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INSTITUTO POLITECNICO
NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INSTERDISCIPLINARIA DE
INGENIERÍAS CAMPUS GUANAJUATO
INGENIERÍA FARMACÉUTICA
INGENIERIA DE FERMENTACIONES
“Elaboración de la penicilina mediante la fermentación
del Hongo Penicillium Chrysogenum”
6FV1
FECHA DE ENTREGA
03/12/2013
Objetivos específicos
INTRODUCCIÓN
Un antibiótico se conoce como aquel compuesto químico producido ya sea por hongos o
bacterias, y que posee una actividad de defensa ante diferentes microorganismos
presentes en cualquier medio ambiente, para el hongo proteger los nutrientes que
necesita, mediante la interferencia del compuesto mismo en diversos pasos del
metabolismo de los microorganismos enemigos. Por consiguiente se le considera un
metabolito secundario, porque es antimicrobiano y resulta capaz de inhibir un crecimiento
bacteriano. [3-4]
Apreciamos una estructura consistente en un anillo tiazolídinico con un anillo β- lactámico, y una
parte variable acilada en la posición 6, lo que demuestra que se pueden obtener varios tipos de
penicilina gracias a las propiedades estructurales de la molécula.
Imagen extraída de: [http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Penicillin-G.svg]
Se aprecia la ruta biosintética del compuesto para dar como producto final penicilinas del tipo G y V
Imagen extraída de: Microbiología General 2008
Por último resta mencionar que una propiedad fundamental en los hongos, es que
contienen enzimas que son dependientes de metales como: Manganeso, Cromo, Hierro y
Cobalto, necesarios para que las enzimas cumplan su función, considerando que los
hongos son restrictivos en su crecimiento porque contienen muchas rutas metabólicas
alternas para producir antibióticos, u otros metabolitos secundarios como pigmentos. Las
rutas metabólicas en los hongos poseen enzimas muy específicas que dependen de
metales (metaloenzimas), y es importante que estén presentes en el medio de cultivo para
el crecimiento y desarrollo del hongo, el medio debe tener un pH acido entre 4.5 y 5 (a
excepción del Penicillium, cuyo pH debe ser de 6.5 ya que influye a un mejor desarrollo
del metabolito) puesto que a un valor mayor desarrollaría mayor cantidad de biomasa que
la necesaria. [1-2,4]
Purificación
Por último, para la separación del antibiótico se utiliza la cromatografía en columna, esta
técnica permite la separación de mezclas de sustancias, sus características y los factores
que en ella intervienen. Generalmente esta técnica se emplea en la purificación de
compuestos químicos, ya que existe una afinidad diferencial de los distintos compuestos
inmersos en la mezcla por la fase móvil o estacionaria, estos compuestos son arrastrados
por un eluyente que los propicia a avanzar a lo largo de la columna, pero como no todos
los compuestos avanzaran a la misma velocidad, por consiguiente terminamos obteniendo
el antibiótico de interés, ya que esperamos sea el compuesto que avance con mayor
velocidad que los otros. [1,4]
Figura 3: Se muestra que parte del metabolismo de un microorganismo se ve afectado por los diversos
antibióticos.
Existen factores propios del agente antimicrobiano, como son absorción, distribución,
metabolismo, eliminación, unión a proteínas plasmáticas y otros parámetros
farmacocinéticos, los cuales pueden influenciar la respuesta del paciente. Debido a que
los microorganismos tienen susceptibilidad variable a agentes antimicrobianos, es
necesario tener una herramienta que permita determinar la susceptibilidad del
microorganismo causante de la infección. [5-9]
Cada vez son menos los organismos que tienen susceptibilidad predecible, por lo que
debemos hacer estudio de susceptibilidad en la mayoría de los microorganismos aislados.
La indicación primaria para el estudio de susceptibilidad es determinar el antibiótico más
apropiado para iniciar la terapia en un paciente con un proceso infeccioso. En la mayoría
de los casos, cuando comienza una enfermedad se indica un antibiótico de amplio
espectro (o una combinación de antibióticos) hasta obtener resultados acerca de la
identificación del germen causal de la infección. Posteriormente al obtener una respuesta,
puede indicarse un antibiótico más específico. [2,8]
En este momento existen varios métodos basados en la biología molecular que pueden
ser usados para detectar resistencia específica a varios antimicrobianos, pero su uso de
rutina no está indicado. Estos métodos son principalmente usados con fines
epidemiológicos, para monitorear resistencia a antibióticos. [7]
Material Reactivos
3 matraces erlenmeyer de 500 mL Glucosa
2 charolas de aluminio Sulfato de amonio
1 Espátula Extracto de levadura
2 Probeta 50 mL KCl
1 Mechero de bunsen MgSO4
2 Asa para sembrar FeCl3
Algodón Etanol al 90°
Gazas Caja petri con hongo de penicillium cultivado
Papel destraza Tubo con esporas
2 matraces erlenmeyer de 1 L Ciclohexanona
Pinzas de disección Solución acido sulfúrico 1 N
Encendedor Agar PDA
Probeta de 5 L Agar Bacteriológico
5 Lámparas de alcohol Peptona de Caseína
4 tubos Falcón Cloruro de sodio
Embudo de separación Penicilina Comercial
Columna cromatografía anionica Tubo eppendorf con esporas
Papel Filtro Cepa de cultivo con Lotto
1 Porta Objeto Cepa de cultivo con E. Coli
2 Cubre Objetos Cepa de cultivo con Salmonella
1 Caja petri de vidrio Agua destilada
Equipo para cromatografía de intercambio Equipo
iónico
Tubos Eppendorf estériles Equipo para filtración al vacio
Micropipeta de 1000 µL Bomba
Puntas para micropipeta Bomba peristáltica
Celdas para espectrofotómetro de vidrio y Fermentador Instrumentado
plástico
3 vasos de precipitado de 100 mL Microscopio
Pinzas de disección Autoclave
12 cajas petrí de plástico estériles Refrigerador
Encendedor Incubadora a 29°C
Secador Espectrofotómetro Uv-vis
Agitar posteriormente
Añadir a la solucion
vigorosamente añadir cada una de
el extracto de
efectuando una las sales pesadas en
levadura y agitar
disolucion la balanza
Seguir agitando
Añadir lentamente Envolver con una
vigorosamente
la glucosa a la gasa un pedazo de
nuestra solucion
solucion y agitar algodón, y proteger
hasta que todos los
mientras se va nuestro medio de
componentes esten
adhiriendo. cultivo
disueltos
Microcultivo
Colocar 2 ml de agua
En base a lo observado,
Observar el hongo al destilada (no se pudo
determinar el tipo de
microscopio utilizando efectuar), sellar la caja
cepa para cada muestra
objetivos 20 x y 40 x e incubarla por 36
y su especie.
horas a 37 °C
Introducir la porcion
extraida del hongo en
Verificar la asepsia del Meter el medio de
Flamear de nueva el medio de cultivo,
Biorreactor y considerar cultivo inoculado a un
cuenta el Aza y todo lo flameando el boquete
todas las medidas conservador durante 4
que se utilizo. del matraz y la tapa de
necesarias. . dias.
algodon, cerrando
nuestro medio.
Dejar el biorreactor
fermentando una semana
y posteriormente realizar
una filtracion para separar
el producto de la biomasa.
Posteriormente tratar el
Eliminar los residuos de caldo por centrifugacion,
Colocar el sobrenadante
mayor tamaño mediante colocando en tubo de 50
en un recipiente.
una filtracion de vacio mL con tapa por 10 min
a 5000 rpm
Rotular un frasco
Tratar el restante de la
determinado para
fase acuosa pasando la Sustraer una muestra de
guardar el producto
misma por la columna 10 mL de la fase acuosa
resultante de la
cromatografica
cromatografia
Guardar el producto
final en refrigeracion por
un periodo de 2 semanas
Elaboración de antibiograma
Resultados y Discusión
Microcultivo
No se tiene una imagen disponible del la identificación del hongo, pero a continuación se
muestra una imagen similar a la del hongo que se identifico experimentalmente y que
cumplió con las características que debe mostrar el penicillium.
Extraída de:
[http://www.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/3/pexp.JPG&imgrefu
rl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html&h=654&w=640&sz=44&tbnid=5nTOG24FOgB9
aM:&tbnh=115&tbnw=113&zoom=1&usg=__cNjOr5ylM7fxFkTE378KHAwbp8Q=&docid=WTW3zN12yYH7DM&sa=X&ei=wK
FlUsa3K8SD2QXr84DoDQ&ved=0CC8Q9QEwAQ]
Realizando una investigación más profunda, también se discute que pudo haberse
utilizado sacarosa, su efecto respecto a nuestro medio de cultivo hubiese sido próspero,
pero no brinda suficientes fuentes de carbono debido a su inestabilidad como molécula
orgánica (no tiene todas sus conformaciones en posición ecuatorial como la glucosa), por
ende bioquímicamente no se adapta completamente a las necesidades de desarrollo y
crecimiento en el hongo según la literatura contrastada. [1-4]
Una vez realizada la filtración al vacio se obtuvo un caldo impuro el cual se procedió a
purificar para obtener la penicilina. Después de centrifugar el caldo y añadirle 200 mL de
Ciclohexanona, dejar reposar 5 días y añadir a un tubo de decantación, se observo la
separación de dos fases: Orgánica (tenía otros metabolitos ajenos a la penicilina) de color
amarillo fuerte y Acuosa (contenía a la penicilina) de color amarillo claro. Se separa la
fase acuosa y posteriormente se pasa sobre una columna cromatografía anionica, para
guardar y conservar el producto.
Es importante este proceso puesto que se tiene que extraer el antibiótico de los otros
metabolitos inmersos en el caldo, para lo cual se centrifuga el sobrenadante y se le añade
ciclohexanona, cabe mencionar que la ciclohexanona es buena para solubilizar
metabolitos polares inmersos en el caldo, puesto que es un compuesto polar que ataca a
grupos aminos y carbonilicos de otro metabolitos secundarios. Comparando con otros
trabajos experimentales de obtención de penicilina, se encuentra que anteriormente hubo
otros intentos de purificación utilizando otros solventes polares como: éter, cloruro de
metileno y acetato de etilo, pero estos no resultaron en una separación de fases
adecuada, aparte de que muchos metabolitos secundarios se colaban en la fase acuosa
de penicilina, por ende el solvente orgánico que ha dado mayor resultado es la
Ciclohexanona, de haberse usado éter o cualquier otro mencionado, se hubiese obtenido
una fase acuosa de un amarillo más pronunciado. [Wade 2012]
Todas las penicilinas tienen una estructura básica (figura 1), la cual tiene una absorbancia
con una longitud de onda entre 200 y 230 nm. Se tomó una longitud de onda de 285 nm,
ya que el espectrofotómetro no admitía lecturas a menores longitudes de onda, aparte
285 nm todavía se encuentra en el rango donde se obtiene una absorbancia relevante.
0.8
Absorbancia
0.6
0.4 Logarítmica
0.2 (Absorbancia)
0
0 100 200 300 400 500 600
Concentración y Dilución
0.8
0.6
Series1
0.4
Lineal (Series1)
0.2
0
0 20 40 60 80
Concentración y Dilución
Con esta gráfica, se obtiene una tendencia lineal y congruente en la curva de calibración
de la penicilina comercial, contrastando estos resultados con las lecturas de absorbancia
realizadas al producto de la cromatografía de penicilina, que fue de 1.886, el resultado
nos otorga una concentración final de 143.64 mg/mL, y para el producto sobrenadante,
que fue de 1.795, el resultado fue una concentración final de 134.805 mg/mL.
Al comparar los resultados del grafico con varios análisis estadísticos en minitab, se
elucida que este método es de los más exactos para la determinación de un
comportamiento grafico útil para conocer concentraciones y constantes, cabe mencionar
que este tipo de datos resulto indispensable para la determinación de la concentración en
productos de penicilina obtenida por la fermentación, y como las concentraciones tuvieron
un rango de números aceptable, por ende se corrobora la eficiencia del método de
referencia para conocer la cantidad de producto elaborado. [3]
Elaboración de Antibiograma
Contaminación
Imagen 6: Antibiograma infectado por hongos ajenos al cultivado y halos de inhibición penicilina
sobrenadante a distintas concentraciones en cultivo salmonella
Contaminación
Considerando que cada antibiótico tiene un mecanismo de acción diferente, y cuenta con
diferentes regiones moleculares activas, que pueden reaccionar con una bacteria, se
usaron tres muestras distintas del mismo antibiótico, penicilina, aproximando las
concentraciones de las mismas, a las concentraciones que se encuentran de manera
comercial tanto en forma farmacéutica, como medicamentos.
Como podemos apreciar en las siguientes imágenes, hubo inhibición en todos los cultivos
donde se colocaron sensidiscos impregnados con las distintas penicilinas trabajadas en el
laboratorio, la mayor inhibición apreciada en las tres cepas fue de la penicilina comercial,
posteriormente el producto obtenido de la cromatografía y al ultimo la muestra
sobrenadante. Con los halos de inhibición obtenidos se corrobora la presencia y
producción de penicilina en la fermentación, y se aprecia que la excesiva biomasa
(imagen 2) contenida al fermentar el hongo, no afecto a la obtención del antibiótico, sino
de lo contrario produjo mayor cantidad del mismo. A pesar de haberse contaminado las
cepas de las imágenes 3 y 6, se observa una inhibición en el crecimiento de los hongos
enemigos desarrollados, corroborando con mayor certeza la obtención del antibiótico
puro, a tal magnitud de propagarse una combinación de hongos por invasiones de
espacio en el agar, que propagarse por el mismo, porque el antibiótico impedía
mencionada propagación, por consiguiente, la afectividad de los antibióticos ayudo a
inhibir una mayor contaminación en las cepas cultivadas en las cajas petri. [5-7,9]
67.4 mg/mL
33.7 mg/mL
Conclusión
Con base a los resultados obtenidos se concluye sobre la importancia de considerar los
factores necesarios para la preparación de un medio de cultivo enriquecido, adecuado a
un determinado microorganismo a desarrollar, ya que la fermentación de un metabolito
secundario en especifico, no solo es producto del tipo de biorreactor empleado para su
elaboración, sino de los factores microbiológicos adecuados al microorganismo
seleccionado para producirlo, tales como: reactivos, materiales, y condiciones
ambientales (esterilidad, pH y temperatura), ya que de ello depende el sano desarrollo del
hongo inoculado. Fundamentando que el medio de cultivo debe ser apropiado al
microorganismo de interés, y quedar exento de cualquier microorganismo contaminante,
esto se logra gracias a la añadidura de sales al medio de cultivo y la esterilización del
mismo, y la zona de trabajo, como cada uno de los materiales a emplear, durante la etapa
de inoculación.
La purificación del caldo de cultivo resulta esencial para la obtención del compuesto, se
necesita un antibiótico 100 % puro para poderse administrar por cualquier vía, por ende
su importancia, porque administrar una penicilina impura puede generar efectos
secundarios y adversos a la salud del consumidor, y como no se conoce a los otros
metabolitos secundarios producidos por el hongo Penicillium Chrysogenum, por lo tanto
se desconoce su acción y posibles efectos biológicos en el organismo.
Las Bacterias pueden tener diferentes métodos de resistencia a los antibióticos, esto
debido al uso descomunal que la industria farmacéutica ah dado a los mismos, en el área
de la salud, este es un tema de interés para la población civil, ya que se requieren de
nuevos fármacos capaces de inhibir un determinado crecimiento bacteriano por rutas
metabólicas alternas que no generen ningún tipo de resistencia. Para la realización de un
Por último se produjo penicilina pura a una concentración de 143.64 mg/mL, gracias a la
fermentación del hongo Penicillium chrysogenum en un biorreactor de tanque agitado
lamba, y un medio de cultivo enriquecido con precursores necesarios para inducir al
hongo a desarrollar un metabolismo secundario propicio a la excreción del antibiótico
deseado. Se sometió el producto empleando métodos que implican bioseparaciones,
procesos utilizados en la producción de antibióticos por la microbiología clínica.
Cuestionario Complementario
Referencias
[2] Melo Ruiz V. (2007). Bioquímica de los procesos metabólicos (2da Edición).
México. Editorial Reverte.
[3] Microbial Technology. Microbial Processes. Second Edition (Volume I). Ed. H.J.
Peppler and D. Perlman. Academic Press, N. Y., 1979.
Base de Calculo
Reactivo Cantidad (g) para Cantidad (g) para Cantidad (g) para
1000 mL 800 mL 200 mL
Glucosa 40 32 8
Sulfato de amonio 3 2.4 0.6
Extracto de 2 1.6 0.4
Levadura
KCl 0.5 0.4 0.1
MgSO4 0.5 0.4 0.1
FeCl3 0.5 0.4 0.1
y = 0.0103x + 0.4065
X = (y – 0.4065)/0.0103
La concentración total de penicilina comercial era de 800,000 UI que a mg/mL son 500
Por lo tanto tenemos una concentración de 500 mg/mL de penicilina comercial en ámpula
C1 = 500