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INGENIERÍA

GENÉTICA
La Nueva Biotecnología

El descubrimiento de las enzimas de restricción permitieron el


desarrollo de tecnologías para la manipulación genética.

En la década del 70 surge la “nueva biotecnología” bajo el concepto


de la manipulación organismos para su “mejoramiento”.

Ingeniería Genética
• Ingeniería Genética: es la biotecnología que se concentra en el
estudio de la manipulación genética de un organismo con un
propósito determinado.

Ejemplos de aplicación de la ingeniería genética:

• Industria Alimenticia: producción de alimentos transgénicos, de mayor


resistencia a las condiciones adversas que se presentan durante su
proceso productivo, permitiendo una mejora en los rendimientos.

• Industria Farmacéutica: producción de hormonas (insulina), vacunas y


antibióticos; en todos los casos con mejor rendimiento y calidad de
producto respecto a los métodos tradicionales.

• Medicina: empleo de la terapia génica (aportar un gen funcionante a


células que carecen de esta función) para el tratamiento de enfermedades.
Generar cerdos transgénicos que posean órganos compatibles con los del
hombre.
Plásmidos
Transcripción y Traducción
Transcripción y Traducción
Regulación de la expresión génica

No todos los genes se expresan simultáneamente y al mismo nivel:

• Genes constitutivos: Se expresan al mismo nivel independientemente de


las condiciones ambientales. Se expresan en forma continua. Por ejemplo,
los genes que codifican para las enzimas necesarias para el metabolismo
básico celular.

• Genes regulados: Se expresan a distintos niveles (o no se expresan)


dependiendo de las condiciones ambientales. Se expresan en
determinadas situaciones. Codifican para enzimas que solamente se
necesitan para momentos concretos.
Regulación de la expresión génica

En la parte inicial de los genes existe una zona, denominada promotor,


que es reconocida por la ARN polimerasa indicando por donde se debe
iniciar la transcripción.

Existen diferentes mecanismos celulares mediante los que regula la


expresión de los genes regulados. Estos varían según sean procariotas o
eucariotas

A continuación veremos uno de los mecanismos empleados por bacterias


para la expresión de genes regulados.

Nota: los ARNm de bacterias suelen ser policistrónicos, es decir que un mismo
ARNm codifica para varias enzimas.
Regulación de la expresión génica - Operón

Control negativo: el producto del gen regulador impide la expresión de


determinados genes. Al compuesto que evita el efecto del producto del gen
regulador permitiendo la expresión de los genes se denomina inductor.
Ejemplo: el operón lactosa, el inductor es la lactosa.

Control positivo: el producto del gen regulador activa la expresión de


determinados genes. Al compuesto que junto al producto del gen regulador
evitan la expresión de los genes se denomina correpresor. Ejemplo: el
operón triptofano, el correpresor es el triptofano.
Regulación de la expresión génica – Operón lactosa

Operón Lactosa - control negativo: La presencia de lactosa permite la


expresión de enzimas que permiten que sea utilizada como nutriente.
Regulación de la expresión génica – Operón lactosa

En ausencia de lactosa:
Regulación de la expresión génica – Operón lactosa

En presencia de lactosa:
Regulación de la expresión génica – Operón triptofano

Operón Triptofano - control positivo: El triptofano es un aminoácido


sintetizado por la célula. La célula no lo sintetiza al estar presente.
Regulación de la expresión génica – Operón triptofano

En ausencia de triptofano:
Regulación de la expresión génica – Operón triptofano

En presencia de triptofano:
Tecnología del ADN Recombinante - Elementos

Mediante esta tecnología se pueden obtener organismos modificados.


Consiste en la inserción de fragmentos de ADN (genes de interés) que le
proporcionan características particulares y diferentes a las que poseía
originalmente

En esta tecnología son indispensables los siguientes elementos:

• ADN a clonar: es el fragmento de ADN que posee el gen/genes de interés.

• Huésped: es la célula a modificar que portará los genes de interés.

• Vector: molécula de ADN que transfiere el ADN a clonar al genoma del huésped.

• Enzima de restricción (o endonucleasa de Restricción): es una enzima que


puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula
de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto.

• ADN ligasa: enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5’ de una
cadena polinucleotídica y el extremo 3’ de otra cadena polinucleotídica, uniendo
fragmentos de ADN. Se utiliza luego de la restricción.
Tecnología del ADN Recombinante - Etapas

En la tecnología del ADN recombinante podemos diferencia las


siguientes etapas:

1) Generación de segmentos de ADN. Se emplean endonucleasas de restricción que


cortan el ADN en posiciones precisas.

2) Separación de los fragmentos de ADN obtenidos.

3) Corte del vector mediante el empleo de la misma enzimas usadas en 1).

4) Unión de los segmentos de ADN obtenidos en 1) en el vector, mediante el empleo de


ADN ligasas. A esta nueva molécula de ADN se la denomina ADN recombinante.

5) Inserción del vector en el huésped. Esta célula posee la maquinaria genética necesaria
para expresar la información contenida en el ADN recombinante. A esta célula
modificada se la denomina célula recombinante.

6) Selección de las células que han incorporado el ADN recombinante.


Tecnología del ADN Recombinante - Etapas

ADN recombinante.flv
Tecnología del ADN Recombinante - Huésped

Son las entidades usadas para propagar los vectores.

Las características ideales de un huésped son:


• crecimiento rápido.
• no patógeno
• aceptar material genético exógeno
• permanecer estable en cultivos.

Pueden emplearse huéspedes procariotas o eucariotas (incluidas células


animales y vegetales)
Tecnología del ADN Recombinante – ADN a clonar

Es el fragmento de ADN a insertar y que porta la información deseada

Se puede obtener por las siguientes vías:


• Genoma total: se fragmenta el genoma por métodos físicos o enzimáticos.
Los fragmentos se separan y se selecciona el que porta la información
deseada..
• Síntesis enzimática: disponiendo del ARNm se procede a su retro
transcripción para sintetizar el ANDc que portará la información de interés.
• Síntesis química: se sintetiza el fragmento de ADN acoplando en forma
sucesiva los diferentes nucleótidos que lo conforman. Esta metodología es la
menos utilizada.
Tecnología del ADN Recombinante – Vector

Es la molécula carrier del ADN a clonar

Existen diferentes vectores. Se eligen según el tamaño del ADN a clonar:

• Plásmidos: capacidad de transporte 5 kb (kilobases)


• Bacteriófagos: son virus de bacterias que portan el fragmento de ADN de
interés. Capacidad de transporte 25 kb.
• Cósmidos: son plásmidos de gran tamaño encapsulados en fagos.
Capacidad de transporte 40 kb
• Cromosomas artificiales: transportan gran cantidad de material genético.
Tecnología del ADN Recombinante – Introducción del Vector

Existen diferentes métodos para introducir el vector en el huésped. El


método a elegir dependerá de las características de ambos:

En procariotas:
• Transformación: se somete a la célula a tratamientos físicos y químicos para
que pueda captar moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo.
Por ejemplo: Se Incuban las células y el plásmido a 0°C en solución de
CaCl2..Se aplican shocks térmicos a 40°C. Se pueden agregar agentes
permeabilizantes.
• Transducción: se introduce el ADN de interés mediante infección con un
virus.

En Eucariotas:
• Transfección: análogo a la transformación en procariotas.
Tecnología del ADN Recombinante – Identificación de la célula recombinante

Al aplicar esta tecnología se debe poder seleccionar aquellas células que


han incorporado el vector de las que no.

Debe existir la forma de poder conocer si una célula ha incorporado el


vector o no.
Tecnología del ADN Recombinante – Identificación de la célula recombinante

Las cualidades antes mencionadas son proporcionadas por el vector. Por


este motivo es necesario que en el vector existan las siguientes zonas:

• Gen reportero: expresa una proteína que proporciona al huésped una característica particular
fácilmente visible y que no posee en su forma salvaje. Por ejemplo, la producción de una proteína
fluorescente.

• Gen de resistencia: expresa proteínas que le proporcionan resistencia a antibióticos. De este


modo, al someter a las células a un antibiótico luego del proceso de introducción del vector, sólo
sobreviven aquellas que han incorporado al vector.

• Zona de origen: es donde se origina la replicación. Es necesaria para la replicación del plásmido.

• Zona de restricción: es la zona en la que debe actuar la enzima de restricción y donde se debe
insertar el ADN de interés. Es necesario que la enzima actúe en esta zona para evitar la pérdida de
las características antes mencionadas.

• Promotor: regulan la expresión del gen reportero y del gen de interés, convirtiéndolos en genes
constitutivos o regulados.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) - Elementos

Es una metodología que permite obtener “in vitro” un gran número de copias de un
fragmento de ADN a partir de una cantidad mínima.

En esta técnología son indispensables los siguientes elementos:

• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): que son el sustrato para polimerizar nuevo ADN.

• Dos cebadores (o primers): que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del
ADN. Son secuencias cortas de nucleótidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo
iniciar la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar.

• ADN polimerasa: con temperatura óptima alrededor de 70ºC (la más común es la Taq
polimerasa).

• ADN molde: que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

• Iones metálicos: que son cofactores de la ADN polimerasa.

• Buffer: mantenimiento del pH para el funcionamiento óptimo de la ADN polimerasa.

• Termociclador: aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas
que conforman un ciclo.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) - Etapas

En la PCR podemos diferenciar las siguientes etapas. El conjunto de


estas etapas conforman un ciclo:

1) Desnaturalización: consiste en separar las dos hebras del ADN molde mediante
el empleo de la temperatura (se rompen uniones puente de hidrógeno entre las
bases). Es una fase corta que dura entre 20 y 30 a una temperatura de 94 a 95°C.

2) Hibridación o templado: se produce un enfriamiento brusco de la mezcla a unos


50 a 65°C, permitiendo la unión de los cebadores con las hebras del ADN molde.
Esta fase dura entre 20 y 40 segundo.

3) Elongación o polimerizacíon: se eleva la temperatura permitiendo que la ADN


polimerasa sintetice la nueva hebra de ADN complementaria al ADN molde,
uniendo los dNTPs agregados. La temperatura de esta etapa se ajusta de
acuerdo a la temperatura de funcionamiento óptimo de la ADN polimerasa
(aproximadamente 70°C). La temperatura elevada también es necesaria para
mantener las hebras de ADN separadas. El tiempo de esta etapa depende de
procesividad de la ADN polimerasa y de la longitud del fragmento de ADN a
amplificar.

Todas estas etapas determinan un ciclo. Este ciclo se repite entre 20 y


35 veces consecutivas permitiendo la generación exponencial de
fragmentos de ADN.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) - Etapas

Pc r.av i
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) - Mutagénesis