UNIVERSIDAD NACIONAL

PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA N° 3:
DETERMINACIÓN DE BACTERIAS
VIABLES POR EL MÉTODO DE
REDUCCIÓN DEL COLORANTE

ALUMNO:
INGA LACHIRA, Carlos Raúl

DOCENTE:
Dra. Graciela Olga Albino Cornejo

ASIGNATURA:
Microbiología de Alimentos I

Lambayeque, mayo de 2018

 Microbiología de Alimentos I

PRÁCTICA N° 3
DTERMINACIÓN DE BACTERIAS VIABLES POR EL MÉTODO DE
REDUCCIÓN DEL COLORANTE
I. INTRODUCCIÓN
La calidad de la leche cruda se establece con base a parámetros higiénicos,
sanitarios y composicionales. La calidad higiénica resulta de especial
importancia, por tratarse del contenido microbiano que está presente en la
leche cruda, el cual se transfiere en buena medida a los productos que se
elaboran a partir de ella en la industria láctea y que inciden de manera
representativa en la vida útil tanto de la materia prima como del producto
terminado.
Existen grupos de microorganismos que son tomados como indicadores en la
Industria Láctea, pues su presencia permitirá comprobar el cumplimiento de
la aplicación de las buenas prácticas higiénicas. Entre los microorganismos
indicadores tenemos: Bacterias aeróbicas mesófilas, Coliformes totales y
fecales, Enterobacterias totales, Enterococos.
Las pruebas colorimétricas, son técnicas de análisis versátiles y
convencionales, que evidencian indirectamente la calidad higiénica de la leche
cruda y su capacidad de conservación, por medio de cambios en la tonalidad
de color. Su versatilidad radica en que se requieren equipos de laboratorio
y reactivos no muy cotosos, y se puede aplicar a gran número de
muestras.
En el procedimiento se utilizan patrones de azul de metileno y se observa el
proceso de reducción del colorante (de azul a blanco para el azul de Metileno).
El tiempo necesario para que se produzca la reducción del colorante está
relacionado con el número de microorganismos de la muestra.
Teniendo en cuenta que los métodos de reducción no funcionan eficazmente
en leches refrigeradas, se ha sugerido la sustitución de estas por otras técnicas
rápidas.
La prueba colorimétrica de Azul de Metileno y, indica la variación del
potencial de óxido-reducción en la leche por cambios en la tonalidad del
colorante en solución, dependiendo de la actividad reductora de los
microorganismos y de las sustancias reductoras presentes en la leche.
En la reducción de Azul de Metileno en solución, se conocen cuatro sistemas
de reducción:
 Un sistema bajo condiciones estrictamente anaeróbicas que es capaz de
reducir el azul de Metileno en la leche cruda.
 Un sistema también presente en la leche cruda el cual es capaz de reducir el
azul de Metileno anaeróbicamente en presencia de formaldehído.
 Un sistema de reducción presente en leche pasteurizada el cual es revelado
bajo condiciones anaerobias.
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 Un sistema de reducción formado por leche cruda y leche pasteurizada

anaeróbicamente en presencia de luz.

El azul de Metileno evalúa la cantidad aproximada de bacterias en la leche y,

por tanto, la capacidad de conservación. El mecanismo del azul de Metileno
para valorar la calidad microbiológica está relacionado con la actividad
reductora de las bacterias que en el proceso de respiración eliminan el oxígeno
disuelto en la leche y el colorante se reduce hasta que se elimina totalmente.
Cuando no implica un cambio de oxígeno en la reducción, dos átomos de
Hidrógeno están involucrados en la reacción. Es importante identificar el
origen del Hidrógeno y qué sustancias lo forman para descartar que los
sistemas de reducción no estén influenciados por bacterias
II. OBJETIVO
 Determinar la calidad y el estado de la muestra de leche utilizando el
método de Reducción de Colorantes.
 Hacer uso de un método indirecto, para determinar el número de
microorganismos viables que afecten la calidad de la leche.

III. MATERIALES
3.1. Muestra Biológica:
 Leche
3.2. Material de Laboratorio:
 Pipeta graduada de 10 mL.
 Pipeta graduada de 1 mL
 Tubo de dilución con tapa rosca
 Gradillas
 Termómetro
 Baño de agua a 37° C
 Reloj
 Azul de Metileno estandarizada.

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Verificar el baño de agua, debe tener una temperatura de 37°C.

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4.2. Homogenizar la muestra, mínimo 20 veces.

4.3. Colocar 10 mL de leche en el tubo de dilución con tapa rosca.

4.4. Colocar 1 mL de Azul de Metileno, mezclando el contenido, invirtiendo

dos veces.

4.5. Colocar en una gradilla, llevando al baño de agua teniendo en cuenta que
el agua cubra el contenido del tubo. También se coloca un tubo de control
negativo (10 mL de leche hervida + 1 mL de colorante) y un tubo control
positivo (10 mL de leche hervida).

4.6. Controlar durante 4 horas cada 30 minutos, invirtiendo el tubo si no está

decolorado.
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4.7. Para reportar los resultados de la prueba se va a tener en cuenta el

tiempo que tarda en reducirse, así tendremos:
Calidad Clase Tiempo en reducirse
Muy Buena A > 4 horas
Buena B 3 – 4 horas
Regular o Aceptable C > 30 minutos - < 3 horas
Inaceptable D < 30 minutos

V. RESULTADOS
En la práctica la muestra de leche analizada se mostró reducida
(decolorada) a los 30 minutos de incubación, lo cual indica que se
trata de una leche tiene Inaceptable o de muy mala calidad, de
clase “D”.
En el proceso de reducción se observó cambios de color Azul a
Blanco, el cual se expresa en el tiempo transcurrido desde el inicio
hasta su decoloración completa decoloración.

VI. CONCLUSIONES
 Se realizó de forma correcta el método indirecto de determinación de
microorganismos viables por el método de reducción del colorante.
 La muestra analizada resultó tener una calidad inaceptable, ya que la
reducción del Azul de Metileno ya se observaba a los 30 minutos, obteniéndose
un viraje de azul (estado oxidado) a blanco (estado reducido), siendo una leche de
clase D.

VII. CUESTIONARIO
7.1. ¿Qué otros colorantes se pueden utilizar para la determinación de
microorganismos viables a parte del usado en clase?
Además del Azul del metileno, otros colorantes que se usan para
determinar microorganismos viables son: la Resazurina, un colorante
derivado de la oxacina que es usada también en la industria azucarera; y
el Trifenilfetrazolium.

7.2. ¿Para qué otras muestras líquidas podemos usar el método de reducción
del colorante?
También puede ser usado para otros alimentos como por ejemplo jugos de
frutas y variedades, en los que se encuentran los jugos de soya, piña y
otros, sobre todo alimentos líquidos en los que también se podría observar
el viraje de color del azul de metileno u otro colorante a usar.
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7.3. ¿A qué número de microorganismos equivale el calificativo que le

hemos dado a las muestras?

TIEMPO N° DE M.O/mL
> 4 horas < 500.000
3 – 4 horas 0.5 – 4 millones
> 30´ - <3 horas 4 – 20 millones
< 30´ 20 – 30 millones

De acuerdo a la tabla el número de microorganismos en la muestra

estudiada estaría entre 20 - 30 millones /mL.

7.4. Fórmula del Azul de Metileno cuando está oxidado y reducido.

VIII. REFERENCIAS

Dávila, N. y Hernández, J. E. (2006). Métodos de ensayos rápidos de detección de

microorganismos en la leche. REDVET. Revista Electrónica de Veterinaria,
VII (7), 1-18.
MacFaddin, J. F. (2004). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3a ed. Buenos Aires, Argentina: Editorial Médica
Panamericana.
Zambrano, J. J. y Grass, J. F. (2008). Valoración de la calidad higiénica de la leche
cruda en la asociación de productores de leche de Sotará – Asproleso,
mediante las pruebas indirectas de Resazurina y Azul de Metileno. Facultad
de Ciencias Agropecuarias, 6 (2), 56 – 66. Recuperado de
http://www.scielo.org.co/pdf/bsaa/v6n2/v6n2a08