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PRESENTACION DEL BIOREACTOR « MATIS »

Frédéric Georget
(investigador CIRAD)

Taller sobre los Bioreactores,


Colpos, 12-15 de Septiembre del 2016
Que significa MATIS?

 MATISSE es el apellido de un pintor muy


famoso en Francia.
Pues es un nombre fácil de recordar..

The Sorrows of the King, 1952


(La tristeza del Rey)

 También, M.A.T.I.S es el nombre de un bioreactor a inmersión temporal, patentado por el CIRAD en


2011.

 M.A.T.I.S significa: « Monobloc Advance Temporary Inmersion System »


Porque el MATIS?
El MATIS nació de :

- Una necesidad industrial muy especifica : la necesidad de producir in


vitro millones de plantas de café a bajo costo. El reto era enorme ya que:
- Una planta de café procedente de semilla vale alrededor de
0,20$ de dólares vs 2$ in vitro (estima. del 2007)
- La densidad de siembra alrededor de 4000 plantas /ha. (se
necesita muchas plantas)

- De un convenio de transferencia tecnológica que teníamos desde 2004


con una comercializadora de café para difundir nuevas variedades de
plantas hibridas de café en América central.
Estimamos el mercado en plantas de café en México y América central a 100
millones de plantas por ano.

- Una oferta comercial limitada: En aquel tiempo, utilizábamos el


bioreactor RITA pero, después de 5 anos de uso, nos dimos cuenta que no era
adaptable para una utilización a gran escala y, a nuestro parecer, no había
en aquella época, bioreactores que podían cumplir con las exigencias
industriales en términos de costo, tamaño, eficiencia biológica y manejo.
Los limites del RITA
 Contenedor demasiado pequeño: 1 litro de volumen total pero
solo 0,5l de volumen útil para las plantas (parte superior) y solo
250 ml de medio de cultivo en la parte inferior;
 La biomasa es compacta (vertical) y no permite una buena
mezcla del material, y con poco acceso a la luz;
 El sistema de sobre presión bajo la campana para la subida del
medio no es muy eficiente. 30% del medio se queda en el fondo
del contenedor después de cada inmersión. Además el burbujeo
no es optimo y el material no se mezcla bien lo que genera
heterogeneidad en el desarrollo del material vegetal en el
bioreactor;
 El Rita contiene demasiado piezas (7) lo que complica su uso.
 El precio del Rita es elevado (alrededor de 70$/unidad)

Por fin, el RITA no ofrece ninguna solución técnica para la micro propagación de meristemo y esquejes que
representan casi 99% del mercado comercial. Es bueno para uso de investigación pero no atrae a las unidades
de producción industriales.
Requisitos del MATIS

 El uso era para laboratorios de CIV en países en desarrollo o emergentes;


 Debía ser de tamaño mas grande que el RITA pero no muy grande tampoco
para evitar contaminaciones y por ende perdidas masivas;
 Debía ser mas plano para evitar una estratificación vertical del material;
 Debía de tener mas acceso a la luz y ser fabricado con materia distinta al
polisulfona;
 Debía ser autoclavable y caber varios en un autoclave vertical clásico;
 Debía ser monobloc como el RITA para poder usar las mismas rampas y el
mismo sistema aerolico;
 Debía tener menos piezas que el RITA;
 Por fin, el precio debía andar bajo los 50$.
Bosquejos del MATIS

Rita

MATIS

Unidad de filtracion « Nalgene »


Resultado final

280 mm

Tapa

Tubo
200 mm central
Canasta
167,80 mm

1,750 l
Tamiz
Contenedor principal

1,250l - Sistema mono bloque


- 3 litros de volumen
- 5 piezas
- Policarbonato transparente
- Sistema de sierre tipo « olla de presión »
Diferencias entre RITA y MATIS
Tipo de bioreactores RITA MATIS Indicadores

Facilidad de almacenamiento 5 4 Note de 1 al 5 (1= dificil; 5= muy facil)

Amontonamiento (numero de undidad/m3) 211 41

Facilidad de montage 3 5 Note de 1 al 5 (1= dificil; 5= muy facil)

Numero de piezas 7 4 Vs.


Facilidad para autoclavar 5 4 Note de 1 al 5 (1= dificil; 5= muy facil)

Numero de unidades por autoclave (ej: modelo de 266l


cylindrico y vertical) 56 11

Presion en aire para efectuar una immersion 1l/mn 2 l/mn

2 electrovalvulas 2 vias et 1 2 electrovalvulas 2 vias et 1


Sistema aerolico rampa PVC rampa PVC

Numero de bioreactores conectados por rampa (5 m) 250 48

Numero de bioreactores por metro cuadrado 87 17

Numero de bioreactores por sala de crecimiento (5 x 3=


15 m2) 2500 480

Capacidad optima en embriones cotiledonarios por unidad 250 1000

Riesgo de contaminacion 1 2 Note de 1 al 5 (1= dificil; 5= muy facil)

Volumen de medio / contenedor 250 ml 1l

% contaminacion < 5% < 10%

Materia Polisulfona (amarillo) Policarbonato (transparente)

Problema debida a la materia Craking RAS

Precio de venta (€) 56 € 60 €

Costo inversion MATIS vs RITA 115000 28800 -86000


Primeros resultados del uso del MATIS
ES Café
% conversión plántulas
in vitro
Obtención de una mejor conversión in vitro
de los embriones en plántulas durante la
Embriones cotiledonarios
etapa de desarrollo en Bioreactores

5-15%

Plántulas convertidas

80-90%
ES Café
Tasa exito Fase 1

Obtención de una mejor tasa de


conversión en plántula ex vitro
40-50% durante la etapa de aclimatación
de los embriones/plántulas
T= o T= 10 sem

70%
Banano
(Crystal Vitro, Costa Rica)

- Explantes mas desarollados en MATIS y en


menos tiempo (3 sem vs 4 sem en frascos)
- Tasa de multiplicacion mayor (2,5 vs 1,8)
- Posibilidad de hacer la fase de enraice
directamente en vivero en lugar de en medio
solido (ahoro de MO)
Stevia
(Colpos, Mexico)
Prunus
(Agromillora; Espana)
Agave y platano
(Agromod; Mexico)
Cacao
(Nestlé; France)
“Feed back” de los usuarios

 En general, la gente reporta una muy buena repuesta biológica con el uso del MATIS, cual sea el
material probado;
 No obstante, nos han reportado :
- Problemas para colocar los empaques
- Problemas de contaminaciones
- Problemas de bajada y de subida del medio durante las inmersiones
- Problemas de vitrificación sobre especies lignosas (multiplicación in vitro por
esquejes)
Acciones tomadas para mejorar el
MATIS
 Problemas para colocar los empaques

Cambiar los empaques por empaques de menos « shore » y


mas elástico lo que compensaría el problema de la
deformación de la tapa. Además, el empaque, siendo mas
elástico, seria mas solidario de la tapa lo que limitaría que se
soltara al abrirla bajo campana a flujo laminar.
Acciones tomadas para mejorar el
MATIS
 Problemas de contaminaciones

Refuerzo del contorno

Refuerzos laterales

Cambiar los empaques y rigidificar la tapa del MATIS


Acciones tomadas para mejorar el
MATIS
 Problemas de bajada y subida del medio de cultivo

Agrandar los orificios del tubo central y de los respiradores


Acciones tomadas para mejorar el
MATIS
 Problemas de vitrificación

- Agregar otro respirador en la tapa :2 en lugar de 1 para


mejorar la oxigenación y aeración del Bioreactor (limitar
la condensación en las paredes del MATIS)

- Modificar el tamiz central (agregar ranuras para que el


agua escuja)
Buenas practicas para el uso del MATIS

 Colocación de los empaques


 Buen armado del Bioreactor
 Esterilización del MATIS
 Buen manejo bajo campana a flujo laminar
 Buen sistema aerolico para las inmersiones
Buenas practicas para el uso del MATIS
Colocación de los empaques

1°) Colocar el empaque en la ranura del MATIS sobre 3-4 cm de largo.


2°) La parte plana del empaque hacia el fondo de la ranura
3°) El montaje se hace de la izquierda hacia la derecha
4°) Se coloca el empaque con ligera presión en la ranura manteniendo siempre
la presión con el dedo;
5°) Se repite la operación hasta hacer toda la vuelta
6°) Al final observamos que el empaque es ligeramente mas corto

7°) Después de haber colocado el empaque, hay


que alisarlo dentro de la ranura para evitar que se
salga al abrir la tapa.
8°) Para eso, hay que presionar ligeramente con
el dedo el empaque y alisarlo con el dedo a lo
largo de la ranura en el sentido contrario a su
montaje con el fin de descomprimirlo.
Buenas practicas para el uso del MATIS
Armado del Bioreactor

x 1°) El MATIS completo cuenta con 5 piezas de policarbonato


transparente (el recipiente, la tapa, la canasta, el tubo central y
el tamiz), 2 empaques suaves de polipropileno transparentes y 2
filtros de aire; (Foto A y B)

2°) Colocar los empaques en sus respectivos lugares;


(Foto C)

3°) Montar el tubo central y el tamiz en la canasta; (Foto D)

4°) Colocar el tubo central + tamiz+ canasta en el recipiente


grande (Foto E)

5°) Colocar la tapa encima (Foto F)

6°) El MATIS esta listo para ser autoclavado.


Buenas practicas para el uso del MATIS
Esterilización del MATIS
1°) Humidificar las paredes del MATIS con un atomizador con agua destilada;
x
2°) Colocar el medio de cultivo en el MATIS: 1 litro de medio de cultivo por MATIS;

3°) Tapar los dos orificios del MATIS con Algodón y papel aluminio;

4°) Colocar la tapa en su lugar y entrecerrar: La tapa debe de quedar floja durante
el proceso de esterilización para evitar una posible sobrepresión;

5°) Autoclavar 20 minutos a una temperatura de 120°C y bajo una presión de 0,5
atmo;

6°) Después del autoclave, se cierra un poco mas el MATIS y se coloca


directamente bajo campana de flujo laminar para que el medio se enfrié. Una vez
frio, se puede cerrar el MATIS al 22.5°. No es necesario cerrarlo por completo al
45°;

7°) Los filtros se autoclavan a parte en un frasco de vidrio tapado con papel
aluminio. Después del autoclave, se coloca el frasco en una estufa de desecación a
50°C durante 3-4 horas. Los filtros se autoclavan con las mangueras de PP puestas.

8°) La colocación de los filtros en los MATIS se hace bajo campana de flujo laminar
con pinzas esterilizadas. Se quita el papel aluminio de los orificios. Por medio de
las pinzas, se quita el algodón y se colocan los filtros.

9°) El MATIS esta listo para su uso.


Buenas practicas para el uso del MATIS
Buen manejo bajo campana

x
1°) Abrir la tapa bajo campana de flujo laminar;
2°) Poner la tapa al revés sobre un frasco de vidrio para que
no toque la mesa;
4°) Colocar el material vegetal en la canasta del MATIS con
las pinzas o las espátulas
5°) Cerrar la tapa y colocar el MATIS en las cámaras de
crecimiento;
6°) Conectar el filtro de abajo con la manguera de la rampa
aerólico
7°) Checar el buen funcionamiento del MATIS con un ciclo de
inmersión en modo manual
Buenas practicas para el uso del MATIS
Buen manejo bajo campana

1°) Al salir del laboratorio, se quitan los dos filtros del MATIS;
2°) Si el MATIS esta contaminado, se vuelve a autoclavar
antes de lavarlo (sin los filtros);
3°) Si el MATIS esta limpio, se desmonta las diferentes piezas
y se lavan por separado con agua y detergente que no
contiene compuesto aromático (derivado del Tolueno o
Benceno);
4°) Lavar el MATIS con el lado suave de una esponja para no
rallar el policarbonato;
5°) Enjuagar con agua
6°) Después del lavado, poner las piezas a secar.

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