Protocolo de producción de Navicula incerta para alimentar abulones en

estadios de postlarva y juvenil.

El cultivo de N. incerta en al laboratorio de abulones del departamento de acuicultura del CICESE se
realiza en tres niveles de producción diferentes, sin embargo el procedimiento que se debe seguir
en el manejo de la cepa depende del objetivo al cual se quiera llegar o de la necesidad que se busque
satisfacer.

Primer Nivel: Mantenimiento de cepa

Al menos se deben mantener 3 matraces con la misma cepa, esto servirá como respaldo por si se
llega a contaminar alguna de las cepas y permitirá que el cultivo de microalga en el siguiente nivel
se mantenga estable.

 El cultivo de la cepa de N. incerta se realiza en matraces de 125 mL o de 250 mL.

 Tomar agua del sistema UV, la cual esta previamente filtrada por un filtro de 5 micrómetros
y dos de 1 micrómetro, y posteriormente es expuesta a irradiación de 2 lámparas UV, la
primera de 25 watts (en la entrada) y la segunda de 40 watts (en la salida).
 En el caso de usar matraces de 250 mL agregar 120 mL de agua filtrada e irradiada con luz
UV en cada uno de los matraces, en el caso de usar matraces de 125 mL agregar 70 mL de
agua, posteriormente colocar un tapón de algodón y gasa hecho a la medida de la boquilla
de los matraces. (Se sugiere colocar un gorro de papel aluminio a todos los tapones de
algodón, sin embargo este no es necesario).
 Una vez preparados los matraces esterilizar en las autoclaves del departamento de
acuicultura a 15 psi y a 120 C durante 40 minutos (CONSULTAR HORARIOS Y DISPONIBILIDAD
CON EL PERSONAL AUTORIZADO). Posterior a la esterilización se debe dejar enfriar el agua
hasta que quede a temperatura ambiente.

Preparación de Medio F2 y siembra de inóculo

 Antes de manejar los matraces y el inóculo, acondicionar el espacio donde se realizará la

siembra, el sitio debe estar equipado con un mechero de bunsen. La superficie del lugar se
debe limpiar con cloro al 10% y posteriormente con alcohol al 70%, con el fin de evitar
contaminación.
 Antes de encender el mechero, corroborar que tanto este como el tanque de gas se
encuentran cerrados, una vez verificado, abrir la válvula de gas de manera que comience a
fluir gas hasta el mechero sin salir de este.
 Abrir la válvula del mechero y encender con cuidado, evitar flamazos; una vez encendido
regular la flama entre 10 y 15 cm de altura, no más puesto que esto representará un gasto
de gas innecesario. El mechero da como máximo un radio de 20 cm alrededor de la flama
de zona estéril por lo que el manejo de los nutrientes debe ser en un radio no mayor a este.
  Una vez limpio el sitio de siembra y con un área estéril adecuada, transportar los matraces,
el inóculo de N. incerta, nutrientes, vitaminas y los silicatos además de una pipeta de 1 o 5
mL, así como puntas limpias y estériles al lugar. Los nutrientes se encuentran en el
refrigerador mabe que está en el laboratorio de genética, en la parte de la puerta, las puntas,
estériles están en el casillero que dice Erik Fuera del laboratorio de genética).
 Los nutrientes del medio comercial (ProLine® Aquatic Eco Systems) vienen en una
presentación que involucra 2 soluciones que se complementan, no obstante, estas no
contienen silicatos por lo que es necesario agregarlos aparte. Tanto los nutrientes como los
silicatos se deben agregar a los matraces dentro de la zona estéril, estas soluciones se
adicionan a razón de 1 mL:1000mL de agua de mar (volumen final), por lo cual se debe:

 Retirar el tapón de los matraces dentro del área estéril

 Agregar 150 microlitros de cada solución de nutrientes y de silicatos en cada matraz de
250 mL
 Agregar 80 microlitros de cada solución de nutrientes y de silicatos en cada matraz de
125 mL
 Una vez adicionados los nutrientes, agregar el inóculo de N. incerta (30 mL de cepa en
el caso de los matraces de 250 mL y 15 mL en el caso de los matraces de 125 mL).
 Tapar los matraces y colocarlos en los sitios asignados para su cultivo (laboratorio
húmedo o laboratorio de peces).

Segundo nivel Cultivo en matraz Fernbach (Primer escalamiento)

Al menos se deben mantener 2 matraces con la misma cepa, esto servirá como respaldo por si se
llega a contaminar uno, manteniendo estable el cultivo de microalga y asegurando un stock para el
siguiente nivel.

 El cultivo del primer escalamiento de N. incerta se realiza en matraces de 2 L.

 Llenar los matraces Fernbach con 1.9 L de agua filtrada e irradiada con luz UV.
 Posteriormente colocar un tapón de algodón y gasa hecho a la medida de la boquilla de los
matraces. (Se sugiere colocar un gorro de papel aluminio a todos los tapones, sin embargo
este no es necesario).
 Una vez preparados los matraces esterilizar en las autoclaves del departamento de
acuicultura a 15 psi y a 120 C durante 40 minutos (CONSULTAR HORARIOS Y DISPONIBILIDAD
CON EL PERSONAL AUTORIZADO). Posterior a la esterilización se debe dejar enfriar el agua
hasta que quede a temperatura ambiente.
Preparación de Medio F2 y adición de inóculo

 Antes de manejar los matraces y el inóculo, acondicionar el espacio donde se realizará la

siembra, el sitio debe estar equipado con un mechero de bunsen. La superficie del lugar se
debe limpiar con cloro al 10% y posteriormente con alcohol al 70%, con el fin de evitar
contaminación.
 Antes de encender el mechero primero, corroborar que tanto este como el tanque de gas
se encuentran cerrados, una vez verificado, abrir la válvula de gas de manera que comience
a fluir gas hasta el mechero sin salir de este.
 Abrir la válvula del mechero y encender con cuidado, evitar flamazos; una vez encendido
regular la flama entre 10 y 15 cm de altura, no más puesto que esto representará un gasto
de gas innecesario. El mechero da como máximo un radio de 20 cm alrededor de la flama
de zona estéril por lo que el manejo de los nutrientes debe ser en un radio no mayor a este.
 Una vez limpio el sitio de siembra y con un área estéril adecuada, transportar los matraces,
el inóculo de N. incerta, nutrientes, vitaminas y los silicatos además de una pipeta de 1 o 5
mL, así como puntas limpias y estériles al lugar. Los nutrientes se encuentran en el
refrigerador mabe que está en el laboratorio de genética, en la parte de la puerta, las puntas,
estériles están en el casillero que dice Erik Fuera del laboratorio de genética).
 Los nutrientes del medio comercial (ProLine® Aquatic Eco Systems) vienen en una
presentación que involucra 2 soluciones que se complementan, no obstante, estas no
contienen silicatos por lo que es necesario agregarlos aparte. Tanto los nutrientes como los
silicatos se deben agregar a los matraces dentro de la zona estéril, estas soluciones se
adicionan a razón de 1 mL:1000mL de agua de mar (volumen final), por lo cual se debe:

 Retirar el tapón de los matraces dentro del área estéril

 Agregar 2 mL de cada solución de nutrientes y de silicatos en cada matraz de 250 mL
 Una vez adicionados los nutrientes, agregar el inóculo de N. incerta (100 mL de cepa
cada matraz).
 Tapar los matraces y colocarlos en los sitios asignados para su cultivo (laboratorio
húmedo o laboratorio de peces).

Tercer Nivel Cultivo en charolas (Primer escalamiento)

El cultivo de la cepa de N. incerta se realiza en matraces de 250 mL.

Al menos se deben mantener 4 charolas diferentes con cepa, esto servirá como respaldo por si se
llega a caer o contaminar el cultivo de algunas de ellas y permitirá que la producción de microalga
necesaria para alimentar a los abulones sea segura.

 El cultivo de N. incerta se realiza en charolas de 35 cm de ancho, 40 cm de largo y 15 cm de

altura.
  Tomar agua del sistema UV y llenar las charolas con 10 L de agua.
 Esterilizar el agua de las charolas agregando 1 mL de solución de cloro comercial y agua al
6% por cada litro de agua en las charolas, posteriormente tapar las charolas y dejarlas así
por 24 h.
 Una vez cumplido el tiempo agregar 0.15g de tiosulfato por cada litro de agua y dejar
aireando la solución por 2 h.

Preparación de Medio F2 y siembra de inóculo

 Para evitar contaminación, las charolas con agua esterilizada deben destaparse lo menos
posible, por lo cual es necesario preparar las soluciones de los nutrientes en un área estéril.
Para esto primero se debe acondicionar el espacio donde se realizará la siembra, el sitio
debe estar equipado con un mechero de bunsen. La superficie del lugar se debe limpiar con
cloro al 10% y posteriormente con alcohol al 70%, con el fin de evitar contaminación.

 Tapar con contac las charolas

 Agregar 10 mL de cada solución de nutrientes y de silicatos en cada matraz de 250 mL
 Una vez adicionados los nutrientes, agregar 500 mL de N. incerta (la cuañ debe ser
extraida de los matraces de 2 L).
 Tapar con contac las charolas.

Nota: Para llevar a cabo todas las actividades se sugiere el siguiente calendario de
actividades semanal

Horario propuesto
Lunes Martes Miercoles Jueves Viernes Sábado Domingo
Alimentación
Siembra en Siembra de
de postlarvas
Charolas inóculo
o juveniles
Limpieza de Siembra en
matraces matraces
Fernbach Fernbach
Alimentación
Esterilización
de postlarvas o
de matraces
juveniles
PERSONAL AUTORIZADO PARA USO DE AUTOCLAVE

Estudiantes

 Araceli
 Geraldo Montoya
 Paola Estrella

Técnicos

 Ceres Molina Cardenas

 Carmen Vargas

Nota: Las personas en esta lista NO ESTAN OBLIGADAS a realizar la esterilización de ningún material,
solo son personas que pueden usar el equipo (autoclave), por lo que se les deberá preguntar con
anticipación su disponibilidad. Es responsabilidad del encargado del cultivo de N. incerta ajustar sus
tiempos y entregar el material a esterilizar en perfecto estado y con tiempo para que dicha actividad
se realice de manera rutinaria y sin demoras.