IDENTIFICACIÓN Y COLONIZACIÓN NATURAL DE HONGOS

MICORRÍZICOS ARBUSCULARES EN NOGAL 2009.

Metodologías:
1. tinción de raicillas para identificar la presencia de hongos
micorrízicos arbusculares (HMA).

1.1. técnica de clareo y tinción propuesta por Phillips y Hayman

(1970). (Modificada para raíces leñosas).

1) se separaron las muestras por tratamientos y repeticiones

2) las raíces se lavaron con agua sobre un tamiz de tamaño tal que no dejara
pasar las raíces, para eliminar todo el suelo adherido

3) se seleccionaron las raicillas pequeñas

4) se colocaron en tela-gasa, envolviéndolas para evitar su dispersión

5) la tela-gasa con la muestra se introdujo en una bolsa pequeña de malla

sombra Esterilizable

6) la bolsa se marcó para identificar la Muestra

7) se colocaron en un vaso de precipitados al que se agregó KOH al 10%, en

cantidad suficiente para cubrirlas durante 24 horas, repitiendo este paso cinco
veces. En cada cambio de KOH se enjuagó con agua destilada

8) las raíces se cubrieron nuevamente con la solución de KOH al 10% y se

expusieron a calor húmedo en la autoclave (10 min/4.5 kg de presión) para el
clareo de las raíces, fueron necesarios cinco clareos para eliminar los pigmentos.
Después de cada exposición en la autoclave el KOH se eliminó y las raíces se
enjuagaron con agua destilada

9) las raíces se cubrieron con H2O2 al 10% y se dejó por 30 min; 10) se retiró el

H2O2 y se enjuagó inmediatamente con agua destilada, con el fin de remover

todos los residuos de H2O2; 11) se agregó HCl al 10% por 15 min para acidificar
el medio;
12) se retiró el ácido y sin enjuagar se adicionó el colorante azul tripano en
lactoglicerol

13) se sometió a calor húmedo en la autoclave por 15min/4.5 kg de presión

(tinción)

14) finalmente, se dejó enfriar y se procedió a hacer los montajes de raicillas en

portaobjetos para su observación al microscopio.

Las raíces clareadas y teñidas se colocaron en cajas Petri con suficiente

lactoglicerol. En un portaobjetos y utilizando agujas de disección se colocaron 20
segmentos de aproximadamente 1 cm de largo, paralelamente unos a otros.
Sobre las raíces se adicionaron gotas de lactoglicerol, colocando posteriormente
el cubreobjetos. Se eliminaron las burbujas de aire y cada laminilla se selló con
esmalte transparente.

evaluación de las estructuras morfológicas características de la micorriza

arbuscular

se realizaron observaciones en el microscopio óptico a través del

objetivo seco débil y seco fuerte; método empleado por Phillips y Hayman (1970).
Para ello se efectuaron tres pasajes equidistantes por laminilla. Al revisar un
campo óptico donde se encontraba un segmento que contenía hifas, vesículas o
arbúsculos, independientemente de la intensidad de micorrización, se le otorgó
el valor de uno para la evaluación total y por estructuras.

2. Identificación de Hongos Micorrízicos Arbusculares

2.1. La técnica de tamizado y decantación propuesta por
Gerdemann y Nicolson (1963)

Solo se usa con la finalidad de obtener e identificar los hongos

micorrízicos arbusculares asociados a la raíz de nogal:

1) se hizo una suspensión con 100 g de suelo en dos litros de agua

2) la suspensión se agitó mecánicamente durante cinco minutos y se dejó
reposar por tres minutos, para eliminar partículas grandes sedimentación
3) la suspensión se pasó por tamices de 500 y 44 micras, lavando con agua
abundante
4) se le agregó agua al decantado y se repitieron dos veces más los pasos
anteriores
5) posteriormente, el tamizado obtenido de la malla de 44 micras que contiene
las esporas se colocó en una caja Petri para su observación en el microscopio
estereoscópico
6) la identificación taxonómica de las morfoespecies de HMA se realizó en un
microscopio compuesto con contraste de fases, de acuerdo con la forma,
tamaño, color de las esporas, además de la forma y acoplamiento de la hifa de
sostén, tomando como base el manual de identificación de Schenk y Pérez
(1990).

1. Muestreo de suelo
2.2. Muestreo de suelo para caracterización

Se tomó una muestra de 1 kg de suelo aproximadamente por cada

árbol identificado. La muestra fue tomada con un tubo muestreador de impacto
de acero inoxidable a una distancia aproximada de 1 m del pie de cada árbol en
forma de cruz (4 submuestras por cada árbol). La muestra tomada fue de la
primera capa arable del suelo (20 cm de profundidad). Las muestras fueron
colectadas en bolsas de polietileno previamente codificadas, posteriormente
almacenadas en cajas térmicas para su transporte al laboratorio de suelos.

2.3. Muestreo de suelo y raíces para la extracción de hongos

micorrizícos

Se tomaron muestras de suelo rizosférico, siguiendo el

procedimiento similar mencionado anteriormente (3.1). De los puntos
muestreados para suelo se extrajo raíces de cacao nativo con la finalidad
determinar el porcentaje de esporulación y colonización de hongos micorrizícos.

3. Esporas de HMA en suelo

Se contó el número de esporas colectadas en el suelo de la
prolongación de copa de las plantas en cada una de las zonas en cada uno de
los departamentos. Se usó el método de decantación en húmedo mediante
tamices (Gerdemann and Nicolson 1963, Sieverding 1983) modificado, que se
detalla a continuación:
 3.1. Procedimiento (Conteo de esporas en el suelo)

- Pesar 10 g del suelo colectado, en el estado que se

encuentre, tratando de que sea lo más representativo posible. Obtener 3 sub
muestras a partir de cada muestra. Secar lo pesado
- Pesar los 10 g de suelo para obtener la cantidad de suelo
real. Moler el suelo lo máximo posible.
- Verter el suelo molido en un litro de agua. Mezclar la
solución. Esperar 15 segundos para que las partículas más pesadas sedimenten.
Rápidamente vaciar el contenido en un combinado de tamices de 45 μm y 425
μm (el de mayor medida primero luego el otro).
- Vaciar el contenido restante en un tubo para centrifuga hasta
llegar a los 30 ml como máximo. Agregar una solución azucarada previamente
preparada con (50 % de concentración de azúcar) hasta llegar a los 50 ml.
Colocar los tubos en la centrifuga a 2000 rpm por 1 min.
- Retirar los tubos y tamizar (con tamiz de 45 μm). Lavar para
limpiar el azúcar sobrante. Vaciar el contenido en tubos tratando de no llenarlos
con más de 20 ml.
- Homogenizar la solución con las esporas de micorrizas y
tomar 1 ml. Verterlo en una placa Petri cuadriculada. Hacer lo mismo hasta lograr
3 ml en la placa
- Contar esporas totales de micorrizas arbusculares con un
contador hacer este procedimiento dos a tres veces.

Tinción de raíces para observar la colonización micorrízica

La colonización de las células corticales de la raíz por HMA, no altera la morfología
de la raíz, en contraste con las asociaciones ectomicorrízicas. Por lo tanto, para
detectar y medir la colonización micorrízica, las raíces son sometidas a un
procedimiento de clareo y tinción. El método más ampliamente utilizado es el
descrito por Philips y Hayman (1970). Kormanik y McGraw (1982) eliminan el fenol
en las soluciones para tinción y decoloración, mientras que Koske y Gemma (1989)
modificaron el procedimiento mediante la eliminación de ácido láctico de estas
soluciones sin interferir con la intensidad de la tinción. Teniendo en cuenta el costo
de los productos químicos y el ahorro al reducir el número de productos químicos
sin interferir con la calidad de la tinción, se propone para la tinción de raíces el
método de Philips y Hayman (1970) modificado por Koske y Gemma (1989).

Materiales necesarios

• solución de KOH al 10% (hidróxido de potasio)

• solución de HCl al 1% (ácido clorhídrico)
• solución acidificada de glicerol, (500 ml de glicerol, 450 ml de H2O, 50 ml de
de HCl al 1%)
• azul de tripano 0.05 % en solución de glicerol (0,5 g/l)
• H2O2 alcalinizada (3 ml NH4OH al 20%, 30 ml de H2O2 al 3%, 567ml de
agua).

Procedimiento

1. Lavar las raíces para eliminar residuos de suelo y enjuagar con varios
cambios de agua.
2. Sumergir las raíces en KOH a 90°C por una hora o a 120°C por 15 minutos
en autoclave.
3. Eliminar el KOH y enjuagar las raíces con agua (dos o tres veces) para quitar
el exceso de KOH.
4. Si las raíces están demasiado pigmentadas se deben sumergir en agua
oxigenada alcalinizada durante 10-30 minutos. Enjuagar nuevamente las raíces
con agua.
5. Sumerja las raíces en HCL al 1% por cinco minutos.
6. Elimine el HCl. No enjuague las raíces en este paso ya que éstas deben
estar acidificadas para una tinción adecuada.
7. Tiña las raíces en una solución de glicerol ácido con azul de tripano a 90°C
por una hora o a 120 °C por cinco minutos.
8. Descargue la solución colorante y mantenga las raíces en glicerol acidificado
(sin azul de tripano) o agua a temperatura ambiente o 4°C.

Comentarios: si lo desea, la solución de glicerol acidificada puede ser

reemplazada por una solución de lactoglicerol (20 ml de ácido láctico, 40ml de
glicerol y 40 ml de agua destilada). El paso 4 puede ser omitido si las raíces no
están muy pigmentadas; la solución de agua oxigenada alcalinizada debe de
prepararse justo antes de su uso. Para almacenar por un tiempo largo, las
raíces pueden guardarse en agua adicionada con unas gotas de azida de sodio
al 0.01%.

Para los pasos 2 y 7, un baño de agua a 90°C es apropiado para mantener las
muestras.

Medición de la colonización micorrízica

La determinación de la colonización micorrízica de la raíz, se realiza con
frecuencia en raíces colectadas de campo (sacadas directamente del suelo o
de plantas individuales) o en plantas experimentales, crecidas bajo condiciones
del invernadero.

Esta medida estima el crecimiento de un aislamiento de un hongo o de una

comunidad fúngica dentro de la corteza de la raíz. El método de intersección de
cuadrante (Giovannetti y Mosse, 1980) que se presenta a continuación, es usado
comúnmente para medir la longitud de la raíz y el porcentaje de la colonización
micorrízica.

Material necesario

• Cajas de Petri cuadriculadas en la base con cuadrados de 1.1 x 1.1 cm.

• Agujas de disección.

Procedimiento
1. En una caja de Petri extienda al azar las raíces teñidas.
2. Bajo el microscopio de disección explore las líneas horizontales y verticales
de la cuadrícula.
3. Registre:
a) el número total de intersecciones de las raíces y las líneas de la cuadricula
b) el número de intersecciones con raíces micorrizadas.
4. Calcule el porcentaje de colonización micorrízica (% CM) utilizando la
siguiente fórmula:
% CM = (Número total de intersecciones con raíces micorrizadas/ Número total
de intersecciones entre la raíz y las líneas de la cuadrícula) X 100.

Comentarios: los datos obtenidos en el paso 3, también se pueden utilizar para

determinar las longitudes tanto de la raíz completa como de la raíz micorrizada.
Si toda la raíz se extiende en la caja de Petri, con las líneas de la cuadricula
separadas en 1.1 cm, el número total de raíces que interceptan las líneas de la
cuadricula, representan la longitud total de la raíz en cm. Por lo tanto, el total de
la longitud de la raíz micorrizada será el número de intersecciones, con
estructuras micorrízicas. Si se toma una muestra pequeña de toda la raíz, se
teñirá y se medirá en el microscopio con este método. Es posible calcular la
longitud total de la raíz y la longitud de la raíz micorrizada de la planta completa,
usando la relación entre el peso seco de la planta y la submuestra. Para más
detalles ver http://invam.caf.wvu.edu/methods/mycorrhizae/rootlengths.htm.

Figura 7.1 Caja Petri con raíces teñidas para marcar la micorrización distribuida
uniformemente por el método de intersección de línea.

Nota. En el diagrama las infecciones de micorrizas son representadas con

puntos negros.

Figura 7.1 provee una ilustración del método de intersección de línea. Ejemplo,
después de expander las raíces, el numero de intersecciones entre una raíz y
las líneas horizontales y verticales tendríamos:
• 25 intersecciones (Línea horizontal)
• 18 intersecciones (Línea vertical) y
• 12 intersecciones (Puntos negros) presentando colonización micorrízica.
• Por lo tanto, el largo de la raíz = 43 cm (25 + 18) y el largo de la raíz
micorrizada=12 cm
(Seis intersecciones positivas sobre líneas horizontales y seis intersecciones
positivas sobre líneas verticales).
• El porcentaje de colonización micorrízica= (12/43) x 100=27.9%.
4.4.2. Colonización de raíces en plantas
Se evaluó el porcentaje de colonización micorrízica en raíces de cada genotipo.
Se usó el método con tinta y vinagre (Vierheilig et al., 1998) modificado.

Procedimiento (colonización de micorrizas en raíces)

- Colectar raíces de cacao (raicillas). Introducir raicillas en tubos de prueba.
Agregar KOH (hidróxido de potasio, al 10 %) hasta cubrir la muestra.

- Esperar 24 horas. Eliminar KOH de tubos. Agregar KOH nuevamente hasta

cubrir la muestra. Dejar que la muestra se aclare.

- Colocar en baño maría a 90 °C por 60 minutos. Eliminar el KOH de tubos.

Agregar HCl al 1 % por 2 – 3 minutos. Eliminar HCl al 1%.

- Agregar tinta Pelikan® (azul o negra) en una solución de vinagre blanco al 5 %.

Calentar en baño maría a 90 °C por 60 minutos. Eliminar el excedente de tinta
en el tubo de ensayo. Lavar las raíces de dos a tres veces con agua destilada.

- Luego verter las raicillas ya teñidas en una placa Petri cuadriculada.

Distribuirlas homogéneamente por la placa y contar las intersecciones que tienen
micorrizas entre las totales.

5.4.7. Porcentaje de infección

Para determinar el porcentaje de infección de las raíces, se utilizó raíces de un
centímetro. de longitud aproximadamente, se depositaron en un frasco boca
ancha estéril, se lavaron varias veces con agua para remover el suelo adherido
a las raíces mismas y se procedió a su respectiva tinción, utilizando la técnica
propuesta por Sieverding, (1984). Esta técnica consiste en añadir las raíces en
vasos de precipitación cubiertos con KOH al 10%, permaneciendo dentro de esta
solución en la autoclave por 10 minutos, al cabo de los cuales se procede a
decantar el contenido del vaso y lavar las raíces con agua corriente. Luego se
agrega HCl al 10% hasta cubrirlas y de nuevo se procede a dejarlas a
temperatura ambiente por otros 10 minutos, hasta que tomen un color
blanquecino. Se decanta y se lavan con agua corriente, se tiñen con azul de
anilina o azul de tripano (0.05% en ácido láctico), para permanecer por espacio
de 10 minutos en la autoclave.
Finalizada esta última fase se decanta el azul de tripano, se recupera para su
reutilización y se conservan las raíces en glicerina. Las raíces coloreadas por
esta técnica, en un número de 10 a 15, se colocaron paralelamente sobre
láminas, se taparon con un cubreobjetos y se observaron al microscopio en
objetivo de 10X y 40X, realizando el conteo en 100 campos ordenadamente. En
cada campo se observó y se contó el número de campos negativos y positivos.
Cuando el campo de positivo se determinó el tipo de estructura presente como
arbúsculos, vesículas, hifas y esporas. Para determinar el porcentaje de
colonización de cada muestra, se utilizó la siguiente formula, propuesta por
Sieverding, (1984):