniae*
neumonía, sepsis entre otros
Potencialmente puede causar malestar
Micrococcus sp. No en vías respiratorias a personas
inmunocomprometidas.
Arizona sp Patógeno Infecciones entéricas
Shigella sp Patógeno Disentería, afecciones gastrointestinales
Agente causal de infecciones del tracto
Serratia rubidaea Oportunista
respiratorio
Puede provocar artritis si uno se pincha
Pantoea
Oportunista con la espina de una planta contaminada
agglomerans**
con esta bacteria.
Enterobacter
Oportunista Gastroenteritis, neumonía, entre otros
hafniae
Infecciones del tracto urinario, otro tipo
Proteus morganii Patógeno
de infecciones
Bacillus sp No -
Infecciones sistémicas (Pericarditis
Streptomyces sp. Patógeno oportunista crónica, paniculitis, neumonía entre
otros).

* Relevancia clínica

** Es oportunista con pacientes inmuno comprometidos


49

De las especies identificadas las más patógenas para el hombre

son Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pantoea agglomerans,

Shigella sp., Arizona sp.

4.4.2. Géneros fúngicos patógenos

Cuadro 23. Hongos patógenos para el hombre.

Especies
Patogenecidad Afecciones o enfermedades
identificadas

Geotrichum sp. Oportunista* Geotricosis

Fusarium sp. Patógeno de vegetales -

Oídium sp. Patógeno de vegetales -

Aspergilosis, onicomicosis,
Aspergillus sp. Oportunista*
otomicosis, sinusitis alérgica,

Penicillium sp. Oportunista* Peniciliosis

Trichophyton sp. Patógeno Dermatofitosis o tiñas

Botrytis sp. Patógeno de vegetales -

Monilia sp. Patógeno de vegetales -

Puede provocar alergias e


Hormodemdrum sp. Patógeno de vegetales
hipersensibilidad en el hombre

Monocillium sp. Patógeno de vegetales -

* Oportunista en personas inmunocomprometidas

De las 10 especies identificadas los más patógenos para el hombre

son Trichophyton sp, y el oportunista Aspergillus sp., los otros hongos

identificados son patógenos de vegetales pero pueden comportarse como

oportunistas si hay personas con un sistema inmune vulnerable.


50

4.5. Medidas de prevención

Al haberse detectado la presencia bacterias patógenas

suspendidas en el aire, así como también hongos, entre patógenos y

oportunistas en el circuito Cueva de las Lechuzas las medidas de prevención

sugeridas de la presenta práctica pre profesional son realizados en base a los

siguientes criterios (Protección, tiempo de la visita, reactividad inmunológica del

visitante):

- Uso de mascarillas de protección dentro de la cueva (CALDERON

et al., 2002).

- Tiempo máximo de la visita de 30 minutos (Tiempo que toma

llegar y regresar de todo el circuito de la Cueva de las Lechuzas.

- Ingresar a la cueva con polos manga larga.

- No ingresar con sandalias, todo debe ser calzado cerrado

- Ingresar con buzo o pantalón, no con bermudas, short entre otros.

- Número de visitantes por grupo: un máximo de 10 personas (Con

fines de guardar el orden dentro de la cueva, y evitar el contacto

con superficies contaminadas.

- En pacientes con enfermedades que comprometan el sistema

inmunitario se recomienda no ingresar hasta las zonas

correspondientes al punto 3 y 4 del presente estudio, debido a la

mayor presencia de microorganismos patógenos (LACEY y

DUTKIEWICZ, 1994) (DIB et al., 2003).


51

- Confeccionar letreros informativos con los requisitos para el

ingreso a la cueva, además de esto hacer énfasis en la toma de

medidas precautorias en las personas inmunocomprometidas.

- No consumir alimentos dentro de la cueva, ni beber líquidos

- Instalar un lavadero para las manos al salir de la visita, en el inicio

de la escalera de acceso a la cueva.


52

V. DISCUSIÓN

Los factores físicos también influyen en la distribución de los

microorganismos, LACEY (2006) dice que la diversidad y las concentraciones

de las partículas biológicas presentes en la atmósfera varían espacial y

temporalmente como consecuencia de diversos factores ambientales, tales

como cambios en las condiciones meteorológicas locales o regionales

(velocidad del viento, precipitaciones, radiación solar y humedad), fuente de

procedencia (suelo, vegetación, sistemas acuáticos, etc.), contaminación

ambiental y actividades antropogénicas (agricultura, ganadería, industria, etc.).

En la presente práctica se observa que en ambos muestreos el

comportamiento de las variables temperatura y humedad es característico,

mientras más nos internamos a la cueva en cada punto de muestreo vemos

que la temperatura disminuye y la humedad aumenta, registrando 58 % y 59%

de humedad en el primer y segundo muestreo respectivamente,

correspondiente al primer punto y tendiendo a aumentar hasta llegar a valores

de 76 % y 69 % en el cuarto punto, en el primer y segundo muestreo

respectivamente; asimismo con la temperatura, valores de 29.3°C y 33.3°C en

ambos muestreos y en el primer punto, al llegar al cuarto punto se tuvo

temperaturas de 25°C y 26.5°C en ambos muestreos, esto se debe a las


53

corrientes de aire vienen del interior y también la que ingresa del exterior lo

cual regula las variables de temperatura y humedad y en efecto influyen en la

dispersión de los microorganismos.

Las bacterias identificadas en la presente práctica en el primer

punto son Staphylococcus aureus, Micrococcus sp., Pantoea agglomerans,

encontradas en el primer punto de muestreo que es la parte externa de la

cueva, en el segundo punto presenta a Klebsiella pneumoniae, Serratia

rubidaea, Enterobacter hafniae, Pantoea agglomerans, Serratia rubidaea, el

tercer punto Pantoea agglomerans, Morganela morganii, Bacillus sp.,

Staphylococcus aureus, y por último en el punto 4 se encontró Bacillus sp,

Pantoea agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Staphyloccocus aureus,

Streptomyces sp. (Actinomiceto) Arizona sp, Shigella sp. Algunas de estas

especies bacterianas también fueron identificadas en un estudio realizado en 3

cuevas de España donde los géneros bacterianos identificados, son los

siguientes: Arthrobacter, Brachybacterium, Kocuria, Micrococcus,

Streptomyces, Bacillus, Staphylococcus, Brevundimonas, Paracoccus,

Prolinoborus, Acinetobacter y Pseudomonas (DOMINGUEZ, 2014). La

coincidencia con algunos géneros tales como Bacillus, Staphylococcus,

Micrococcus se debe a que estos géneros se adaptan a diversos factores

ambientales lo cual permite su supervivencia en el aire.

La presencia de Micrococcus en la parte externa de la cueva

según DIB et al (2013) por lo general, las especies del género Micrococcus son

consideradas inocuas para la salud humana, sin embargo, pueden comportarse

en ocasiones como patógenos oportunistas, principalmente en personas


54

inmunodeprimidas. Además su material genético extracromosomal constituye

un reservorio de genes de resistencia a antibióticos, que pueden ser

transferidos a especies de bacterias patógenas, con el consiguiente riesgo para

la salud. El género Micrococcus es uno de los más frecuentes entre las

bacterias aerovagantes cultivables. Su abundancia en las cuevas puede

deberse a su gran versatilidad para colonizar ambientes extremos, ya que

posee material genético extracromosomal que le confiere resistencia a

antibióticos, tolerancia a metales pesados y a compuestos orgánicos tóxicos,

capacidad de metabolizar un amplio rango de sustratos, incluyendo colesterol,

ácido benzoico, etc. (DIB et al., 2013).

Además estas bacterias han desarrollado diversas estrategias de

adaptación, dependiendo de la cepa, como producción de antibióticos,

exopolisacáridos y pigmentos que les confieren protección; e incremento en la

concentración de ácidos grasos insaturados y anteiso como estrategia de

adaptación a bajas temperaturas, la presencia de este tipo de organismos

puede representar posibilidades de investigación en el campo de la

biorremediación.

Al igual que se identificaron bacterias también se realizó con los

fungi. Las partículas de origen fúngico, particularmente las esporas,

representan una proporción significativa de los bioaerosoles presentes en el

aire de ambientes interiores y del exterior (CALDERON et al., 2002) y están

implicadas en la propagación de enfermedades humanas, animales y de

plantas (ABDEL HAMMED, 2005).


55

La concentración de esporas fúngicas y otros alérgenos presentes

en ambientes interiores está fuertemente influenciada por las concentraciones

del exterior. Cuando hay ventilación natural se encuentran unas

concentraciones similares en ambos ambientes. En presencia de barreras que

impidan la entrada de partículas del exterior, las concentraciones suelen ser

menores en el interior, en ambientes no contaminados (BURGE y ROGERS,

2000).

Los fungi identificados en la práctica pre profesional son los

siguientes en el primer punto Geotrichum sp, Fusarium sp, Oídium sp,

Penicillium sp, Phytophtora sp., Aspergillus sp., en el segundo punto Monilia sp.

Aspergillus sp., en el tercer punto Aspergillus sp. Oídium sp. Trichophyton sp.

Botrytis sp. Monilia sp. Fusarium sp. Y por último en el cuarto punto

Hormodemdrum sp. Streptomyces sp. Botrytis sp. Fusarium sp. Monocillium sp.

Aspergillus sp. Oídium sp. Phytophtora sp.

El número de especies bacterianas por punto de muestreo varia en

tanto más nos adentremos a la Cueva de las Lechuzas siendo el cuarto punto

el de mayor número de especies identificadas de Arizona sp, Shigella sp.,

Klebsiella pneumoniae, Bacillus sp, Pantoea agglomerans, Staphyloccocus

aureus, Streptomyces sp., siendo un total de 7 especies de las 12 especies

identificadas en los 4 puntos.

Las condiciones de humedad favorecen la proliferación de

bioaerosoles bacterianos y fúngicos en ambientes interiores, ya que la

humedad promueve la colonización de los materiales por los microorganismos

(GREEN et al., 2003). La presencia de personas y animales en ambientes


56

interiores también incrementan las concentraciones de microorganismos en el

aire (GREEN et al., 2003).

En cuanto a la variedad de hongos las variaciones de temperatura

y humedad influencian en su distribución donde hay mayor humedad se

encontraron más géneros de fungi identificando 10 géneros en total a lo largo

del circuito, y siendo el punto 4 el que tuvo mayor número de géneros de fungi

haciendo un total de 7 especies los cuales fueron Hormodemdrum sp, Botrytis

sp. Fusarium sp. Monocillium sp. Aspergillus sp. Oídium sp. Phytophtora sp.

En el caso de la presencia de Arizona sp, Shigella sp., Klebsiella

pneumoniae en el cuarto punto están íntimamente ligado a la presencia de

residuos fecales tanto de murciélagos como de guacharos, la presencia de

otros microorganismos patógenos se puede deber a que en muchas ocasiones

algunos turistas van con alguna enfermedades provocadas por una bacteria o

relacionadas a esta, lo cual indirectamente se permitiría el ingreso de una

bacteria a un ecosistema nuevo el cual tiene la probabilidad de poblarla y

adaptarse a los diversos factores. En el caso de Morganella morganii está

relacionado con los residuos fecales y la producción de infecciones urinarias,

Serratia rubidaea potencialmente puede ser causal de infecciones del tracto

respiratorio la población vulnerable es toda aquella persona que se encuentra

inmunocomprometida.

En el año 2000 se realizó un estudio en la Cueva de las Lechuzas

en detectó la presencia de Histoplasma capsulatum el cual representa un

potencial patógeno moderado, se realizaron pruebas de resistencia a

antimicóticos, resultado de esto se determinó que dicho hongo es resistente


57

ante diferentes antimicóticos (MAZABEL, et al, 2000). En el presente estudio no

se registró la presencia de Histoplasma capsulatum, los factores que

determinan esto pueden ser variables, ya siendo la migración de este hongo a

otro ecosistema cosa que es poco probable ya que el desarrollo de este hongo

está relacionado con las heces de los guacharos y murciélagos en el piso de la

cueva, pueden ser factores climáticos, estación entre otros.

Las medidas propuestas se basan en criterios de prevención es por

eso que se recomienda el uso de mascarillas al momento de visitar la cueva

para evitar, la inhalación de bioaerosoles que pueden causar efectos

perjudiciales en la salud humana y animal, dependiendo de la naturaleza y

concentración de los componentes predominantes de dichos bioaerosoles

(CALDERON et al., 2002), de las circunstancias de la exposición y de la

reactividad inmunológica del sujeto (LACEY y DUTKIEWICZ, 1994). Estos

efectos perjudiciales incluyen irritación de las membranas mucosas, bronquitis

crónica, rinitis alérgica, asma, alveolitis alérgica, síndrome tóxico por polvo

orgánico (LACEY y DUTKIEWICZ, 1994), neumonitis por hipersensibilidad,

aspergilosis (BURGE y ROGERS, 2000), entre otros.

En cuanto a los fungi algo característico es que aparentemente

pueden ser no patógenos, pero su potencial patogenecidad nunca se debe

tomar en juego ya que la población más vulnerable para los fungi que pueden

ser patógenos facultativos o no, son las personas con el sistema inmune

comprometido por ejemplo personas con VIH – SIDA, diabetes, cáncer,

personas que llevan una terapia inmunosupresora entre otros, los cuales si

llegan a visitar la cueva tienen que tomar las medidas precautorias necesarias
58

ya que al estar su sistema inmune debilitado podría adquirir una infección

oportunista que en muchas ocasiones tiene efectos muy graves y con

localizaciones infrecuentes y a menudo generalizadas. Ante estos posibles

riesgos para los visitantes, la duración de la visita dentro de la cueva es un

factor predominante, estableciendo así un tiempo máximo de 30 minutos de

duración de la visita, para reducir el riego de inhalar o respirar microorganismos

patógenos, de igual manera el uso de prendas que cubran brazos y piernas

para evitar posible contaminación con microorganismos patógenos que pueden

estar en diferentes superficies de la cueva como barandas, rocas entre otros.


59

VI. CONCLUSIONES

1. La humedad relativa y la temperatura influencian en la distribución tanto

de bacterias como de hongos, siendo zonas de mayor humedad los

puntos 3 y 4 y de temperatura relativamente constante.

2. Se identificó 11 especies bacterianas, predominando Staphylococcus

aureus, Pantoea agglomerans y Serratia rubidaea. Asimismo se

identificó 10 géneros de fungi de los cuales los más predominantes

fueron Aspergillus sp., Oidium sp. y Fusarium sp.

3. El punto 4 fue el punto que presento mayor variedad de

microorganismos 8 especies de las 12 especies bacterianas

identificadas y 7 de los 10 géneros fungi identificados.

4. Las especies más patógenas detectadas son Klebsiella pneumoniae,

Staphylococcus aureus, Arizona sp. Shigella sp. las cuales están ligadas

a los residuos fecales de animales y la alta humedad en cuanto a los

fungi patógenos se identificó los siguientes géneros Trichophyton sp. y el

oportunista Aspergillus sp.

5. Se sugirió medidas de prevención para el ingreso a la Cueva de las

Lechuzas lo cual sirve de información para los operadores turísticos, a

fin de proteger la salud pública.


60

VII. RECOMENDACIONES

- Se recomienda realizar el muestreo con toda la indumentaria de

protección, gorro, guantes, mascarilla, guardapolvo para evitar posibles

patologías.

- Se recomienda cubrir y proteger el sensor del termohigrómetro para

disminuir el error en la obtención de datos de temperatura y humedad.

- Se recomienda tener mucho cuidado en la utilización del mechero al

momento del muestreo dentro de la cueva, al ser un entorno cargado de

gas metano producto de las deposiciones de los animales, este se torna

en una atmosfera parcialmente combustible.

- Realizar la esterilización de materiales y manejar con cuidado las

colonias aisladas, buscar siempre trabajar en condiciones de asepsia.

- Se recomienda a los encargados del Parque Nacional Tingo Maria

implementar las medidas de prevención sugeridas para el ingreso a la

Cueva de las Lechuzas, para el bienestar y seguridad del turista y

personal trabajador.
61

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68

ANEXOS
69

ANEXO A – Documentos

Figura 9. Solicitud para solicitar permiso al Jefe del Parque Nacional de Tingo

Maria.
70

ANEXO B - Tabla de pruebas bioquímicas.

Cuadro 24. Tabla de pruebas bioquímicas

ESCHERICHIAEA EDWARDSIELLEAE SALMONELLA KLEBSIELLEAE PROTEAE


PRUEBA BIOQUIMICA
Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Providencia
Escherichia Shigella Edwardsiella Salmonella Arizona Freundii diversus pneumonia cloreae aerogenes hafniae agglomerans marcescens liquefaciens rubidaea vulgaris mirabilis morgani rettgeri alcalifaciens situartii
INDOL (+) (-O+) (+) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-O+) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (+) (+)
MORILITY (SIM) (+O-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (+O-) (+) (+) (+O-) (+) (+) (+O-) (+) (+) (+)
ROJO METILO (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) ( - O +) (-) (-) (+O-) (-O+) (+O-) (+O-) (+O-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
VOGES -PROSKAUER (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) ( + O - ) (+O-) (+) (+O-) (+) (-) (+O-) (-) (-) (-) (-)
LISINA DESCARBOXILASA (LIA) (d) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (-) (+) ( + O (+) ) ( + O (+) ) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
LACTOSA (TSI) Pico (+) (-)^1 (-) (-) (d) ( (+) O + ) (d) (+) ( + O (+) ) (+) (d) (d) (-) (d) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
SACAROSA (TSI) (d) (-)^1 (-) (-) (-) d (-O+) (+) (+) (+) (d) (d) (+) (+) (+) (+) (d) (-) (d) (d) ( (+) O + )
GRAS FROM GLUCOSE (TSI) Fondo (+) (-)^1 (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-O+) ( + O - ^3) (+O-) (d) (+O-) (+) (+O-) (-O+) (+O-) (-)
HYDROGN SULFIDE (TSI) (-) (-) (+) (+) (+) ( + O - ) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
CITRATO DE SIMONS (-) (-) (-) (d) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (d) (d) (+) (+) ( + O-) (d) (+O-) (-) (+) (+) (+)
MALONATE (-) (-) (-) (-) j ( - O + ) (+) (+) (+O-) (+O-) (+O-) (+O-) (-) (-) (+O-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
UREA (-) (-) (-) (-) (-) d^w d^w (+) (+O-) (-) (-) d^w d^w d^w d^w (+) (+) (+) (+) (-) (-)
71

ANEXO C - MAPA
72

Figura 10. Mapa de ubicación de la Cueva de las Lechuzas en el PNTM


73

ANEXO C – PANEL FOTOGRÁFICO


74

Figura 11. Primer punto de muestreo.

Figura 12. Segundo punto de muestreo.


75

Figura 13. Tercer punto de muestreo.

Figura 14. Cuarto punto de muestreo.


76

Figura 15. Muestreo en el segundo punto.

Figura 16. Muestreo en el tercer punto


77

Figura 17. Muestreo en el cuarto punto

Figura 18. Higrómetro para la medición de temperatura y humedad relativa.


78

Figura 19. Recuento de microorganismos punto 3.

Figura 20. Siembra de microorganismos en medios enriquecedores.


79

CLED – PUNTO
1
AUSENCIA

Figura 21. Crecimiento de microorganismos en medio CLED - Primer muestreo.

Figura 22. Crecimiento en medio Mc Conkey muestra punto 3 - Primer


muestreo
80

Figura 23. Crecimiento de microorganismos en medio M77 muestra punto 4 -


Primer muestreo.

Figura 24. Crecimiento de Staphylococcus aureus en medio Baird Parker.


(Colonias negras) - Primer muestreo.
81

Figura 25. Crecimiento de Staphylococcus aureus en medio de cultivo Manitol


Salado - Segundo muestreo.

Figura 26. Crecimiento de Hafnia alvei(Colonia morada) y crecimiento de


Klebsiella pneumoniae (Colonia mucosa) en M77 – P2
82

Figura 27. Crecimiento de Pantoea agglomerans y Shigella sp. en medio de

cultivo M77 , muestra cuarto punto - Segundo muestreo.

Figura 28. Tubos para diferenciación bioquímica del primer muestreo.


83

Figura 29. Ejemplo de resultado de muestra de medio de cultivo CLED, punto 2

del primer muestreo correspondiente a Serratia rubidaea.

Figura 30. Tubos para diferenciación bioquímica del segundo muestreo.


84

Figura 31. Ejemplo de resultado de muestra de medio de cultivo M77, punto 2

del segundo muestreo correspondiente a Enterobacter hafniae.

Figura 32. Crecimiento de hongos pertenecientes al primer punto de muestreo -


Primer muestreo.
85

Figura 33. Crecimiento de hongos pertenecientes al segundo punto de


muestreo - Primer muestreo.

Figura 34. Crecimiento de hongos pertenecientes al tercer punto de muestreo -


Primer muestreo.
86

Figura 35. Crecimiento de hongos pertenecientes al cuarto punto de muestreo -


Primer muestreo.

Figura 36. Crecimiento de hongos pertenecientes al primer punto de muestreo -


Segundo muestreo
87

Figura 37. Crecimiento de hongos pertenecientes al segundo punto de


muestreo - Segundo muestreo.

Figura 38. Crecimiento de hongos pertenecientes al tercer punto de muestreo -


Segundo muestreo.
88

Figura 39. Crecimiento de hongos pertenecientes al cuarto punto de muestreo -


Segundo muestreo.
89

ANEXO D – CATÁLOGO DE HONGOS IDENTIFICADOS EN EL CIRCUITO


CUEVA DE LAS LECHUZAS.
90

Punto de Hongo
Fotografía
muestreo identificado

1–A Geotrichum sp.

1–B Fusarium sp

Oídium sp
1–C
91

2–A Monilia sp.

Aspergillus sp.
2–B
Patógeno

2–C Monilia sp.


92

3–A Aspergillus sp.

3–B Oídium sp.

3–C Trichophyton sp.


93

3–D Botrytis sp.

Hormodemdrum
4–A
sp.

Hormodemdrum
4–B sp.
94

Streptomyces sp
4–C
(Actinomiceto).

4–D Botrytis sp.

4–E Fusarium sp.


95

Punto de Hongo
Fotografía
muestreo identificado

Penicillium sp
1–A

1–B Phytophtora sp.

1–C Phytophtora sp.


96

1–D Aspergillus sp.

1–E Aspergillus sp.

1–F Aspergillus sp.

2–A Aspergillus sp.


97

2–B Aspergillus sp.

2–C Aspergillus sp.

2–D Aspergillus sp.


98

2–E Aspergillus sp.

2–F Aspergillus sp.

3–A Monilia sp.


99

3–B Fusarium sp.

3–C Aspergillus sp.

Aspergillus sp.
3–D
(Otro tipo)
100

3–E Aspergillus sp.

3–F Aspergillus sp.

3–G Monilia sp.


101

Monocillium sp
3–H
.

4–A Monocillium sp.

4–B Oídium sp.


102

4–C Aspergillus sp.

4–D Phytophtora sp.


103

INDICE DE CUADROS

Página

Cuadro 1. Número de visitas a la Cueva de las Lechuzas por mes durante el

año 2015 ............................................................................................................ 9

Cuadro 2. Número de visitas a la Cueva de las Lechuzas hasta el mes de

Junio durante el año 2016. ............................................................................... 10

Cuadro 3. División política de la ubicación de la Cueva de las Lechuzas. ...... 20

Cuadro 4. División política de la ubicación del Laboratorio de Microbiología .. 21

Cuadro 5. Puntos de muestreo ....................................................................... 24

Cuadro 6. Humedad relativa en los puntos de muestreo en la Cueva de las

Lechuzas del Parque Nacional de Tingo Maria. ............................................... 33

Cuadro 7. Temperatura de los puntos de muestreo en la Cueva de las

Lechuzas del Parque Nacional de Tingo Maria. ............................................... 33

Cuadro 8. Número de microorganismos por punto de muestreo..................... 35

Cuadro 9. Determinación de la ausencia o presencia de bacterias en los 4

diferentes medios de cultivo usados en el primer muestreo. ........................... 35

Cuadro 10. Determinación de ausencia o presencia de bacterias en los 4

diferentes medios de cultivo usados en el segundo muestreo. ........................ 36

Cuadro 11. Resultados de las pruebas bioquímicas del segundo punto de

muestreo (Entrada a la Cueva de las Lechuzas). ............................................ 37


104

Cuadro 12. Resultados de las pruebas bioquímicas del tercer punto de

muestreo (Termino de la zona vestibular de la Cueva de las Lechuzas.) ........ 38

Cuadro 13. Resultados de las pruebas bioquímicas del cuarto punto de

muestreo (Termino de la zona media de la Cueva de las Lechuzas.) .............. 39

Cuadro 14. . Resultados de las pruebas bioquímicas del primer punto de

muestreo (Comienzo de las escaleras en la Cueva de las Lechuzas.) ............ 40

Cuadro 15. Resultados de las pruebas bioquímicas del segundo punto de

muestreo (Entrada de la Cueva de las Lechuzas.) .......................................... 41

Cuadro 16. Resultados de las pruebas bioquímicas del tercer punto de

muestreo (Termino de la zona vestibular de la Cueva de las Lechuzas.) ........ 42

Cuadro 17. Resultados de las pruebas bioquímicas del cuarto punto de

muestreo (Termino de la zona media de la Cueva de las Lechuzas). .............. 43

Cuadro 18. Resultados de la identificación de hongos del primer muestreo en

el circuito Cueva de las Lechuzas. ................................................................... 44

Cuadro 19. Resultados de la identificación de hongos del segundo muestreo

en el circuito Cueva de las Lechuzas. .............................................................. 45

Cuadro 20. Especies de bacterias identificadas en el circuito Cueva de las

Lechuzas en ambos muestreos. ...................................................................... 46

Cuadro 21. Hongos identificados en ambos muestreos. ................................. 47

Cuadro 22. Especies bacterianas patógenos para el hombre. ........................ 48

Cuadro 23. Hongos patógenos para el hombre. ............................................. 49

Cuadro 24. Tabla de pruebas bioquímicas ..................................................... 70


105

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Flujo turístico por mes del año 2015. .................................................. 9

Figura 2. Flujo turístico hasta Junio del 2016 ................................................... 10

Figura 3. Mapa de ubicación de la Cueva de las Lechuzas. ............................ 20

Figura 4. Perfil de la zonificación de la Cueva de las Lechuzas....................... 24

Figura 5. Puntos de muestreo en el circuito Cueva de las Lechuzas. .............. 25

Figura 6. Interacción de la temperatura y humedad relativa en la Cueva de las

Lechuzas - Primer muestreo ............................................................................ 34

Figura 7. Interacción de la temperatura y humedad relativa en la Cueva de las

Lechuzas - Segundo muestreo ........................................................................ 34

Figura 8. Cantidad de microorganismos encontrados por punto de muestreo. 46

Figura 9. Solicitud para solicitar permiso al Jefe del Parque Nacional de Tingo

Maria ................................................................................................................ 69

Figura 10. Mapa de ubicación de la Cueva de las Lechuzas en el PNTM. ...... 72

Figura 11. Primer punto de muestreo. .............................................................. 74

Figura 12. Segundo punto de muestreo. .......................................................... 74

Figura 13. Tercer punto de muestreo. .............................................................. 75

Figura 14. Cuarto punto de muestreo. ............................................................. 75

Figura 15. Muestreo en el segundo punto. ....................................................... 76


106

Figura 16. Muestreo en el tercer punto ............................................................ 76

Figura 17. Muestreo en el cuarto punto ........................................................... 77

Figura 18. Higrómetro para la medición de temperatura y humedad relativa. .. 77

Figura 19. Recuento de microorganismos punto 3........................................... 78

Figura 20. Siembra de microorganismos en medios enriquecedores. ............. 78

Figura 21. Crecimiento de microorganismos en medio CLED - Primer muestreo.

......................................................................................................................... 79

Figura 22. Crecimiento en medio Mc Conkey muestra punto 3 - Primer

muestreo .......................................................................................................... 79

Figura 23. Crecimiento de microorganismos en medio M77 muestra punto 4 -

Primer muestreo............................................................................................... 80

Figura 24. Crecimiento de Staphylococcus aureus en medio Baird Parker.

(Colonias negras) - Primer muestreo. .............................................................. 80

Figura 25. Crecimiento de Staphylococcus aureus en medio de cultivo Manitol

Salado - Segundo muestreo............................................................................. 81

Figura 26. Crecimiento de Hafnia alvei(Colonia morada) y crecimiento de

Klebsiella pneumoniae (Colonia mucosa) en M77 – P2 ................................... 81

Figura 27. Crecimiento de Pantoea agglomerans y Shigella sp. en medio de

cultivo M77 , muestra cuarto punto - Segundo muestreo. ................................ 82

Figura 28. Tubos para diferenciación bioquímica del primer muestreo. ........... 82

Figura 29. Ejemplo de resultado de muestra de medio de cultivo CLED, punto 2

del primer muestreo correspondiente a Serratia rubidaea. .............................. 83

Figura 30. Tubos para diferenciación bioquímica del segundo muestreo. ....... 83
107

Figura 31. Ejemplo de resultado de muestra de medio de cultivo M77, punto 2

del segundo muestreo correspondiente a Enterobacter hafniae. ..................... 84

Figura 32. Crecimiento de hongos pertenecientes al primer punto de muestreo -

Primer muestreo............................................................................................... 84

Figura 33. Crecimiento de hongos pertenecientes al segundo punto de

muestreo - Primer muestreo............................................................................. 85

Figura 34. Crecimiento de hongos pertenecientes al tercer punto de muestreo -

Primer muestreo............................................................................................... 85

Figura 35. Crecimiento de hongos pertenecientes al cuarto punto de muestreo -

Primer muestreo............................................................................................... 86

Figura 36. Crecimiento de hongos pertenecientes al primer punto de muestreo -

Segundo muestreo ........................................................................................... 86

Figura 37. Crecimiento de hongos pertenecientes al segundo punto de

muestreo - Segundo muestreo. ....................................................................... 87

Figura 38. Crecimiento de hongos pertenecientes al tercer punto de muestreo -

Segundo muestreo. .......................................................................................... 87

Figura 39. Crecimiento de hongos pertenecientes al cuarto punto de muestreo -

Segundo muestreo. .......................................................................................... 88


108

ÍNDICE DE CONTENIDO

I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 1

1.1. Objetivos ............................................................................................... 3

1.1.1. General........................................................................................... 3

1.1.2. Específicos ..................................................................................... 3

II. REVISIÓN DE LITERATURA ...................................................................... 4

2.1. Conceptos generales ............................................................................ 4

2.1.1. Definición de una cueva ................................................................. 4

2.1.2. Características de una cueva ......................................................... 5

2.2. Cueva de las Lechuzas ......................................................................... 7

2.2.1. Número de visitantes a la Cueva de las Lechuzas ......................... 8

2.3. Estudios realizados sobre la composición microbiológica del aire en

otras cuevas. ................................................................................................ 11

2.4. Diversidad microbiana en cuevas ....................................................... 12

2.5. Papel de los microorganismos en las cuevas ..................................... 13

2.6. Microorganismos ................................................................................. 14

2.6.1. Bacterias ...................................................................................... 14

2.6.2. Hongos ......................................................................................... 16


109

III. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................. 20

3.1. Lugar de ejecución .............................................................................. 20

3.1.1. Ubicación del área de estudio ...................................................... 20

3.1.2. Ubicación del área de procesamiento de muestras ...................... 21

3.2. Materiales ........................................................................................... 21

3.2.1. Medios de cultivo .......................................................................... 21

3.2.2. Para realizar las pruebas bioquímicas.......................................... 22

3.2.3. Reactivos ...................................................................................... 22

3.2.4. Materiales de laboratorio .............................................................. 22

3.2.5. Equipos ........................................................................................ 22

3.3. Identificación del área de estudio ........................................................ 23

3.4. Metodología ........................................................................................ 25

3.4.1. Determinación de parámetros físicos en la cueva ........................ 25

3.4.2. Para la identificación de microorganismos presentes en el aire. .. 26

IV. RESULTADOS ....................................................................................... 33

4.1. Parámetros físicos en la Cueva de las Lechuzas ............................... 33

4.2. Reconocimiento de microorganismos ................................................. 35

4.2.1. Conteo de microorganismos ......................................................... 35

4.2.2. Determinación de la presencia o ausencia de bacterias en el aire

de la cueva de las Lechuzas. .................................................................... 35

4.2.3. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias .............. 36


110

4.2.4. Identificación de hongos ............................................................... 44

4.3. Determinación de la variedad de microorganismos ............................ 46

4.3.1. Variedad de especies microbianas en la “Cueva de las Lechuzas”

46

4.3.2. Variedad de géneros fúngicos en la “Cueva de las Lechuzas.” .... 47

4.4. Microorganismos patógenos para el hombre ...................................... 48

4.4.1. Especies bacterianas patógenas .................................................. 48

4.4.2. Géneros fúngicos patógenos ........................................................ 49

4.5. Medidas de prevención ....................................................................... 50

V. DISCUSIÓN............................................................................................... 52

VI. CONCLUSIONES................................................................................... 59

VII. RECOMENDACIONES .......................................................................... 60

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 61

ANEXOS .......................................................................................................... 68

ANEXO A – DOCUMENTOS ........................................................................ 69

ANEXO B - TABLA DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS....................................... 70

ANEXO C – PANEL FOTOGRÁFICO ........................................................... 73

ANEXO D – CATÁLOGO DE HONGOS IDENTIFICADOS EN EL CIRCUITO

CUEVA DE LAS LECHUZAS. ....................................................................... 89


111

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES

PRÁCTICA PRE PROFESIONAL

COMPOSICIÓN MICROBIOLÓGICA DEL AIRE EN EL CIRCUITO


TURISTICO CUEVA DE LAS LECHUZAS DEL PARQUE
NACIONAL TINGO MARÍA EN EL PERIODO FEBRERO – MAYO
DE 2016

Ejecutor : ALCEDO PABLO, Juan Carlos

Asesor : Blgo. GOZME SULCA, César Augusto.

Lugar de ejecución : Universidad Nacional Agraria de la Selva

Duración del trabajo : 03 de Febrero al 03 de Mayo de 2016.

Tingo María - Perú

2016
112

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS AMBIENTALES

PRÁCTICA PRE PROFESIONAL

COMPOSICIÓN MICROBIOLÓGICA DEL AIRE EN EL CIRCUITO


TURISTICO CUEVA DE LAS LECHUZAS DEL PARQUE NACIONAL TINGO
MARÍA EN EL PERIODO FEBRERO – MAYO DE 2016

Ejecutor : ALCEDO PABLO, Juan Carlos

Asesor : Blgo. GOZME SULCA, César Augusto.

Lugar de Ejecución : Laboratorio de microbiología de la UNAS

Duración : 03 de Febrero al 03 de Mayo de 2016

TINGO MARIA – PERÚ

2016

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