PROTOCOLO DE VALIDACION

NOMBRE DEL ESTABLECIMIENTO Protocolo

Protocolo de validación No. Validación de una valoración analítica

Título

Protocolo redactado por:

Aprobación departamental: Fecha:

Aprobación de GC por: Fecha:

Objetivo: Demostrar mediante un estudio de laboratorio que las características funcionales del ensayo de hierro total en agua tratada por el método de la
ortofenantrolina son adecuada para la aplicación analítia de rutina. Registrar la información y los datos necesarios para establecer las especificaciones de operatividad de la
valoración. Confirmar y documentar que el desarrollo del procedimiento analítico, para cuantificar hierro en aguas tratadas son confiables para los análisis rutinarios.

Alcance: Aplica a las aguas tratatadas que llegan al laboratorio producto de los porcesos para potabilizarla.
Responsabilidad: Los analistas químicos y/o técnicos de laboratorio son los directamente responsables de efectuar los estudios de validación, adicionalmente de
registrar, analisar y documentar la información correspondiente. El supervisor planificará el estudio, redactará el protocolo, supervisará la operatividad y comprobará la
integridad de los registros. Garantia de Calidad examinará y aprobará el protocolo de validación; examinará y aprobará los datos del informe de validación.
 MATERIALES, EQUIPOS Y DOCUMENTOS
Materiales, equipos, documentos: PON y formularios de registro de datos para la valoración sometida a prueba. Los materiales y el equipo que se describan en el
PON. Remisión a los documentos donde se compruebe que el equipo que va a usarse está validado y calibrado.

ESTÁNDARES, REACTIVOS, MATERIALES , EQUIPOS

Estandares Reactivos usados:

Nombre Reactivos Estado
Código
Número Control
Fecha Control
Fecha vencimiento
% Potencia
% Humedad
Incertidumbre

Instrumentación usada: Material de volumétrico usado:

Fecha
CODIGO EQUIPO MARCA MATERIAL VOLUMEN
calibración

Otros materiales
Material Uso especifico Observación
ERIALES, EQUIPOS Y DOCUMENTOS
egistro de datos para la valoración sometida a prueba. Los materiales y el equipo que se describan en el
l equipo que va a usarse está validado y calibrado.

Marca

Material de volumétrico usado:

Tolerancia
 INTRODUCCION
Validación de métodos analíticos
Hojas de los procedimientos y del cálculo
Este programa contiene instrucciones y las hojas del cálculo para la validación interna de métodos analíticos cuantitativos. En caso de una validación interna señale las
pruebas a realizar dependiendo del método. En los casos de métodos nuevos, desarrollados en el laboratotio y/o normalizados donde se ampli el alcance ó han sido
modificados, es recomemdable realizar una validación completa con todos los parámetros descritos. Existe otros métodos normalizados donde no es posible realizar una
validación total (ejemplo pH), en estos casos se fijan los siguientes par´metros para validar: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad (si hay laboratorios para
comparar).
Presione click en los botones para ir a la hoja de cálculo especifica

4. IDEONIDAD DEL SISTEMA ID

ID
5.1 SELECTIVIDAD SL
SL
5.2 SELECTIVIDAD (CONDICIONES EXTREMAS) SE
SE
6. LINEALIDAD (PATRON) LP
LP
7. LINEALIDAD (PATRON + MATRIZ) LPM
LPM
8. REPETIBILIDAD RP
RP
9. PRECISION INTERMEDIA PI
PI
10.1 EXACTITUD EX
EX
10.2 EXACTITUD ADICIÓN DE PATRÓN EX
EX
11. LIMITE DE DETECCION Y CUANTIFICACION LD LC
LD LC

12. ROBUSTEZ RB
RB

13. CONFIRMACIÓN DE RUTINA CR

CR

14. INCERTIDUMBRE IN
IN

15. CONCLUSION Y CERTIFICADO IN

IN
 IN
IN

El esquema abajo puede ayudarte a decidir que estudios son necesarios para la validación. Las 6 cajas azules contienen todos los diversos estudios de la validación
posibles cuando una validación completa es necesaria. (validación de un nuevo método desarrollado).

Método de desarrollo de una nueva validación

Estudio de exactitud
Estudio de exactitud
Parámetros mínimos para todos
Estudio de repetibilidad los métodos analíticos en el
Estudio de repetibilidad
laboratorio
Selectividad / especificidad
Selectividad / especificidad

Limite de detección y cuantificación

Limite de detección y cuantificación

Estudio rango de linealidad

Estudio rango de linealidad

Estudio de precisión intermedia

Estudio de precisión intermedia

Estudio de robustez (opcional)

Estudio de robustez (opcional)

ESPECIFICACIONES DEL MÉTODO A VALIDAR

MÉTODO REFERENCIA Modificaciones Límite especificación Unidad

Contenido de hierro total en agua ASTM N/A 0.3 ppm

MODIFICACIONES DEL MÉTODO A VALIDAR

 ENSAYO DE IDEONIDAD DEL SISTEMA
DEFINICIÓN: El test de ideoneidad del sistema (system suitability test) consiste en un conjunto de ensayos que permiten comprobar en el momento de utilización del
método, que el sistema, (analista, reactivos e instrumental) es adecuado para llevar a cabo la determinación para la que se ha establecido y validado dicho método. Por lo
tanto, el test de idoneidad del sistema se ha de entender como parte integrante del procedimiento de análisis y requisito previo a su realización. Aunque el ensayo de
ideonidad del sistema aparentemente solo aplica a métodos donde se involucre instrumentación; es adecuado en métodos gravimétricos y volumétricos para tener mejor
confiabilidad.
Para verificarlo continúe con los siguientes pasos:
a) Se realiza la preparación independiente de dos estándares de referencia (estándar de cuantificación y comprobación) se aplica el procedimiento analítico descrito.
b) Se mide la respuesta del estándar de cuantificación 5 veces y el estándar de comprobación dos (2) veces.
c) El coeficiente de variación (CV) del estándar de cuantificación debe ser menores al 1% en métodos instrumentales y se aceptan CV menores del 2.0% para métodos
volumétricos y gravimétricos
d) Se calcula la correlación entre los dos estándares y debe estar entre el 0.98 a 1.02.
e) Recolectar datos primarios y anexar a la validación.

Correlación de estándares Fecha : 15/May/2007

°T mínima: %HR mínima :

%HR máxima:
°T máxima:

ml Std1 2.90 ml Respuestas Std cuantificación Prom. Áreas Std1 (Presición) 0.3506
1 0.35100
2 0.35200 Coef. de Variación (Precisión) 0.7706 %
3 0.35400
4 0.34900
5 0.34700

ml Std2 3.10 ml Respuestas Std comprobación Prom. Áreas Std2 (Verificación) 0.3605
1 0.36000
2 0.36100 Correl. de Estándares 1.0396
 SELECTIVIDAD
Definición:
Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultánea o separadamente los analitos de interés, de forma inequivoca en presencia
de otras sustancias químicas que pueden estar presentes en la muestra. Frecuentemente el término especificidad se utiliza como sinónimo del
anterior, aunque debería reservarse para aquellas situaciones donde la respuesta obtenida solo se puede producir con una única entidad química,
algo que no es posible cuando se refiere a procedimientos analíticos que emplean instrumentación no específica. Como existen muy pocos métodos
que den respuesta a un único analito, el término selectividad es normalmente más apropiado.
La presencia de interferencia puede tener distintos efectos en la determinación del analito como: imposibilitar su inequivoca identificación (aparición
de falsos positivos), distorsionar la respuesta del analito (afectan normalmente la pendiente y la ordenada).
La selectividad de un método analítico se debería determinar antes de iniciar el estudio de cualquier otro parámetro, debe conocerse el grado de
respuesta del método proporcionada únicamente por el analito.

Procedimiento:
a) Para efectuar estudios de selectividad debemos realizar estudio bibliográfico de las interferencias posibles; en este punto es de vital importancia
la información que nos propociona métodos validados que aparezcan en libros oficiales (ASTM).
b) Realizar estudio experimental ó retrospectivo de las muestra a evaluar para verificar la existencia de interferencias de acuerdo a la literatura; la
exisencia de concentraciones altas de las interferncias de acuerdo al estudio experimental ó retrospectivo; conlleva a realizar un diseño experimental
para evaluar la incidencia de estas interferencias en la selectividad del método y verificar si es adecuado ó no para la matriz de interes.
c) Si con el estudio del punto anterior definimos la adecuación del método para la matriz de interes; realizamos replicas sextuplicadas con las
posibles calidades de agua para usar en el laboratorio.
d) Los coeficientes de variación de los sextuplicados debe de estar por debajo del 2.0%

e) Si alguna interferencia se evalua; se realizá el analisis seis veces adicionado la interferencia y sin adicionarla. Se observa el porcentaje de
discrepancia de a cuerdo a la formula: xxxxx y se concluye la incidencia de está sobre le resultado.
 Fecha :
Selectividad °T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:

V (mL) ó W (mg) 20.10 Blanco (H2OS / Al - Reac) V (mL) ó W (mg) 20.34 Blanco (H2OS / Al - Reac)
1 0.000 0.000 0.000 0.000 1
2 0.000 0.000 0.000 0.000 2
3 0.000 0.000 0.000 0.000 3
4 0.000 0.000 0.000 0.000 4
5 0.000 0.000 0.000 0.000 5
6 0.000 0.000 0.000 0.000 6
Promedio respuesta 0.000 0.000 0.000 0.000 Promedio respuesta #DIV/0! #DIV/0! ### ###
Desviación estándar 0.000 0.000 0.000 0.000 Desviación estándar #DIV/0! #DIV/0! ### ###

Coef. de variación ### ### ### 0.070 Coef. de variación #DIV/0! #DIV/0! ### 0.070

V (mL) ó W (mg) 20.34 Matriz sola (H2OS / Al + Reac) Promedio absorbancias 0.353
1 0.351 Desviación estándar 0.0014
2 0.354 Coef. de Variación 0.39 %
3 0.351
4 0.354
5 0.353
6 0.353

V (mL) ó W (mg) 20.34 Matriz + Fe + Al (0.3ppm y 0.2 ppm) Promedio absorbancia 0.347
1 0.349 Desviación estándar 0.0015
2 0.348 Coef. de Variación 0.42 %
3 0.347
4 0.346
5 0.345
6 0.346

% de discrepancia -1.65 %
Diferencia entre las medias ###
Error estándar combinado 0.0008
T studen (estadistico) 2.2281
Intervalo de confianza -0.0077 A -0.0040
 RANGO LINEAL DE TRABAJO
Para cualquier método analítico es necesario establecer su rango lineal de trabajo donde puede ser aplicado; de una manera general se trabaja alrededor de los límite de
especificación del analito que se quiere evaluar, no obstante se pueden definir rangos más amplios pero que incluya las especificacines del analito.
la gráfica siguiente ayuda a comprender la importancia de determinar este rango lineal; aunque existe otros métodos donde el comportamiento de la respuesta vs la
concentración del analito no es representación de una curva de primer orden (puede ser de primer , segundo ó tercer orden).

Rango de linealidad
Resultado

Concentración

En la practica es conveniente verificar la linealidad en el rango donde se espera la concentración de las muestras; tambien es muy util para diseñar una estrategia de calibración
de rutina al usar el método.
Procedimiento:
a) Se realiza curva de calibración de concentración vs respuesta del instrumento, usando cinco niveles de concentración del estándar de referencia certificado (cada nivel se
prepara por triplicado).
b) La curva se raliza alrededor de la concentración de especificación o las concentraciones que se trabajan de rutina (en la décima parte de la concentración de especificación y
el doble de la concentración de especificación).
c) Se halla la ecuación de la recta Y=mX + b.
d) Se tabulan los resultados y se grafican, se determinan lo coeficientes de correlación (r>0.999) y coeficientes de determinación (r2>0.998), adicionalmente.
e) t obtenido se compara con el t teórico para ensayos bilaterales (2 colas) con una probabilidad del 95% (p=0.05) para correlación lineal
f) Se verifica las varianzas en cada nivel de concentración para ver la incidencia de estos en los resultados, realizando un test de cochran (G), si Gexp< Gtab, las varianzas no
inciden sobre los resultados
Si tobt > ttab existe correlación lineal significativa
 Fecha : 15/May/2007
°T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:
Determinación de la linealidad (mínimo cuadrados). Analisis de varianzas
Dato X Y Xi-Xp (Xi-Xp) 2
Yi-Yp (Yi-Yp) 2 (Xi-Xp)(Yi-Yp) Factor (Y/X) Promedio S S2
1 120 0.212 -80.00000 6400.00000 -0.14107 0.01990 11.28533 0.00177
2 120 0.214 -80.00000 6400.00000 -0.13907 0.01934 11.12533 0.00178 0.002 0.000 0.00000
3 120 0.211 -80.00000 6400.00000 -0.14207 0.02018 11.36533 0.00176
4 160 0.282 -40.00000 1600.00000 -0.07107 0.00505 2.84267 0.00176
5 160 0.281 -40.00000 1600.00000 -0.07207 0.00519 2.88267 0.00176 0.002 0.000 0.00000
6 160 0.283 -40.00000 1600.00000 -0.07007 0.00491 2.80267 0.00177
7 200 0.35 0.00000 0.00000 -0.00307 0.00001 0.00000 0.00175
8 200 0.352 0.00000 0.00000 -0.00107 0.00000 0.00000 0.00176 0.002 0.000 0.00000
9 200 0.351 0.00000 0.00000 -0.00207 0.00000 0.00000 0.00176
10 240 0.422 40.00000 1600.00000 0.06893 0.00475 2.75733 0.00176
11 240 0.424 40.00000 1600.00000 0.07093 0.00503 2.83733 0.00177 0.002 0.000 0.00000
12 240 0.425 40.00000 1600.00000 0.07193 0.00517 2.87733 0.00177
13 280 0.495 80.00000 6400.00000 0.14193 0.02015 11.35467 0.00177
14 280 0.498 80.00000 6400.00000 0.14493 0.02101 11.59467 0.00178 0.002 0.000 0.00000
15 280 0.496 80.00000 6400.00000 0.14293 0.02043 11.43467 0.00177
Suma 3000.00000 5.29600 0.00000 48000.00000 0.00000 0.15113 85.16000
Gexp 0.54674
Promedio 200.00000 0.35307 0.00000 3200.00000 0.00000 0.01008 5.67733

b -0.0018 m 0.0018
r 0.9999 r2 0.9997 r=
 {(X – X) (Y – Y)}
i i

tr 219.14
(X – X) ] [(Y – Y) ]
i
2
i
2 1/2

Linealidad

0.6
r=

| r | n-2
ÁREA

0.5
f(x) = 0.0017741667x - 0.0017666667  - r2
0.4 R² = 0.9997293702

0.3
Volver
0.2   (X – X) (Y – Y)
i i
Volver
Intro
m= Intro
0.1

0
 (X – X) i
2

100 120 140 CONCENTRACION

160 180 200 % 220 240 260 280 300
 PRECISION / REPETIBILIDAD
Definiciones:
La precisión expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las
condiciones prescritas; la procedencia de las muestras destinadas al estudio de la precisión puede ser de muestras reales o preparadas en el laboratorio.
El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad o el más-menos del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo
método de ensayo. Como consecuentia de la existencia de estos errores los análisis efectuados sobre muestras idénticas en las mismas circunstancias no conducen
generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo,
instrumentarl, reactivos, tiempo,etc.) de aquí la importancia del estudio de la precisión.
La precisión engloba diferentes tipos de estudios:

La precisión de un método analítico se expresa generalmente como el coeficiente de variación (CV) de una serie de medidas y se calcula matemáticamente de la siguiente
manera:
CV (%) = (s/ x)*100; donde "s" = desviación estándar y " x " media aritmética de los resultados

Factores que inciden en estudio de precisión

Repetibilidad Precisión intermedia Reproducibilidad
Instrumento Igual Diferente Diferente
Día de análisis Igual Diferente Diferente
Analista Igual Diferente Diferente
Otros factores (ej: columnas cromatográficas, resctivos,
Igual Diferente Diferente
condiciones ambientales, etc.)
Laboratorio Igual Diferente Diferente
Procedimiento:
a) El ensayo de repetibilidad del método se efectúa sobre una serie de alicuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio
(preparación de muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analista.
b) Se realiza la prueba entre 7 a 10 veces
c) Esta muestra homogénea puede ser preparada en el laboratorio ó una muestra de planta.
d) Se halla los coeficientes de variación (CV); para la mayoría de ensayos instrumentales los CV <2.0%, para análisis de trazas ó límites se admiten CV < 5.0% ó más altos.
RECOLECCIÓN DE DATOS PARA VALIDACIÓN

Fecha : 15/May/2007
°T mínima: %HR mínima :
Repetibilidad °T máxima: %HR máxima:
Analista No.1

V ó W (teórico) 10.00000 Agua dest. Cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.3539

10.00000 1 0.352 0.35200 Desviación estándar 0.0029

10.00000 2 0.354 0.35400 Coef. de Variación 0.8064 %
10.00000 3 0.349 0.34900
10.00000 4 0.356 0.35600
10.00000 5 0.358 0.35800
10.00000 6 0.354 0.35400
10.00000 7 0.354 0.35400

Analista No.2
V ó W (teórico) 10.00000 Agua dest. Cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.3539
10.00000 1 0.352 0.35200 Desviación estándar 0.0029
10.00000 2 0.354 0.35400 Coef. de Variación 0.8064 %
10.00000 3 0.349 0.34900
10.00000 4 0.356 0.35600
10.00000 5 0.358 0.35800
10.00000 6 0.354 0.35400
10.00000 7 0.354 0.35400
 PRECISION INTERMEDIA
Definiciones:
Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos,
días, etc) y en un mismo laboratorio.
El objetivo del estudio de la precisión intermedia es determinar la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en un mismo
laboratorio pero en condicones operativas diferentes.

En el estudio de la precisión intermedia se deben considerar aquellas circunstancias en las que se pretende desarrollar el método de ensayo. El analista debe evaluar
los efectos usados al variar una serie de factores. Típicos factores a estudiar incluyen el día, el analista, el instrumento, etc. (ver tabla 1) no es necesario estudiar cada
uno de estos factores individualmente sino que es suficiente comprobar que la variabilidad aportada por el conjunto de factores está dentro de los límites establecidos.

Procedimiento:
El ensayo de precisión intermedia del método se efectúa sobre una serie de alicuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el
principio (preparación de muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analista.
Se realiza la prueba entre 3 veces cada analista participante por cada día de la prueba.
La muestra homogénea puede ser preparada en el laboratorio o una muesta de planta
Se halla los coeficientes de variación (CV); CVtotal < 2 CVrepetibilidad

Precisión intermedia Fecha : 15/May/2007

°T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:
Datos analistas:
V (mL) W (mg) 50 Respuestas matriz cargada Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.351
50 1 0.349 0.349 Desviación estándar 0.0027
1 50 2 0.352 0.352 Coef. de Variación total 0.78
50 3 0.354 0.354
50 4 0.353 0.353
Dia 1 2 50 5 0.348 0.348
50 6 0.347 0.347
50 4 0.355 0.355
3 50 5 0.352 0.352
50 6 0.351 0.351
50 1 0.354 0.354
1 50 2 0.351 0.351
50 3 0.350 0.350
50 4 0.352 0.352
Dia 2 2 50 5 0.354 0.354
50 6 0.356 0.356
50 4 0.352 0.352
3 50 5 0.348 0.348
50 6 0.347 0.347
Datos analista 1:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.352
50 1 0.349 0.349 Desviación estándar 0.0025
Dia 1 1 50 2 0.352 0.352 Coef. de Variación indi. 0.72
50 3 0.354 0.354
Datos analista 2:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.349
50 1 0.353 0.353 Desviación estándar 0.0032
Dia 1 2 50 2 0.348 0.348 Coef. de Variación indi. 0.92
50 3 0.347 0.347
Datos analista 3:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.353
50 1 0.355 0.355 Desviación estándar 0.0021
Dia 1 3 50 2 0.352 0.352 Coef. de Variación indi. 0.59
50 3 0.351 0.351
Datos analista 1:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.352
50 1 0.354 0.354 Desviación estándar 0.0021
Dia 2 1 50 2 0.351 0.351 Coef. de Variación indi. 0.59
50 3 0.35 0.350
Datos analista 2:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.354
50 1 0.352 0.352 Desviación estándar 0.0020
Dia 2 2 50 2 0.354 0.354 Coef. de Variación indi. 0.56
50 3 0.356 0.356
Datos analista 3:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.349
50 1 0.352 0.352 Desviación estándar 0.0026
Dia 2 3 50 2 0.348 0.348 Coef. de Variación indi. 0.76
50 3 0.347 0.347
 Precisión intermedia (cambio de instrumento)
Datos analista 1:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.345
50 1 0.346 0.346 Desviación estándar 0.0010
1 50 2 0.345 0.345 Coef. de Variación indi. 0.29
50 3 0.344 0.344
Datos analista 2:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.345
50 1 0.345 0.345 Desviación estándar 0.0006
2 50 2 0.344 0.344 Coef. de Variación indi. 0.17
50 3 0.345 0.345
Datos analista 3:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.346
50 1 0.346 0.346 Desviación estándar 0.0015
3 50 2 0.345 0.345 Coef. de Variación indi. 0.44
50 3 0.348 0.348
 EXACTITUD
Definición y generalidades:
La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor
experimental encontrado.
No deben confundirse exactitud con precisión. La precisión está relacionada con la dispersión de una serie de medicines, pero no da ninguna indicación de lo cerca que
está del valor verdadero. Se puede tener mediciones muy precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de
precisión.
La exactitud se expresa como porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de analito añadida sobre la muestra o como la diferencia entre la
media obtenida y el valor aceptado como verdadero junto a los intervalos de confianza

Porcentaje de recuperación ® = Xm / m * 100

Diferencia = Xm - m
Donde:
Xm = valor medio hallado
m= Valor aceptado como verdadero

Método de placebo cargado: Se prepara un placebo del problema que contiene todos los ingredientes excepto el analito a determinar. Sobre dicho placebo se añaden
cantidades conocidas de un analito patron a tres niveles de concentración dentro del rango a estudiar. El ensayo de recuperación se realiza como mínimo con 3 replicados
para cada nivel. El analito se determina en cada muestra utilizando el mismo método analítico a evaluar y se calcula la recuperación (Greeb, 1996 Carr. 1990, Mehta 1989).
El problema del método de placebo cargado está en como se introduce el analito sobre el placebo. El proceso de adición, por mucho que simule lo más exactamente
posible la preparación del producto acabado, solo se trata de una aproximación ya que en el producto acabado real el analito o principio activo está intimamente mezclado
con los otros ingredientes. Po lo tanto, la eficacia de la recuperación obtenida con el método del placebo cargado puede llegar a ser más elevada de lo que en realidad es.
Aún teniendo en cuenta este inconveniente.

Procedimiento:
a.) Se prepara placebo o matriz sin el analito
b.) Añadir cantidades exactas del analito en tres niveles de concentración del rango lineal, realizar triplicado en cada nivel.
c.) Se prepara para cada nivel de adición estándares por duplicado.
d.) Se halla los porcentajes de recuperación de las muestras adicionadas de acuerdo a la fórmula:
Porcentaje de recuperación ® = Xm / m * 100
Diferencia = Xm - m
Donde:
Xm = valor medio hallado
m= Valor aceptado como verdadero

e.) Los porcentajes de recuperación deben estar entre 98.0% y 102.0%, para análisis de trazas o límites se admiten recuperaciones entre el 95.0% y
105.0%.
f.) Se verifica las varianzas en cada nivel de concentración para ver la incidencia de estos en los resultados, realizando un test de cochran (G), si Gexp < Gtab, las
varianzas no inciden sobre los reultados.
g) Finalmente se aplica test t. (p = 0.05; gl =_ 3 - 1 = 2) = 4.303
 |100 - x | * n Al ser t exp < t tab no existe diferencia significativa entre la recuperación medida y el 100% por
t exp=
lo que la exactitud es correcta
CV
X = promedio de recuperaciones
n = número de niveles
CV= coeficiente de variación de recuperaciones

Fecha : 15/May/2007
°T mínima: %HR mínima :

A b s o rb a n c ia enc o nt ra d a
°T máxima: %HR máxima:
Cuadro 4. Determinación de la exactitud.
Dato X Y XY X2 Y2 %R
1 160 0.284 45.440 25600.000 0.081 0.18
0.45
2 160 0.285 45.600 25600.000 0.081 0.18 0.4 f(x) = 0.0016875x + 0.0136111111
3 160 0.28 44.800 25600.000 0.078 0.18 0.35 R² = 0.998999123

0.3
4 200 0.352 70.400 40000.000 0.124 0.18 0.25
5 200 0.351 70.200 40000.000 0.123 0.18 0.2
0.15
6 200 0.354 70.800 40000.000 0.125 0.18
0.1
7 240 0.418 100.320 57600.000 0.175 0.17 0.05
0
8 240 0.419 100.560 57600.000 0.176 0.17 150 160 170 180
Absorbancia 190 200
aceptada como210 220
verdadera% 230 240 250

9 240 0.417 100.080 57600.000 0.174 0.17

Suma 1800.000 3.160 648.200 369600.000 1.137 1.582 G tablas ( a =0.05;K=3;n = 3 ) = 0.8709
Promedio 200.000 0.351 0.176 Donde "k" el número de grupos y "n" el número de determinaciones por
grupo
s 0.002
CV 0.873
t exp 198.107

Analisis de varianzas (test de

Datos corregidos para exactitud por debajo de la concentración nóminal
cochran)
V (mL) ó W Resp.
(mg)
20.00 Respuestas
Correg.
Prom. Abs. std 0.035 %R Promedio S S2
160 1 0.284 0.036 Desviación estánd. 0.0001 0.18 0.177 0.002 0.000
Muestra 160 2 0.285 0.036 Coef. de Variación 0.35 0.18
160 3 0.28 0.035 0.18
160.00 1 0.282 0.035 0.18 0.176 0.001 0.000
Estándar 160.00 2 0.281 0.035 0.18
160.00 3 0.283 0.035 0.18
0.17 0.174 0.000 0.000
0.17
0.17

Gexp 0.783
 Datos corregidos para exactitud en la concentración nóminal
V (mL) ó W Resp.
25.00 Respuestas Prom. Abs. std 0.044
(mg) Correg.
200 1 0.352 0.044 Desviación estánd. 0.0001
Muestra 200 2 0.351 0.044 Coef. de Variación 0.28
200 3 0.354 0.044
200.00 1 0.35 0.044
Estándar 200.00 2 0.352 0.044
200.00 3 0.351 0.044

Datos corregidos para exactitud por encima de la concentración nóminal

V (mL) ó W Resp.
30.00 Respuestas Prom. Abs. std 0.053
(mg) Correg.
240 1 0.418 0.052 Desviación estánd. 0.0002
Muestra 240 2 0.419 0.052 Coef. de Variación 0.36
3 0.052 Volver
240 0.417 Volver
240.00 1 0.053 Intro
0.422 Intro
Estándar 240.00 2 0.424 0.053
240.00 3 0.425 0.053
 LIMITE DE DETECCCION Y CUANTIFICACION
Definición y generalidades:
Dado un método analítico determinado se entiende por límite de cuantificación (LC) de dicho método, la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar bajo las
condiciones experimentales descritas, con una adecuada precisión y exactitud; y por límite de detección (LD) la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar aunque no
necesariamente cuantificar bajo dichas condiciones experimentales (ICH, QZA)
El límite de cuantificación es por tanto un término cuantitativo mientras que el límite de detección es solo cuantitativo, encontrándose entre ambos términos un rango de concentraciones en el
que si bien o puede cuantificarse el analito en cuestión con razonable certeza, si puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos.
Existe gran variedad de métodos estadísticos para hallar el límite de detección y cuantificación; en el presente protocolo de validación aplicaremos el método de extrapolación de la recta
de calibrado a concentración cero ( 0 ).
Procedimiento:
a.) Se trabaja con la ecuación de la curva del rango lineal (Y = mX+b), y se hacen correcciones de los valores de Y.
b.) Se calcula los residuos al cuadrado (Yexp - Yc)2.
c.) Se calcula la desviación estándar del blanco S (x/y)
SX/Y = {[ ( Y - Y1)2]/ (n-2)}1/2
Y = Respuestas
Y1 = Respuesta corregida
n = # de datos
d.) Se calcula los límites de cuantificación y detección.
LD = YB + 3SX / Y
LC = YB + 10SX / Y

e.) Se preparan para calcular estos límites tres muestras a concentraciones que se suponen cercanas al LC y se analizan en las condiciones descritas en el método obteniendo la siguiente
tabla de resultados:
f.) De este pequeño estudio de linealidad a concentraciones bajas se deduce una nueva recta de calibrado que será la que se extrapole. ( Y= mX +b)
g.) Se calcula r, r2 y T estadísticos, adicionalmente el test de cochran
h.) Se prepara una nueva curva (Y = mx + b) de desviación estándar de las medidas (eje Y) vs las concentraciones (eje X).
i.) Esta ecuación nos proporciona un nuevo valor de la ordenada en el origen Sbl.
j.) Se calculan los nuevos límites de detección y cuantificación de acuerdo a la ecuaciones:

LD (K=3) CD = Ybl + (3*Sbl)

------------------------------
m* 3

Ybl + (10*Sbl)
LC (K=10) CD = ---------------------------
m* 3

Nota: Lo que se trata de probar es la linealidad en este rango y la probabilidad de tener límites de cuantificación y de detección más bajos; de igual forma la decisión final depende de las
exigencias del método que se está validando.
 Fecha : 15/May/2007

°T mínima: %HR mínima :

°T máxima: %HR máxima:

Ecuación de la recta de linealidad Curva en rango bajo LD y LC.

Dato X Y XY X2 Y2 (Y/X)*100
m= 0.00177 b= -0.00177 1 10 0.016 0.16000 100.00000 0.00026 0.160
2 10 0.015 0.15000 100.00000 0.00023 0.150
Dato Cnc "X" Área "Y" Y1=mX+b (Y-YI) (Y- Y1)2 3 10 0.014 0.14000 100.00000 0.00020 0.140
1 120.000 0.212 0.211 0.00087 0.0000008 4 12 0.019 0.22800 144.00000 0.00036 0.158
2 120.000 0.214 0.211 0.00287 0.0000082 5 12 0.022 0.26400 144.00000 0.00048 0.183
3 120.000 0.211 0.211 0.00013 0.0000000 6 12 0.021 0.25200 144.00000 0.00044 0.175
4 160.000 0.282 0.282 0.00010 0.0000000 7 15 0.025 0.37500 225.00000 0.00063 0.167
5 160.000 0.281 0.282 0.00110 0.0000012 8 15 0.026 0.39000 225.00000 0.00068 0.173
6 160.000 0.283 0.282 0.00090 0.0000008 9 15 0.027 0.40500 225.00000 0.00073 0.180
7 200.000 0.350 0.353 0.00307 0.0000094
8 200.000 0.352 0.353 0.00107 0.0000011
9 200.000 0.351 0.353 0.00207 0.0000043 Suma 111.00000 0.185 2.364 1407.000 0.004 1.487
10 240.000 0.422 0.424 0.00203 0.0000041
11 240.000 0.424 0.424 0.00003 0.0000000
12 240.000 0.425 0.424 0.00097 0.0000009
13 280.000 0.495 0.495 0.00000 0.0000000 Promedio 12.33333 0.021 0.16519
14 280.000 0.498 0.495 0.00300 0.0000090 s 0.01437
15 280.000 0.496 0.495 0.00100 0.0000010 CV 8.70063
Suma: 0.00004 m 0.00 b (Ybl) -6.2E-03
SX/Y: 0.00177 r 0.968397 r 2
0.93779
Límite de Detección 2.999279 mg/L tr 10.27
Límite de Cuantificación 9.997596 mg/L
 LC y LD
Linealidad

0.600 0.03

ÁREA
Àrea

0.500 0.025
f(x) = 0.0017741667x - 0.0017666667 f(x) = 0.0021666667x - 0.0061666667
0.400 0.02 R² = 0.9377920561
R² = 0.9997293702
0.300 0.015
0.200 0.01
0.100 0.005
0.000 0
100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 9 10 11 CONCENTRACION
12 13 % 14 15 16
Concentración (%)

Dato X Y Ym S LC y LD
1 0.016 2.00E-03

2 10.00000 0.015 0.015 1.00E-03 1.50E-03

3 0.014

S
1.00E-03 f(x) = - 1.38822429382093E-05x + 0.0013470561
4 0.019 R² = 0.0131578947
5 12.00000 0.022 0.021 1.53E-03 5.00E-04
6 0.021
0.00E+00
7 0.025
9.00000 10.00000 CONCENTRACION
11.00000 12.00000 BAJA
13.00000 14.00000 15.00000 16.00000
8 15.00000 0.026 0.026 1.00E-03
9 0.027

Volver
Volver
Ybl = -6.17E-03 LD = (Ybl + (3 x Sbl)) / (m x (3)1/2) -1.084927 Intro
Intro
Sbl = 0.0007 LC = (Ybl + (10 x Sbl)) / (m x (3) 1/2) 0.222321
 Robustez
La guía ICH, Q2A define la robustez de un método analítico como la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en ciertos parámetros, proporcionando

idea de su fiabilidad o "estabilidad" durante su empleo en rutina. es por tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para proporcionar resultados válidos en presencia de pequeños cambios

respecto de las condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durante su utilización.

La robustez (Robustness) no debe confundirse con el término Ruggedness que es el grado de reproducibilidad de los resultados mediante el análisis de las mismas muestras bajo una variedad de condiciones
tales como diferentes laboratorios, diferentes analistas, diferentes instrumentos, lotes de reactivos, días, tiempos, diferentes, temperaturas, etc.; es decir se sigue el método analítico dentro de los parámetros
especializados en él, pero introduciendo las condiciones experimentales las variaciones habituales de laboratorio a laboratorio. Da una idea de la influencia que tienen las variables ambientales y operacionales
del método en los resultados, por lo que podría asimilarse al término reproducibilidad.
Para los estudios de robustez normalmente se utilizan métodos donde se plantea un factorial; el usado en el siguiente protocolo es el de youlder-steiner; donde plantea la variabilidad de siete factores para
producir 8 ensayos.
Fecha : 15/May/2007
°T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:
Factor Condición Factor Factor
Factor validado Condición validado Experimento Factor A/a Factor B/b Factor C/c Factor D/d
E/e F/f
Factor G/g Resultado
modific. modificada
1 A B C D E F G 0.357
a
A 2 A B c D e f g 0.358
3 A b C d E f g 0.359
b
B 4 A b c d e F G 0.355
5 a B C d e F g 0.356
c
C 6 a B c d E f G 0.352
7 a b C D e f G 0.340
d
D 8 a b c D E F g 0.339
Cálculo del
e
E efecto 0.011 0.008 0.002 0.007 0.001 0.001 0.002

f AFECTA AFECTA NO AFECTA AFECTA NO AFECTA NO AFECTA NO AFECTA

F
Volver
Volver
g Intro
Intro
G
 CERTIFICADO DE LA VALIDACION PARA DETERMINAR HIERRO TOTAL EN AGUA POTABLE

PARAMETRO EVALUADO ESPEFICACIONES RESULTADO OBSERVACIONES

Selectividad N/A N/A Ver conclusiones

Coef. Correl.(R) > 0.9990 0.9999 CUMPLE

Coef. Deter.(R ) >

2
0.9980 0.9997 CUMPLE
Linealidad patrón
T. student (exp) > 2.15 219.14 CUMPLE

Gexp Cochran < 0.6838 0.5467 CUMPLE

Repetibilidad Coef. Variac.(%) < 5.0 0.8 CUMPLE

Precisión intermedia Coef. Variac.(%) < 5.0 0.8 CUMPLE

95.0 > Recup. (%) > 105.0 0.2 NO CUMPLE

Exactitud T. student (exp) < 2.31 198.11 NO CUMPLE

Gexp Cochran < 0.8709 0.7832 CUMPLE

Límite de detección N/A -1.0849 Ver conclusiones

Límite de cuantificación N/A 0.2223 Ver conclusiones

 CERTIFICADO DE LA VALIDACION PARA DETERMINAR HIERRO TOTAL EN AGUA POTABLE

Conclusiones:

Fecha:

Analista 1: Analista 2:

Preparado por: Aprobado por: