Biología Molecular

MSc Jhonatan Alarcón Baldeón

Lic. Arturo Rivas Cardenas

Ada Catiana Durán Piralla

1. Aprender la extracción del ADN a través de la sangre periférica.

2. Encontrar los beneficios de realizar una extracción de ADN por el método

Salting out
 La extracción de ácidos nucleicos es el primer proceso del análisis demuestras para
PCR, de una importancia capital para el éxito del mismo. A su vez es muy importante
tener claro nuestros objetivos analíticos para seleccionar correctamente el método más
adecuado de extracción.
En general existen:
1. Métodos tradicionales de purificación (extracción y precipitación)
2. Kits de purificación de ADN usando columnas prehechas
(cromatografía de intercambio aniónico)
Los pasos generales en el proceso de extracción de ácidos nucleicos son:
1. HOMOGENIZACIÓN: Permite la disgregación de la estructura celular y
tisular, para facilitar la salida de los ácidos nucleicos. Para tal efecto podemos
utilizar:
a) Métodos físicos: Cizallamiento, sonificación, hervido, congelación-
descongelación, choque osmótico, etc.
b) Detergentes: como el SDS
c) Enzimas: Lisozima, Proteinasa K
2. SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN: Permite la eliminación progresiva de
proteínas y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético
cada vez más limpio.
Se pueden utilizar varios procedimientos:
a. Fenol/Cloroformo: Ha sido uno de los métodos más usados, aunque de
menor importancia en clínica. El fenol desnaturaliza las proteínas y
componentes celulares, y el cloroformo permite la separación de las fases
durante la centrifugación.
b. Separación cromatográfica: Se emplean columnas preempaquetadas, ya sea
de afinidad o de intercambio iónico, previa unión del ácido nucleico a resinas
(Chelex - 100) o matriz de sílice. Luego es necesario lavados sucesivos para
eliminar los contaminantes, y la elusión con tampón TE.
3. PRECIPITACIÓN: Permite la obtención de un ácido nucleico listo para ser
almacenado o diluido en la concentración deseada para su análisis. Se suele
utilizar el etanol o Isopropanol.
Los principales métodos de extracción de ADN en diagnóstico molecular
son:

1. Métodos de extracción con Fenol/Cloroformo

2. Métodos de extracción con Salting Out
3. Sistema de matriz de Sílice y Columnas
4. Kits Comerciales de extracción: Sistema de QIAamp de QIAGEN
 Centrífuga de tubos (4,000 – 5,000)

 Baño María

 Propipetas

 Micropipetas (100 – 1000 µL)

 Pipetas Pasteur (cuentagotas)

 Tubos de centrífuga de polipropileno (estériles)

 Tubos al vacío con EDTA

 Tubos de microcentrífuga estériles (eppendorf)

 Jeringas de 5cc

 Jeringas de tuberculina

 Gradilla de tubos

 Rotulador indeleble

 Buffer lisis de Glóbulos rojos (Buffer lisis frío)

 Solución SE

 Solución SDS 10 %

 Proteinasa K 20 mg/mL

 Solución ClNa 6M

 Alcohol isopropílico o estanol absoluto

 Solución TE
 Realizaremos
la venopunción
usando tubos
vacutainer con
EDTA

Recolectaremos
la cantidad de
6 mL (usar 2
tubos de 3mL)

Luego, agregar a estos

6mL, Buffer lisis frío,
hasta completar 14 mL
REFRIGERAR
(sangre + buffer
lisis frío = 14 mL)
- en la congeladora -
durante 15 min y
homogenizar
cada 5 min.
Para lisas las células

Rotular
nuestro tubo
Vaciar los 6mL de
de centrífuga
de sangre, en el tubo
polipropileno de de polipropileno
de 15 mL
 Centrifugar a 5000 RPM durante 10 min. Luego
eliminar el sobrenadante, con la pipeta Pasteur

No olvidar CONTRAPESAR cada tubo

Después de ELIMINAR
el sobrenadante, debemos RESUSPENDER,
con el Buffer lisis frío, BLF, solución
hipotónica, que lisa los GR.
Luego, nuevamente, CENTRIFUGAR
También
notamos que
conforme se
repite este
Dicho
procedimiento el
proceso se
color del líquido
repetirá 3
en el tubo, se
veces
vuelve más
pálido, es decir,
está siendo
lavado

Al RESUSPENDER debemos golpear con los dedos, la punta de tubo, en donde se

encontrará el pellet (‘‘pequeñas porciones de material aglomerado’’)
 No olvidemos, disolver el pellet,
golpeándolo en el fondo del tubo.

Posteriormente RESUSPENDER el pellet

con el Buffer lisis caliente hasta los 3 mL

El BLC,
buffer lisis caliente,
tiene en su composición
Tris - HCl, NaCl y EDTA

Agregar SDS 10% (50 µL)

Luego agregar Proteinasa K (50 µL)

Llevarlo al Baño María a 50 ° C → durante 17 - 24 horas

 Retirarlo del Baño María

Agregar NaCl 6M (2 mL). Mezclar

vigorosamente por unos minutos.
Luego llevar a la centrífuga

Extraer en otro tubo vacío (Corning) el sobrenadante final, con la

ayuda de la pipeta Pasteur

Agregar tanto
ALCOHOL (96°) Mezclar
como líquido en el tubo suavemente y
Corning, para lograr el observar la
precipitado y la formación de
formación de la medusa la ‘medusa’
de ADN

Dejar secar en la estufa

Con la ayuda de una
pipeta Pasteur, extraer
dicha medusa hacia el
Agregar 1mL de solución TE y
tubo eppendorf de 2 mL disolverlo en la estufa

Finalmente, guardar el ADN extraído a

T° de refrigeración.
1. El método del Salting out permite el uso de sales, simples y reemplazables. Y
evita el uso de disolventes orgánicos. Por lo que su aplicacación es de fácil
manejo. Permitiendo que sea didáctico.
2. Todos los métodos de extracción poseen la misma estructura: lisis, extracción
y purificación
 - ¿Por qué utilizamos el EDTA cómo anticoagulante?

Porque esta no interfiere en la biología molecular, como otros anticoagulantes

(fluoruro de sodio, heparina, etc). Y no produce contaminantes.

- Se debe procurar asegurarse de que el Baño María se lleve a cabo las

horas correspondientes, para garantizar el éxito de nuestro procedimiento

- Se utilizó Alcohol medicinal de 96° para realizar la obtención del precipitado

y posteriormente la de la medusa de ADN.
1. Herrera, H. Rosado. J, (2008). Guía de prácticas de Biología Molecular.
Lima – Perú.
2. Adriana Clegg, FujiFilm [Blog] Recuperado de
http://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/post/10-metodos-de-
extraccion-de-adn/