UNIVERSIDAD NACIONAL DE

FRONTERA
DE
SULLANA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE
INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

“PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y COLORACIÓN COMPUESTA O

DIFERENCIAL DE FROTIS”

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

AUTORES:
ALBÁN MENDOZA, INGRID ABIGAIL
FLORES MENDOZA, LESLY CAROLINA
GUTIERRES BAILON, ROSA ELISABETH
YACILA SILVA, KEVIN ERASMO

CÁTEDRA:
MICROBIOLOGÍA GENERAL/ MICROBIOLOGÍA DE
LOS ALIMENTOS

SULLANA - PERÚ
2018
 I. RESUMEN

Esta práctica se enfocó en la preparación de muestra para la coloración compuesta o

diferencial del frotis, para ello hicimos uso de portaobjetos, cubreobjetos y cultivos de
microorganismos y tintes los cuales nos permitieron la realización de la práctica, como
resultado aprendimos la técnica correcta de fijación de muestras, y tinción compuesta.

II. INTRODUCCIÓN:
La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir
entre varios tipos de células bacterianas. Una tinción diferencial típicamente consiste
de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a
todas las células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el
colorante solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el
cual tiñe las células recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las células que aún
retienen el colorante primario. La tinción propuesta por el médico danés Christian
Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología,
que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram
negativas. La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano
que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias.

Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su
vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. El ácido teicoico reacciona con el cristal
violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un complejo de las moléculas
cristal violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared celular de
las células Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil decolorar una
célula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el
cristal violeta de la célula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de
alcohol también disuelve mucho de la capa exterior de lipopolosacárido de la pared
celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remoción del colorante primario
cristal violeta de estas células. Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade,
las células Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram
negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de
tinción, las células Gram positivas serán del color del cristal violeta, o colorante
primario, y las células Gram negativas serán del color de la safranina que es el
colorante de contraste

III. OBJETIVO
1. General
 Dominar las técnicas de tinción de Gram
2. Específicos
 Preparar correctamente un frotis microbiológico.
 Aplicar las técnicas de coloración o tinción de Gram.
 Diferenciar una bacteria Gram+ y Gram-.
  Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la
caracterización e identificación de las bacterias

IV. FUNDAMENTO TEÓRICO

4.1.Bases Teóricas
4.1.1. Tinción: Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se
adsorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de
las células de los microorganismos y poder realizar la observación en
microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan
contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden
observarse claramente sin algún tratamiento previo.
De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
a) Tinción simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la
morfología celular.
b) Tinción diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto
diferencias entre células bacterianas o entre partes de una misma
célula. Estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos
reactivos complementarios para la tinción.

4.1.2. Colorantes: Los colorantes más utilizados: azul de metileno, cristal

violeta, safranina, son catiónicos y se combinan fuertemente con
componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos
y los polisacaridos ácidos (las envueltas externas de los microorganismos
están por lo general cargadas negativamente).
 Tinción diferencial de Gram: Esta tinción se denominada así por el
bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre
la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, Gram positivas y gramnegativos (en este caso,
los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga
eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos
de bacterias).
Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el
Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con
agua, se cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de
nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir
y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar y
secar. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma
distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su
tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica.
El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste
 en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de
ácido teicoico.

Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es

peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado,
contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y
está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos,
lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la
célula gram-negativa es peptidoglicano.
4.2.Bases Conceptuales

 Microorganismo: Un microorganismo, también llamado microbio u

organismo microscópico, es un ser vivo que sólo puede visualizarse
con el microscopio.
 Frotis: Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un
portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más
posible los microorganismos.
 Colorante: Son compuestos orgánicos que tienen afinidad por algún
componente y sirve de contraste.
 Fijación: Proceso que impide la degeneración celular. Se pretende que
la célula o tejido se mantenga en el mismo estado que cuando fue
extraída la muestra.
 Portaobjetos: es una fina placa de cristal sobre el cual se disponen
objetos para su examen microscópico.
 Cubre Objetos: es una fina hoja de material transparente de planta
cuadrada. Se coloca sobre un objeto que va a ser observado bajo
microscopio, el cual se suele encontrar sobre un portaobjetos.
 Bacterias Gram positivas: son aquellas que se tiñen de azul oscuro o
violeta por la tinción de Gram. Las bacterias Gram positivas cuentan
con una envoltura celular que comprende la membrana citoplasmática y
una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano,
que rodea a la interior.
 Bacterias Gram negativas: Las bacterias gramnegativas son todas
aquellas que no se tiñen de azul oscuro o de violeta por la tinción de
Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: Es por eso el nombre
gramnegativas o también Gram-negativas. Esta característica está
íntimamente ligada a la estructura didérmica dada por la envoltura
celular, ya que presenta doble membrana celular (una es externa y la
otra citoplasmática) lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana.
V. METODOLOGÍA Y MATERIALES

5.1.Metodología

1) Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire.

2) Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el
proceso de tinción, pasando el portaobjeto 3 o 4 veces por la llama de un
mechero de Bunsen.
3) Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con
solución de Cristal Violeta por 1 minuto.
4) Pasando el minuto, lavar con agua destilada.
5) Cubrir el preparado con Lugol Gram por 1 minuto. Lavar nuevamente con
agua destilada.
6) Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con
unas gotas del decolorante: alcohol acetona hasta no arrastrar más colorante
violeta. Esto, requiere habitualmente unos 30 segundos o menos.
7) Lavar con agua destilada y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el
soporte. Cubrir la superficie con Safranina (contracolor), durante un minuto.
Lavar con agua.
8) Colocar el preparado en un soporte de tinción en posición vertical, dejando
que escurra el exceso de agua y que se seque el extendido.
9) Examinar el extendido al microscopio con objetivo de inmersión (100X).

Las bacterias Gram positivas se observan de color azul intenso o violeta. Las bacterias
Gram negativas se observaran de color rojo o rosado.

5.2.Materiales
5.2.1. Equipos:

1) Microscopio Óptico.
2) Mechero Bunsen.
3) Mecheros de Alcohol.

5.3. Materiales

1) Cubre y porta objeto.

2) Soporte de porta objetos para tinción.
3) Bandeja de vidrio de tinción.
4) Recipiente para desechos de reactivos.
5) Bolsas herméticas para desecho microbiológico.
6) Pipetas Pasteur
7) Goteros Asa de siembra
8) Vaso Beaker de 100 ml.
9) Pizeta.
10) Aguja de siembra
11) Estilete
12) Plumón de tinta indeleble de punta gruesa.
13) Hisopos (palitos de madera con algodón)
14) Bolsas para descarte de basura.
15) Fósforos.
16) Toalla o tela de secado (que no desprenda pelusas)
 17) Detergente.

5.4. Reactivos

1) Cristal violeta.
2) Lugol.
3) Alcohol Acetona.
4) Safranina o Fucsina de Gram
5) Agua Destilada.
6) Aceite de inmersión.
7) Alcohol 96°

5.5. Muestras Biológicas:

1) Cultivos bacterianos.
2) Microorganismos de la cavidad bucal.

VI. RESULTADOS

Foto 01: Muestra de cultivo Foto 02: Muestra de cultivo de Foto 03: Muestra de cultivo de
bucal. agua estancada. agua estancada.

Foto 04: Preparación de frotis de Foto 05: Fijación de las muestras Foto 06:Se cubre la muestra con
las muestras. con calor. cristal de violeta por un minuto.

Foto 07: Se lava la muestra
para quitar el exceso de
colorante.
Foto 08: Se cubre el preparado con Foto 09: Se cubre la
lugol, por un minuto. Luego se dejan
muestra con Safranina por
caer gotas de alcohol por 30
un minuto y luego se lava
segundos. con agua.

Foto 10: Se observan Foto 11:Se observan hifas de

diplobacilos y streptobacilos, hongos de la muestra bucal.
bacterias Gram positivas.

Foto 12:Microorganismo
encontrado en la muestra de
agua, teñido de rojo.
VII. ANÁLISIS Y DISCUSIONES
Esta práctica nos ha permitido identificar bacterias y clasificarlas según el grosor de su
pared celular en Gram positivas y Gram negativas, al preparar la muestra se ha puesto
en práctica las técnicas de frotis, fijación y tinción. Para la tinción hay que tener
mucho cuidado y cumplir los tiempos requeridos para la absorción del colorante, así
también la decoloración con el alcohol, cuidados que nos garantizaran una muestra
correcta, que nos otorgará un buen análisis.

VIII. CONCLUSIONES
 Con la tinción de Gram lo que estamos detectando es básicamente el tipo de
pared celular de la bacteria que estamos analizando en ese momento.
 El frotis nos permite separar las bacterias a observar y no obtener
aglomeraciones de estas y así observar bien su estructura.
 La tinción de Gram utiliza dos colorantes y un mordiente, el primer colorante
es el cristal de violeta, luego el mordiente que es el lugol y finalmente el
colorante de contraste que es la Safranina.
 Las bacterias Gram positivas se observan de color azul intenso o violeta. Las
bacterias Gram negativas se observaran de color rojo o rosado.

IX. CUESTIONARIO

1) ¿Cuáles son los errores que usted identificó durante la práctica, que pueden influir
en una buena tinción de Gram?
A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado
con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células
(cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglucano
y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo
muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan
como gram negativas. Otro aspecto a tener en cuenta es el tiempo que se debe
dejar actuar el colorante, ya que si es insuficiente no obtendremos buenos
resultados.

2) Estructuralmente ¿Qué fundamenta la tinción de Gram en bacterias?

Las bacterias gram negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con mayor
facilidad que las gram positivas. esto debido a que las Gram positivas poseen un
gruesa pared celular y retiene el colorante primario a diferenncia de las Gram
negativa.

3) ¿Qué importancia diagnóstica tiene la tinción de Gram?

La importancia de la coloración de Gram como herramienta diagnóstica en primera
instancia permite caracterizar tamaño, forma y/o agrupación bacteriana, la reacción
tintorial y el germen predominante en una infección o en muestras contaminadas
con biota normal. En esta coloración también es relevante considerar la presencia
de la respuesta leucocitaria o respuesta inflamatoria y otro tipo de células como las
epiteliales, con el fin de orientar la presencia de infección aguda o crónica y en
algunos casos evaluar la calidad de la muestra clínica como sucede con las
muestras de esputo.
4) ¿Se podría utilizar la tinción de Gram en levaduras?
En general la tinción de Gram no es aplicable a otros microorganismos como
protozoos y hongos, exceptuando a las levaduras que se tiñen como Gram
positivas.

5) ¿Esta tinción de Gram en levaduras tendrá la misma importancia diagnóstica que

para las bacterias?
No tiene tanta importancia como las bacterias ya que en ellas existe toda una clasificación
por medio del gram lo que no sucede con las levaduras.

6) ¿Cuál es el fundamento técnico de cada uno de los reactivos utilizados en la técnica

de coloración de Gram?
 Cristal Violeta: Colorante primario o básico, que se une a la pared celular
bacteriana. El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal
violeta o violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos
químicos empleados como indicadores de pH y colorantes.
 LUGOL: solución de yodo, utilizado como mordiente, el cual facilita la
adhesión del cristal violeta a la pared celular. También denominado
solución de yoduro de potasio yodado o Lugoln, la solución de Lugol está
formada por di - yodo (I2 ) y yoduro de potasio (KI ) diluido en agua.
Descubierta por el médico francés Jean Lugol, de donde proviene su
nombre, esta solución se utiliza en muchas circunstancias, sobre todo por
sus propiedades antisépticas y bactericidas.
 ALCOHOL: decolorante. El alcohol etílico (etanol) es una sustancia
incolora, inflamable y volátil. Hace parte de la familia del fenol
(alcoholes). Este además, esta presente en distintas bebidas alcoholicas
acompañado de otras sustancias químicas, además es utilizado como
desinfectante.
 SAFRANINA o FUCSINA DE GRAM: colorante secundario, que
imparte una coloración de contraste o contracolor (color rojo o rosado). La
safranina es un colorante catiónico que aporta color rojo a las estructuras
histológicas. Es muy usada en histología vegetal donde tiñe de rojo los
núcleos y la lignina de las paredes celulares secundarias. También se usa
en las tinciones Gram para bacterias.

7) Teniendo en cuenta la clasificación bacteriana por la tinción de Gram (Gram

positivos y Gram negativos) ¿Cuál grupo tiene mayor importancia desde el punto de
vista clínico alimentario?
Los bacilos Gram-negativos, catalasa-positivos, son los agentes más importantes
en el deterioro de los alimentos y al mismo tiempo los patógenos más relevante de
origen entérico transmitidos por alimentos. Las bacterias más peligrosas son las
gram negativas, estas se caracterizan por tener en su pared bacteriana un
componente altamente tóxico llamado lipopolisacárido (LPS), por formar parte de
las mismas bacterias se los llama endotoxinas y si es liberado al torrente sanguíneo
como ocurre durante los procesos de sepsis pueden iniciar una serie de procesos
que llevan al shock con caida abrupta de la presión sanguínea y falla
multiorgánica. Las bacterias gram positivas tambien pueden causar estos
fenómenos pero deben ser cepas productoras de toxinas como toxinas del
síndrome del shock tóxico de Stafilococus aureus.
8) ¿Qué medios selectivos y/o diferenciales se usan para el crecimiento y aislamiento de
bacterias Gram positivas y Gram negativas?
 Agar CCF (fructosa, cicloserina, cefoxitina): Medio utilizado para el
aislamiento selectivo de Clostridium difficile (bacteria Gram postiva)en
muestras de heces u otros materiales intestinales. Contiene rojo neutro
como indicador.
 Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos): Es un medio
diferencial recomendado para el análisis bacteriológico de orina ya que en
él crecen profusamente la gran mayoría de las bacterias, tanto Gram
negativas como Gram positivas, que provocan infecciones urinarias,
pudiéndose diferenciar o identificar sus respectivas colonias.
 Agar sulfito de bismuto: Medio para el aislamiento de Salmonella typhi.
El sulfato ferroso actúa como indicador en la producción de sulfhídrico. El
sulfito de bismuto y el verde brillante inhiben considerablemente el
crecimiento de bacterias contaminantes.

9) Desde el punto de vista alimentario ¿Qué importancia tiene clasificar un aislamiento

como Gram positivo o Gram negativo?
Es importante para el reconocimiento de su patogenicidad o utilidad para producir un
alimento.
10) Si usted se encuentra con un problema de diarrea, y al hacer el aislamiento de la
bacteria sospechosa del proceso infeccioso, se encuentra con que es una bacteria
Gram positiva ¿Tendría mejor pronóstico?. Justifique su respuesta
Si, debido a que existe una bacteria Gram positiva que causa esta enfermedad que son
Estafilococos, los acuales aparte de producir diarrea también producen vómitos.

11) Define los siguientes términos.

 COLORANTE: Sustancia soluble en agua, capaz de teñir y dar un nuevo
color a un tejido, alimento, etc; puede ser de origen natural o sintético.

 MORDIENTE: Sustancia química que sirve para fijar el color o el pan

(lámina muy fina de oro, plata, etc.) a una cosa.

 TINCIÓN DIFERENCIAL:Se usan para diferenciar de manera más

explícita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes
diferenciales, que se componen de más de una sustancia tintórea.

 TINCIÓN SIMPLE: es un proceso por el cual las moléculas de un

colorante se absorben a una superficie. El uso de colorantes permite
cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio.

 PÉPTIDO GLUCANO: El peptidoglicano o mureína constituye la

estructura básica de la pared celular de las bacterias y es ligeramente
diferente en bacterias Gram-Positivas y Gram-Negativas, aunque en ambas
está formado por los mismos componentes, una secuencia alternante de N-
acetil-glucosamina (NAG) y ácido acetil-murámico (NAM), unidos
mediante un enlace B-1,3.
  ÁCIDO TEICOICO: están cargados negativamente y por lo tanto
contribuyen a la carga negativa de la pared celular Gram-positiva.
También pueden proporcionar soporte estructural a la pared celular

 ESPACIO PERIPLASMICO: El periplasma es un espacio delimitado

por dos barreras permeables selectivas, es decir, membranas biológicas,
que son la membrana interna y la membrana externa de las bacterias
Gram-negativas. En sentido estricto, no hay espacio periplásmico en las
bacterias Gram-positivas, porque sólo hay una membrana biológica, la
membrana citoplasmática.

 PORINAS: son proteínas con estructura barril β formadas por láminas

β.Pertenecen a las proteínas integrales de membrana, que son las que se
ubican a través de una membrana celular y funcionan como poros a través
de los cuales las moléculas se pueden difundir.

 MEMBRANA CELULAR: Es la estructura fina que envuelve a la célula

y separa el contenido de la célula de su entorno. Es la encargada de
permitir o bloquear la entrada de sustancias en la célula. La membrana
consiste en una doble capa de lípidos que encierran las proteínas.

 LIPOPOLISACÁRIDO: es el mayor componente de la membrana

externa de las bacterias Gram negativas, desempeñan una importante
función en la activación del sistema inmune al constituir el antígeno
superficial más importante de este tipo de bacterias

12) Haz un diagrama de flujo sobre el proceso de la tinción de Gram, indicando la

función de cada sustancia empleada.

Tinción Gram

Gram Positivas Gram Negativas

Fijación
Sin color Fijación Sin color

Violeta Cristal de Violeta Violeta

Violeta Lugol Violeta

Decoloración Alcohol-
Violeta Acetona Sin color

Violeta Safranina Rosado

13) Haz un dibujo de las paredes celulares de una bacteria Gram positiva y una Gram
negativa señalando las principales estructuras en ellas.
X. WEBGRAFÍA
 Universidad Tecnológica Nacional.Argentina. (2009). Recuperado de:
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/pr
actico4.pdf
 Manual de Microbiología de los Alimentos. BACTERIAS. Recuperado de:
http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/2%20bacterias.pdf
 MICROBIOLOGÍA CLÍNICA MEDIOS DE CULTIVO. Recuperado de:
http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/medios-de-cultivo.pdf
 Técnicas de tinción. Fundamentos. . Recuperado de:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
 GLOSARIO de MICROBIOLOGÍA y PARASITOLOGÍA. UNAM. Recuperado de:
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/glosario.html