https://sites.google.

com/site/enzineticupiig/bradf
ord-y-dns
7. Bradford Y DNS

Al trabajar con enzimas, es importante saber lo que realmente hay en la muestra con la que se
esta trabajando, por eso es importante hacer algunas pruebas y comprobar que y cuanto es lo
que tenemos en la muestra, a continuación hablaremos de un método para determinar
azúcares reductores y otro para determinar proteínas.

·Bradford.

Es muy importante determinar y cuantificar la concentración total de proteínas, existen

varios métodos para lograrlo pero aquí hablaremos del método de Bradford, ya que es uno de
los más rápidos, sencillos, baratos y pocas sustancias interfieren en su determinación, entre las
sustancias que infieren están los detergentes y las soluciones básicas.

Ese método se basa en la unión no covalente del colorante Azul de Coomassie G-250 y la
proteína; el colorante en solución ácida presenta dos formas coloreadas, café y azul. El color
café cambia a azul cuando el colorante se ha unido con la proteína, la formación de este
complejo colorante-proteína toma aproximadamente 2 minutos y permaneces estable por 1
hora.
Las muestras se leen en el espectofotometro a una absorbancia de 595 nm.

El método de Bradford es sensible para los residuos de aminoácidos de arginina, triptófano,

tirosina, histidina y fenilalanina.

La solución de Bradford se prepara con:

-10 mg de Azul de Comassie G-250
-5 mL de etanol al 95%
-10 mL de ácido fosfórico al (5% (w/v)

La solución de diluye a volumen final de 100 mL.

El reactivo debe tener color café y se almacena en un frasco ámbar bajo refrigeración.

La curva patrón se realiza con albúmina, la cual queda de la siguiente forma:

 Figura 7.1. Curva estándar de Albumina de suero bovino (BSA) por el método de Bradford.

Bradford, M. M., 1976. “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem. 72:248-254.

·Ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS).

Tambien es importante determinar la concentración de azúcares reductores totales en una

muestra, y con esta cuantificación se obtiene una curva de calibración siguiendo el método del
ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS).

El método DNS determina la presencia de grupos carbónicos libres (C=O) de los azucares
reductores. El procedimiento se basa en una reacción redox, que ocurre en la utilización
de ácido 3,5 dinitrosalicílico para provocar la oxidación de los azucares y al mismo tiempo su
propia reducción endotermica. Un mol de azúcar reacciona con un mol de ácido 3,5
dinitrosalicílico, dando lugar a una reacción estequiométrica que permite conocer la cantidad
de azucares reductores presentes en la muestra.

Después de esto se continua con la determinación, haciendo lecturas de absorbancia en el

espectrofotometro a 540 nm.
 Figura 7.2. Reacción de oxidación de azúcares reductores, método DNS.

La reacción es colorimétrica, el ácido 3.5 dinitrosalicílico es de color amarillo, mientras que la

aparición de ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico provoca un viraje a pardo oscuro, cuya intensidad
será proporcional a la cantidad de azucares reductores (E. Casablanca et al., 2009). Por
esta razón, el método no es recomendable para muestras coloreadas, ya que pueden afectar
en la lectura que se realice en el espectrofotometro.

El reactivo del ácido 3,5 dinitrosalicílico se prepara con:

-Solución de 100 mL con 2g de NaOH disuelto

-Agregar 2g de ácido 3,5-dinitrosalicílico con agitación constante
-Agregar 40 g de Tartrato de sodio-potasio tetrahidratado
-Agregar 0.4g de fenol
-Agregar 0.1 g de sulfito de sodio
-Aforar a 200 mL con agua destilada

El volumen final no debe ser mayor a 200 mL y se debe guardar en oscuridad en frasco ámbar

Existen dos facetas de calibración en el análisis cualitativo, la calibración instrumental y la

calibración metodológica. La calibración instrumental se realiza con estándares que no
contienen el analito y se utiliza para asegurar el funcionamiento del instrumento empleado.

La calibración metodológica se realiza con estándares que contienen el analito para establecer
una relación entre las características fisicoquímicas del analito y las señales del instrumento.
En un proceso analítico se relaciona la señal y características del analito, de modo que la
calibración se realiza al obtener la señal de respuesta como función de la concentración
conocida del analito. Se representan los datos obtenidos y se obtiene la gráfica de la señal
corregida frente a la concentración del analito. Lo normal es que la gráfica tienda a una línea
recta, donde a medida que aumenta la concentración (Fig.1), la señal de respuesta es mayor
(pendiente positiva). En el modelo de curva de calibración lineal, la pendiente vendrá dada por
la ecuación matemática:

y = mx + b

Siendo m la pendiente, x la concentración e y la señal de respuesta. La sensibilidad de

calibración es la pendiente de la curva de calibrado. Por tanto en una curva de calibrado lineal
la sensibilidad es siempre la misma y no va a depender de la concentración, ya que para que
se cumpla y = mx + b, las concentraciones deben tener una incertidumbre insignificante.

Exactitud

Es el grado de concordancia entre el resultado de una determinación o la media de “n”

resultados y el valor “verdadero” del analito en la muestra en cuestión. Toda medida tiene un
fallo, por lo que el valor verdadero no lo conocemos, pero nos podemos aproximar a él
utilizando los siguientes materiales:

• Material de referencia: material o sustancia, en el cual una o más de sus propiedades están
suficientemente bien establecidas para que sea usado en la calibración, la estimación de un
método de medición o para asignar valores a los materiales.

• Material de referencia certificado (MRC): material en el que los valores de una o más de sus
propiedades están certificados por un procedimiento técnicamente validado.
Determinación de proteínas y azúcares reductores

Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteína presente en las
muestras biológicas, basados en las propiedades que muestran las proteínas en solución.

Los métodos más usuales son:

. Reacción de Biuret.

. Método de Lowry.

. Método de Bradford.

. Método del ácido Bicinconínico (BCA).

. Absorción en el ultravioleta.

. Métodos inmunológicos.

Siendo uno de los más utilizados el método Bradforf por ser un método rápido, reproducible y
sensible.

Para la determinación de azúcares según el método Miller, los azúcares reductores pueden
reducir al ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones. Cuando el ácido 3,5-
dinitrosa- licílico es reducido en presencia de calor, por los azúcares reductores que entran en
contacto con él, se desarrolla un cambio de color parecido al café (con variaciones de amarillo
hasta café). El cambio de coloración puede entonces determinarse por lecturas de densidad
óptica, leídas por espectrofotometría a una determinada longitud de onda. La concentración de
los azúcares reductores totales liberados en la muestra se determina haciendo una
interpolación en la curva patrón del azúcar utilizado, graficando la absorbancia en función de la
concentración.

OBJETIVO GENERAL

Elaboración de diferentes curvas de calibración (azúcares reductores y proteínas) y entender

su importancia.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Obtener una curva de calibración para azúcares reductores haciendo uso del método de Miller
(DNS) usando Glucosa como estándar.

• Obtener una curva de calibración para proteína por el método Bradford usando Albúmina de
huevo (AH) como estándar.

MATERIALES Y EQUIPO

. Micropipetas de 1000, 200 y 20 µL

. Puntas para micropipeta azules y amarillas

. Tubos eppendorf de 1.5 mL

. Gradillas para eppendorf

. Vasos de pp de 1 litro

. Vasos de pp de 250 mL

. Reactivo DNS

. Reactivo Bradford

. Parrilla de calentamiento

. Recipiente con hielos.

. Espectrofotómetro con celdas

. Vortex

DESARROLLO EXPERIMENTAL Y TEÓRICA.

OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN.

a) Azúcares Reductores

1. Para la obtención de la curva de calibración de azúcares reductores se utilizará como

estándar la Glucosa para ello se realiza la curva patrón de Glucosa (o el azúcar reductor más
adecuado en función de lo que se vaya a determinar) en un rango de concentración de 0 a 2.0
g/L.

2. Las diluciones se prepararán, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1, o bien, pueden

realizarse diluciones seriadas teniendo en cuenta la concentración que se tendrá en cada una.

3. Una vez que se preparan las diluciones se debe realizar el procedimiento para azúcares
reductores.
*Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotómetro.

CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES POR EL MÉTODO DE DNS

4. Agregar 100 µL de la solución problema (solución de glucosa a 1 mg/mL o de sacarosa a 6

mg/mL ya digerida, tabla 1).

5. Agregar 300 µL del reactivo de DNS preparado.

6. Ebullir 5 minutos y dejar enfriar (10 minutos aproximadamente) en el recipiente con hielos.

7. Agregar 600 µL de agua destilada.

8. Agitar en vórtex a temperatura ambiente.

9. Leer la absorbancia registrada en el espectro de UV-Visible a 540 nm (cuidar que no pase

más de 30 min para su lectura).

10. Elaborar la curva patrón en donde se grafique en el eje de las ordenas (eje “y”) promedio de
la absorbancia determinada a 540 nm y en el eje de las abscisas (eje ”x”) el promedio de la
concentración de Glucosa determinada en g/L.

11. Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros:

y = mx + b

En donde “y” representa la absorbancia determinada a 540 nm. “x” representa la concentración
de maltosa determinada en g/L.

La curva patrón será correcta cuando se obtenga una R2 mayor o igual a 0.98, con lecturas de
absorbancia entre 0 y 1.

b) Determinación de Proteína.

1. La determinación de proteína de una solución enzimática con el método de Bradford, se

determina por medio de una curva tipo con albúmina de huevo (AH) y el reactivo de Bradford.

2. Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de AH de 0 a 200 µg/mL, a partir de una

solución de 200 µg/mL, (Tabla 2).

3. Agregar en un tubo eppendorf limpio la cantidad de solución de AH y agua que se indica

para obtener un volumen final de 0.25 mL de muestra.
4. Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar en reposo
EXACTAMENTE 5 minutos, inmediatamente después leer la absorbancia a 595 nm, ajustando
el equipo con el “blanco de reactivos” o agua (el que no contiene proteína).

REFERENCIAS

• Bradford, M. M., 1976. “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem. 72:248-254.

• Miller G., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.
Anal. Chem. 31: 426-428.